（微生物学专业论文）家蚕肠道微生态产脂肪细菌的分离鉴定与差异性比较.pdf

m a j o r f i e l d a d v i s o r c a n d i d a t e m i c r o b i o l o g y a p p l i e dm i c r o b i o l o g y 一 一一 p r o f w a ny o n g ji f e n gw e i c h o n g q i n g c h i n a m a y , 2 0 1 1 及取得的 文中已加 朋友、同 学位论文作者：汤乍 签字日期 训年乡月多。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：囱不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：汤传 导师签名：孑 垃 签字日期：纱7 f 年岁月；o 日签字日期： 7 0 0 年| 【月7 日 1 3 脂肪酶产生菌的筛选及酶活测定的方法9 第二章引言。1 1 2 1 研究背景及意义1 1 2 2 技术路线1 3 第三章材料与方法1 4 3 1 实验材料1 4 3 1 1 供试昆虫14 3 1 2 培养基1 4 3 1 3 对照菌株1 4 3 1 4 主要试剂及配方一1 4 3 1 5 主要仪器1 6 3 2 实验方法1 6 3 2 1 取材16 3 2 2 家蚕肠道优势菌的分离纯化l7 3 2 3 家蚕肠道优势菌的形态学及生理生化鉴定1 7 3 2 4 家蚕肠道优势菌的分子生物学鉴定2 0 3 2 5 脂肪酶产生菌的筛选2 0 3 2 6 脂肪酶产生菌生长曲线的测定2 1 3 2 7 脂肪酶产生菌酶活力测定2 1 第四章结果与分析2 2 4 1 家蚕肠道优势菌的分离2 2 4 2 家蚕肠道优势菌的初步鉴定2 3 4 3 家蚕肠道优势菌的分子生物学鉴定2 5 西南大学硕士学位论文目录 4 3 1 优势菌的1 6 sr r n a 基因扩增2 5 4 3 2 优势菌的序列比对及系统发育分析。2 8 4 4 脂肪酶产生菌的筛选3 7 4 5 脂肪酶产生菌的鉴定3 7 4 6 脂肪酶产生菌生长曲线的测定4 2 4 7 脂肪酶产生菌酶活力的测定4 3 第五章小结与讨论4 4 5 1 家蚕肠道产脂肪酶的细菌4 4 5 2 家蚕肠道脂肪酶产生菌生长曲线及酶活测定结果4 5 5 3 不同饲料饲养家蚕其肠道脂肪酶产生菌的差异性。4 5 参考文献4 6 致谢5 4 发表论文、专利及参研课题5 5 对于哺乳动物，昆虫肠道微生物功能的研究相对较慢，目前较为深入的研究仅集中在一些特 殊的类群如白蚁和沙漠蝗。这些微生物及其代谢产物对昆虫宿主的生长发育具有重要影响， 如降解纤维素、生成甲烷、耗氢将c 0 2 还原为乙酸盐、固氮、维持较低的氧化还原势能，同 时在抵抗病原微生物的侵袭与定植中也起着重要作用。然而，对其它种类昆虫肠道微生物功 能的研究则较少。鳞翅目昆虫作为昆虫纲的一个重要类群，目前仅有一些研究表明鳞翅目昆 虫肠道中栖息着大量的微生物菌群并且这些微生物可能产生消化酶为宿主提供营养物质。 家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物，并且是一类具有重要经济价值的泌丝昆虫。家蚕属于寡 食性昆虫，主要以桑叶为食，但柘叶也可以作为其代用饲料。最近研究发现，4 龄起蚕用柘叶 替代桑叶饲养家蚕，家蚕不但生长发育缓慢，而且极易感染家蚕核型多角体病毒( b m m v ) 。 但是，有研究报道指出家蚕消化液中的脂肪酶具有较强的抗b m n p v 活性。因此，本试验用柘 叶饲养家蚕来构建b m n p v 敏感模型，采用分子生物学方法和常规传统方法相结合的鉴定技 术，以探讨b m n p v 敏感和不敏感家蚕其肠道优势菌、特别是脂肪酶产生菌的多样性和差异性， 为进一步研究和探讨家蚕抗病性与其肠道脂肪酶产生菌的关系奠定基础。 试验结果如下： 1 通过纯培养分离方法从桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共获得5 6 株优势菌。这些优势菌按 照菌落形态和菌体特征可分为1 2 类，其中桑叶饲养家蚕肠道中的优势菌表型有1 0 类，柘叶 饲养家蚕肠道中的优势菌表型有7 类，它们共有的优势菌表型有4 类。 2 通过形态学、生理生化、1 6 sr r n a 基因序列测定及系统发育分析，这1 2 类优势菌分 别属于气单胞菌属( a e r o m o n a s ) 、短杆菌属( b r e v i b a e t e r i u m ) 、棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、克雷 伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 、柠檬酸杆菌属( c i t r o b a c t e r ) 、土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、寡养单胞菌属 ( s t e n o t r o p h o m o n a s ) 、短波单胞杆菌属( b r e v u n d i m o n a s ) 和芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 。其中葡萄球菌属 ( s t a p h y l o c o c c u s ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、寡养单胞菌属( s t e n o t r o p h o m o n a s ) 甭t l 短波单胞杆菌属 ( b r e v u n d i m o n a s ) 4 个类型是桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共有的优势菌群；气单胞菌属 似e r o m o n a s ) 、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u r a ) 、克雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 西南大学硕士学位论文摘要 和柠檬酸杆菌属( c i t r o b a c t e r ) 5 个类型是桑叶饲养家蚕肠道中特有的优势菌群；柘叶饲养家蚕 肠道中特有的优势菌群仅有两类，分别是土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 和假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) ；而芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 只是4 龄家蚕肠道中共有的优势茵类型。 3 通过在罗丹明b 琼脂平板上筛选5 6 株优势菌，从桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共获得9 株产脂肪酶的菌株。这9 株脂肪酶产生菌经鉴定分属于6 个菌属，分别是芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、 短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、棒杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 、克雷伯 氏菌属( k l e b s i e l l a ) 和寡养单胞菌属( s t e n o t r o p h o m o n a s ) 。其中寡养单胞菌属( s t e n o t r o p h o m o n a s ) 是桑叶与柘叶饲养家蚕肠道中共有的脂肪酶产生菌，其它5 个菌属仅在桑叶饲养家蚕肠道中 存在。结果显示，不同饲料饲养家蚕其肠道脂肪酶产生菌的多样性存在较大差异，柘叶饲养 家蚕其肠道脂肪酶产生菌的类型远不如桑叶饲养家蚕肠道中的丰富。 4 家蚕肠道脂肪酶产生菌通过在体外发酵培养4 8h 左右达到最大菌体浓度。然而，它们 的最大菌体浓度存在较大差异，其中s w 4 1 的最大菌体浓度最高，s w 7 2 的最大菌体浓度最低。 此外，脂肪酶产生菌在其细胞浓度达到最大值时，所产脂肪酶酶活力也达到最高值。其中s w 4 1 的最大总酶活力最高，为2 4 9 5 9 肌；s w 5 4 的最大总酶活力最低，为7 7 4 6u l 。 关键词：桑叶柘叶家蚕肠道脂肪酶产生菌鉴定 n 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t ，j l =,i i l 量曼暮曼曼量量鼍詈置量鼍皇蔓蔓皇曼鼍寡舅吕量皇曼曼曼曼曼量鼍量皇量舅曼曼曼曼皇量墨量量量曼皇舅曼皇墨量皇曼皇曼皇曼基曼 d i f f e r e n tc o m p a r i s o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f l i p a s e p r o d u c i n gb a c t e 。t h ed l k w o r m b a c t e r i ai nt l l es i l k w o r m - - i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a c a n d i d a t e ：f c n gw e i a d v i s o r ：p r o f w a ny o n g ji a b s t r a c t i n s e c ti n t e s t i n a ls y s t e mi sac h a n g e f u le n v i r o n m e n tf o l l o w e db yi n t a k i n gf o o d , d i g e s t i o na n d e x c r e t i o n t h eg u t sh a r b o ra b u n d a n tm i c r o o r g a n i s m sw h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h eh o s t s n u t r i t i o n , d e v e l o p m e n t , r e p r o d u c t i o n , a n dr e s i s t a n c et op a t h o g e n s c o m p a r e dw i t hm a m m a l s ，t h e f u n c t i o n so fm i c r o o r g a n i s m si ni n s e c tg u t sh a v eb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l yo n l yi ns e v e r a ls y s t e m s s u c ha st e r m i t e sa n dd e s e r tl o c u s t s s o m es p e c i f i cr o l e so fm i c r o o r g a n i s m si nt h e s ei n s e c tg u t sh a v e b e e nd i s c l o s e d ，i n c l u d i n gl i g n o c e l l u l o s ed i g e s t i o n , m e t h a n o g e n e s i s ，a c e t o g e n e s i sf r o mh 2a n dc 0 2 ， n i t r o g e nf m a t i o n , m a i n t e n a n c eo fal o wr e d o xp o t e n t i a la n dp r e v e n t i o no fe n t r yo ff o r e i g n m i c r o o r g a n i s m s h o w e v e r , r e l a t i v e l yl i t t l e i sk n o w na b o u tt h er o l e so fm i c r o o r g a n i s m si no t h e r i n s e c tg r o u p s l e p i d o p t c r ai sa ni m p o r t a n tg r o u po fi n s e c t a , af e ws t u d i e sh a v ei n d i c a t e dt h a tt h e l e p i d o p t e r sh a r b o rg u t b a e l g f i aa n dt h ep o s s i b i l i t yt h a tm i c r o o r g a n i s m sp r o d u c es o m eo ft h e d i g e s t i v ee n z y m e st op r o v i d ee s s e n t i a ln u t r i e n t so ra s s i s ti ni m p o r t a n tb i o c h e m i c a lf u n c t i o nr e l a t e d t oh o s tf o o di n g e s t i o n t h es i l k w o r m ，b o m b y xm o r il ( l e p i d o p t e r a ：b o m b y c i d a e ) ，a sam o d e lf o rl e p i d o p t e r a , i sa n a g r i c u l t u r a l l yi m p o r t a n ti n s e c tf o rs i l kp r o d u c t i o n t h es i l k w o r m ，a no l i g o p h a g o u si n s e c t , m a i n l y f e e d so nm u l b e r r yl e a v e s ，b u tt r i c u s p i dc u d r a n i a ( m o r a c e a e ) l e a v e sc a na l s oa c ta st h ef o r a g eo ft h e l a r v a e r e c e n ts t u d i e sh a v ef o u n dt h a tt h es i l k w o r ml a r v a en o to n l yg r o wr e t a r d e db u ta l s oa r e s u s c e p t i b l et ob o m b y xm o r in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ( b m n p v ) w h e nr e a r e dw i t ht r i c u s p i dc u d r a n l a l e a v e s h o w e v e r , af e ws t u d i e sh a v ep o i n t e do u tt h a tt h el i p a s e 咖s i l k w o r ml a r v a la l i m e n t a r y c a n a ls h o w ss t r o n ga n t i v i m la c t i v i t ya g a i n s tb m n p v t h e r e f o r e ，i nt h i ss t u d y , w eu s e dt r i c u s p i d c u d r a n i al e a v e st of e e ds i l k w o r mt oc o n s t r u c tab m n p vs u s c e p t i b l em o d e la n da d o p t e dt h e i d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g yc o m b i n e dm o l e c u l a rb i o l o g yw i t ht r a d i t i o n a lb a c t e r i o l o g i c a lm e t h o d t h e o b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st oe x p l o r et h ed i v e r s i t i e sa n dd i f f e r e n c e so fd o m i n a n ti n t e s t i n a lb a c t e r i a , e s p e c i a l l yt h el i p a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i ab c t w e e t lt h eb m n p vs u s c e p t i b l ea n dn o n - s u s c e p t i b l e s i l k w o r m t h e s eu n d e r s t a n d i n go fd i e t - d e r i v e di n t e s t i n a lb a c t e r i a lc o m m u n i t ym a yy i e l di n s i g h ti n t o t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eg u tb a c t e r i aa n dd i s e a s er e s i s t a n c eo ft h es i l k w o r m i i i s t a p h y l o c o c c u s ，e n t e r o b a c t e r , s t e n o t r o p h o m o n a s ，b r e v u n d i m o n a sa n db a c i l l u s f o u rp h y l o t y p e so f t h ei s o l a t e dd o m i n a n tb a c t e r i a i n c l u d i n gs t a p h y l o c o c c u s ，e n t e r o b a c t e r , s t e n o t r o p h o m o n a s ， b r e v u n d i m o n a s ，w e r ec o m m o ni nt h ei n t e s t i n eo f b o t ht h es i l k w o r ml a r v a ef e do nd i f f e r e n tf o r a g e t h e r ew e r ef i v ep h y l o t y p e si n c l u d i n ga e r o m o n a s ，b r e v i b a c t e r i u m ，c o r y n e b a c t e r i u m ，k l e b s i e l l aa n d c i t r o b a c t e ro n l ye x i s t e di nt h ei n t e s t i n eo ft h el a r v a er e a r e dw i t hm u l b e r r yl e a v e s w h i l et h el a r v a e f e dw i t ht r i c u s p i dc u d r a n i al e a v e sp o s s e s s e do t h e rt w od i f f e r e n t g e n u s e s ，a g r o b a c t e r i u ma n d p s e u d o m o n a s b e s i d e s ，b a c i l l u sw a sc o i t l m o no n l yi nt h ei n t e s t i n eo f t h ef o u r t h i n s t a rs i l k w o r m 3 a c c o r d i n gt os e r n i n gf i 衄- s i xd o m i n a n ts t r a i n s 0 1 1r h o d a m i n eba g a rp l a t e ，n i n e l i p a s e - p r o d u c i n g b a c t e r i aw e r eo b t a i n e da n dc l a s s i f i e di n t os i x g e n e r ai n c l u d i n gb a c i l l u s ， b r e v i b a c t e r i u m ，c o r y n e b a c t e r i u m ，s t a p h y l o c o c c u s ，k l e b s i e l l aa n ds t e n o t r o p h o m o n a s t h ec o m m o n b a c t e r i u mb e l o n g e dt og e n u ss t e n o t r o p h o m o n a s ，a n dt h eo t h e rb a c t e r i ao n l ye x i s t e di nt h ei n t e s t i n e o ft h es i l k w o r ml a l w a er e a r e dw i t hm u l b e r r yl e a v e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i v e r s i t yo f l i p a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i ah a das i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew h e nt h es i l k w o r ml a r v a ew e r er e a r e d0 1 1 d i f f e r e n tf o r a g e ，t h ed i v e r s i t yo f l i p a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i af r o mt h ei n t e s t i n eo f t h et r i c u s p i dc u d r a n i a l e a v e sf e e d i n gs i l k w o r mw a sc o n s i d e r a b l yd e f i c i e n tc o m p a r e dw i t ht h a to ft h el a r v a er e a r e dw i t h m u l b e r r yl e a v e s 4 t h em a x i m u mc e l ld e n s i t yo fl i p a s e p r o d u c i n gb a c t e r i aw a so b s e r v e da ta b o u t4 8ho f f e r m e n t a t i o n h o w e v e r , t h em a x i m u mb a c t e r i a ld e n s i t ys h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nw h i c hs t r a i n s w 41h a dt h em a x i m u m y i e l d ，w h e r e a ss t r a i ns w 7 2h a dt h em i n i m u my i e l d b e s i d e s ，l i p a s ea c t i v i t y r e a c h e dt h em a x i m u ma f t e r4 8ho ff e r m e n t a t i o n nv i t r o a tt h e i rm a x i m u mb a c t e r i a ld e n s i t y , s t r a i n s w 4 1s h o w e dh i g h e s tl i p a s ea c t i v i t yw h i c hw a s2 4 9 5 9u 几，b u ts t r a i ns w 5 4w a st h el o w e s tt h a t t h ea c t i v i t yw a so n l y7 7 4 6u l k e yw o r d s ：m u l b e r r yl e a f t r i c u s p i dc u d r a n i al e a f s i l k w o r mi n t e s t i n e l i p a s e - p r o d u e i n gb a c t e r i u m c h a r a c t e r i z a t i o n i v 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 昆虫肠道微生物的研究进展 昆虫是地球上最大的未得到充分利用的生物资源，其进化历史比较悠久，分 布广，食性杂，与生存环境关系密切，其中许多昆虫与其体表或肠道细胞中的微 生物建立了共生关系。这些微生物经过长期的进化在宿主体内形成特定的区域， 并与昆虫的营养生理活动等有着密切的联系，一方面昆虫肠道的微环境影响其群 落结构及代谢活动，另一方面它们在很大程度上也影响着昆虫的生命活动【l 】。昆虫 肠道系统是一个伴随取食、消化、排泄等活动而多变的微环境，其中寄居着大量 的微生物，这些微生物对昆虫的生长发育有着重要作用，如参与昆虫的食物消化、 营养吸收、生殖 2 - 4 与信息素的合成【5 一，同时在抵抗病原微生物的侵入与定植、促 进免疫系统的功能等方面也具有重要作用f 7 引。早期，对昆虫与肠道微生物关系的 研究多集中于昆虫病原微生物及其应用等方面，而以微生态学理论为指导，以昆 虫营养生理为中心而进行的昆虫肠道微生物及其功能等方面的研究较少。昆虫肠 道微生物的研究，不仅有利于昆虫资源的开发和合理利用，而且有利于从昆虫肠 道中获得特殊功能的细菌资源，用于抑制病原菌的扩散和传播，从而减少疾病的 发生。 1 1 1 昆虫肠道菌群的一些基本概念 1 1 1 1 常住菌群和过路菌群 正常菌群是指在长期的历史进化过程中形成的寄居在昆虫肠道并且通常情况 下对宿主无害或有益的微生物种群。正常菌群分为原籍茵群与外籍菌群两类。原 籍菌群又称固有菌群或常住菌群，指在动物肠道中占有特定区域的微生物。外籍 菌群又称过路菌群，指那些不能在正常动物肠道内定植且长期生存的微生物。实 际上，由于昆虫种类丰富多样，并且其肠道微生物经常处于动态变化之中，因此昆 虫肠道中的常住茵群一般很难确定。一般情况下，昆虫肠道常住菌群增长的速度 等于甚至超过肠道对它们的排出【9 】，而过路菌群受环境影响很大，经常处于变化状 态。常住菌群与宿主细胞接触越多，其对宿主的营养和保护等生理作用越明显。 而过路菌群一般情况下对宿主是无害的，但在某些特殊情况下也可能对宿主具有 致病作用，而且它们与宿主细胞接触愈多，对宿主的侵袭和危害愈大f l o 1 1 】。 1 1 1 2 益生菌和病原菌 益生菌是指通过调节宿主肠道微生态平衡从而提高宿主健康水平和健康状态 的活菌制剂及其代谢产物。动物体内的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、 光合细菌等【1 2 】。病原菌又称病原微生物，是指能够侵入宿主体内引起宿主感染和 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 致病的微生物，主要有细菌、真菌、病毒等。在哺乳动物( 包括人) 的肠道菌群 里，益生菌和病原菌的划分非常清楚。而在昆虫肠道的微生物菌群中，由于不同 种类的昆虫其优势菌群是有差异的，因此并没有明确指出哪些类群是病原菌，哪 些类群是益生茵。目前己知的昆虫病原菌有苏云金芽孢杆菌、发光杆菌、嗜线虫 致病杆菌等，这些病原菌被广泛用于农林害虫的防治。 1 1 1 3 胞内共生与胞外共生 昆虫与其肠道共生菌之间关系比较密切，在长期的进化过程中它们相互依赖， 相互影响。昆虫为共生微生物提供稳定的生存环境和生长发育所需的营养物质， 而这些共生菌则为宿主合成食物中缺乏的营养成分以供宿主食用【l 引。昆虫体内的 共生微生物按其存在部位的不同可分为两类，即胞内共生微生物和胞外共生微生 物。胞内共生是指共生菌生活在昆虫体内特定的细胞中，与宿主一起共同进化并 为宿主提供营养物质【1 4 】，例如蚜虫体内的巴克纳氏菌存在于其血腔的含菌细胞中 1 5 1 。胞外共生是指细菌附着于肠腔内原虫细胞壁上和肠壁细胞的内部，如豌豆蚜 a c y r t h o s i p h o np i s u m 体内的欧文氏菌【1 6 】。 1 1 2 昆虫肠道微生物研究现状 昆虫种类丰富，其肠道处于一个可变的动态环境，因此肠道微生物也丰富多 样。相对于哺乳动物，昆虫肠道微生物多样性的研究相对缓慢，目前国内外较为深 入的研究仅集中在一些特殊的类群如白蚁【1 7 a $ 、蚜虫【1 9 2 川和重要农业害虫沙漠蝗 【4 】。在国内，昆虫肠道微生物领域的研究更是薄弱，目前仅对具有重要经济价值的 家蚕肠道微生物进行了较为全面的研究，而对其他种类昆虫肠道微生物的研究则 较少。 主要生活在木质材料上的等翅目昆虫白蚁其肠道中有大量的细菌存在，它们 大多数为兼性厌氧菌，有的甚至是严格好氧菌，包括肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) ，葡 萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) ，柠檬酸细菌属( c i t r o b a c t e r ) ，链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 等 1 2 1 2 2 。白蚁肠道的优势菌有拟杆菌门b a c t e r o i d e t e s 、螺旋体门s p i r o c h a e t e s 、厚壁 菌门f i r m i c u t e s ( 其中梭菌目c l o s t r i d i a l e s 占优势) 及变形菌门p r o t e o b a e t e r i a 的细菌 【2 3 也5 1 。白蚁肠道中的优势菌与其所共生的宿主在种上有很大的特异性。在同翅目 昆虫中，蚜虫肠道中的变形菌门是其常住菌群f 2 明；斑衣蜡蝉肠道中存在4 个细菌 菌株，它们都为兼性厌氧芽孢杆菌【2 6 1 ；日本龟蜡蚧雌成虫肠道中存在5 个细菌菌 株，分别是短状杆菌属、芽孢杆菌属、纤维单胞菌属、明串球菌属和微球菌属【2 7 1 。 直翅目中，以植物叶片或茎秆为食的沙漠蝗其肠道细菌主要有肠杆菌属 e n t e r o b a c t e r 、克雷伯氏菌属k l e b s i e l l a 、葡萄球菌属s t a p h y l o c o c c u s 等，其中变形 菌门肠杆菌属e n t e r o b a c t e r 为其优势菌【4 】。此外，张伟等1 2 8 】从鞘翅目昆虫桑粒肩天 2 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 牛中肠分离出2 1 种细菌，它们分属1 3 个不同的菌属，其中优势菌为葡萄球菌属。 家蚕作为一种重要的经济昆虫，对其肠道微生物的研究始于2 0 世纪6 0 年代， 当时日本学者河北俊彦、潼泽义郎、饭冢敏彦等【2 9 - 3 i 】仅对家蚕肠道细菌性病原菌 有过一些研究报道。而在国内，近年来很多研究工作者对其肠道微生物进行了大 量研究。马文石等【3 2 】对需氧菌与柞蚕软化病的发生关系进行了研究。孙雪奇等【3 3 】 研究了家蚕肠道好氧及部分兼性厌氧微生物，并且模拟家蚕肠道微生态结构把菌 体制成微生态制剂来达到增强肠道对营养物质的吸收和蚕体对疾病的抗性的目 的。李蒙英等瞰】对现行二化性家蚕品种5 龄家蚕肠道中的细菌进行了调查，其中葡 萄球菌属和阴沟肠杆菌属为4 个家蚕品种共有的优势菌。易发平等p 5 】研究了家蚕不 同蚕期、不同龄期间肠道好氧微生物种群构成及变化，指出春蚕肠道好氧菌比秋 蚕的多，春蚕肠道中除了秋蚕所具有的微球菌科菌和芽孢杆菌科菌外，还具有肠 杆菌科茵，而人工饲料育家蚕肠道好氧菌仅以芽孢杆菌科菌为主。张剑飞等【3 6 】指 出4 、5 龄家蚕肠道优势菌为微球菌属和芽孢杆菌属。袁志辉等【3 7 】采用非培养法和 传统纯培养法相结合的方法从5 龄家蚕肠道中分离到6 种主要的细菌，分别是节杆 菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、大肠杆菌属( e s c h e r i c h i a ) 、芽胞杆菌 属( b a c i l l u s ) 、葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 和假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 。田贞华等【3 s 1 从4 龄家蚕肠道分离出1 4 种不同类型的细菌，揭示了家蚕肠道细菌种群的多样性。 相辉等【3 9 】调查了两个家蚕品系其肠道细菌群落的多样性并指出肠球菌属 ( e n t e r o c o c c u s ) 和栖热菌属( t h e r m u s ) 是两个家蚕品系肠道中的优势菌群。向芸庆等 例分别用桑叶与柘叶饲养家蚕，在4 、5 龄家蚕肠道中共获得1 2 类优势菌群，这些 优势菌主要以革兰氏阴性杆菌为主。 1 1 3 昆虫肠道微生物的作用 1 1 3 1 参与代谢，提供营养物质 肠道微生物对昆虫的营养作用是指肠道微生物直接或间接地为宿主提供营养 物质，从而促进宿主的生长发育的作用。肠道微生物的营养贡献包括：对大分子 难消化碳源物质的降解；促进碳氮营养物质的吸收；提供维生素、微量元素等。 在自然界中，昆虫是少数可以消化食物中的纤维素的动物类群之一。昆虫消 化纤维素的机制相当复杂，许多昆虫自身不能完成对维生素的消化，而必须依靠 肠道内的微生物来消化纤维素，促进营养物质的代谢与转化。白蚁自身不能分泌 纤维素酶，只能依赖后肠中存在的纤维素分解菌消化食物中的纤维素【4 1 删。此外， 白蚁和鳞翅目昆虫肠道中的微生物基因组中含有多种木聚糖酶基因，其编码的木 聚糖酶能催化木聚糖的水解【4 5 】。这些研究暗示了昆虫肠道细菌具有降解大分子物 质的能力。固氮是白蚁获得营养的另一个重要方面。白蚁以木材为食，木材中含 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 有较高的纤维素、木质素等多糖物质，而蛋白质、维生素和其它含氮物质的含量 较低，因此白蚁肠道中的固氮菌及其代谢产物可以为宿主提供含氮物质，以维持 白蚁体内氮素的平衡。目前，已在白蚁肠道的共生菌群中发现大量的固氮酶基因 。半翅目昆虫长红猎蝽( r h o d n i u sp r o l i x u s ) 的肠道中有一种诺卡尔菌( n o c a r d i a r h o d n i i ) ，该菌能为宿主提供毗哆醇，烟酰胺，泛酸钙等b 族维生素，如果其肠道 中缺乏诺卡尔菌属，则幼虫不能正常发育为成虫。同翅目昆虫蚜虫主要以植物的 韧皮部汁液为食，但这些汁液中的营养成分很不平衡，其中许多必需氨基酸的浓 度都非常低【4 7 】。对于动物而言，必需氨基酸和非必需氨基酸大致平衡时才有利于 自身的正常生长发育郴】。因此，那些以植物韧皮部汁液为食的同翅目昆虫都必须 依靠体内的共生菌提供必需的氨基酸 4 9 1 。此外，同翅目昆虫稻飞虱肠道中的共生 菌含有较高的尿酸酶，这些酶能够分解宿主的代谢废物尿酸来合成必需氨基酸以 供宿主生长发育所需【5 0 l 。白蚁肠道中的优势菌螺旋菌能够通过耗氧将c 0 2 还原为 乙酸盐供白蚁利用，并且这种产酸比产甲烷更占优势【5 1 1 。此外，蜚蠊目蟑螂的肠 道菌也能产生有机酸和甲烷1 5 2 j 。 1 1 3 2 定植抗性 定植抗性是指肠道常住菌群阻止包括病原菌在内的外来微生物在肠道内定 植，从而达到抵御过路菌群( 包括病原菌) 侵染的目的【5 3 i 。定植抗性产生的原因 有：( 1 ) 占位性保护作用，即肠道常住菌群通过与外来菌争夺营养物质等，从而达 到占据生态位以抵抗外来微生物侵袭的作用。d i l l o n 等【8 】研究无菌饲养的沙漠蝗其 肠道微生物多样性与病原菌的侵袭关系时发现，沙漠蝗的肠道微生物种类多时更 能抵抗病原菌的侵袭，即定植抗性强。( 2 ) 抗性物质的产生或激起宿主的免疫反应。 含有正常菌群的沙漠蝗能够抑制病原真菌孢子的萌发和侵袭，但沙漠蝗在无菌饲 养下其生长发育正常，但对真菌的敏感性明显高于正常沙漠蝗。此外，正常沙漠 蝗的肠道和粪便中含有多种具有抗真菌活性的酚类物质，而无菌饲养的沙漠蝗其 肠道和粪便中缺少酚类物质【5 4 , 5 5 。如果将沙漠蝗肠道中的优势菌群p a n t o e a a g g l o m e r a n s 引入到无菌沙漠蝗的肠道中，结果在沙漠蝗的肠道和粪便中检测到一 种酚类物质，并且其肠液具有了抗真菌孢子萌发的能力 7 1 。这暗示了肠道菌群产生 的酚类物质具有抗真菌作用，并且这些酚类化合物仅作用于过路菌群而不作用于 肠道常住菌群。j t m 和y a s u h i s a 5 6 1 在研究东方茶卷叶蛾肠道菌群对苏云金芽孢杆 菌生长的影响时发现，将苏云金杆菌及毒蛋白引入到正常卷叶蛾的肠道中，昆虫 死亡后肠道内的常住菌群增加很快，苏云金杆菌的数量几乎没有变化：而将苏云 金杆菌及毒蛋白引入无菌饲养的卷叶蛾肠道中，结果昆虫死亡后其体内的苏云金 杆菌数量增加了2 0 多倍。这说明昆虫肠道常住菌群能够抑制外来菌群在肠道中定 植和大量繁殖。这在家蚕及其它昆虫肠道微生物能够产生定植抗性的研究中也有 4 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 类似报道。鲁兴萌和汪方炜【57 j 在研究家蚕消化道内的高频微生物肠球菌时发现， 肠球菌对家蚕微孢子虫孢子的发芽具有较强的抑制作用。将甜菜夜蛾的肠道优势 菌蜡状芽孢杆菌添加到饲料中，另一组用青霉素除去这些优势菌，结果发现，前 者甜菜夜蛾的化蛹率和蛹的重量都提高了，而幼虫的龄期和死亡率却降低了。双 翅目昆虫的肠道菌对利士曼原虫和疟原虫可能有抑制作用【5 8 , 5 9 1 。此外，蜚蠊目昆 虫德国小蠊的肠道中含有能产生广谱抗真菌活性物质的细菌，这些细菌对镰刀菌、 白色念珠菌及黄萎轮枝孢菌等多种病原菌具有较强的抑制作用 6 0 l 。 1 1 3 3 产生昆虫信息素 植物表面有微生物存在，昆虫在取食时会受到其表面微生物代谢产物的影响， 同时寄主植物也会受到存在于昆虫粪便中的肠道微生物代谢产物的影响，即肠道 微生物参与了昆虫与寄主植物这一复杂的相互关系【6 。以无菌沙漠蝗的粪便为培 养基，研究发现沙漠蝗肠道中的几种细菌都能合成聚集信息素的前体一邻甲氧基 苯酚和其它一些小分子苯酚，其中邻甲氧基苯酚的前体是寄主植物中的香草酸【6 】。 这表明昆虫肠道细菌能够利用植物代谢产物合成化学信息素，即昆虫信息素的产 生受到肠道细菌的调节。此外，正常沙漠蝗的肠道和粪便的挥发物中含有愈创木 酚，愈创木酚是昆虫聚集信息素的主要成分，由肠道细菌产生，而无菌饲养的沙 漠蝗其肠道和粪便挥发物中则不含有愈创木酚，将沙漠蝗肠道中的优势菌群 p a n t o e aa g g l o m e r a n s 引入到无菌沙漠蝗的肠道中，在其肠道和粪便挥发物中又可 检测到愈创木酚瞰】。肠道微生物除了参与昆虫与寄主植物的相互关系，还参与昆 虫与天敌的相互关系。海灰翅夜蛾在食植物时其唾液中分泌一种n 酰基氨基酸盐 类，这种物质能够激起植物释放挥发性气体以吸引昆虫天敌。因此昆虫唾液分泌 物中的这种物质被称为激发子 6 2 1 。p i n g 等【6 3 】研究发现海灰翅夜蛾幼虫