（动物学专业论文）节杆菌和大肠杆菌海藻糖6磷酸合成酶在低温下的催化效率比较.pdf

摘要 海藻糖是一种非还原性二糖分子，它可在干燥、脱水、热胁迫、冷胁迫、氧 化胁迫、渗透压胁迫等多种胁迫环境下对生命体起保护作用，广泛存在于除高等 动物以外的生命体中。o t s a o t s b 途径是生命体合成海藻糖的主要途径，o t s a 基 因编码海藻糖- 6 磷酸合成酶，它以葡萄糖6 磷酸和u d p 葡萄糖作为底物，生成 海藻糖6 磷酸和u d p 。o t s b 催化海藻糖6 磷酸生成海藻糖。u d p - 葡萄糖在冷 信号传导中起重要作用，海藻糖6 磷酸调控着体内糖的代谢，都对生命体在逆 境中的存活与生长起重要作用，它们分别是o t s a 的底物和产物，因此研究不同 生长环境中的生命体的o t s a 催化效率具有重要意义。 本实验所用实验材料为节杆菌和大肠杆菌，此株节杆菌为耐冷菌，其o t s a 与中温菌大肠杆菌的o t s a 作酶动力学比较，通过不同温度下一系列酶学参数的 分析，得出节杆菌o t s a 在低温下较之大肠杆菌的优越性，从而为研究耐冷菌的 耐冷机制奠定基础。 利用p c r 技术扩增出大肠杆菌和节杆菌中的o t s a 基因，连接入t 载体，转 入大肠杆菌d h 5 c t ，再用限制性内切酶将基因片段切下，连接入p e t 表达载体， 转入大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导后，工程菌大量表达重组蛋白。利用亲和 层析法分离纯化目的蛋白，并对其催化活性进行测定。 通过分析对比低温下不同物种问o t s a 的催化效率，得出节杆菌的o t s a 比 大肠杆菌的更适应低温环境，这个适应性主要取决于对u d p 葡萄糖的亲和度( 体 现在米氏常数k m 上) ，而不取决于酶的转换数( k c a t ) 。温度由3 0 降至1 6 时，大肠杆菌o t s a k m 由4 3 5 9 9 上升至9 5 8 9 1 ，节杆菌o t s a k m 由1 0 6 7 6 6 下 降至2 2 3 3 1 ，k c a t 则呈无规则波动，由此推论：节杆菌比大肠杆菌更适应低温 环境，一部分原因是由于其海藻糖6 磷酸合成酶( o t s a ) 在低温下对u d p 葡萄 糖的亲和度更高。 关键词：海藻糖6 - 磷酸合成酶胁迫 亲和层析催化效率米氏常数转 换数 a b s t r a c t t r e h a l o s ei san o n r e d u c i n gd i s a c c h a r i d ew h i c hc o u l dp r o t e c to r g a n i s m sf r o mb e i n g d a m a g e di nv a r i o u ss t r e s sc o n d i t i o n ss u c ha sd e s i c c a t i o n , d e h y d r a t i o n , h e a t ，c o l a , o x i d a t i o na n do s m o t i cb q l 既s t h i ss u g a ri sp r e s e n ti nv a r i e t yo fo r g a n i s m se x c e p t h i g h e ra n i m a l s t h em a i np a t h w a yo ft r c h a l o s e sb i o s y n t h e s i si st h eo t s a o t s b p a t h w a y t h eg e n eo t s ae n c o d e st r e h a l o s e - 6 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，w h i c hp r o d u c e t r e h a l o s e - 6 - p h o s p h a t ea n du d pw i mt h es u b s t r a t e so fg l u c o s e 一6 - p h o s p h a t ea n d u d p g l u c o s e t h e f u n c t i o no fo t s bi s t o p r o d u c e t r e h a l o s e u s i n g t r e h a l o s e 6 - p h o s p h a t e a st h ei m p o r t a n tr o l e so ft h es u b s t r a t ea n dp r o d u c to fo t s ai n o r g a n i s m s s u r v i v a la n dg r o 砌1m p g l u c o s e 船l v e sa sac r u c i a lm o l e c u l ei nt h e t r a n s m i s s i o no fc o l ds i g n a l ，a n dt r e h a l o s e - 6 p h o s p h a t er e g u l a t e st h ec a r b o h y d r a t e s m e t a b o l i s mi nv 办矿i ti sn e c e s s a r yt od oar e s e a r c ho nt h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yo f o t s a o f d i f f e r e n to r g a n i s m sf r o md i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s t h ea r t h r o b a c t e r s p q t sf r o mc o l de n v i r o n m e n ta n de s c h e r i c h i ac o i lf r o m c o m m o ne n v i r o n m e n tw c t ec h o s e nt od ot h i sr e s e a r c h a n a l y z i n gas e r i e so f e n z y m o l o g i c a lp a r a m e t e r si nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sc o u l dr e s u l t si no t s af r o m a r t h r o b a c t e rs p c j t si ss u p e r i o rt ot h a tf r o me s c h e r i c h i ac o i l , w h i c hc o u l ds e ta f o u n d a t i o nt ot h em e c h a n i s mr & 3 e a r e ho f c o l d - r e s i s t a n t t h eo t s ag e n e sf r o me s c h e r i c h i ac o l ia n da r t h r o b a c t e rs p c j t sw c r ea m p l i f i e d r e s p e c t i v e l yb yp c ra n dt r a n s f o r m e di n t oh o s tb a c t e r i at oe x p r e s st h er e c o m b i n e d p r o t e i n s ，w h i c hw e r et h e ni s o l a t e da n dp u r i f i e db ya f f m i t yc h r o m a t o g r a p h ya n dt h e i r c a t a l y t i ca c t i v i t yw e r em e a s u r e d a n a l y z i n gt h ed i f f e r e n tc a t a l y t i ce f f i c i e n c i e so fo t s af r o md i f f e r e n to r g a n i s m s 砒 l o wt e m p e r a t u r el e dt ot h er e s u l tt h a to t s af r o ma r t h r o b a c t e rs p c j t si sm o i e a d a p t a b l et ol o wt e m p e r a t u r et h a nt h a tf r o me s c h e r i c h i ac o i l t h ea d a p t a t i o nd e p e n d s o no t s a sa f f i n i t yt ou d p - g l u c o s e ( k i n ) r a t h e rt h a nc a t a l y t i cc o n s t a n t ( k c a t 卜1 m 吼 t h et e m p e r a t u r ef e l lf r o m3 0 ct o1 6 c ，k mo f e s c h e r i c h i ac o l i so t s ar o s ef r o m 4 3 5 9 9t o9 5 8 9 1w h i l et h a to fa r t h r o b a c t e rs p c j t s so 【s af e l lf r o m1 0 6 7 6 6t o 2 2 3 3 1 ，a n dk c a tf l u c t u a t e dr u l e l e s s l r 舶i c hi n f e r st h a ta r t h r o b a c t e rs p c j t s s m o r ea d a p t a b i l i t yt ol o wt e m p e r a t u r et h a ne s c h e r i c h i ac o l ip a r t l yd e r i v e sf r o mo t s a s h i g h e ra f f i n i t yt ou d p - g l u c o s ei nl o wt e m p e r a t u r e k e y w o r d s ：o t s a s t r e s s a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y c a t a l y t i ce f f i c i e n c y m i e h a e l i sc o n s t a n t c a t a l y t i cc o n s t a n t 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明 引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：芰题 日期：帅 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：壶塑 导师签名： 塾坠e t 期：芝= ：乙f 、。k， 兰州大学硕士学位论文 刖雷 低温微生物是指可在低温下生存的微生物。它可以被分为两类：一，耐冷菌， 指能在低温条件下生长，在0 5 1 2 可生长繁殖，最高生长温度可达2 0 。c 以上的微 生物。这类微生物在自然界分布很广，从常冷到不稳定的低温环境中均可分离到， 它还分布于海产品及冷冻食品上，即使在南北两极常冷的环境中分离到的微生物 大部分也是耐冷菌。二，嗜冷菌，指必须生活在低温条件下，在0 1 2 可生长繁殖， 最适温度不超过1 5 c ，最高温度不超过2 0 。c 的微生物。嗜冷菌只占低温微生物的 很少一部分，它的分布受环境的限制，主要分布于终年冰冻的环境中，如南北两 极地区、冰窟、高山、深海和冻土域等低温环境中【”。中国天山一号冰川是一个 常年低温的极端环境，它的年平均气温接近零度，因此研究该地方的永冻冻土中 生存的耐冷节杆菌的冷适应机制是国际上对模式种一大肠杆菌冷休克过程研究 的很好的补充。 节杆菌是一类好氧，触酶阳性的杆菌。该菌进行呼吸代谢，胞壁肽聚糖含赖 氨酸，磷酸类脂型为p i ，主要的甲基萘醌为m k - 8 、m k - 9 h 和m k - 1 0 ，d n a 的g + c m 0 1 含量为5 9 7 0 。它的最突出的特征是在生长过程中呈现杆球循环。当节杆菌 生长于对数期时，菌体呈不规则分枝杆状，通过突然分裂而繁殖。进入稳定期后， 菌体变为球状。一旦转接到新鲜培养基上，球型细胞又开始出芽生长，再次变为 生长活跃的杆菌，有雏形分枝，但无真正的菌丝体。虽然节杆菌常能从鱼、污水 和植物表面分离到，它们的最主要的栖息地还是土壤，是土壤微生物菌群的重要 组成者1 2 1 。 微生物在受到低温胁迫时从生长曲线的变化上可分为两个阶段。第一个阶段 为冷休克期，在这个时期微生物的菌液浓度保持不变，由于温度降低从而引起细 胞膜流动性、酶催化活性的减弱，物质转运和代谢速率的降低，影响核酸二级结 构的稳定性从而抑审i j d n a 的复制、m r n a 的转录和翻译。若温度低于细胞质冰点， 还会使细胞形成冰晶体对细胞结构造成严重损坏【3 1 。因此微生物在冷休克期产生 保护分子，以及改变体内的代谢策略，从而为适应低温作了准备。第二个时期为 冷适应期，这个时期微生物的菌液浓度缓慢的上升。在该时期微生物的体内代谢 方式已经适应了温度的变化，可以进行生长与繁殖。因此研究微生物的冷休克期 是揭示它对低温的耐受与适应分子机制的重要时期。 兰州大学顽上学位论文 研究人员在对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等微生物的冷休克阶段研 究时发现有大量的海藻糖分子积累。大肠杆菌的海藻糖合成突变体在4 c 下由于 不能合成海藻糖，菌液中的活细胞数随时间的变化急剧下降。然而当向突变体中 转) k o t s a o t s b 基因的时候，该突变体的低温生存数会明显升高【4 】。 海藻糖是一种非还原性二糖，它是由两个葡萄糖以岛一1 ，1 葡萄糖苷键连接 的。虽然海藻糖有多种异构体，例如：a 肛1 ，1 ，b , i k i ，1 和n 一1 ，l - ，但是只有岛* 海藻糖( 图1 ) 可从生命体中分离出来。这个分子广泛存在于很多生物中，包括细 菌、酵母菌、真菌、昆虫、无脊椎动物和植物。海藻糖在低等生物中的功能早在 1 8 3 2 年黑麦的麦角症中被报道【5 1 ，广泛存在于酵母和真菌的孢子，子实体和生长 的细胞中【& 7 1 。例如z 芷r _ d i c t y o s t e l i u mm u c o r o i d e s ( 盘基网柄菌) 的大孢囊中曾报道 海藻糖占其干重的7 1 8 1 ，t n e u r o s p o r at e t r a s p e r m a ( 四孢脉孢菌) 的子囊孢子中 占其干重的1 0 1 9 1 。海藻糖在不同的细菌中也被发现，包括s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s ( 吸水链霉菌) 以及其他的链霉菌中”o j 。在许多分枝杆菌例如 m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s ( 耻垢分枝杆菌) 、m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ( 结核分 枝杆菌) t q 和c o r y n e b a c t e r i a ( 棒形杆菌) 1 2 d p 均有海藻糖的发现。另外人们在 e s c h e r i c h i a c o i l ( 大肠杆菌) 、r h i z o b i u m s p ( 根瘤菌) 、s u l f d o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s 、 p i m e l o b a c t e r s p r 4 8 ( 脂肪杆菌) 以2 乏a r t h r o b a c t e r s p q 3 6 ( 节杆菌) 中均发现了 该分子【1 3 1 。 hh 图1 海藻糖结构图 在研究的早期人们认为海藻糖是一种能量和碳源的储存物，而随着研究的不 断深入，近几年人们发现其是一个多功能分子，在酵母和植物中它可能是一种细 胞内的信号分子，用于调节一些代谢的途径从而调节生长。另外海藻糖能保护蛋 白质和细胞膜在多种胁迫下不变性，包括干燥、脱水、热休克、冷休克、氧化胁 迫和渗透压胁迫。人们在分枝杆菌和棒状杆菌中发现海藻糖可与多种糖脂组成细 2 兰州大学硕士学位论文 胞壁。 现在已发现海藻糖的生物合成途径有三条：第一条途径是先由海藻糖六磷酸 合成酶( o t s a ) 催化u d p 葡萄糖和葡萄糖六磷酸形成海藻糖六磷酸和u d p ( 图2 ) b 4 1 ，再由海藻糖磷酸酯酶( o t s b ) 去磷酸化，形成海藻糖。在酵母、昆虫和链 霉菌中已经发现了海藻糖六磷酸合成酶的供体为u d p 葡萄糖或者g d p - 葡萄糖 的一种。然而在重新分析m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s 的高纯度海藻糖六磷酸合成酶 时发现a d p 葡萄糖、c d p 葡萄糖、g d p - 葡萄糖、t d p - 葡萄糖和u d p 一葡萄糖都 是它的天然底物【1 5 】。o t s a 除了合成海藻糖六磷酸以外还调节着糖的代谢，它还 可以作用于葡萄糖的运输和调节糖激酶的活性【1 6 1 。它可以通过使磷酸化的糖进 入海藻糖代谢从而抑制过量的糖酵解，在这条途径中产生的无机磷又是甘油醛三 磷酸脱氢酶发挥活性所必要的【切。海藻糖六磷酸可以通过抑制己糖激酶的活性 从而抑制糖进入糖酵解中f 1 毛3 7 】，它并能通过对a d p 葡萄糖焦磷酸化酶的翻译后 修饰来激活该酶合成淀粉1 3 毋。 嘭睾罐。+ 参一 l n 岛吨c ” 丑6 _ p i “ ；f f r s a 图2 海藻糖合成o t s a b 途径 第二条途径是麦芽糖糊精在t h y ，r 把z 的催化作用下形成海藻糖【1 9 1 。第三条 途径是麦芽糖在t r e s 的作用下产生海藻耕1 9 】。 由于这两条替代途径分布不如第一条途径广泛，现在仅在分枝杆菌、根瘤菌、 棒形杆菌以及节杆菌中发现，因此本实验仅研究广泛存在的第一条途径，即 o t s a o t s b 途径。又因为这条途径中的第一个酶一海藻糖六磷酸合成酶( o t s a ) 兰州大学硕e 学位论文 的地位比较特殊，其底物u d p 一葡萄糖是冷信号传导途径中的一个中介物，调节 着s i g m as 因子，对o t s a 也有负调控作用川1 ，产物海藻糖六磷酸调节着体内糖的 代谢，所以选o t s a 作为研究对象。而o t s a 的另一个底物葡萄糖六磷酸是糖酵 解的中间产物，在体内广泛存在，u d p 葡萄糖担当信号传递的角色，在体内含 量不稳定，是o t s a 的关键性底物，所以本实验选择u d p 一葡萄糖为可变底物进行 一系列酶动力学测定与计算。 本实验所选用菌株分离自中国天山一号冰川永冻冻土，属于节杆菌属，未定 种，由于其采样地点的极端环境及菌株对低温的良好耐受性，故选择此菌株作为 本实验的酶源菌株。 此株节杆菌为耐冷菌，把它的o t s a 与中温菌大肠杆菌的o t s a 作酶动力学比 较，通过不同温度下一系列酶学参数的分析与比较，得出节杆菌o t s a 在低温下 较之大肠杆菌的优越性，从而为研究耐冷菌的耐冷机制奠定基础。 4 兰州大学碗上学位论文 材料与方法 l 实验材料 1 1 菌株 1 1 1 节杆菌( a r t h o b a c t e r s p c j t s ) 该菌株分离自中国天山一号冰川永冻冻土，属于节杆菌属，未定种。最适生 长温度2 5 c ，可在4 c 及更低温度下生长。由于其采样地点的极端环境及菌株对 低温的良好耐受性，故选择此菌株作为本实验的酶源菌株。 1 1 2 大肠杆菌d h 5 a 一种用于铺制平板培养质粒的重组缺陷琥珀抑制型菌株。其中( i ) 8 0 i a c z a m l 5 突变可与p u c 载体编码的p 一半乳糖苷酶氨基端实现n 互补。 1 1 3 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体t 7 启动子的表达载体( 如p e t 系列) 的基因。t 7 噬菌体r n a 聚合酶位于九噬菌体d e 3 区，该区整合于b l 2 1 的染色 体上。 1 2 质粒 1 2 1p m d 1 9 t 载体 购自t a k a r a 公司。一种高效克隆p c r 产物( t ac l o n i n g ) 的专用载体。由 p u c l 8 载体改建而成，在p u c l 8 载体的多克隆位点处的x b ai 和s a li 识别位点 之间插入了e c o rv 识别位点，用e c o rv 进行酶切反应后，再在两侧的3 端 添加“t ”而成。因大部分耐热性d n a 聚合酶进行p c r 反应时都有在p c r 产 物的3 末端添加一个“a ”的特性，所以可以大大提高p c r 产物的连接、克隆 效率。( 见图3 ) h i n d i l l s 口 i s 耵i f i h a c c l 基“i v 一t o o o 岫s 胁 x b e l b a m h i s m r i m a l 妇n i s a c i r l 图3p m d - 1 8 t 载体图谱 5 兰州大学硕士学位论文 1 2 2p e t - 2 8 表达载体 含有t 7 启动子和终止子，在含有t t i l n a 聚合酶诱导基因的细胞株b l 2 1 ( d e 3 ) 中，连接在p e t - 2 8 多克隆位点上的d n a 序列可以被大量表达。还带有 n 末端h i s - t a g 、凝血酶位点、1 7 - t a g 和c 末端h i s - t a g 序列，可以用于表达蛋 白的纯化。( 见图4 ) 1 2 3p e t - 4 2 表达载体 含有t 7 启动子和终止子，在含有t t r n a 聚合酶诱导基因的细胞株b l 2 1 ( d e 3 ) 中，连接在p e t - 4 2 多克隆位点上的d n a 序列可以被大量表达。还带有 n 末端h i s - t a g 、c 末端h i s - t a g 、g s t - t a g 、s - t a g ，可以用于表达蛋白的纯化。 ( 见图5 ) 图4 p e t - 2 8 质粒图谱 6 兰州大学硕士学位论文 1 3 p c r 引物 1 3 1 大肠杆菌k 1 2o t s a 引物 根据国际核酸序列数据库g e n b a n k 公布的e s c h e r i c h i ac o l i 的o t s a 序列，设 计特异引物p l 、p 2 ，分别含有酶切位点b s p hi 和x h oi ( 大肠杆菌o t s a 的a t g 后为a 碱基，所以设计b s p h i 位点，b s p h i 与n c o i 是同尾酶，n c o i 为p e t - 2 8 载体r b s 后的第一个限制性酶切位点，x h oi 为其h i s - t a g 序列前最后一个限制 性酶切位点，这样可以最低限度的减少融合蛋白中的表达载体序列) ： p 1 ：5 - g g gg t c g t t t a g t c g t a g 3 ， p 2 ：5 -c , - c a a g c i t r g g a a a g g - 3 ( 注：阴影处为酶切位点) 1 3 2 简并引物 用已知的分枝杆菌和大肠杆菌的o t s a 序列进行比对，得到同源性相对较高 的两段区域，据此设计上下游简并引物p 3 、p 4 ： 7 兰型叁兰堡主兰堡堡兰 p 3 ：5 - t y r r g c a c a r y c c k l l c c c g 一3 ( yf o rc t , kf o rg 门r ) p 4 ：5 - g c y a c y a g g l l a ：r c c c g t c 一3 1 3 3t 灿l - p c r 引物 1 3 3 1 随机引物1 2 0 1 a d i ：5 n t c g a s t w t s g w g r r 3 ( nf o ra r r c gsf o rg c ，wf o ra f t ) a d 2 1 ：5 - n g a c g a s w g a n a w g a a - 3 a d 2 2 ：5 n g a c g a s w g a n a w g r r - 3 a d 2 3 ：5 - n g a c g a s w g a n a w g a c 一3 a d 2 4 ：5 - n g a c g a s w g a n a w c a a 3 a d 2 5 ：5 n g a c g a s w g a n a w c t r - 3 a d 3 ：5 - n g n w a a s g t n t s c a a 一3 1 3 3 2 特异引物 向5 扩增的引物： r t o t s a l ：5 - c g a c g g t g c c t t c a a c r r c t r c g c o c 3 r t o t s a 2 ：5 - c a ：r c c t c g a c g t t g a g c t t g c c g t c c 一3 r t o t s a 3 ：5 钮c t c c c a g t t c c c g g c g g 3 向3 扩增的引物： t o t s a l ：5 - c g a g g a c g g c a a g c t c a a c g t c g a g g - 3 t o t s a 2 ：5 - g g c t c c t g c g c g a a g a a g t t g a a g g c 一3 t o t s a 3 ：5 - c t g c c a t c c g c t a c c t g c 一3 1 3 4 节杆菌o t s a 全长引物 根据拼接好的节杆菌o t s a 基因设计特异引物p 5 、p 6 ，分别含有酶切位点 n d ei 和h i n d l l l ( n d ci 为p e l 2 载体r b s 后的第一个限制性酶切位点，由于节 杆菌o t s a 基因内部含有n c oi 和x h oi 酶切位点，所以不用2 8 载体，且3 引 物设计的是h i n d i i i 位点，为其h i s - t a g 序列前倒数第三个限制性酶切位点，减少 融合蛋白中的表达载体序列) ： p 5 ：5 g t c c a n 钢? g g t g a a c g c t g c t g c c g c c g 0 3 p 6 ：5 - g a t a a g c l l t g g g c a g c c t c c g g c t c - 3 ( 注：阴影处为酶切位点) 8 兰州大学硕f ：学位论文 1 4 主要试剂及工具酶 甘油 美国a m r e 戥? , o t r y p t o n e英国o x o i d y e a s te x t r a c t英国o x o i d a g a r o s c 美国a m r e s c o a g a r 美国a m r e s c o而s 美国a m r e s c o s d s 美国s i g m a e d t a美国a m r e s g o 氨苄青霉素 美国a n l r e o卡那霉素 美国a m r e s g o 溶菌酶 美国a m r e o考马斯亮蓝美国a m l f e s c o r - 2 5 0 考马斯亮蓝 美国a m r e s c o昧唑 美国s i g m a g - 2 5 0 乳酸脱氢酶美国m m r e s c o 丙酮酸激酶美国s i g m a p e p瑞士r o c h e g 6 p i 美国s i g m a u d p g 美国s i g m ah e p a r i n 美国s i g m a n a d h 美国a 皿r e s c o a d p美国a m r e s c o 限制性内切酶 f e r m e n t a s ( m b l ) t 4d n a 连接 f e r m e n t a s ( m b l ) 及b u f f e r 酶及b u f f e r p e g - 4 0 0 0 f e r m e n t a s ( m b i ) d n am a r k e r 加拿大b b i 蛋白质m a r k e r 大连t a k a r a i p t g 大连t a k a r a l a t a q 酶 大连t a k a r ag cb u f f e r大连t a k a r a p m d - 1 8 t 载体 大连t a k a r a普通t a q 酶及 上海生工 b u f f e r d n t p m i x上海生工甘氨酸上海生工 b s a上海生工t e m e d上海生工 过硫酸铵北京拜尔迪丙烯酰胺 北京拜尔迪 甲叉双丙烯酰北京拜尔迪d n a 回收纯 安徽u - g e n e 胺化试剂盒 其他试剂和药品均为国产分析纯 1 5 主要实验仪器 c r2 1 g 高速冷冻离心机：日本h r r a c h i 公司 p o w e r p a e 电泳仪：美国b i o r a d 公司 m i n i s u b 电泳槽：美国b i o r a d 公司 m i i l i p r o t e a n 电泳槽：美国b i o r a d 公司 g e ld o ex r 凝胶成像系统：美国b i o r a d 公司 m y c y c l e rp c r 仪：美国b i o r a d 公司 m l s 3 7 5 0 高压蒸汽灭菌锅：日本s a n y o 公司 n u4 2 5 - 4 0 0 e 生物安全柜：美国n u a i r e 公司 s h k e 4 0 0 0 6 c e 恒温振荡系统：美国b a r n s t e a d 公司 m d f u 5 2 v 超低温冰箱：日本s a n y o 公司 q 兰州大学硕士学位论文 m l r - 3 5 0 h 多功能环境培养箱：日本s a n y 0 公司 s n 订- f 1 4 0 制冰机：日本s a n y o 公司 a b 2 0 4 s 电子天平：瑞典m e t t l e rt o l e d 0 公司 各种量程移液器：德国e p p e n d o r f 公司 u p c - 9 0 0 核酸蛋白纯化系统：美国a m c r s h a m 公司 h i t r a p5 m l 层析柱：美国a m e r s h a m 公司 h i t r a p5 m l 脱盐柱：美国a m e r s h a m 公司 s m a r t s p e c 蛋白核酸分析仪：美国b i o r a d 公司 h i - i 1 恒温水浴锅：国华电器有限公司 j y 9 2 i i 超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技有限公司 h x - 1 0 5 0 恒温循环器：北京宜科科学仪器研究所 d h p 9 0 8 2 电热恒温培养箱：上海华连医疗器械与限公司 w d 9 4 0 5 b 水平摇床：北京六一仪器厂 1 6 主要生物信息学软件及数据库 1 6 1g e n b a n k ：美国国立卫生研究院( n i h ) 基因序列数据库。汇集并注释了所 有公开的核酸以及蛋白质序列，与e m b l 和d d b j 每天交换所得到的数据。 1 6 2b l a s t ：局部相似性基本查询工具。是由“国家生物技术信息中心”( n c b i ) 维护的一个实用程序，用来扫描核苷酸或氨基酸序列数据库以找到“符合项”。 1 6 3b i o e d i t ：分子生物学应用软件，可对核酸序列和蛋白质序列进行常规的分 析操作。它的基本功能是提供蛋白质核酸序列的编辑排列处理和分析。 1 6 4d n a c l u b ：一个简单的对d n a 进行与p c r 有关的操作的软件。它的功能 有：输入d n a 序列、查找o r f 序列、把d n a 翻译成蛋白序列、查找酶切位点、 查找p c r 引物序列、设计p c r 引物。 1 6 5s i g m a p l o t ：科学绘图软件。它的e n z y m ek i n e t i c s 模块可分析及绘图出所输 入的酶动力学数据，可找出最适合反应机构并显示出其特点，自动绘图出一系列 的图形。 2 实验方法 2 1 菌种的培养和保存 大肠杆菌的最适生长温度为3 7 c ，使用时接种入l b 液体培养基震荡培养或 1 0 兰州大学颈七学位论文 划线，涂布于l b 固体平板上置于培养箱中过夜。保存时往菌液中加入甘油至终浓 度为1 5 ( 如果菌中带有质粒则为l o ) ，置于8 3 ( 2 超低温冰箱中保存。 本实验所用的节杆菌最适生长温度为2 5 ( 2 ，使用时接种入p y g 液体培养基 震荡培养或划线，涂布于p y g 固体平板上置于培养箱中过夜。保存时往菌液中加 入甘油至终浓度为1 5 ，置于8 3 超低温冰箱中保存。 2 2 基因组d n a 的提取 ( 1 ) 取摇培过夜的菌液于1 5 m l 离心管，1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃上清。 ( 2 ) 每管加1 0 0 u lt e 缓冲液，吹打均匀。 ( 3 ) 每管加2 0 u l 溶菌酶，3 t c 温育2 小时( 大肠杆菌l 小时) 。 “) 加入1 0 0 u l2 0 s d s ，颠倒混匀至澄清。 ( 5 ) 加入1 0 0 u l5 m n a c i ，8 0 u lc t a b - n a c i ，颠倒混匀，6 5 温育5 m i n 。 ( 6 ) 加入2 0 0 u l 氯仿，颠倒混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 。 ( 7 ) 吸上清，加入2 0 0 u l 氯仿，同上。 ( 8 ) 吸上清，加入等体积德异丙醇，1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 。 ( 9 ) 弃上清，加入7 0 乙醇1 0 0 2 0 0 u l ，离心l r n i n 。 吸掉液体，吹干，加入2 0 u l 双蒸水。 2 3p c r 扩增 2 3 1 大肠杆菌o t s a 的扩增 2 5 l l l 反应体系：模板d n ao 5 u l d n t p 佗5 r a m ) 2 u l 1 0 p c r b u f f e r 2 5 l l l 双蒸水1 6 7 5 1 1 l t a q 酶( 5 u u 1 ) 0 2 5 u l p i ( 1 0 u m ) 1 5 u l p 2 ( 1 0 u m ) 1 5 u l 程序设定：l 9 4 预变性5 m i n 3 0 9 4 变性4 0 s ，5 5 退火5 0 s ，7 2 延伸l m i n 4 保持o o 2 3 2 节杆菌o t s a 片段的简并扩增 兰州大学颂士学位论文 2 5 i l l 体系同上 程序设定：1 x9 4 预变性5 m i n 1 0 x9 4 ( 2 变性3 0 s ，6 0 退火4 0 s ，7 2 延伸l m i n 9 4 ( 2 变性3 0 s ，6 0 退火4 0 s ，7 2 延伸l m i n 9 4 变性3 0 s ，4 5 退火l m i n ，7 2 延伸l m i n 4 保持o o 2 3 3 节杆菌o t s a 的5 t a i l p c r 和3 t a i l p c r 步骤一： 2 5 u l 体系：模板d n a l u l d n t p ( 1 0 m m ) l u l 2 g cb u f f e ri1 2 5 u l l a - t a q 酶( s u u 1 ) o 2 5 u l 特异引物k 1 0 u m ) o 3 u l 随机引物( 1 0 u m ) 5 u l 双蒸水4 9 5 u l 程序设定：l 9 2 3 m i r a9 5 l m i n 5 x9 4 3 0 s ：6 5 l m i m7 2 1 5 m i n 1x9 4 03 0 s ；2 5 03 m i r a7 2 0 ( 慢升 2 r a i n ) ； 7 2 1 5 m i n 1 4 9 4 1 5 s ；6 5 l m i n ；7 2 1 5 m i n ； 9 4 1 5 s ；6 5 l m i n l7 2 1 5 m i n ； 9 4 1 5 s ：4 4 l m i m7 2 1 5 m i n ； l 7 2 5 m i n 取l u l 反应产物用2 0 u l 双蒸水稀释作为步骤二的模板 步骤二： 2 5 u l 体系：步骤一p c r 产物l u l d n t p ( 1 0 m m ) l u l 2 g c b u f f e ri1 2 5 i l l l a - t a q 酶( 5 u u 1 1o 2 5 u l 兰型叁竺堡! 兰垒堡苎 特异引物2 ( 1 0 u m ) 0 4 u l 随机引物0 0 u m ) 4 u l 双蒸水5 8 5 l l l 程序设定：1 1 1 2 x9 4 1 5 s ；6 5 l m i m7 2 1 5 m i n ： 9 4 1 5 s ；6 5 l m i m7 2 1 5 r a i n , 9 4 1 5 s ；4 5 l m i n ；7 2 1 5 m i r a l 7 2 5 m i n 取1 l | l 反应产物用1 0 u l 双蒸水稀释作为步骤三的模板 步骤三： 2 5 u l 体系：步骤二p c r 产物l u l d n t p ( 1 0 m m ) l u l 2 g cb u f f e ri1 2 5 i i l l a - t a q 酶( 5 t a u l ) 0 2 5 u l 特异引物3 ( 1 0 u m ) o 6 u l 随机引物( 1 0 u m ) 3 u l 双蒸水6 6 5 u l 程序设定：1 2 - 1 4 x9 4 4 0 s ；4 5 l m i n , 7 2 1 5 m i r a l 7 2 5 m i n 2 3 4 节杆菌o t s a 全长的扩增 2 5 u l 反应体系：模板d n a o 5 u l d n t p ( 2 5 m m ) 2 u l 1 0xp c rb u f f e r2 5 u l 双蒸水1 6 7 5 u l t a q 酶( 5 u u 1 ) o 2 5 u l p 5 ( 1 0 u m ) 1 5 u l p 6 ( 1 0 u m ) 1 5 u l 程序设定：lx9 4 ( 2 预变性5 m i n 3 0 9 4 4 c 变性3 0 s ，5 3 c 退火4 0 s ，7 2 c 延伸l m i n 4 c 保持o 。 兰州大学硕士学位论文 2 4 扩增产物的回收 扩增出的p c r 产物在1 的琼脂糖凝胶中进行电泳，1 2 0 v 电压，电泳2 0 m i n 后，在凝胶成像系统下观察记录结果。将目的d n a 条带用刀片切下，装入离心 管中，用d n a 回收试剂盒进行回收： ( 1 ) 每管加入n j 缓冲液2 0 0 u l ，水浴加热并不断上下翻转使其溶解，转移至吸附 柱中，1 0 0 0 0 r p m 室温离心l m i n 。 ( 2 ) 倒掉液体，加入7 0 0 u ls p w 洗涤缓冲液，1 0 0 0 0 r p m 室温离心l m i n 。 ( 3 ) 倒掉液体，空管室温离心1 0 0 0 0 r p ml m i n ，放置至酒精挥发完全。 ( 4 ) 加入2 5 u ld n a 洗脱液，1 0 0 0 0 r p m 室温离心l m i n 。 2 5 回收产物的连接 2 0 u l 反应体系：回收产物1 4 5 u l t 载体o 5 1 l l p e g 4 0 0 02 u l t 4 连接酶b u f f e r