（动物学专业论文）盘基网柄菌（dictyostelium+discoideum）细胞凋亡中细胞色素c的作用分析.pdf

2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 细胞凋亡中细 胞色素c 的作用分析 研究生：宋金辉 学号：5 1 0 5 1 3 0 0 0 4 4 专业：动物学 研究方向：动物细胞与分子生物学 导师：侯连生 摘要 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 是一种简单的真核微生物，外形 象阿米巴虫，通常称它为“社会阿米巴( s o c i a la m o e b a e ) ”，以吞食细菌为生。 在营养丰富条件下，以单细胞形式存在并通过二分分裂方式繁殖；一旦食物匮乏， 成百上千的单个细胞聚集成多细胞体，并逐渐分化为两种细胞：前柄细胞和前孢 子细胞。多细胞体历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段完成分化和发育过程，最终前 柄细胞分化为柄细胞，前孢子细胞分化为孢子细胞，二者组成的个体称为子实体。 在合适条件下，孢子细胞萌发开始新生命周期；而柄细胞无论用什么条件都不能 萌发，因此柄细胞是死亡细胞，柄细胞的形成是既是一个分化的过程，又是一个 细胞凋亡的过程。目前认为细胞色素c 不仅是呼吸电子传递链的一个载体，而且 在细胞凋亡过程中也起着重要的调节作用。细胞色素c 释放到胞质中可以激活凋 亡蛋白激活因子1 和胱天蛋白酶9 ，活化的胱天蛋白酶9 再激活胱天蛋白酶- 3 ， 最后导致生化和形态学上的凋亡现象。然而在盘基网柄菌的前柄细胞凋亡中，细 胞色素c 的作用如何不很清楚，并鲜有相关的报道。 本实验首先观察了野生型盘基网柄菌细胞k a x 3 和突变型细胞a k l 2 7 在剥 夺食物的条件下，其多细胞的发育情况。我们观察到野生型细胞k a x 3 经历趋 化性聚集、细胞丘和蛞蝓体等三个阶段，最后形成由空心的柄和孢子体组成的子 实体，顺利完成多细胞体的发育。而突变型细胞a k l 2 7 ，尽管发育早期细胞趋 化性聚集，但到疏松聚集阶段发育停滞下来，细胞的分化停止，最后细胞解聚为 松散的单个细胞。 为了研究柄细胞的形成过程( 即前柄细胞的凋亡过程) 与细胞色素c 的关系， 我们过蛋白印记的方法和半定量r t - p c r 的方法比较了16 h 、18 h 、2 0 h 三个多 细胞发育阶段的前柄细胞和前孢子细胞中细胞色素c 的定位变化情况和其表达 水平的变化。得出结论：1 、发育1 6 h 2 0 h 盘基网柄菌前柄细胞在凋亡过程中， 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 线粒体内细胞色素c 含量减少，而同时胞质中细胞色素c 含量也逐渐增加，这说 明二者是相关的事件。这些数据也提示在凋亡的前柄细胞中细胞色素c 是由线粒 体内释放到胞质中的；线粒体中仍然保留一定数量的细胞色素c 事实说明细胞色 素c 并没有全部释放到胞质中，细胞尚未完全死亡，仍然需要一定量的细胞色素 c 参与呼吸链电子传递来保证能量的供给。2 、从胞质中和线粒体中细胞色素c 的总含量比较来看，前柄细胞中的含量要高于前孢子细胞。从前柄细胞发育的三 个时段来看，18 h ，2 0 h 时段呈现降低的趋势；说明前柄细胞随着凋亡进程，胞 内细胞器，包括线粒体，因吞噬作用而逐渐减少，能量需求逐渐减少，细胞生命 力也逐渐降低；3 、半定量r t - p c r 检测结果发现各发育各阶段前柄细胞中细胞 色素c 的表达量明显高于同一阶段的前孢子细胞的表达量，从转录水平表现出凋 亡对细胞色素c 的需求，该结果也同时验证了免疫印迹实验数据。基于上述实验 结果，我们推测这种调控与细胞凋亡进程密切相关，盘基网柄菌细胞整个发育周 期大约是2 4 h ，所以发育到2 0 h 时，前柄细胞基本分化成柄细胞，换句话说，基 本凋亡成柄细胞，细胞内大部分胞器，其中包括线粒体，被消灭，其结果是细胞 色素c 需求降低，随之细胞色素c 的表达量也开始下降，使得凋亡后期细胞色素 c 总含量下降。4 、前柄细胞的凋亡过程是一个渐进的过程。 本实验数据说明细胞色素c 在一定程度上参与了盘基网柄菌前柄细胞的凋 亡过程。 关键词：细胞凋亡；线粒体：盘基网柄菌；细胞色素c 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 i n v e s t i g a t i o nf u n c t i o no fc y t o c h r o m e cd u r i n g a p o p t o s i s o fd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m c a n d i d a t en a m e ：s o n gj i n h u i s c h o o ln u m b e r ：510 513 0 0 0 4 4 s p e c i a l i t y z o o l o g y d i r e c t i o n ：c e l l u l a ra n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p , , i s o r ( s i g n a t u r e ) ：h o ul i a n s h e n g a b s t r a c t d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw h i c hw eu s u a l l yc a l l e d ”s o c i a ia m o e b a e ”i sa s i m p l ee u k a r y o t ea n dp h a g o c y t o s i ss o i l b a c t e d af o rf o o d u n d e rf a v o r a b l e c o n d i t i o n 。i tm u l t i p l i e sa sau n i c e l l u l a ro r g a n i s mw h i c hp r o p a g a t i o nb yb i n a r y f i s s i o n u p o ns t a r v a t i o n ，am u l t i - c e l l u l a rs t r u c t u r ew a s f q l r m e db ya g g r e g a t i o n o ft h o u s a n d so fs i n g l ec e l l sw h i c hd i f f e r e n t i a t eg r a d u a l l yi n t ot w ot y p e so fc e l l s c a l l e dp r e s t a l kc e l l sa n dp r e s p o r ec e l l s t h ep a t h w a yi n v o l v i n ga g g r e g a t i o n 。 m o u n d ，s l u g ，c u l m i n a t i o ns t a g e si n d u c e st h ef o r m a t i o no faf r u i t i n gb o d y c o n s i s t i n go fa h e a do fs p o r e ss u p p o r t e do nas t a l ko fv a c u o l a t e dc e l l s s p o r e s a w a i td i s p e r s a ia n dg e r m i n a t ej nf a v o u r a b l ec o n d i t i o n sf o ra m o e b o i dg r o w t h h o w e v e r , t h ef o r m a t i o no fs t a l k c e l l si sap r o c e s so fc e l id e a t h s oi t i sa c o m b i n e dc o u r s eo fd i f f e r e n t i a t i o na n da p o p t o s i s c u r r e n te v i d e n c e ss u g g e s t t h a tc y t o c h r o m ecn o to n l yt a k ep a r ti ne n e r g yp r o d u c i n gf o rt h ec e l l ，b u ta l s o p l a yac r u c i a ir o l ei nc e l id i f f e r e n t i a t i o na n dc e l ia p o p t o s i s i ti n d u c ea p o p t o s i s b ya c t i v a t e sa p a f - l ( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n g f a c t o r1 ) a n dc a s p a s e - 9 w h i c hs t i m u l a t et h ec a s p a s e 3a n dt h ef o i i o w i n gc h e m i c a ia n dm o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c eo fa p o p t o s i s h o w e v e ri t sf a i r l yk n o wa n db a r e l yr e p o r t e dt h er o l e o fc y t o c h r o m eci na p o p t o s i so fp r e s t a l kc e l l si nd i c t y o s t e l i u m k a x 3c e l l s ( w i l dt y p e ) a n da k l2 7c e l l s ( m u t a n tt y p e ) w e r et a k e na s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l sa n dt h em i t o c h o n d r i aw e r eg o ta td i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a ls t a g e s a p p e a r a n c eo fa g g r e g a t i o n ，m o u n d ，s l u g ，c u l m i n a t i o n s t a g e sw a so b s e r v e di nk a x - 3c e l l s h o w e v e r , t h em u t a n t t y p es t r a i na k l 2 7 u n d e r g o e sn o r m a lc h e m o t a x i s 。b u ti s a r r e s t e da tt h ei o o s ea g g r e g a t es t a g e a k l2 7c e l l se v e n t u a l l yd i s s o c i a t ei n t os i n g l e c e l l i n a d d i t i o n 。c e l l - t y p e 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 d i f f e r e n t i a t i o ni sb l o c k e dj nt h e s em u t a n tc e l l s t h em e t h o d so fw e s t e mb l o ta n ds e m i q u a n t i t a t i v ee v a l u a t i o nr t - p c r w e r eu s e dt od e t e c tt h e c h a n g e so fq u a n t i t ya n de x p r e s s i o nl e v e l o f c y t o c h r o m ecb e t w e e np r e s t a l kc e l l sa n dp r e s p o r ec e l l sa t1 6 h 、1 8 h 、2 0 ho f m u l t i - c e l l u l a rd e v e l o p m e n t ，i no r d e rt od i s c u s st h er o l eo fc y t o c h r o m eci n a p o p t o s i so fp r e s t a l kc e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：1 ，t h ea m o u n t so f m i t o c h o n d d a ic y t o c h r o m ecp r e s e n t sai n c r e a s i n gt e n d e n c yw h i l et h ea m o u n t s o fc y t o p l a s m i cc y t o c h r o m ecp r e s e n t si n v e r s e l yad e c r e a s i n gt e n d e n c yi n p r e s t a l kc e l l sd u n n gd e v e l o p m e n t a l16 h - 2 0 h 。t h et w or e l a t e de v e n t si n d i c a t e t h a tc y t o c h r o m ecw h i c hm a yc a u s es u b s e q u e n t l ya p o p t o s i sw a sr e l e a s e d g r a d u a l l yf 吣mm i t o c h o n d d ai n t oc y t o p l a s m i c b u tt h ep h e n o m e n o no fl o t so f c y t o c h r o m ecs t i l ls t a y e di nm i t o c h o n d n as h o w e dt h a tt h ea p o p t o t i cp r e s t a l k c e l l ss t i l la l i v ea n dn e e de n e r g yp r o d u c e db yr e s p i r a t o r yc h a i np a r t i c i p a t e db y c y t o c h r o m ec 2 ，t h et o t a ia m o u n t so fc y t o c h r o m ec ( i n c l u d em i t o c h o n d d a c y t o c h r o m eca n dc y t o p l a s m i cc y t o c h r o m ec ) i np r e s t a l kc e l l sw h i c hs h o w sa d e c r e a s i n gt e n d e n c yi nl a t e r18 h ，2 0 hw a sh i g h e rt h a ni np r e s p o r ec e l l s t h i s r e s u l ts u g g e s t e ds o m em e c h a n i s mh a si m p r o v e dt om a k eu pt h ed e f i c i e n c y o fe l e c t r o n c a r d e rc y t o c h r o m ecw h i c hr e d u c e db yr e l e a s i n g ，a n dr e l i e v eo ft h e e f f i c i e n c yo ft h i sm e c h a n i s mw a sh e l p i n gc e l l st og o t od e a t h 3 ，t h ee x p r e s s i o n l e v e lo fc y t o c h r o m eci np r e s t a l kc e l l si sh i g h e rt h a ni np r e s p o r ec e l l si ne a c h d e v e l o p m e n t a ls t a g e t h i sr e s u l t ss h o w st h er e q u i r e m e n t so fc y t o c h r o m eci n t r a n s c t i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s a n dv e r f i f i e st h e h y p o t h e s i sp r o p o s e d p r e v i o u s l y a sw ek n o w , w h e nd i c t y o s t e l i u m ，w h o s ed e v e l o p m e n t a lc y c l ei s 2 4 h ，d e v e l o p s2 0 h ，m o s to r g a n e l l ew a sd i s r u p t e da n dt h er e q u i r e m e n t so f c y t o c h r o m ecw a si o w , s ot h et r a n s c r i p t i o no fc y t o c h r o m ecw a st od e c r e a s e a n dd c r e a s et h et o t a la m o u n ti nl a t ea p o p t o s i s a sar e s u l t ，t h er e g u l a t i o no f t h et r a n s c r i p t i o no fc y t o c h r o m ecw a sc l o s e l yr e l a t e dw i t ha p o p t o s i s 4 ，i t sa g r a d u a lp r o c e s si na p o p t o s i so fp r e s t a l k r e s u l t so fo u rl a b o r a t o r ys h o w e dc y t o c h r o m ecw a st a k i n gp a r ti nt h e a p o p t o s i so fp r e s t a l ko fd i c t y o s t e l i u mk a x - 3c e l l s k e yw o r d s ：a p o p t o s i s ；c y t o c h r o m ec ：d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ；m i t o c h o n d n a 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我 所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 学位论文授权使用声明 日期：塑笾： p 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：导师签名： 吼盥日期：p 6 f c 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 第一章前言 1 、盘基网柄菌与细胞凋亡 细胞凋亡如同细胞生长分化一样，是生命活动中重要的细胞学事件，不同于 因受各种伤害导致的细胞坏死，它是一种遵循自身程序结束其生命的主动的细胞 学过程，以保证机体能及时清除过多的衰老的或受损的细胞，维持正常的新陈代 谢。在某些生理或病理因素的条件下，细胞对内外信号刺激做出应答反应，触发 程序性细胞死亡机制。它对于健康机体的维持、神经系统的正常发育、免疫系统 正常功能的维持等方面具有重要意义。 1 1 细胞凋亡的特征 形态方面，细胞收缩变圆，胞体变小，胞膜皱缩但完整，常形成泡状突起， 胞浆密度升高；细胞的缩小使细胞间距增大，相互脱离；胞核固缩，染色质凝集， 呈斑块状或月牙状；进而细胞内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体； 最后被巨噬细胞上的受体识别并被吞噬。其溶酶体、线粒体、细胞膜结构完好， 维持着内外渗透压梯度的平衡和密封状态，因此没有细胞内容物的外溢现象，因 而也不引起组织的炎症反应【1 1 。 生化方面，胞浆内c a 2 + 浓度升高，激活c a 2 + 依赖性核酸内切酶。这些酶在降 解d n a 的同时，也常常引起胞浆内蛋白质交联或细胞骨架破坏；染色质d n a 被 核酸内切酶有控降解为5 0 3 0 0 k b 或1 6 0 2 0 0 b p 的寡核苷酸片断【2 】。 1 2 细胞凋亡的信号传导途径 细胞凋亡的信号传导途径极其复杂，但许多细胞凋亡的诱因常通过相同的路 径来传导死亡信号，这些路径被称为凋亡信号传导的基本通路。l o c k s h i n 通过 观察鳞翅目昆虫节间肌肉的正常衰变及变性肌肉的超微结构改变，得出结论：当 细胞受到生理性和病理性刺激作用后能触发凋亡起始信号，按一系列精确的反应 程序启动自身遗传机制，形成级联放大的信号传导和基因表达；再通过信号传导 系统将信号传导至效应器，最终导致生理性死亡【3 l 。在哺乳动物中主要有两种途 径导致了细胞凋亡：受体凋亡途径( 胞外途径) 和线粒体凋亡途径( 胞内途径) 【2 4 】 o 1 2 1 受体凋亡途径 死亡受体( d e a t hr e c e p t o r ) 是能够诱导细胞凋亡的t n f 超家族的亚型，目 前已发现f a s 、t n f - r 1 、t r a m p 、t r a i l 一1 和t r a i l - 2 五个家族成员。这些 受体同属l 型膜蛋白，其共同特点是胞外部分富含半胱氨酸残基，胞内部分含有 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 与死亡信号传导相关的死亡区域( d e a t hd o m a i n ) 【4 l 。除t r a m p 外，t n f 死 亡受体家族相应的配基已被确定，其结构也具有相似性，皆属型跨膜蛋白：由 三个相同的亚单位组成的活性配基与受体结合后促使受体聚合而激活。此外配基 也可由金属蛋白酶催化后以可溶性形式存在。受体通过死亡区域直接或间接与细 胞内衔接蛋白( a d o p t o rp r o t e i n ) f a d d 相偶联。f a d d 是一种胞浆蛋白，c 端 含有死亡区，n 端是一种新的蛋白基序，是死亡信号传导的必需成分，称死亡 效应区( d e a t he f f e c t d o m a i n ，d e d ) 【5 j ，当f a d d 与受体结合后，借助于d e d 与f l i c e 偶联形成d i s c ( d e a t hi n d u c i n gs i g n a i i n g o m p i e x ) 复合物。f l i c e 即 c a s p a s e 8 前体，其n 端也含有d e d ，c 端含有典型i c e 蛋白酶结构域，裂解 后导致c a s p a s e 8 自我活化，进而激活下游效应c a s p a s e 诱导细胞凋亡闸。体 外研究表明c a s p a s e 8 能够直接裂解c a s p a s e 3 ，4 ，7 ，9 ，1 0 ，通过其他c a s p a s e 可间接裂解c a s p a s e 2 ，6 r n 。 1 3 凋亡相关基因的调控 基因是生物体活动的总指挥，调控细胞的生长与凋亡。细胞凋亡的主动性和 程序性以及细胞凋亡时的形态学和生化变化也是一系列基因的激活、表达、调控 的结果。细胞凋亡的相关调控基因包括促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基 因两大类嘲，它们相互牵制，相互影响，共同影响细胞凋亡。 1 3 1 凋亡促进基因 凋亡促进基因包括细胞色素c 、野生型p 5 3 、i c e 、t g f b 、f a s 、c - m y c 、 c e d 一3 、c e d 4 、b a x 等。其中c e d 3 、c e d 4 是在线虫体内发现的，而p 5 3 、i c e 等存在于哺乳动物中。p 5 3 为肿瘤的抑制基因，分为两型：一型为野生型，可 使细胞周期停止在g 1 期，抑制细胞繁殖，诱导易感细胞发生凋亡；另一型为具 有突变能力的变异型。白介素1b 转换酶( i n t e r l u k i n l b c o n v e r t i n g e n z y m e ， i c e ) ，与线虫细胞凋亡相关基因c e d 3 有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋 亡的作用1 9 1 。f a s 为死亡受体，f a s l 是t 淋巴细胞产物，f a s 和f a s - l 结合诱 导细胞凋亡。癌基因c m y c 是调控细胞周期的主要基因。研究表明，c - m y c 在 哺乳动物的细胞凋亡中发挥作用，它的过度表达既可使细胞周期变短、分裂增加， 也可使细胞凋亡，这主要取决于能否获得关键的生长因子。c l e v e l a n d 10 】认为， 抑癌因素存在时，c - m y c 促进凋亡，而有致癌因素时，c m y c 促进增殖。b a x 为 b c l 2 基因家族成员，可诱导细胞凋亡【1 们。 1 3 2 凋亡抑制基因 凋亡抑制基因包括b c l 一2 ，r b ，c e d - 9 ，突变型p 5 3 等。b 细胞淋巴瘤自血病 基因2 ( bc e l li y m p h o m a i e u k e m i ag e n e2 ，b c l 2 ) 是细胞凋亡研究中最受重视 的原癌基因之一。y a n g 等对b c l - 2 、细胞色素c 、细胞凋亡三者之间的关系进行 2 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 研究得出结论：b c i 2 对细胞凋亡的调节作用是一个关键因素，它能通过阻止细 胞凋亡信号传导系统的最后共同通道而抑制细胞凋亡【1 2 1 。对哺乳动物能抑制多 种细胞类型的细胞凋亡，抑制由多种因素引起的细胞凋亡。突变型p 5 3 丧失野 生型p 5 3 诱导细胞凋亡的作用，可抑制细胞凋亡。突变型p 5 3 还可拮抗c - m y c 引起的凋亡敏感性，从而对凋亡起到间接负调控作用闸。 1 4 盘基网柄菌细胞凋亡进展 由于盘基网柄菌前柄细胞凋亡发生在多细胞分化和发育的过程中，因此与己 有的发生在高等动物的凋亡现象相比较，盘基网柄菌前柄细胞的凋亡既有相同之 处也有其独特之处。有关学者己经运用荧光染色的方法对盘基网柄菌凋亡的形态 学特征例如细胞膜磷脂酞丝氨酸，线粒体膜电位以及细胞膜的完整性进行了有关 的研究。 盘基网柄菌由前柄细胞向柄细胞的分化过程中发生了凋亡的现象：磷脂酰丝 氨酸残基的外翻、线粒体跨膜电势的下降、光天蛋白酶3 的活性增耐1 3 1 。这种凋 亡现象与一种位于线粒体内膜上的黄素蛋e t d d a i f ( d i c t y o s t e l i u mh o m o l o go f a p o p t o s i s i n d u c i n gf a c t o r ) 有判1 4 1 。荧光免疫显示d d a i 馒初定位于线粒体内膜， 用t b l a s t n 在粘菌c d n a 文库中搜索哺乳动物a i f 的同系物确定了d d a i f ，并命 名为s l b 3 4 8 。利用基因特异引物和特异的锚引物，通过在盘基网柄菌的c d n a 文库中p c r ，克隆其5 端，所得产物克隆至i j p g e m t 载体上，排序，然后融合 至u s l b 3 4 8 ，最后获得全长d d a i f ，其序列号是a j 2 7 2 5 0 0 ，位于盘基网柄菌第5 条染色体的1 3 0 6 1 7 0 虱j 1 3 0 7 8 5 7 。其c d n a 全长1 7 k b ，编码约6 0 k d a 的蛋白质r 。 成熟的d d a i f 大约5 3 k d a ( 通过w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定) ，其中大于3 0 的区域与 人的a i f 一致，6 0 的区域相似。与哺乳动物a i f 一样，d d a i f 包含一个线粒体导 向位点( m l s ) 1 6 1 、一个核导向位点( n l s ) 1 1 7 】和一个处于c 端的螺旋转角螺 旋d n a 结合基序【1 8 1 。所有可以与f a d 和n a d 辅基相互作用的氨基酸都可以在 d d a i f , 串找到【19 l 。d d a i f 与哺乳动物a i f 非常相似，特别是在它的系统发生上保 守的氧化还原酶结构域，且该结构域在细胞核凋亡中是必须的。当有d i f - 1 存在 时释放到细胞质中，随后导向了细胞核，最终导致了细胞死亡。由此可以看出代 表单细胞生物的盘基网柄菌中的凋亡诱导因子d d a i f 在结构上与哺乳动物a i f 二t f - 常相似，具有一定的保守性。 盘基网柄菌细胞多细胞发育至蛞蝓体约1 6 小时后，有多达1 8 7 的细胞被 结合异硫氰酸荧光素的a n n e x i n v 所标记【13 】，这一比例与蛞蝓体中前孢子细胞和 前柄细胞的分配比例刚好相符，进一步的观察还发现在细胞分化刚完成时细胞膜 磷脂酰丝氨酸外翻的细胞分布在蛞蝓体头部，即前柄细胞区域。也有学者注意到 蛞蝓体时期前柄细胞线粒体膜电位发生了下降的情况，而且其比例占整个蛞蝓体 3 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 细胞的2 0 。已有的研究表明d n a 片断化是细胞凋亡晚期的一个重要指标，有 学者电泳分析凋亡柄细胞后发现并没有片断化的分子条带出现，针对于这种结 果，b l u m b e r g 等认为这是因为盘基网柄菌的染色体中并没有出现像后生动物中 那样的规则的核小体结构所造成的僻饥。d n a 片断化的原因在于d n a 发生了核小 体之间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片断，盘基网柄菌染色体内 没有类似于后生动物中规则的核小体结构，即使在有关酶的作用下发生了降解也 难以产生大小为1 8 0 2 0 0 b p 整数倍的d n a 条带。由于盘基网柄菌前柄细胞的 凋亡过程同时又是柄细胞的分化过程，因此前柄细凋亡期间也发生了一些独特的 形态学变化，如自噬泡，线粒体内自噬现象，纤维素细胞壁的形成以及细胞核的 变化，这些形态学特征不仅是凋亡的标志，也是细胞分化的结果。目前有关细胞 色素c 在自然生长的盘基网柄菌凋亡中的作用研究较少，而在自然多细胞发育的 细胞中细胞色素c 起了什么作用，线粒体膜结构是否发生了变化目前仍然不是很 清楚，值得我们去研究。已有研究表明a i f 诱导的核凋亡在单细胞状态的盘基网 柄菌中起主要作用【2 1 1 ，而自然生长的多细胞体细胞核的凋亡在前柄细胞分化最 后阶段才发生，因此我们推测必然有其它的凋亡诱导因子在自然生长的盘基网柄 菌中发挥作用。 2 、线粒体、细胞色素c 与细胞凋亡 线粒体是a t p 合成的主要场所，对维持细胞正常生理功能起着重要作用。线 粒体不仅做为体内的“能量加工厂一，而且还与氧自由基的产生，细胞死亡进程 的调控有关。线粒体是具有双层生物膜的小体，内膜上具有许多皱折及颗粒，是 线粒体氧化磷酸化合成a t p 的部位。此外，线粒体含有自身的基因组一线粒体 d n a ，通过转录和翻译，产生一部分与氧化磷酸化有关的蛋白质，在细胞凋亡 的发生中起着重要作用，被形象地称为细胞凋亡的“燃烧室 。 2 1 线粒体与能量代谢 与氧化磷酸化有关的蛋白质位于线粒体内膜上，主要包括由氧化还原酶复合 体组成的电子传递链、a t p 合成酶以及腺苷转运体( a n t ，a d e n i n en u c l e o t i d e t r a n s l o c a t o r ) 。电子传递链是由7 0 多种多肽组成，按氧化还原电势由大到小依 次排列，被分为四类酶复合体，分别称为复合体i 、i i 、i 和。由三羧酸循环 或脂肪酸b 氧化产生的n a d h 及f a d h 2 等以还原当量进入电子传递链，来自 n a d h 的电子首先进入酶复合体i ( n a d h 脱氢酶) ，随后传递给辅酶q ( c o q ) ，来自f a d h 2 的电子首先进入酶复合体i i ( 琥珀酸脱氢酶) ，随后传递 给c o q ，电子从c o q 依次经过酶复合体i i i ( 细胞色素c 还原酶) 、酶复合体( 细 胞色素c 氧化酶) ，最后传递给氧产生水。在电子传递过程中所释放的能量被用 4 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 来将基质内的质子泵出到线粒体内膜外，从而在线粒体内膜两侧产生一电化学梯 度，形成线粒体膜电位( 1 l rm ) 。内膜外的质子可通过a t p 合成酶f 0 亚基上的质 子通道流回到基质内，质子回流所释放的势能被用来使a d p 磷酸化形成a t p 。 线粒体内的a t p 随后在a n t 的作用下与胞浆a d p 交换，进入到细胞浆为细胞 提供能量。 2 2 线粒体内的遗传物质 线粒体本身的遗传物质线粒体d n a ( m t d n a ) 位于线粒体基质内，每 个线粒体内含有数个拷贝。信息容量并不大，它的编码可能要比d n a d 、几万倍。 对细胞来说，为了保证m t d n a 及线粒体遗传系统的功能，需要几十种由细胞核 基因组编码的酶参加。m t d n a 的形态学已用电子显微镜及沉降分析法加以研究。 后生动物的m t d n a 具有环形结构，其大小恒定，长约5 l lm ，分子量约为1 0 4 k d 。 m t d n a 属母性遗传，哺乳动物精子细胞m t d n a 拷贝数非常低，而卵细胞内的 拷贝数极高( 1 0 5 ) ，所以子代细胞内线粒体基因主要来源于母亲。m t d n a 是 一种双链环形分子，与线粒体功能有关的其它基因，如编码其它氧化磷酸化蛋白， 代谢酶、d n a 和r n a 多聚酶、核糖体蛋白、以及m t d n a 调节因子等都是由核 基因所编码，它们在细胞核及胞浆内经转录和翻译后经特殊的载体运输到线粒体 内。 盘基网柄菌的m t d n a 含有5 5 ，5 6 4 b p ，其中a + t 碱基对占7 2 6 。其基因组 包含核糖体r n a ( ( m l 和m s ) ， 1 8t r n a s ，n a d h 脱氢酶复合物的1 0 4 亚基 ( n a d l ， 2 ，3 ，4 ，4 l ，5 ，6 ，7 ，9 和1 1 ) ，细胞色素b 前体基因， 细胞色素氧化酶3 个亚基，a t p 合成酶复合物的4 个亚基( a t p l ， 6 ，8 和9 ) ， 1 5 个核糖体蛋白，和另外五个开放阅读框。盘基网柄菌m t d n a 有以下显著特点： ( 1 ) 所有的基因都是同一条d n a 链所编码；( 2 ) 如其它原生动物一样，c o x l 基 因没有终止子，c o x l 和c o x 2 基因融合为一个基因；( 3 ) 本身编码的t r n a 数量不 足以支持线粒体蛋白的合成：( 4 ) 在m la n dc o x l 2 基因序列中有5 组i 型内含子， c o x l 2 含其中3 组，并含有四个独立的开放阅读框。 目前，越来越多的研究证明线粒体在调节细胞生长分化的转变机制、细胞类 型的决定、细胞运动存在重要的作用 2 2 1 。通过盘基网柄菌a x - 2 细胞切除其线粒体 1 4 的m t d n a ) 建立p b 细胞株，该细胞株显示以下特性：饥饿条件下其分化速 度明显延缓，发育阶段停滞于蛞蝓体时期，因而无法形成子实体结构。而且，在 蛞蝓体中细胞类型的模式和细胞类型的比例都发生了很大的变化：前孢子细胞的 分化受到明显的抑制，原来的前端为前柄细胞后端为前孢子细胞的结构模式也发 生了改变。趋光性试验发现，p 1 3 细胞株的蛞蝓体的爬行运动也表现出轻微的 混乱。所有结果表明，在盘基网柄菌细胞发育期间m t d n a 很可能在细胞分化的 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 进程中有着极为重要的意义。 2 3 线粒体凋亡途径 n e w m e y e 趣过对无细胞体系的研究表明，细胞核凋亡样的改变必须在线粒 体匀浆存在的条件下才能出现，从而发现线粒体在凋亡进程中的重要作用。线粒 体在多细胞生物的细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，通过释放促凋亡因子如 细胞色素c 激活c a s p a s e s 途径，释放凋亡诱导因子( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r ， a l p ) 诱发c a s p a s e s 非依赖性途径。细胞色素c 可激活半胱氨酸蛋白酶( c a s p a s e ) 启动细胞凋亡。c a s p a s e 是一类富含半胱氨酸的蛋白酶，存在于大多数细胞内， 通常它们以单链的酶原形式存在于胞浆内。所有i 拘c a s p a s e 均有一个功能前区和 一个酶促中心组成，功能前区结构的差异决定t c a s p a s e 功能的不同。它具有高 度保守的底物结合和酶促序列，且均在天门冬氨酸后将底物裂解。胞浆内的细 胞色素c 在a t p 、d a t p 的参与下，与a p a f - 1 ( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v i n gf a c t o r - 1 ) 形成一个复合体，a p a f - l 通过其氨基端和c a s p a s e - 9 的功能前区相互作用，导 致c a s p a s e 3 的激活，后者可进一步激活c a d ( c a s p a s e - a c t i v a t e dd n a s e ) ，最 终导致染色体凝集，d n a 断裂，发生凋亡。 线粒体具有介导细胞生和死的功能：线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮 存c a 2 + 、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用，它为细胞的各种生命活动提 供基础能量。研究发现，线粒体内也包含一些与细胞凋亡密切相关的物质，如细 胞色素c ( c y t c ) 、凋亡诱导因子( a i f ) 、c a 2 + 和活性氧自由基( r o s ) 等。在凋亡 信号的刺激下，线粒体膜通透性增加，由此产生一系列关键性变化，包括c y t c 的 释放、线粒体跨膜电位( v m ) 的下降、细胞内氧化还原状的改变、b c l 基因家 族成员的介入等。不同信号的传导最终集中到线粒体上激活或抑制这些事件的发 生，再经相应的信号传导通路调控凋亡1 2 3 1 。线粒体通透性转换孔( m i t o c h o n d r i o n p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p t p ) 被称为细胞生死开关的m p t p ，是由电位 依赖性阴离子通道( v o l t a g ed e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l v d a c ) ，i i p ：l 蛋i 刍( p o r i n ) 、 腺苷酸移位酶( a d e n i nn u c l e o t i d e t r a n s l o c a s e ，a n t ) 及亲环素d ( c y p d ) 组成的 复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构。v d a c 位于线粒体外膜中，为非 专一性孔蛋白，其运输作用由专一性的反向转运载体( a n t i p o r t e r ) - a n t 来调节。 a n t 是甲状腺素的专一受体，单独存在时对c a 2 + 非常敏感。在健康的线粒体 中，v d a c 和a n t 形成了一个大分子复合物，在生成a t p 的基质和消耗a t p 的细胞质之间运送腺嘌呤核苷酸。但是在应激状态，如c a 2 + 浓度升高、氧化应 激、腺嘌呤核苷酸的耗竭、无机磷酸盐浓度升高、线粒体内膜的去极化和缺血再 灌注损伤时产生的刺激物都能促使m p t p 开放【2 5 1 。尽管有报道促凋亡( b a x 和 b a k ) 和抗凋亡( b c l 一2 和b c l - x l ) b c l 一2 家族蛋白能够与a n t 和v d a c 相结合， 6 2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 但这些连接的功能和作用目前还在争论之中 4 1 。c y p d 属于分子伴侣 ( m o l e c u l a rc h a p e ro n e ) ，有肽基脯氨酸顺反异构酶活性，在线粒体嵴的基质 面结合到m p t p 上，与m p t p 的环胞菌素敏感性有关。 2 3 1 细胞色素c 通路 细胞色素c 从线粒体释放后，不仅使线粒体呼吸链、电子传递受阻，细胞能 量供应减少，而且细胞色素c 进入胞质后，可水解c a s p a s e - 9 酶原成c a s p a s