（有机化学专业论文）hplcms在天然来源生物活性成分快速筛选中的应用研究.pdf

摘要 本论文的研究旨在发展、建立一系列可应用天然来源生物活性成分快速筛选 与分析的新方法。主要内容包括：拓扑异构酶作为靶分子的h p l c 血v i s 一亲和超 滤筛选；抗体作为靶分子的h p l c m s 一亲和超滤筛选：血管紧张素i 转换酶作 为靶分子的h p l c m s 一高通量生物活性筛选。 1 ) 拓扑异构酶作为靶分子的h p l c 煳s 一亲和超滤筛选方法研究： 以d n a 拓扑异构酶作为靶蛋白，将其与多种化合物的混合物共同孵育，对 酶有亲和性的小分子物质能与酶发生作用形成复合物，通过超滤将该复合物与其 它无亲和性的小分子物质分离；加酸使酶变性后，原与酶形成复合物的小分子化 合物被游离，通过再次超滤而获得。应用h p l c 皿订s 对这些小分子活性物质直接 进行定性定量分析。在该方法中，选用拓扑异构酶i 和拓扑异构酶1 1 分别作为靶 分子，通过生物亲和超滤筛选，从混合物中捕获抗癌活性成分。一系列拓扑异构 酶i 抑制剂，包括喜树碱、g 一硝基喜树碱和1 0 一羟基喜树碱等和两种拓扑异构 酶i i 抑制剂阿霉素和柔红霉素作为被筛选化合物库模型，研究结果验证了该方法 的可行性。在此基础上将该筛选方法应用于植物愈伤组织培养细胞中抗癌成分的 筛选，获得了目标分子。 2 ) 抗体作为靶分子的h p l c 府订s 一免疫亲和超滤筛选方法研究： 采用抗体作为靶蛋白捕获可与之发生亲和性结合的生物活性化合物。这些化 合物可被抗体从多种混合物中选出，用超滤的手段使这些能与抗体结合的化合物 与其它混合物分离，应用高效液相色谱结合电喷雾质谱或大气压电离源质谱直接 分析鉴定小分子的活性化合物。通常能识别某种半抗原的抗体，可识别与该半抗 原相似的小分子物质。磺胺二甲基嘧啶半抗原，齐墩果酸半抗原和柔红霉素半抗 原首先被合成，通过免疫动物，从兔血清中制备得相应的抗体。以磺胺二甲基嘧 啶抗体作为靶分子，建立了相应的筛选模型，活性化合物被超滤后应用液质联用 方法进行分析鉴定。在本研究中，应用齐墩果酸抗体和柔红霉素抗体作为靶分子 对白花蛇舌草、芦荟、山茱萸和奇蒿等几种天然植物提取物中的活性物质进行了 筛选，并成功地筛选出生物活性成分芦荟大黄素、齐墩果酸、熊果酸及齐墩果酸 甙。 3 ) 血管紧张素i 转换酶作为靶分子的h p l c m s 一高通量筛选方法研究： 在该方法中，待筛选物质首先通过高效液相色谱结合质谱被分离和鉴定，它 们对血管紧张素i 转换酶的抑制活性强弱利用微孔板读板器快速测定。该方法集 活性筛选、化学分析于一体，提供了一个高通量筛选血管紧张素i 转换酶抑制剂 的方法。 该研究中的血管紧张素i 转换酶从猪肺中被分离并纯化，用于血管紧张素 i 转换酶抑制剂的筛选。卡托普利加入到柚皮提取物中作为被筛选库，建立高通 量血管紧张素抑制剂的筛选模型，并将此模型应用到葛根、珠子草、黄芩提取物 中血管紧张素i 转换酶抑制剂的筛选，并从中筛选出葛根素，甲氧基葛根素和 c o r i l a g i n 等具有抑制血管紧张素i 转换酶活性的成分，其中葛根素和 c o r i l a g i n 具有较强的抑制活性。此外，鱼发酵生产的鱼酱油也被用作待筛选物 质，在其复杂组分中有两种目标分子显示出较强的a c e 抑制活性。 a b s t r a c t t h i st h e s i sr e p o r t st h ed e v e l o p m e n ta n de s t a b l i s h m e n to fs i r e so fn e w s c r e e n i n g m e t h o d sf o rb i o a c t i v e c o m p o u n d sb y h p l c m sc o m b i n ew i t ho t h e r b i o l o g y t e c h n i q u e s ，w h i c h i n c l u d et h r e e m e t h o d s ：a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o no fd n a t o p o i s o m e r a s e s - t a r g e t e dc o m p o u n d sf o rd r u gc a n d i d a t es c r e e n i n g , i m m u n o a f f i n i t y u l t r a f i l t r a t i o nf o r s c r e e n i n gd r u g c a n d i d a t ea n da s c r e e n i n g m e t h o df o r a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e i n h i b i t o r s 1 ) d n at o p o i s o m e r a s e ( t o p o ) a st a r g e tp r o t e i ni si n c u b a t e dw i t ham i x t u r e o fc o m p o u n d s ，a n dt h e nt h ec o m p l e xf o r m e db yt h et a r g e ta n ds m a l lm o l e c u l e si s s e p a r a t e df r o mt h er e s to f t h em i x t u r eb yu l t r a f i l t r a t i o n t h ec o m p l e xt h a ti sr e t a i n e d o nt h em e m b r a n ei ss u b s e q u e n t l yb r o k e nt h r o u g ha d d i n ga c i da n ds m a l lm o l e c u l e s t h a ta r es p e c i f i c a l l yb o u n dt ot h et a r g e ti sr e l e a s e dm a dc o l l e c t e d ，t h e na n a l y z e db y h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p hc o m b i n e dw i t he l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) s o m ea n t i c a n c e r c o m p o u n d sa r e s c r e e n e db yt h i s m e t h o d ；i nw h i c hd n a t o p o i s o m e r a s ei a n d1 ia r er e s p e c t i v e l yu s e da sat a r g e tt o c a p t u r e a n t i t u m o r c a n d i d a t e sf r o mam i x t u r e t h r e ek i n d so f r e c o g n i z e d i n h i b i t o ro ft o p o i ， c a m p t o t h e c i n ，9 - n i t r o c a m p t o t h e c i na n d 10 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i na n dt w ok i n d so f i n h i b i t o ro ft o p o i i ，d a u n o r u b i c i na n dd o x o r u b i c i na r ea c t e da sas c r e e n i n gl i b r a r y m o d e l w ea l s oh a v es u c c e s s f u l l ya p p l i e dt h i sm e t h o dt o s c r e e n i n gc o m p o u n d s f r o mc e l l sg r o w ni nc u l t u r e 2 ) a b i o a c t i v ec o m p o u n ds c r e e n i n ga p p r o a c hf o ri m m u n o a f f i n i t yi sp r e s e n t e d a n t i b o d y i su s e da sat a r g e tp r o t e i nt oc a p t u r eb i n d i n gc o m p o u n d sf r o mam i x t u r e o fb yu l t r a f i l t r a t i o n u s i n gh i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t h e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o no ra i rp r e s s u r ec h e m i c a li o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y , s m a l l m o l e c u l ea c t i v ec o m p o u n d sa r ed i r e c t l yi d e n t i f i e d t h e h e p t e n s o f s u l f a d i m i d i n e ，o l e a n o l i c a c i da n dd a u n e r u b i c i na r e s y n t h e s i z e d ，a n d t h e i ra n t i b o d i e sa r e p r e p a r e d f r o mr a b b i t s s e r u m u s i n g 3 s u l f a d i m i d i n ea n t i b o d ya sat a r g e tm o l e c u l a rt ob i n ds i m i l a rm o l e c u l e s ，ah i 出 t h r o u g h p u t s c r e e n i n g m o d ei se s t a b l i s h e d t h i sm e t h o dh a ss u c c e s s f u l l yb e e n a p p l i e dt os c r e e n i n gb i o a c t i v ec o m p o u n d sf r o me x t r a c to f n a t u r a lp l a n t b i o a c t i v e c o m p o n e n t s ，f r a n g u l ae m o d i n ，o l e a n o l i ea c i d ，u r s o l i ca c i d ，o l e a n o l i cg l y c o s i d ea r e f i s h e do u tf r o mo l d e n l a n d i ad i f f u s a r o x b ，l i l i a c e a ea l o e , f r u c t u s c o r n ia n d a r t e m i s 沁a n o m a l as im o o r 3 1a h i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n ga p p r o a c hf o ra n g i o t e n s i n - ic o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r yi sp r e s e n t e d a c t i v ec o m p o u n d sa r ei s o l a t e d a n di d e n t i f i e db y h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o m b i n e dw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y , a n da c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo f t h e mi sm e a s u r e db ym i c r o a r r a ya s s a y t h em e t h o di n t e g r a t e s a c t i v i t ys c r e e n i n g a n dc h e m i c a l a n a l y s i s i no n e p r o c e s s ，a n dp r o v i d e s a h i g h t h r o u g h p u tm e t h o d f o rt h ea c ei n h i b i t o r ss c r e e n i n g t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fb i o a c t i v ec o m p o u n d si se v a l u a t e db ya c e ，w h i c hi s i s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mh o gl u n gt i s s u e t h ee x t r a c t sa ss c r e e n e dl i b r a r yw e r e o b t a i n e df r o mp u e r a r i al o b a t a ，p h y l l a n t h u sa m a r u s ，a n ds c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g ip u e r a i n ，c o r i l a g i n ，a n da d o n i n e w i t hi n h i b i t o r ya c t i v i t yo fa c ea r es c r e e n e d o u ta n di d e n t i f i e d b y t h es a m ew a y , t h e r ea r et w op e p t i d e sf r o mm a n r u o ta r ec a u g h t w h i c hs h o ws t r o n gi n h i b i t o r ya c t i v i t yo f a c e 4 浙江大学博士学位论文 a b b r e v i a t i o n 缩略语 a b a n t i b o d y抗体 a c e a n g i o t e n s i n ic o n v e r t i n ge n z y m e血管紧张素i 转换酶 a ga n t i g e n抗原 a p c ia i rp r e s s u r ec h e m i c a li o n i z a t i o n 大气压化学电离源 b s ab o v i n es e r u ma l b u m e n 牛血清白蛋白 d a ud a u n o r u b i c i n 柔红霉素 d a u b s a 柔红霉索半抗原与血清白蛋白结合形成的完全抗原 d a u s a 柔红霉素半抗原 d a u o v a 柔红霉素半抗原与卵自蛋白结合形成的完全抗原 d c c n ，n d i c y c l o h e x y l e a r b o d i i m i d en ，n 一二环己基碳化二亚胺 d m f n ，n d i m e t h y l f o m l a m i d en ，n 。二甲基甲酰胺 d o xd o x o r u b i c i n 柔红霉素 e d c 。h c i - e t h y l 一3 ( 3 - d i m e t h y - a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o e h l o r i d e h c i 1 一乙基一3 ( 3 一二甲基氨基丙基) 一碳二亚胺盐酸盐 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o a b s o r b e n t酶联免疫吸附分析 e s ie l e c t r i c a ls p r a yi o n i z a t i o n 电喷雾离子源 h p l c h i g hp e r f o m a a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h 高效液相色谱 i a i m m u n o a s s a y免疫分析 i g gi m m u n o g o t b u l i ng免疫球蛋白g m sn l a s ss p e c t r u m 质谱 n h s n h y d r o x y s u c c i n i m i d en 一羟基丁二酰亚胺o d n m rn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e 核磁共振 p a b p o l y c l o n a la n t i b o a y多克隆抗体 p b s p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 s as u c c i n i ca n h y d r i d e 丁二酸酐 a m 2s u l f a m e t h a z i n e 磺胺二甲基嘧啶 浙江大学博士学位论文 s m ，一s a 磺胺二甲基嘧啶半抗原 s m 2 一b s a磺胺二甲基嘧啶半抗原与血清白蛋白结合形成的完全抗原 s m 2 o v a磺胺二甲基嘧啶半抗原与卵白蛋白结合形成的完全抗原 t l c o l e t h i n - - l a y e r c h r o m a t o g r a p h薄层色谱 o l e b s a o l e n h a o l e o v a o v ao v a l b u m i n 齐墩果酸 齐墩果酸半抗原与牛血清白蛋白结合形成的完全抗原 齐墩果酸半抗原 齐墩果酸半抗原与卵白蛋白结合形成的完全抗原 卵清白蛋白 浙江大学博士学位论文 第一章前言 新药的发现和评价以药理学研究为基础。这一学科开始于1 9 世纪2 0 年代中 期。伴随着大量药物的化学合成，治疗效果的药理学评价变得日益重要，在2 0 世纪许多新药是在这一传统的研究方法下被发现的，即用新的化学物质或生物样 品的提取物( 纯物质) 进行动物实验，发现和评价了现已使用的大多数药物。 卜九世纪7 0 年代中期，受体技术被引入，通过放射性配体连接方法发展用 于对化合物的评价研究。该方法基于s c h i l d ( 1 9 4 7 ) ，s c a t c h a r d ( 1 9 4 9 ) 等人的 评价及计算。受体连接的方法被用于各种传导过程，有如离子通道神经传导受体。 受体的性质与分类是连续的过程，放射性配体连接方法促进了新化合物的设计， 特别是在用衍生分子模型获得结构一活性相关性的信息研究方面，取得进展。受 体技术提供了一个快速直接评价微量化合物( 5 1 0m g ) 的方法，评价化合物与受 体或酶单独相互作用的有效性。当这种新方法完善后，它也提供了化合物的活性 与它的连接位点之间的部分信息，因此产生了体外放射性配体连接方法( s h a w 1 9 9 2 ) 。受体可分成许多小类，真正掌握新化合物所有受体药理学的性质仍需要 很长时侧。 通过d n a 测序技术许多受体被鉴定，它们大多数属于g 蛋白连接受体总属， 它们的配体基还未被鉴定。反转分子药理学和功能基因组策略可以用来鉴定这些 受体配基的活性( w “s o ne ta 1 1 9 9 8 ) 。反转分子药理学方法学包括克隆和g 蛋白连接受体在哺乳动物细胞内的表达，筛选功能相应的细胞，或生物提取物、 肽库及复杂化合物中的同类物质及其替代品。配体连接方法是一种最有效的工 具，用于研究替代品、新受体拮抗物，鉴定新类型的替代品和已知受体的拮抗 物。然而它不能区别替代品与拮抗物。配体连接方法的大量筛选适用于高的通量。 但是，只有在应用可靠的筛选模型，才可避免筛选的盲目性( b u t c h1 9 9 1 ) 。 经典的方法具有高相关性的优势。如果一个高血压大鼠口服一定剂量的某种 化合物使血压降低，这种化合物可能在人体内也有效。剂量相应曲线的测定，给 药时间的影响，静脉注射和口服用药的效果比较，已经提供了药代动力学的数据。 这种方法的缺点在于时间较长且新化合物消耗量较大( 通常5 9 ) 。此外，该法在 观察到的效果中只能获得较少的分子机理方面的信息。 浙江大学博士学位论文 组合化学和高通量筛选方法是9 0 年代初期应用于药物研究的新方法。由于 化学家的杰出贡献，新化合物在药物研究中产生。一段时间以来训。算机模拟分子 模型被认为是最有效的方法。受体和酶的三维结构特性的研究，生物靶相互作用 的分子设计被认为是对现代计算机技术的挑战性。 组合化学可重复地以共价键形式连接不同的“b u i l d i n gb l o c k s ”，产生大量 分子结构不同的各种化合物。当化学家有了这一技术后，可以用不同的化学试剂 和支架进行固相或液相合成库化合物，直接发现任一个新的靶或优化先导化合 物。分子d o c k i n g 算法，应用核磁共振测定蛋白连接位点图；手性h p l c 进行高 对映体选择性制备；直接光合成蛋白质的同源模型等手段，允许超前的理性设计 指导预期药物的合成。光谱学的方法，包括质谱和红外和核磁共振，已经被应用 到不同水平的组合库合成中。 高通量筛选是受体技术发展的必然趋势。受体技术的评价方法与化学合成策 略的变化是密切相关的。通过组合化学产生大量的化合物及其它可用于实验的化 合物，包括天然产物，在短时期内高通量筛选与之相互刺激。 高通量筛选模型的特点是大规模、自动化，用机器人在9 6 孔或3 8 4 孔等培 养板上进行样品的取样、分装、测试等操作，此方法即可选用根据作用机理而设 计的受体，酶、离子通道和核酸等生物分子作为筛选靶，也可应用细胞毒实验进 行筛选。但不同的是高通量筛选方法可同时处理大量样品，快速提供各化合物的 作用信息，一般情况下高通量筛选方法每天可以处理几百甚至几千个样品，样品 越多越能体现出它的优越性。 本研究所建立的三种生物活性物质的筛选方法也是受体技术的应用。这些方 法分别是，拓扑异构酶作为靶分子的h p l c 府“s 一亲和超滤筛选；抗体作为靶分 子的h p l c m s - - 亲和超滤筛选；血管紧张素i 转换酶作为靶分子的h p l c m s 高通量生物活性筛选。三种方法的共同特点是均采用了高效液相色谱与质谱联用 技术，在完成活性筛选的同时获得化学性质及分子结构方面的信息。在前两种方 法中以生物亲和超滤方法为手段，而设计的筛选方法。它们分别以酶与底物、抗 原与抗体之间存在的亲和性为基础，这种亲和性使酶和抗体在复杂的混合物体系 中能特异性地识别底物或抗原，并发生非共价继的结合。虽然这种结合虽不如共 价键结合力强，但在一定条件下它能形成相对稳定的复合物。采用超滤手段可获 浙江大学博士学位论文 得这些复合物，从而筛选出具有生物活性的化合物。亲和超滤与h p l c m s 相结合， 可在完成活性筛选的同时鉴定活性化合物。而后一种筛选方法虽然也以酶作为 靶，但活性筛选是以底物的含量变化为活性鉴定的标准，同样通过h p l c m s 技术 在获取活性化合物的相关化学性质和分子结构信息。 浙江大学博士学位论文 第二章h p l c m s 法结合拓扑异构酶亲和超滤筛选 癌症是危及人类生命的主要杀手之一。为攻克这一类疾病，抗癌新药的研究一 直是人们关注的焦点。面对每年成千上万个等待筛选的化合物和基因物质，建立合 理的筛选方法、模型，提高筛选质量、速度，发现更多新型的抗癌药物，一直是抗 癌药物研究的热点领域。 抗癌药物筛选与其它药物相似，也分为体内实验和体外实验两大类。体内实验 主要是用移植肿瘤模型进行筛选。一般选用小鼠p 3 8 8 白血病存活试验，去除大量 阴性化合物，而阳性化合物或提取物用四种移植肿瘤模型进一步筛选。四种移植肿 瘤模型是：l 1 2 1 0 淋巴白血病；b 1 6 黑色素瘤；m 5 0 7 6 肉瘤和m x 一1 人乳腺癌。 体外抗肿瘤筛选实验的种类较多，最常见的是体外细胞毒实验法、作用机理筛选模 型和高通量筛选模型等等。体外细胞毒实验是通过检测离体培养癌细胞在被筛样品 加入后的存活率来确定样品的活性程度。此方法主要有四唑盐( m t t ) 比色法、磺 酰罗丹明比色法和染料排斥法等。作用机理的分析( m e c h a n i s - - b a s e da s s a r y ) 是以 人类肿瘤发生的生长过程中相关的酶或受体等作为分子靶来设计的；近年来，随着 新技术特别是分子生物学技术的飞速发展，活性物质筛选有了新的方法高通量 筛选，高通量筛选模型的特点可同时处理大量样品，快速提供各化合物的作用信息， 一般情况下高通量筛选方法每天可以处理几百甚至几千个样品，样品越多越能体现 出它的优越性。值得注意的是高通量筛选方法也必须以成熟的筛选模型作为基础， 因此，建立与肿瘤相关性好、且易于形成高通量筛选的抗肿瘤药物初筛模型，对加 速抗肿瘤新药的开发是非常重要的。 本章所建立的h p l c m s 法结合拓扑异构酶亲和超滤筛选方法，是以酶与底物、 之间存在较强的亲和性为理论基础，这种亲和性可以使它们在复杂的混合物体系中 能特异性地识别对方，并发生非共价键的结合。虽然这种结合不如共价键结合力强， 但在一定条件下能形成相对稳定的复合物。采用超滤手段可获得这些复合物，从而 筛选出具有抗癌活性的化合物。亲和超滤与h p l c m s 相结合，可在活性化合物被 筛选出的同时，获得该化合物结构方面的信息。 浙江大学博士学位论文 本章分别阻拓扑异构酶i 、拓扑异构酶i i 作为靶分子建立筛选模型。由于该方 法集抗癌活性筛选和活性分子鉴定于一体，大大提高了筛选速度和质量，并具有样 品处理量大、便捷、费用低等优点，适用于天然抗肿瘤活性物质的大规模筛选。 浙江大学博士学位论文 1 拓扑异构酶的制备及抗癌活性评价 1 引言 d n a 拓扑异构酶( 简称t o p 0 ) 是一种重要的核酶，能修饰d n a 的拓扑结构”。1 。按 其在d n a 变构作用中瞬间引起的断裂或再结的d n a 单链、双链的不同分为t o p 0i 和 t o p 01 t 。这类酶在d n a 复制及细胞遗传过程中起着非常重要的作用。近年来开发的 许多抗癌新药都是t o p 0 酶抑制剂，特别是t o p 0 的抑制剂。 虽然两种酶在理化特性、催化机制、反应条件及生理功能等方面存在着明显差 异，但其共同的特性是均可以催化d n a 拓扑异构化反应。d n a 的拓扑异构现象是 指d n a 分子在双螺旋的基础上更高层次的结构紧张状态和松弛状态，即超螺旋状 态与解螺旋状态之间的相互转化过程，其中不发生碱基组成或顺序的任何改变。细 胞d n a 的正常代谢包括d n a 复制、转录、重组等遗传过程，都涉及到d n a 这种 空间的动态变化，即d n a 拓扑异构化反应。d n a 拓扑异构酶则是调节d n a 拓扑 异构动态变化的关键性核酶。近年来，利用该酶的这一特性，以其抑制剂作为抗菌、 抗病毒、抗肿瘤药物的研究日趋活跃。 许多抗肿瘤药物是通过干扰d n a 复制、转录、重组及基因的表达等发挥抗肿 瘤作用的。而调节d n a 拓扑异构化反应，参与d n a 复制、转录、重组等遗传过程 正是t o p o 的主要生物学作用。因此，两者必然具有重要的联系。大量研究证明， 许多临床上使用的t o p o 抑制剂影响癌细胞d n a 复制、转录、重组，t o p o 是肿瘤治 疗的重要靶点。 1 1 拓扑异构酶的结构特征与其它酶抑制剂一样，t o p o 抑制剂也有一定的结构 要求。以t o p o 为靶点的抗肿瘤药物可分为t o p oi 抑制剂和t o p oi i 抑制剂。根据与 d n a 分子的相互作用，这些药物又可分为d n a 嵌入剂和非嵌入剂。它们的共同特 征是具有多环平面结构。通过计算机模拟及晶体x 一衍射证明，这些化合物分子都 具有两个功能区：一是与d n a 结合的部位，嵌入剂的主要特征是其分子中多环芳 烃的平面结构能插入d n a 碱基对之间，而非嵌入剂与d n a 的结合能力则较弱。二 浙江大学博士学位论文 是与酶相互作用的位点，如v m 一2 6 分子中的噻吩基( 3 一硫戊基) 具有与酶通过 非水键而相互作用的可能。并且事实证明，拓扑昴构酶抑制剂作用于共同的酶位点。 1 2 拓扑异构酶的作用机理t o p o 抑制剂的抗肿瘤药物机制并非是直接抑制该 酶的活性，而是通过促进t o p o 介导的d n a 链断裂，即通过阻断酶与d n a 反应的 最后一步单链或双链d n a 在切口部位的重接而实现的。正常情况下，t o p o i 或t o p o i i 切开单链或双链d n a 后，酶与d n a 所形成的是暂时性易解离复合物，在d n a 链过渡过程中完成切口的重接。具有中毒效应的抑制剂的作用在于使这种易解离复 合物趋于稳定和僵化，进而使催化动力学方程平衡向右移动，导致d n a 单链或双 链断裂。就是t o p oi 第7 2 3 位的酪氨酸与单链d n a 3 端的磷酸基，或是使t o p o i i 第8 0 4 位酪氨酸与双链d n a5 端的磷酸基形成共价键。抑制剂的作用实际上是使 细胞内正常的t o p o 转变为导致d n a 链断裂的致伤物。嵌入剂系通过其分子中多环 结构嵌入到t o p o 与d n a 结合部位的双链之间，从而干扰酶将d n a 断端重接的正 常功能，并进一一步造成d n a 链断裂损伤。非嵌入剂则是直接作用于t o p o 或是仅仅 与d n a 中的一条链结合以影响酶功能。 此外，t o p o 抑制剂还有阻断基因转录和干扰癌基因表达的作用。 新近发现的t o p o l i 的一些另类的抑制剂，如阿柔比星( a c l a r u b i c i n ) 、磷曲星 f f o s t r i e c i n ) 等，它们非但不会干扰酶与d n a 形成复合物或造成d n a 链断裂，相反 对其他嵌入剂产生的这类效应具有拮抗作用。推测这些药可能是在更早的阶段影响 了t o p o l l 的催化过程。 2 拓扑异构酶来源 2 1t o p o i 和t o p o i i 型混合酶的实验室制备j 取艾氏( e h r l i c h ) 腹水癌细胞( 约 3 0 m l 团块) ，加入6 0 m l 冷冻的酶提取液( 5 0 m m o l lt r i s h c lp h 7 5 ，l m m o l l e d t a ，l m m o l lp m s f ，1 0 m m o l l 巯基乙醇利1 m m o l ln a c l ) 做成细胞悬液。 以下步骤在4 冰浴或冰库中进行。分次用y q 一3 型电动匀浆器破碎细胞 ( 1 0 0 0 0 r p m 3 m i n ) 。匀浆液放入5 0 0 m l 烧杯中，分步加入9 0 m l 1 2 聚乙二醇 ( p o l y e t h y l e n e g l y c o l ，p e g ) 缓冲液( 即含1 2 p e g 的酶提取液，分子量为8 0 0 0 - - 浙江大学博士学位论文 1 0 0 0 0 ) 。用玻棒缓慢搅拌3 0 m i n 。离心8 0 0 0 r p m 5 m i n ，取上清液1 8 0 m l ( 内含t o p o i 和t o p oi i ) ，缓慢滴入预先用1 0 0 m l6 p e g 缓冲液( 含6 p e g 的酶提取液) 平 衡的羟基磷灰石( h y d r o x y l a p a t i t e ) 层析柱中( 3 0 m 1 ) 。用1 0 0m l 缓冲液a ( o 2 m o l l 磷酸钾p h7 0 ，1 0 甘油，1 0 m m o l l2 - 巯基乙醇，l m m o l l p m s f 和l m m o l l e d t a ) 洗涤层析柱。用5 0 r n l 缓冲液a 和5 0 m l 缓冲液b ( 0 7 m m o | l 磷酸钾代替o 2 m m o l l 磷酸钾，其余成分同缓冲液a ) 对层析柱作线性梯度洗脱，用分步收集器收集样品， 测定2 8 0 ，2 6 0 h m 处的吸光度。测定超螺旋质粒d n a 松弛反应活力，合并具活性部分， 进行b i o r e x 7 0 柱色谱，用2 0 0 8 0 0 m m o l lb c 缓冲液洗脱，如前法收集具活力部 分，低温保存备用。用b r a d f o r d 法测酶液的蛋白质浓度。 2 2t o p o i 或t o p o l i 型酶的采购t o p o i 或t o p o i i 型酶也可购自s i g m a 公司购买。 3 拓扑异构酶i 活性测定及拓扑异构酶i 抑制剂活性评价 拓扑异构酶i 活力定义是在下述反应条件下使0 4pg 超螺旋p b r 。d n a 完全被 解旋所需的酶量为l 酶活力单位( i u ) 。 拓扑异构酶i 活性的测定方法与拓扑异构酶i 抑制剂的活性评价方法基本相同 拓扑异构酶i 抑制剂的抗癌活性是通过对超螺旋p b r 。d n a 解旋能力进行评价。 p b r 3 2 2 超螺旋d n a 作为i 型t o p o 酶的底物，通过药物作用导致解旋反应。 ( 1 ) 药物配制：将药物溶解于o 1 m o l l h e p e s 缓冲液或含1 0 2 0 ( v v ) 的二 甲基亚砜中或其他助溶剂中，其他8 0 9 0 ( v ) 为o 1 m o l l h e p e s 缓冲液， p h6 7 ，使药物的最终浓度为o 2 0 4 m m o l l 。 ( 2 ) 反应液：反应液中体积2 0 皿，含t r i s h c lp h7 - 8 ，k c l6 0 m m o l l ， m g c l 2 1 0 m m o l l ，e d t ao 5 m m o l l ，b s a3 m g m l ，p b r 3 2 2d n a 0 4l ag ，1 单位( u ) t o p oi 。 ( 3 ) 实验：将微量试管分组为加药管、不加药管、已知管( 喜树碱) 对照管和标 准管( 含不同浓度的酶。根据所用酶的活性定出第1 管酶的稀释度，然后依 次成倍递减至第4 管，第5 管为不含酶的空白管) 。除空白对照管外将其余 全部管中均加入酶液( 浓度同标准管第1 管的浓度) 。放3 7 。c 温水浴中反应 1 0 m i n ，加5ul 反应终止液( 5 s d s ，e d t a5 0m m o l l ，2 0 甘油，0 2 5 m g m l ) 浙江大学博士学位论文 溴酚蓝终止反应。反应液用琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液含t r i s 一 。p 0 ； 8 0r a r n o l l ，e d t a8m m o l lp h8 0 。电泳完毕用溴化乙啶染色3 0m i n ， 紫外灯下观察，照相。) 4 拓扑异构酶i i 活性测定及拓扑异构酶i i 抑制剂活性评价 拓扑异构酶i i 活力定义是指在下述反应条件下，3 0 m i n 内可使5 0 o 2 6 船超 螺旋d n a 转变为解旋的d n a 的为一个酶活力单位。 拓扑异构酶i i 活性的测定方法与拓扑异构酶i i 抑制剂的活性评价方法基本相同 拓扑异构酶i i 抑制剂的抗癌活性是通过对p 4 超螺旋d n a 解旋能力进行评价。 p 。超螺旋d n a 作为1 i 型拓扑异构酶的底物，通过药物的作用导致d n a 解旋反应。 ( 1 ) 药物制备：将药物溶解于o 1 m o l l h e p e s 缓冲液或含1 0 2 0 ( v v ) 的二甲基亚砜中或其他助溶剂中，其他8 0 9 0 ( v ) 为o 1 m o l l h e p e s 缓冲液，p h 6 7 ，使药物的最终浓度为0 2 0 4 m m o l l 。 ( 2 ) 反应液：反应液体积为2 4 # 1 ，其中包含5 0 0 m m o i l h e p e sp h 6 7 ，5 0 m m o l l k c i ，1 0 0 m m o l ln a c i ，0 ! m m o l le d t a 、1 0 m m o l lm g c l 2 ，o 1 m m o l la t p , 5 0t t g m b s a ，0 2 6 腿p 4 d n a 。 ( 3 ) 实验将微量试管分组为：加药管，不加药对照管，已知药( v p 一1 6 ) 对 照管和标准管。除空白对照管外将其余全部管中均加入酶液( 浓度同标准管第1 管 的浓度) ，放恒温水浴3 0 r a i n 即刻用终止液停止反应( 终止液：2 s o d i u md o d e c y l ， 2 0 甘油，o 0 5 溴酚蓝) 。 将以上各管的样本加到1 琼脂糖凝胶上在电泳缓冲液( 9 0 m m o l l i r i s b o d ca c i d p h 8 3 和2 5 m m o l le d t a ) 中进行电泳。 电泳结束后，将凝胶膜用溴乙啶( e t h i d i u mb r o m i d e ) 染色( 3 0 4 0 m i n ) ，此时用 紫外灯照射则d n a 可显示荧光带。用荧光带的长度与各标准管进行对比，亦可获 得半定量的结果，一个酶单位是指在3 0 r a i n 内可使5 0 o 2 6 肛g 超螺旋d n a 转变 为解旋的d n a ，每个测定是用两个酶单位。 浙江大学博士学位论文 2 拓扑异构酶作为靶分子的h p l c m s - - 一酶亲和超滤筛选模型 1 筛选模型的建立 h p l c m s 法拓扑异构酶亲和超滤筛选的操作步骤如图2 1 所示。整个过程可概括为 以下六部分： 一、( s t e pi ) 孵育：酶与被筛选物质混合，孵育3 0m i n ，使酶与具有抗癌活性的成 分产生特异性地结合形成复合物：而无活性的成分与酶无特异的亲和性，因此 不能形成复合物。 二、( s t e pi i ) 初次超滤：超滤使复合物与未被酶结合的小分予物质分离，收集膜上 的大分子复合物。 三、( s t e pi i i ) 二次超滤：用缓冲溶液洗涤膜上的大分子复合物，再次超滤，去除复 合物表面非特异结合的小分子物质。 凹、( s t e p1 v ) 释放活性分子：与酶结合的活性成分，可通过加入蛋白变性剂使之从 复合体中游离出来。 五、( s t e pv ) 第三次超滤：超滤后收集滤液，得到具有活性的化合物。 六、( s t e p v i ) 分析、鉴定：将滤液直接用于h p l c m s 分析，根据活性物质的色谱 行为、光谱性质及质谱特征对被筛选出的活性成分进行鉴定。 浙江大学博士学位论文 2 拓扑异构i 作为靶的h p l c 碓s 一亲和超滤筛选模型 2 1 结果与讨论 2 1 1 流动相中修饰剂的选择在流动相中加入酸碱修饰剂，可促进被分析物 的离子化，增强响应信号，提高检测的灵敏度。对于喜树碱、硝基喜树碱及羟基喜 树碱，当流动相( 乙腈水) 中不加任何修饰剂时，其正、负离子总离子流( t i c ) 信号都较弱，而加入醋酸或醋酸铵，正、负离子总离子流( t i c ) 信号都有所提高， 而正离予信号提高的幅度大于负离子信号，因此，采用正离子检测方式。 结果表明( 见图2 1 ) ，在流动相中加入h a c ，对总离子流信号的增强有很强的作 用，但加入h a c 的量不能过大，否则，信号反而降低，最佳醋酸加入量为l 。 2 1 2 锥孔电压( c o n ev o l t a g e ) 的选择锥孔电压不仅直接关系到碎片裂解的方 式，而且对总离子流的强度也有影响。本实验采用正离子检测方式( 见图2 2 ) ，检测 到 m + h r 和【m + n a 】+ 两种加合离子，当锥孔电压由1 5 v 升到7 5 v 时，碎片离子增多， t 5 v 时，有二聚体加钠的离子峰出现。当电压较小时，只出现 m 十h 】+ ；电压大于3 5 v 时，同时出现 m 十h + 3 1 1 m + n a + ：当