（植物学专业论文）一种蓝猪耳胚珠表达磷脂酶c基因启动子的克隆和分析.pdf

摘要 被子植物双受精过程中的信号转导一直是植物学家关注的热点。甲期对植物有性生殖信 号途径的研究主要集中在钙信号方面。与此相比，对受精过程中其它信号因子的研究十分有 限。近年来，随着i p 。c f + 信号系统在动物受精和坯胎发育过程中的研究取得进展，p l c i p s 信使系统和植物有性生殖的关系引起了研究者的关注。但是到目前为止，对被子植物双受精 和胚胎发育过程中磷脂酶c 的参与情况还知之甚少。 本实验室选用具有裸露胚囊的玄参科植物蓝猪耳为材料，研究磷脂酶c 是否参与植物的 受精和胚胎发育过程。从蓝猪耳胚珠中克隆到2 条磷脂酶c 基因t f p l c l 和t z p l c 2 , 初步分 析显示，统“在胚珠中表达量比较高。为了进一步了解t f p z c i 的表达调控及功能，本实验 克隆了t z p l c l 的启动子，构建了植物表达载体，并转化蓝猪耳获得了转基因苗。 通过衔接头p c r 技术，我们首先克隆了t f p l c l 基因上游1 4 2 6 b p 序列。序列分析表明， 该序列含有启动子特征序列，如t a t a - b o x ，c a a t b o x 以及a t 富含区，而且还含有胚乳特异 的a a c a 域，g c n 4 域，g 盒，醇溶蛋向盒等，初步表明该启动子可能具有启动基因在胚珠高 水平表达的功能。在此基础上，我们用p f u t a q d n h 聚合酶从监猪耳基因组d n a 克隆了起始密 码子a t g 上游7 1 2 b p 和1 3 4 1 b p 片段，并将其与衔接头p c r 得到的1 4 2 6 b p 片段进行比对、拼 接、修上e ，得到1 4 3 8 b p 的启动子。启动子与表达载体p b l l 2 1 构建植物表达载体。结果显示： 高保真酶扩增到的片段与衔接头p c r 扩增到的片段相似性为9 9 ，表明1 4 3 8 b p 序列确实是 t f p l c l 基因的启动子区域；2 个植物表达载体分别命名为p p p 7 0 2 和p p p l 3 3 1 ，通过菌液p c r 验证了其正确性。植物表达载体首先转化农杆菌l b a 4 4 0 4 ，筛选阳性转化子后转化蓝猪耳。 叶盘法转化经过侵染，兆培养，生芽筛选等步骤后，现在已经得到抗性芽。本。i 作为研究 t f p l c l 的表达调控及其在胚璩发育和受精过程中的功能奠定了基础。 关键词： 蓝猪耳，磷脂酶c ，衔接头p c r ，启动子，转基因 a b s t r a c t s i g n a lt r a n s d u c t i o nd u r i n gd o u b l ef e r t i l i z a t i o no fa n g i o s p e r mi so n eo fr e s e a r c hf o c u s e sf o r b o t a n i s t s p r i o rs t u d i e so f s i g n a lp a t h w a yo ns e x u a lr e p r o d u c t i o no f a n g i o s p e r mm a i n l yf o c u s e do n c a l c i u ms i g n a l r e s e a r c h e so no t h e rs i g n a lf a c t o r sa r el i m i t e d c o m p a r e dt oc a l c i u ms i g n a l b e c a u s eo fi p 3 c a z s i g n a lp a t h w a yt h a tt a k ep a r ti nf e r t i l i z a t i o na n de m b r y od e v e l o p m e n to f m a m m a lh a v eb e e nm a d ep r o g r e s s ，t h er e s e a r c h e r sp a y e dt h e i ra t l e n t i o n so nt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e np l c i p 3s i g n a ls y s t e ma n ds e x u a lr e p r o d u c t i o no f a n g i o s p e r mr e c e n ty e a r sb u tw ek n e w l i t t l ea b o u tw h e t h e rt h ep h o s p h o l i p a s ect a k ep a r ti nf e r t i l i z a t i o na n de m b r y od e v e l o p m e n to f a n g i o s p e r ms of a r t oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h ep h o s p h o l i p a s ect a k ep a r ti nf e r t i l i z a t i o na n de m b r y od e v e l o p m e n t o fa n g i o s p e r m ，t w op h o s p h o l i p a s ecg e n e s ，n a m e dt f p l c la n dt f p l c 2 ，h a v eb e e nc l o n e df r o m t h eo v u l eo ft o r e n i af o u r n i e r i ，a ni d e a le x p e r i m e n t a lp l a n tf o rs t u d i e so fm e c h a n i s mo fd o u b l e f e r t i l i z a t i o nf o ri t sn a k e de m b r y os a ct h a tp r o t r u d e sf r o mt h e m i c r o p y l e p r i m a r i l ya n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h et f p l c le x p r e s s e dh i g h l yi no v u l e i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h ee x p r e s s i o na n d r e g u l a t i o no ft 妒l c w ec l o n e dt h ep r o m o t e ro ft f p l c l ，c o n s t r u c t e dp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s ， a n dt h e nt r a n s f o r m e dt ot o r e n i a f o u r n i e r it og a i nt h eg e n e t i cm o d i f i e dp l a n t s f i r s tw ee m p l o y e da d a p t o rp c rt oi s o l a t e1 4 2 6 b ps e q u e n c ei nt h eu p s t r e a mo ft h e 驴c g e n e a n a l y s i so ft h es e q u e n c ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r ep r o m o t e r - s p e c i f i ce l e m e n t si nt h e s e q u e n c el i k et a t a - b o x ，c a a t - b o xa n da t - r i c hr e g i o n s ；a n de n d o s p e r m - s p e c i f i ca a c am o t i f , g c n 4m o t i f , g - b o x , p r o l a m i nb o xw e r ea l s of o u n d ，w h i c hp r i m a r i l yi n d i c a t e dt h a tt h ep r o m o t e r c a l l p r o m o t eg e n ee x p r e s sh i g h l yi no v u l e b a s e do nt h er e s u l t s ，w ee m p l o y e dp f u t a qd n a p o l y m e r s et oi s o l a t et h e7 1 2 b pa n d1 3 4 1 b pf r a g m e n t su p s t r e a mo fs t a r tc o d ea t gf r o mt o r e n i a f o u r n i e r ig e n o m i cd n a ，a n dm a d ea l i g m e n t s w i t ht h e14 2 6 b ps e q u e n c e ，a r e ra l i g m e n t ， c o m b i n a t i o na n dc o r r e c t i o n ，w eg o tt h e1 4 3 8 b pp r o m o t e lw ec o n s t r u c t e dp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s w i t h t h ep r o m o t e r a n de x p r e s s i o n v e c t o r p b i l 2 1 t h ea l i g m e n t r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e i d e n t i t y i s 9 9 ，w h i c hm o r ea s s u r e dt h a tt h e1 4 3 8 b pf r a g m e n tw a st h ep r o m o t e ro ft h et f p l c lg e n e t w o p l a n te x p r e s s i o nv e t o r sw e r en a m e dp p p 7 0 2a n dp p p l 3 3 1r e s p c t i v e l ya n dv a l i d a t e db yp c r t h e v e c t o r sw e r et r a n s f o r m e dt oa g r o b a c t e r i u m t u me f a c i e n sl b a 4 4 0 4 ，a n dp o s i t i v er e c o m b i n a n t s w e r ef i l t r a t e dt ot r a n s f o r mt ot o r e n i af o u r n i e r ib yl e a fp l a t e a f t e ri n f e c t i o n ，c o - c u l t u r e ，s e l e c t ， p o s i t i v eb u d g e t sw e r es e l e c t e dp r i m a r i l y t h e s ew o r k sl a yf o u n d a t i o nf o rt h er e s e a r c ho n r e g u l a t i o no fr f e l c le x p r e s s i o na n di t sf u n c t i o ni no v u l ed e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o n k e yw o r d s ：t o r e n i a f o u r n i e r i , p h o s p h o l i p a s ec ，a d a p t o rp r i m e r , p r o m o t e r , g e n et r a n s f e r u s d s ： 1 s ： p e g ： 缩略词表 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e p o l y e t h y l e n eg l y c o l e d t a ： e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a e e t i ca c i d c t a b ： s m ： k a n ： c b ： i a a ： 6 - b a ： c e t y i t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e s t r e p t o m y c i ns u l f a t e k a n a m y e i n e c a r b e n i c i l l i n 3 - 1 n d o l y l a c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e 6 独创性声明 y 溉3 3 9 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包台其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：甲球蝎、 时间：加；年6 月伯 关于论文使用授权的说明 奉人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影e 】j 、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：峄枷骂、 时间：淅6 年钼舶 导师签名 私刁 时间：谚啦6 月f 卵 中国农业大学碗上学位论文 第一部分文献综述 1 磷脂酶0 与信号转导 第一部分文献综述 细胞膜具有维持细胞生命活动的重要作用，磷脂( p h o s p h o l i p i d ) 是细胞膜特有的组分。该类 化台物中甘油的三个羟基均被脂化，第l 、2 位碳原子上的羟基与脂肪酸的羧基形成酯键，第3 位上的羟基则被磷酸酯化，这样形成的结构称为磷脂酸( p h o s p h a t i d i ca c i d ) 。磷脂酸是磷脂的母 体化合物，在磷脂酸的磷酸根羟基上连接不同的i j 己基就形成了不同的磷脂。磷脂的基本结构如图 l 所示： o 凸一r ， o 1 1，、 p 一【) 一x l o h 图1 磷脂基本结构示意图( 参考孙大业等，2 0 0 1 ) 上图中当x 为肌醇时为肌醇磷脂。 肌醇磷脂( i n o s i t o lp h o s p h o l o p i d ) 主要分布在细胞膜内侧，约占细胞膜磷脂总量的1 0 ，主 要以三种形式存在：磷脂酰肌醇( p h o s p a t i d ) ，l i n o s i t o l ，p i ) 、磷脂酰肌醇- 4 磷酸 ( p h o s p a t i d y l i n o s i i o l 一4 p h o s p h a t e ，p i p ) 和磷腊酰肌醇- 4 ，5 - 二磷酸( p h o s p a t i d y l i n o s t o i 一4 ， 5 - b i s p h o s p h a t e ，p i p 2 ) ，后两种是p i 的肌醇环第4 ，第5 位上羟基被进一步磷酸化的结果，其基 本结构如图2 所示： a 2 o r 2 一c 警h ：一o _ l 址r ， 。电。上趾。h h 。描h o o 辜 i p ) 图2 肌醇磷脂分子结构及被各种磷腊酶水解的部位( 参考潘延云等2 0 0 5 ) o o 一 一 h h h忐 o o j c 一艮 中国农业火学硕士学位论文 第一部分文献综述 图中箭头所指位置为相应磷脂酶( p h o s p h o l i p a s e ) 作用的位点，这些磷脂酶依据水解部位不 同分别称为磷脂酶a l 、a 2 、c 、d ( p l a i 、p l a 2 、p l c 、p l d ) 。 肌醇磷脂信号途径是以肌醇磷脂代谢循环为基础，在相应磷脂酶的参与f 进行的。信号分子 发生的最初反应是膜受体接受胞外信号，之后p i p 2 在磷脂酶c ( p l c ) 的催化f 分解成三磷酸肌 醇( i p ，) 和二酰甘油( d g ) ，同时产生两个胞内信使，然后分别启动两个信号传递途径即i p ，c a 2 + 和d g p k c ( 蛋白激酶c ) 信号通路。i p 3 通过作用于内质网膜上特异的三磷酸肌醇受体使胞内 c d + 库释放，引起胞内c a 2 + 水平的升高，从而启动胞内c d + 信号系统，即通过依赖c d + 、钙结合 蛋白( 如c a m ) 的酶的活性的变化来调节生理过程；d g 则通过激活p k c ，以磷酸化的形式对许 多蛋白质和酶类进行修饰。从而调控另一系列的生理过程( 孙大业等，2 0 0 1 ；潘延云等，2 0 0 5 ) 。 可见磷脂酶c 在信号转导过程中有着重要的作用。 2 磷脂酶c 的结构特征 2 1 动物磷脂酶c 的结构特征 目前，哺乳动物中已确认1 2 种不同类型的p l c 同工酶，这1 2 种类型同工酶根据其不同的结 构和调控机制义分为5 人类：p 、丫、6 、和。p l c p 有p l 阻4 种亚型，p l c ? 有柏和y 2 2 种亚 型，p l c 6 有6 l 6 44 种亚型。无论是哪个亚型，其分子结构均包括4 个基本组分：p h 区、e f 手形区、c 2 区和催化区( r h e e ，2 0 0 1 ) 。催化区由氨基酸序列保守的x 、y 域组成，x 、y 域各含 有人约1 7 0 个、2 6 0 个氨基酸残基。不同亚型x 、y 域的序列同源性为3 3 0 o - - 4 3 ，而同一亚型阔 同源性高达7 9 。当蛋白折叠后，这两个区域靠近形成催化活性中心，行使酶的催化功能( 孙大 、i k 等，2 0 0 1 ) 。p h 结构域位丁p l c 的氨基末端，含有约1 0 0 个氨基酸残基，这一区域多存在于 膜表面相关蛋白，可以使酶与膜靠近，进而酶可以与其作用底物如p l p 2 特异结台( r e b e c c h ia n d p e n t y a l a ，2 0 0 0 ) 。e f 手形i x 位于p h 区和x 域之间，具有螺旋一环螺旋结构；该区域是c d + 结合 区域，将p l c i p 3 信号途径和i p 3 c 一+ 信号途径联系起来。但是e f 手形区域和x 、y 的紧邻似乎 表明其不仅起到结合c d + 的作用很有可能也是酶的催化核心的一部分( r e b e c c h ia n d p e n t y a l a ，2 0 0 0 ) 。c 2 区：位于y 结构区的羧基末端f 游部分，大约1 2 0 个氨基酸残基的长度。在 不同的p l c 亚型中，该结构域的大小和功能均有所差别( r e b e c c h ia n dp e n t y a l a ，2 0 0 0 ) 。 2 2 植物磷脂酶c 的结构特征 序列分析结果表明，植物p l c 结构比较简单，总体结构比较接近动物的p l c ，包括保守的x 与y 构成的催化区，e f 手形区域和c 2 域。其中x 、y 区和c 2 区与哺乳动物相似( s a u n d e r se t a l ， 2 0 0 2 ) ，但e f 手形区域却有些不同。对p l c 8 1 晶体的x 射线分析表明，植物p l c 的e f 手形更接近丁 p l c 8 第2 个e f 手形的环形结构，该环形结构的缺失会导致p l c 8 l h p l c t 的失活：实验表明，拟南 芥一个p 1 p l c 同l 。酶a t p i c 2 ，主要结合在质膜区域，其n 端保守区域可能代表了一个e f 手形区域， 该区域若缺乏前3 6 个氢基酸，则没有活性：而缺乏1 1 2 2 个氮基酸则对活性没有影响。这些证据表 曼笪曼曼皇詈墨邕曼璺蔓曼舅曼曼鼍毒量曼皇! ! 鼍曼皇皇曼置鼍皇鲁鼍曼曼皇毫曼皇曼暑曼皇曼曼曼曼曼 l ： ：；：；：= ：= 明这个区域和动物p l c 的e f 手形区域的第2 个环相似( o t t e r h a gp ta ，2 0 0 1 ) 。 图3p l c 亚型结构的功能域( 参考潘延云等，2 0 0 5 ) 3 磷脂酶c 的谓控机制 对磷脂酶c 调控机制的研究首先从p l c 的结构调控开始，哺乳动物p l c 6 ，三维结构的确定 促进了这一研究( e s s e ne ta l ，1 9 9 6 ) 。p l c 8 l p h 结构域可与p i p 2 特异结台。这一结合使酶移向质 膜。在c 一+ 存在的情况下，c 2 区与催化区结合，其余的c a 2 + 离子结合在活跃的组蛋向残基位点， 介导催化反应。c 2 区和2 个组蛋白残基的保守性表明植物的p i p l c s 信号途径催化机理和哺乳 动物相似。但是植物p h 区域的缺失表明植物p i p l c s 信号途径可能需要其他结构域的参加或者 存在其它的机理( h e m a n d e z e t a l ，1 9 9 9 ) 。 c a 2 + 是植物p i - p l c 活性所需的，可能通过催化和膜结合对该信号途径进行双重凋节 ( h e r n a n d e ze t 耐，1 9 9 9 ) 。在生理c 2 + 浓度f ，p i p l c 偏向于以p i p 2 做底物，但是在毫克当量 的c a 2 + 浓度f ，p i 更受欢迎( k o p k ae ta ，1 9 9 8 ) 。这个反应和哺乳动物中是一致的。在植物提 取物中，膜结合的和水溶性的p i p l c s 都存在。前者在微克当量的c 扩浓度下可水解p i p 2 ，后者 在毫克当量的c f 浓度下水解p l ( m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。抗原标记的p i p l c 基因转化西红柿的结 果表明膜结合的和水溶性的p l c 能在同一p i p l c 途径中检测到( s h ie la 1 ，1 9 9 5 ) 。p 1 - p l c 活性还 受m g “，a i ”等离子的调节。a i ”抑制p i p 2 水解( k o p k a e t a l ，1 9 9 8 ) ，m 岔+ 促进p i p l c 活性和质 膜联系( c o u r s o le ta 1 ，2 0 0 0 ) ，但是原核表达的p l c 不受其调控( k o p k ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些都说明 p i p l c 活性受细胞因子、膜环境等的调节。 g 蛋自是哺乳动物p 1 - p l c s 的重要调节因子，对不同讵型功能也备异( r h e e ，2 0 0 t ) 。p l c 鼬 被异源三聚体的g q 蛋向的d 醒单位激活，而p l c ? s 被蛋白络氨酸激酶激活。对p l c s s 激活的了 解不如前2 者多。应川黄蜂毒素对g 蛋白参与植物p 1 p l c 途释的证明起到了推动作h 。当黄蜂 毒素的浓度超过1 0 u m ，就能通过透过质膜的钙释放来激活p i p l c 信号途径，而小是通过激活g 中国农业人学硕士学位论文 第一部分文献综述 蛋a ( c h oe t a l 1 9 9 5 ；m u n n i k e t a l ，1 9 9 8 ) 。 对p i - p l c 同上酶细胞水平的调节是从基冈表达水平来完成的( h i r a y a m a e t a l ，1 9 9 5 ；k o p k a e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。很多组织都有p i - p l c 同_ t 酶的表达，不同的类型在不同的组织中有不同的表达 ( k o p k ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。另外，在不同的胁迫条件下，p l c 的表逃模式也不相同。比如，经过千早 处理的马铃薯叶片p l c l 转录水平f 降了，p l c 2 上升了，而p l c 3 没有发生改变。在拟南芥中， 干旱和低温都引起a t p l c i s 的m r n a 表达上调，但是该基因是组成型表达的( h i r a y a m ae l a 1 ，1 9 9 5 ) 。基因表达的不同模式表明不同的正向和反向调节因子能够调节p i p l c 同工酶的表达 水平，增大了单个p i p l c s 行使特定功能的可能。 4 磷脂酶c 参与的信号途径 磷脂酶c 水解产生第二信使的功能以及它与c a 2 + 的相互调节作用表明了其参与到很多的生 理途径尤其是信号传导途径中。有关其生理功能的研究也很多，例如采用药理学手段，利用其特 异性抑制剂处理实验材料，观察p 1 p l c 途径中组分的变化以及生理现象的变化等等。近年来， 随着分子生物学的发展，对p l c 的研究有了新的方法，对其参与各信号途径也有了更深入的证据。 事实证明，植物的生长发育过程与磷脂酶c 密切相关，磷脂酶c 在此过程中具有许多重要的生理 功能。 4 1 参与花粉管生长的调节 早年就有证据表明百合( l i l i u mi o n g g i f l o r u m ) 花粉管存在肌醇磷脂依赖的p l c 活性( h e l s p e r 叫a l ，1 9 8 7 ) 。利用p l c 的抑制剂u - 7 3 1 2 2 处理百合和蛇莓( d u c h e s n e a i n d i c a ) 花粉，发现花粉的 萌发受到抑制，并且这种抑制和浓度相关：崩i p 3 受体的专一性抑制剂肝素处理花粉能明显抑制其 萌发和生长( 马力耕等，1 9 9 8 ) 。通过显微注射的方法注射肌醇磷脂系统中重要组成成分及其抗 体，结果发现显微注射动物来源p l c i b i 一3 抗体显著抑制花粉管的伸氏生欧，而注射p l c l 3 4 抗体对花 粉管伸长没有影响；显微注射三磷酸肌醇( i p ，) 可显著促进花粉管的伸k 生长：显微注射动物来源 的i p 3 受体i i 、i p 3 受体i 的抗体可显著抑制花粉管的伸长生长，而注射i p 3 受体i 的抗体对花粉管伸 跃没有影响( 王昕等，2 0 0 0 ) 。上述结果表明三磷酸肌醇信号系统可能参与到花粉管的生k 调：冉。 4 2 参与a b a 信号转导 在研究气孔保卫细胞对a b a 的反应时发现：p l c 抑制剂u 7 3 1 2 2 可以抑制a b a 引起的钙 振荡和气孔关 ；l j ，从而证实p l c 参与到a b a 信号转导途径中( s t a x e ne t 口，】9 9 9 ) 。后来利刚转 基因拟南芥发现a t p l c l 呈现活性对a b a 诱导基因的表达是必需的，但是过表达的a t p l c l 不能 激活a b a 反应基因的表达，说明a t p l c l 在a b a 信号转导中并不是起最关键作_ i j ( s a n c h e ze t a 1 ，2 0 0 1 ) 。之后利_ e _ i 转基因烟草研究了p l c 在a b a 调”霄气孔的信号途径中的作用和在所处的位 置。研究发现，p l c 低表达的转基冈烟草的气孔对a b a 的反威相比野生，w 明显不敏感，但是p l c 的完全缺火也只能部分影响a b a 对气孔开放的抑制( h u n te l a l ，2 0 0 3 ) 。这与之前的实验结果是 4 一致的。 4 3 参与胁迫反应 研究者在克隆拟南芥p l c 实验中发现在正常生长条件下t p l c l s 表达量非常低，但是在干旱 或盐胁迫卜- 表达最急剧增加。将拟南芥培养细胞进行渗透胁迫处理，发现无论是甘露醇、n a c i 或是脱水都能引起细胞中i p 冰平的急速升高，而p l c 抑制剂1 3 - 7 3 1 2 2 处理可以抑制i p 3 的增高。p i p ， 在高渗透压刺激后也迅速增加，但是上升速率远不如i p 3 。结果表明，i p 3 的增加是由于胁迫刺激 诱导的p i - p l c 活性增强，而不是来i t l p i p 2 的增加。这些结果表t 碉p l c 参与了胁迫信号的信号传导 ( h i r a y a m a e l a l ，1 9 9 5 ) 。利用豌豆叶片研究了p i p 2 p l c 与水杨酸( s a ) 浓度升高及叶片耐高温 性的关系，发现：耐高温性在激活p l c 对p i p 2 的活性前引发了自由s a 浓度的升高；免疫印迹结果 表明一个6 6 5 k d 的p l c 参与到豌豆叶片耐高温性的形成过程中；对豌豆叶片施用p i p 2 p l c 抑制剂 新霉素发现其对高温的耐受性比对照差。结果表明p i p 2 p l c 参与豌豆叶片抗高温胁追形成高温耐 受性的生理过程( l i ue t a l ，2 0 0 6 ) 。 4 4 感受重力刺激 早期对植物感受重力的研究集中在c 一+ 方面，而近年对这一过程的研究扩展到了肌酵磷脂系 统。研究表明1 1 3 和肌醇磷脂系统参与玉米受重力刺激引发的短期和长期的生理反应。l 作为可 扩散的第二信使在玉米叶枕的感知细胞和应答细胞中起着传递和扩大信号的作崩( p e m r ae t a 1 ，1 9 9 9 ) 。以离体培养的燕麦叶鞘为材料研究其在向地性生长过程中l 的变化，发现垂直生长 的叶鞘由于重力的作_ i j 顶端会弯曲，表现出向地性。这个过程中，叶鞘组织i p 3 浓度会发生变化。 重力刺激1 0 3 0 分钟，叶鞘下半部分的l p 3 浓度是上半部分的3 倍。而施加p l c 抑制剂u 7 3 1 2 2 后，可以阻碍i 增加，并使叶鞘由于重力产生的弯曲生长减少6 5 。这一结果表明i p 3 参与了 植物感知重力刺激的信号传导过程( p e r e r ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。用基因敲除的方法通过同源重组产生 p l c 缺失的苔藓突变体，研究发现，在相同培养条件下的野生型和突变体对重力的反应不同：野 生型垂直生民，突变体却明显的蜿蜒生长；将培养的苔藓旋转9 0 ，野生型受重力影响生长方向 随之改变，表现山向地性，而突变体仍然是随机生长。因此推测苔藓的p l c 基因在苔藓对重力 的感知中发挥重要的作用( a l e x a n d e re t a l ，2 0 0 4 ) 。 5 磷脂酶c 与胚胎发育的关系 磷脂酶c 与胚胎发育的关系的研究最早开始于动物受精方而，在动物中的研究表明该信呼途 径在受精和早期胚胎发育过程中起重要作_ 【i = | ( m i y a z a k ie la 1 ，1 9 9 3 ：c a r r o l le ta 1 ，1 9 9 7 1 l e ea n d s h e n ，1 9 9 8 ；s c h l e s s i n g e r ，1 9 9 7 ) ，从此揭开了磷脂酶c 在有性生殖作州方面研究的新篇章。植物 巾类似的研究滞后丁动物领域，肌醇磷脂信号途径的研究目前人多都集中在植物对逆境信峙的反 麻方而( m u e l l e r - r o e b e ra n dp i c a l ，2 0 0 2 ) ，对丁p l c i p 3 信q 系统是否参1 j 剖被子植物受精过程还知 中国农业大学硕士学位论文 第一部分文献综述 之甚少。 5 1 磷脂酶c 与动物胚胎发育的关系 在受精过程中最甲- 检测到的反应是精卵的融合( m e c u l l o ha n dc h a m b e r s ，1 9 9 2 ) ：精卵融合可 能使得信号从精子向卵细胞传递，从而引发钙波( w h i t a k e re t a l ，1 9 8 9 ；t a y l o r e t a l ，1 9 9 3 ) 。在 受精的早期阶段，除了少数脊椎动物以外，许多动物在受精过程中都出现从精子进入位点扩展到 整个胞质的显著的钙波( w h i t a k e r a n ds w a r m ，1 9 9 3 ；s h e n ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ：m c d o u g a l le t a l ，1 9 9 3 ， 1 9 9 5 ：s t e p h a n oe t a l ，1 9 9 7 ) 。海胆卵和大部分其他后口动物( d e u t e r o s t o m e s ) 在受精过程中由于 c a 2 + 1 。n 的升高引发卵激活，继而启动了胚胎细胞的分裂循环( c r e t o ne t a l ，1 9 9 5 ；j a f f a ，1 9 8 0 ， 1 9 9 9 ) 。钙振荡产生的原因一直是发育生物学家关注的焦点。而对肌醇磷脂的关注也源于p i p 2 水解 产生i p 3 t n d g 两个第二二信使，分别促进了胞内钙库的释放和激活了蛋白激酶c ( b e r r i d g ea n di r v i n e ， 1 9 8 9 ) 。i p 3 是p i p 2 被p l c 水解的产物，它通过与其受体结合能引发胞内钙库的释放。受精引发的钙 振荡是通过l p 3 受体介导的。比如，已知的3 种l p 3 受体都在哺乳动物卵内表达，尤其是i 型i p 3 受体 ( m i y a z a k ie l a l 1 9 9 2 ；m e h l m a n ne t a l ，1 9 9 6 ；p a r r i n g t o ne t a ，1 9 9 8 ；f i s s o me t a l 。1 9 9 9 ) 。而该 类受体分布在皮层区域该区域是钙振荡的起始位点。另外，以仓鼠和小鼠卵为实验材料，注射 i 型l p ，受体的封闭抗体或肝磷脂( 竞争性的p 攫体抑制剂) ，就不能引发由精子或精子提取物引发 的钙振荡( m i y a z a k ie t a l ，1 9 9 2 ；w ue t a l ，1 9 9 7 ) 。更进一步的是，l 型1 p 3 受体在精子进入卵细胞 后发生降解，这标志着i p 3 的进入( b r i n de t a l ，2 0 0 0 ；j e l l e r e t t ee t a l ，z 0 0 0 ) 。因为已经在体细胞中 证明i p 3 受体只有在被i p 3 结合的时候发生降解( b o k k a l aa n dj o s e p h ，1 9 9 7 ；o b e r d o f f e ta l ，1 9 9 9 ) 。 磷脂酶c 的同工酶在哺乳动物雌、雄配子中均能找到，尤其儿4 主要在睾丸中表达。以雄 性小鼠为实验材料，破坏了儿c 矾基因的小鼠不是只产生根少的精子就是不育。体外受精实验表 明，以p l c 5 4 缺失的精子授精将导致被激活的卵细胞数量减少，与受精相关的钙振荡将消失或被 推迟。p l c 5 4 缺失的精子不能引发顶体反应。这些结果表明p l c 8 4 参与到哺乳动物受精过程中透 明带诱发的顶体反应中( k i y o k oe t a l ，2 0 0 1 ) 。为了验证p l c 的生物学功能。通过基因打靶制造了 小鼠突变体。彪c 邸基因的纯合性失活对2 5 天的胚胎是致死的；这些胚胎机体形成能力差，产生 的细胞数目少。两个独立的来自纯合突变体的定向胚胎干细胞克隆有相同的表型。尽管如此，杂 合突变的小鼠是能生育的，至少能繁殖2 代。t l c f l 3 基g 在未受精卵细胞中、胚胎的3 细胞期和柱 形细胞期也表达。总之，儿c 邸基因的表达对小鼠早期的胚胎发育是必需的( s h ue t a l ，1 9 9 8 ) 。 5 2 磷脂酶c 与被子植物发育的关系 烈受精是被子植物特有的生殖方式，始干花粉落到柱头萌发出花粉管，花粉管通过柱头、花 松、胎座、珠孔等雌蕊组织到达胚囊的退化助细胞中，花粉管释放内容物( 包括两个精细胞) ， 使一个精细胞与卵细胞融合而成合子，另一个精子与中央细胞融合而成三倍体的胚乳，完成被子 植物的烈受精。这期间发生了一系列的非、雄细胞的相互作用，确保了花粉管准确到达胚囊，完 成精卵结合( e p e l ，1 9 9 0 ；s u ne la 1 ，2 0 0 0 ) 。在整个过群中，磷脂酶c 在其中的作用已引起了研 究者的火注。研究表明绿藻配r 托融台过科中胞内i p 3 水平升高( m u s g r a v ee t a l ，1 9 9 3 ) ，通过显 6 微注射实验表明三磷酸肌醇信号能诱导蓝猪耳胚囊中央细胞胞质钙浓度升高( h a ne la 1 ，2 0 0 2 ) 。这 些j ：作初步表明肌醇磷脂信号途径在植物受精和发育过程中也可能起重要作用。 6 植物磷脂酶c 基因的克隆 第一个编码有功能的植物p l c 的e d n a 是根据动物和酵母p l c 保守序列设计引物，从诱导开 花的拟南芥克隆得到的，其片段与动物p i _ p l c 极为相似( y a m a m o t oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。同年，从受 干旱和盐胁迫诱导的拟南芥中又筛选到一个类动物p p p l c 6 的e d n a 克隆a t p l c i ( h i r a y a m ae t a 1 ，1 9 9 5 ) 。2 年后，又从拟南芥中克隆到一个在营养组织和花器官中组成型表达的p i p l c ，命名 为a t p l c 2 ( h i r a y a m a p t 耐，1 9 9 7 ) 。用真核生物p i p l c 的保守区域( x 和y 域) 设计简并引物从拟 南芥基因组d n a 中进行扩增，可得到8 个序列不同的片段，他们与动植物中已分离到的p l c 具有 较高的同源性，表明p l c 在植物中与在动物中一样，具有多个同上酶( h a r t w e c k e t a l ，1 9 9 7 ) 。 近年来，已经陆续从拟南芥、马铃薯、大豆、烟草、水稻、豌豆、西红柿、玉米以及百合中克隆 到新的p l c 基因( m u e l l e r - r o e b e r a n d p i e a le l a l ，2 0 0 2 ；k o p k ae t a l ，1 9 9 8 ；s h ie l a l ，1 9 9 5 ；林芳 等，2 0 0 1 ；p i c a le ta 1 ，1 9 9 7 ；s o n ge t 甜，2 0 0 2 ；v e n k t a r a m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ；p a ne ta 1 ，2 0 0 5 ；z h a i e t 口f 2 0 0 5 ) 。最近，我实验室根据p l c 保守序列设计引物，利用r a c e 技术从蠊猪耳( t o r e n i a f o u r n i e r i ) 中克隆到2 个e d n a 序列，分别命名为r y t c l 和t f p l c 2 ( 宋梅芳等，未发表) 。各 p l c e d n a 的特征分别列于表1 。 表1 已克隆的植物o t _ cc d m 及其特征 7 中国农业大学硕上学位论文 第一部分文献综述 拟南芥a t p l c 5a y 0 6 2 6 8 1 5 7 3 a a , 6 6 k dm u l l c r8 ，d ，2 0 0 2 拟南芥a t p l c 6 5 7 6 a a , 6 6 k dm u l l e rp t 日1 2 0 0 2 拟南芥a t p l c 7 5 8 4 a a , 6 7 k d m u l l e re la 1 2 0 0 2 水稻o s p i - p l c l a f 3 3 2 8 7 4 5 9 9 a , a ，6 7 6 5 k d s o n g “n t2 0 0 2 豌豆psplcy 1 5 2 5 3 5 9 4 a a , 7 1 2 8 k d v e n k t a r a m a l l “d f2 0 0 3 百台( i l i “md a y 础f ) l d p l c i a y 7 3 5 3 1 4 4 7 5 a a , 5 4 k dp a ne ta l ，2 0 0 5 百合ldplc2a y 7 3 5 3 1 3 5 3 6 a a , 6 1 k d p a ne ta 1 2 0 0 5 玉米( z e am a y s )z m p l ca y 5 3 6 5 2 5 5 8 6 a a , 6 57 k d z h a ie la l , 2 0 0 5 蓝猪耳( t o m n i a f o u r n i e r i )驴l c l 5 8 3 a a ，6 6 k d 宋梅芳等，待发表 蓝猪耳tfplc2 6 0 1 a a ，6 8 k d 粜梅芳等，待发表 注：参考潘延云等，2 0 0 5 p l c 各同工酶在植物中的表达具有组织特异性，并且在不同发育阶段、不同环境条件f 表达 也各不相同。拟南芥d t