（微生物学专业论文）lipstatin的开发与研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文 摘要 l i p s t a t i n 的开发研究 摘要 l i p s t a i n 是毒三素链霉菌产生的一种抑制胰脂肪酶活性的次级代谢产物。其四氢 衍生物已经开发成为一种新型的减肥药物塞尼可。 本文对l i p s t a t i n 产生菌毒三素链霉菌进行了菌种选育，对发酵条件及发酵培养基 进行了优化，探索了毒三素链霉菌的原生质体制备方法及质粒抽提方法。 利用双氢链霉素作为一种筛选压力，结合紫外线及n t g 诱变方法对毒三素链霉 菌进行了筛选。结果表明，双氢链霉素的加入有利于筛选得到l i p s t a t i n 高产菌株。 对毒三素链霉菌的发酵工艺进行了优化。确定了最佳发酵温度为3 04 c ，最优初 始p h 为6 0 ，最佳摇瓶装量为1 0 ，最佳摇床转速为2 2 0 r p m ；通过培养基的单因素 试验及正交试验最终确定最佳发酵培养基配方为：豆油5 0 ，甘油2 0 ，去脂 黄豆粉3 0 ，卵磷脂1 6 ，m g s 0 4o 0 0 5 ，z n s 0 4o 0 1 。 成功制备了毒三素链霉菌的原生质体。考察了培养基组分、甘氨酸浓度、溶菌酶 浓度、酶解温度及酶解时间等因素对原生质体的形成和再生的影响。通过质粒抽提实 验证明本实验所用菌株内不含有质粒。 关键词：l i p s t a t i n ；毒三素链霉菌：抗生素诱变育种；发酵工艺优化；原生质体制 备：质粒抽提 上海师范大学硕士学位论文 摘要 t h er e s e a r c ha n dd e v e l o p n 狲to f l i p s t a t i n a b s t r a c t l i p s t a t i ni sa ni n h i b i t o ro fp a n c r e a t i cl i p a s e si s o l a t e df r o ms t r e p t o m y c e st o x - y t r i c i n i ， w h i c ht e t r a h y d r o d e r i v a t i v eh a sb e e nc l i n i c a lu s e df o rt r e a t m e n to ns e v e r eo b e s i t yn a m e d x e n i c a l t h i sp a p e rd e a l tw i t ht h es t r a i ns c r e e n i n go f s t r e p t o m y c e st o x y t r i c i n i ，t h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n ，t h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dp l a s m i de x t r a c t i o n s t r e p t o m y c i n w a su s e di ns t r a i n s c r e e n i n g c o m b i n e dw i t ht r a d i t i o n a l m u t a t i o n m e t h o d ss u c ha su va n dn t gt os c r e e n i n gs t r e p t o m y c e st o x y t r i c i n i t h r o u 【曲c a r e f u ls t u d y , w ef o u n dt h a tt h i si sa ne f f e c t i v em e t h o di ns t r a i ni m p r o v e m e n t t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s i n gw a so p t i m i z e d ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r ei s 3 0 ，s t a r t i n gp hi s6 0 ，r o t a t i n gs p e e d i s 2 2 0 r p m t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m i n g r e d i e n t si n c l u d e d ：b e a no i l5 o ，g l y c e r o l2 0 ，d e f a t t e ds o y b e a r lp o w d e r3 0 ，l e c i t h i n1 6 ， m g s 0 4o 0 0 5 ，z n s 0 4 0 0 1 s u c c e s s f u l l y , w ep r e p a r e da n dr e g e n e r a t e dt h ep r o t o p l a s to f s t r e p t o m y e e st o x y t r i c i n i t h e p a r a m e t e r so f m a k i n gp r o t o p l a s tw e r es t u d i e d n op l a s m i dw a sf o u n di nt h es t r a i nw e u s e d k e yw o r d s ：l i p s t a t i n ，s t r e p t o m y c e st o x y t r i c i n i ，s t r a i ns c r e e n i n g ，f e r m e n t a t i o np r o c e s s o p t i m i z i n g ，p r o t o p l a s t ，p l a s m i de x t r a c t i o n 2 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 第一篇文献综述 l 减肥药物的研究现状及进展 肥胖是一种世界范围的常见疾病，当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以 脂肪的形式储存于体内。因为体脂的增加使体重指数 b m i = 体重( k g ) 身高2 ( m ) 大于2 4 者称为肥胖症。无明显病因可寻者称为单纯性肥胖，具有明确病因者称之为 继发性肥胖。随着人们物质生活水平的不断提高，单纯性肥胖正逐渐成为一种较为 常见的病症。它不仅影响美观而且是引发多种疾病( 如：非胰岛素依赖型糖尿病、心 脏病、脑血管疾病、呼吸系统疾病、某些癌症) 的危险因子。因此对它的防治有着十 分重要的临床意义。当饮食和运动疗法对治疗无效( b m i 3 0 k g m 2 ，或b m i 2 7 k g m 2 伴有高血压、糖尿病、高血脂等危险因素) 时，应考虑辅以药物治疗。科学工作者 从未停止过对新的、安全性较高的治疗肥胖药物的研究和开发。 目前开发应用的减肥药物主要分为食欲抑制剂、产热剂( t h e r m o g e n i ca g e n t s ) 、 消化吸收阻滞剂、激素调控剂( h o r m o n a lm a n i p - u l a t i o n ) 四大类( 见表1 ) “。 表1 减肥药的分类 1 1 食欲抑制剂 食物抑制剂均作用于中枢神经系统 4 】。 作用于儿茶酚胺通路的药物般都具有中枢兴奋作用，是间接作用的拟交感胺， 可与去甲肾上腺素竞争抑制去甲l 肾上腺素的摄取，还可被交感神经末梢摄取进入囊 泡，通过置换作用而使囊泡储存的去甲肾上腺素漏至胞浆，然后释放出突出间隙，通 过兴奋下丘脑的饱觉中枢，抑制摄食中枢，从而引起食欲的减退。但是，这类药物的 圭塑堕蔓奎兰堕圭堂垡堡苎三型查! 童查 毒性是最让人头痛的问题。其中最常见的副作用即是其中枢兴奋作用，包括失眠、紧 张、不安、噩梦、易怒、欣快感及随后的疲劳、忧郁，还可能会出现口干、厌食、腹 部绞痛、胃肠功能紊乱、头眩晕、心动过速、血压上升或下降等症状。此类药物不推 荐用于肥胖症的治疗，即使是迫不得己，也仅用于短期治疗。目前这类药物在临床上 己较少使用。 作用于5 一羟色胺通路的药物在治疗剂量下是抑制中枢系统的，具有镇静作用。它 促进神经末梢释放5 一羟色胺，选择性抑制其再摄取，刺激下丘脑的饱觉中枢，减少饥 饿感。它还能增加葡萄糖的利用，降低血糖。其常见的副反应也与中枢神经的不良反 应密切相关( 右旋) 芬氟拉明曾批准用于肥胖的长期治疗( 3 个月) ，但从其上市到 1 9 9 7 年，f d a 收到1 0 0 多份与( 右旋) 芬氟拉明使用有关的心瓣膜病反映，显示长 期或大量使用( 右旋) 芬氟拉明可增加心瓣膜病的危险性，而且还可显著提高原发性 肺动脉高压的危险性。另外，还可能产生药物依赖性。因此，在许多国家此药已经从 市场上自动撤回。 西布曲明是德国b a s f 公司之k n o l l 公司开发的减肥药物【5 】，1 9 9 8 年2 月在美国 首先上市，商品名为m e r i d a 。它于1 9 9 7 年作为减肥药获得f d a 的批准。西布曲明 可抑制去甲肾上腺素和5 羟色胺的再摄取，使人产生饱胀感，降低食欲，减少进食。 与其他的中枢作用食欲抑制剂不同，西布曲明的镇静、兴奋、拟交感作用并不明显。 常见的不良反应是与药理作用相关的口干、头痛、厌食、便秘、失眠。而且西布曲明 不引起单胺类神经递质的释放，在人类中显示无滥用的潜在可能性。其减肥作用较强， 同时还可降低腰臀比例，降低血中甘油三酯、总胆固醇、l d l ，升高h d l ，改善i i 糖尿病的血糖控制。西布曲明己成为减肥药市场的主流产品之一，中国也有几家制药 企业生产含盐酸西布曲明的减肥药物。但最近有关西布曲明可使血压升高、心跳加快 的副作用的报道增多，f d a 又撤回了对其的认证，欧盟也未批准其在欧洲上市。 1 2 产热剂诤j 麻黄碱可促进去甲肾上腺素的释放，减少食物的摄入，类似于拟交感神经剂。可 使心跳加速、血压升高、产热增加。而咖啡因可增加钙离子在肌浆网中的通透性，抑 制磷酸二脂酶的活性，也能产生类似于产热的效应。一些“中草药产品”中即含有咖 啡因，从而达到减重的目的。二者合用，有较明显的减肥效果。其主要的副反应多为 瞬时性的，包括震颤、眩晕、失眠等，但长期服用可能会出现肌肉肥大和紧张现象。 b3 受体存在于褐色脂肪组织【7 】。与白色脂肪组织的功能相反，褐色脂肪组织是 将过量摄食到体内的剩余热量变为热散发到体外去的产热脏器 8 】。褐色脂肪组织机能 的降低是肥胖的一种成因。b3 受体激动剂可促进褐色脂肪组织的产热过程，促进体 内脂肪和糖原的氧化与分解。明显减少白色脂肪组织，且不影响摄食量。但成人体内 的褐色脂肪组织存在很少，03 受体的表达量小，且不同的b3 受体激动剂有种属差异 d 占童堕垄查堂堡主堂垡堡壅一一! ! ! 塞堡堕 性，在动物实验中减肥效果好的b3 受体兴奋剂在人体临床效果不一定好等等，均限 制了此类药物的开发。 1 3 消化吸收阻滞剂 塞尼可能够选择性的抑制胃肠道中的胰脂肪酶，为一种“脂肪阻断剂”。它仅在 胃肠道内发挥药理作用，约有3 0 的膳食甘油三酯不被消化吸收，在食物疗法的基础 上可以进一步减少热量的摄入。其高度选择性决定了塞尼可对肠道内的其他酶类( 如： 磷酸脂酶a 2 、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶) 无作用，因此不影响碳水化合物、 蛋白质和磷脂的吸收。塞尼可无全身性作用，停用后，由于酶的持续性分泌可使脂肪 酶活性迅速恢复。口服的塞尼可( 约9 7 ) 经粪便清除，其中8 3 以原形代谢 4 ” 。 其主要不良反应胃肠道反应：腹痛、腹涨、脂肪油性便。 脂肪替代剂通常用作食品添加剂，替代食物中的油脂，它们可以保留食物原有的 风味，同时降低膳食中脂肪的含量。o l e s t r a 是种蔗糖聚酯，卡路里含量为0 。它由 6 8 个脂肪酸链构成，如此庞大的结构使得脂肪酶对它无能为力，因此不被人体吸收。 由于脂肪与塞尼可可以相互“共溶”，从而降低了肠冒对脂肪的吸收，但同时也降低 了肠胃对一些脂溶性维生素( 如：维生素a 、d 、e 、k ) 的吸收。因此，需额外补加 一些脂溶性维生素。 1 4 激素调节剂 在胃肠道和中枢神经系统内存在着一些可控制饮食行为的多肽和激素如：缩胆囊 肽、5 - 羟色胺、胰岛素等。它们可以降低食欲、减少食物的摄入。l e p t i n 也具有类似 的功能，而神经肽- y ( n p y ) 可以增加食物的摄入量，降低能量的消耗。因此这些 激素或多肽的兴奋剂或拮抗剂可能被开发成为有效的减肥药物【8 】。 l e p t i n 的发现为减肥药的开发提供了新的思路。l e p t i n 首次报道于1 9 9 4 年【9 ，它 是o b ( o b e s e ) 基因的表达产物，是一种多肽激素，由脂肪组织细胞分泌。它通过体 内信号通路给大脑传递指令，抑制进食，导致体重的降低，同时还发现l e p t i n 对n p y 有负调节作用。给缺失该基因的肥胖小鼠注射l e p t i n ，结果小鼠的食物摄入量明显下 降，体重减轻。美国已将l e p t i n 作为一种肥胖治疗药物进入i i 期临床研究，且效果显 著。神经肽一y ( n p y ) 是一种神经内分泌多肽，通过“进食受体”发挥其食物摄入 的兴奋作用。目前有公司正在开发对n p y 受体有拮抗作用的化合物 1 0 。 2 微生物来源的脂肪酶抑制剂 2 1 微生物来源的酶抑制剂的研究进展 微生物来源的酶抑制剂是一类重要的微生物次级代谢产物。同本著名科学家 u m e z a w a 首先提出此概念，他所指的酶是动物和人体内产生的参与各种生命活动的 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 相关酶( 而非微生物产生的诸如b 内酰胺酶等产生细菌耐药性的酶) ，从此开创了由 微生物代谢产物中寻找其他生理活性物质的新时代j 。 从传统的抗生素研究转到从微生物的代谢产物中寻找具有生物活性物质的研究， 可追溯到上世纪6 0 年代初，u m e z a w a 领导的研究小组率先开创了酶抑制剂的研究。 最初他们研究的依据是细胞表面的各种水解酶涉及到各种细胞现象的变化，而有些微 生物产生的各种蛋白酶抑制剂对于分析这些细胞表面水解酶的功能是非常有用的。经 过他们的不懈努力最终发现了一系列可作为生化工具的酶抑制剂，如亮肽素 ( 1 e u p e p t i n s ) 、抑靡蛋t ；t ( c h y m o s t a t i n ) 、乌苯美司( b e s t a t i n ) 等。而对乌苯美司进行体内 研究发现其具有免疫调节作用，使当时不少正在从事新抗筛选的研究人员开始从本质 上意识到微生物的次级代谢产物不仅仅可作为抗生素用于 | 缶床治疗，实际上它具有更 广泛的生理活性可被开发成各种药物用于临床治疗。u m e z s w a 等人的研究工作具有 划时代的意义，由此，也开创了微生物药物的新时代1 2 】【1 3 】【1 4 】。 经过无数科研工作者的不懈努力，从微生物的次级代谢产物中陆续发现了许多极 具应用价值的酶抑制剂。由美国默克公司发现的洛伐他r j ( 1 a v o s t a t i n ) 和日本三共公司 发现的普伐他汀( p r a v a s t a t i n ) 是b 羟基1 3 甲基一戊二酰辅酶a ( f 3 - h y d r o x v b m e t h y l g l u t a r y - c o a ，h m g c o a ) 还原酶抑制剂，二者皆已用于高血脂症的临床治疗， 取得了十分显著的效果。日本生命科学与工业杂志曾引述医药界权威的评价，认 为此种新型药物对高血脂症的治疗是一场革命，其深远影响如同青霉素对感染疾病的 治疗 。 近年来已发现了许多具有临床价值的酶抑制剂。由罗氏公司研究开发的塞尼可 ( x e n i c a l ，商品名；又名o r l i s t a t ，奥利司他) 即是其中一个成功的产品 1 5 。塞尼可 是由毒三素链霉菌产生的内源性胰脂肪酶抑制剂一l i p s t a t i n 的四氢衍生物 ( t e t r a h y d r o l i p s t a t i n ，t h l ) ，用于肥胖症的治疗，是目前唯一一个作为非中枢神经系 统作用上市的减肥药物。 2 2 微生物来源的胰脂肪酶抑制剂的种类 自1 9 7 8 年，u m e z a w a 等人在放线菌的发酵液中陆续发现了一系列结构类似的胰 脂肪酶抑制刹，分别命名为e s t e r a s t i n 【1 6 1 刀、e b e l a c t o n e a 和b 1 8 】、v a l i a c t o n f l 9 ( 见表2 ) 。 其中e b e l a c t o n e a 和b 还具有抑制n 一甲酰甲硫氨酸氨肽酶( f m e t a p ) 和提高免疫应答 的活性。它们在结构上的共同点为都有一条带有一个b 内酯环的脂肪长链。 圭量堕堇查堂堡主兰垡笙奎皇堕i 墨堇 表2 微生物来源的胰脂酶抑制剂 里旦婴! 竺鲤 ! 塑! 竺! 一一旦里旦一 n 1 a c e l y 1 a s p ，0 s t r e p l o 脚c e s e s t e r a s t i ni 口l a v e n d u l a e c h ，( c h z ) 4 c h 2 c h c h ：c h - c h c ”w 、i 。” k 。”3 m d 4 一c 1 e b e l a c t o n e a 、b 饴l i a c t o n o hoo o 1 弋吖一 c h ，c h 3c a , c h ，翎3 r = c 呜 s t r e p t o m y c e s 8 “”# “ a b u r a v i e n s i s m g g 1 s t r e p t o m y c e s a l b o l o n g u s m g l 4 7 一c f 2 l i p s t a t i n 。：。叉只俐拼叱streptomycesn40rmyleuch(ch c h c hc hc h c h f n i2 h c h 。 2 。 一 、( c h 2 k c h 3 ，n ”，r ，r 抽， p a n c l i c i n a p a n c l i c i n b p a n c l i c i n c p a n c l i c i n d p a n c l i c i n e ? 彳 c h 3 ( c h 2 ) 7 c h 2 ) c h 3 n - f o r m y gj y 0 ? 彳 c h 。( c h 2 ) 广弋f c 心) t c h ( c h 3 b 。入i n f 。r m 盟y g l y oo o c h ( c h ( c h ：) o c h ， 吖 。a ：， ：八 f o r m 盟y g l y0 0 c h ：( c h ( c h 删。 o f ， 2 ) 7 、2 ) 、，c h 3 s t r e p t o m y c e s s p n r 0 6 9 1 在二十世纪八十年代左右，罗氏公司的科研人员也开始采集真菌及细菌的样品， 目的是寻找对肠道脂肪酶有抑制能力的微生物代谢产物，开发具有应用价值的新型肥 胖治疗药物。他们对采自西班牙马洛卡( m a l l o r c a ) 和瑞士哥斯特德( g s t t a d ) 泥土 样本中的几千种微生物进行筛选，最后发现毒三素链霉菌产生的化合物l i p s t a f i n ( 表 2 ) 最为稳定，作用也最强，它与早期发现的e s t e r a s t i n 仅有一个氨基酸之差。通过对 其解构，罗氏公司又合成了一种更加稳定的l i p s t a t i n 氢化衍生物t h l ，并将其开发成 为减肥药物，塞尼可【2 0 】【2 ”。1 9 9 4 年，罗氏在日本的研发中心又发现了与t h l 结构类 似的p a n c l i c i n a e ( 见表2 ) 【2 2 】吲。他们发现的这些胰脂肪酶抑制剂亦含有1 3 内酯环 的脂肪长链，对于这类化合物罗氏公司进行了系统的研究。 蜊皿 一 一 皿 一 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 2 3 胰脂肪酶抑制剂的作用机制 人体内脂肪的消化主要是在小肠中进行。胰液和胆汁一同分泌到十二指肠中，胰 液中含有的胰脂肪酶是食物甘油三酯水解过程的关键酶，它可以在水油界面上显示出 高度的酶活性，其最适底物是经乳化的甘油三酯。甘油三酯经该酶水解释放脂肪酸和 单酰基甘油，脂肪酸和单酰基甘油再被小肠粘膜吸收( 图1 ) 1 5 。 把囊穗 图1t h l 对脂肪消化的抑制作用 研究表明，胰脂肪酶抑制剂可与胰脂肪酶的活性部位不可逆共价结合 2 ”。人胰脂 肪酶的活性部位位于1 5 2 位的丝氨酸，丝氨酸的侧链羟基可识别并以n 型方式亲核攻 击l i p s t a t i n 的1 3 内酯环与其羧基形成酯键，酶的活性便被抑制。可见b 内酯环是抑制 活性的关键基团【2 5 1 。实验表明s 内酯环被破坏后，其抑制作用几乎完全丧失。 l i p s t a t i n 对胰脂肪酶表现出高度的专一性，而对其他胰酶如：磷酸脂酶a 2 、淀粉酶、 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等，在剂量 2 0 0 1 t m 时亦未见有抑制作用。但此类酶抑制剂 还对其他来源的脂酶具有抑制作用( 表3 ) 。p a n c l i c i nc 、d 、e 表现出比t i l l 更高的 胰脂肪酶抑制能力，而p a n c l i d n a 、b 则低一些，可能与侧链上甲酰化的氨基酸种类 的差异有关。但比较其不可逆的酶抑制作用发现t h l p a n c l i c i na 和b p a n c l i c i nc 、 d 、e 。究其原因，可能是因为胰脂肪酶是在脂肪小滴( d r o p l e t ) 的表面发生作用， 抑制剂侧链氨基酸部分的疏水性会影响其不可逆抑制作用f 2 3 】。 表3p a n c l i c i n a ea n dt h l 的抑酶活性 ! 蛾! 。生m l 。一、 i n h i b i t o rp o s tr h i z o p u s p s e u d o m c h r o m b 口p 口w 加p h e p a r i n a r r t h i z u s o n a s e s p c e n h h lp 口n c n e n 纯c 2 4l i p s t a t i n 生物合成的研究 占查堕薹查兰婴主堂壁堡苎 奎墼堡垄 德国科技大学和罗氏公司的诸多科研工作者对l i p s t a t i n 的生物合成进行了深入细 致的研究。 l i p s t a f i n 带有一条长的烷基烃链，它可能是由乙酸经过聚酮途径合成；也可能是 来源于现成的脂肪酸链。在最初的研究中，有人试图通过利用放射性同位素标记的乙 酸来阐明其是合成l i p s t a t i n 的构建板块，但实验是失败的。随后a d c l b c r t b a c h e r 等人 进一步研究发现，l i p s t a t i n 的产生菌一毒三素链霉菌可在含有大量油脂的培养基中生 长，说明其可有效的代谢脂类，因此他们将c 标记的油脂加入培养基中，通过同位 素跟踪法与先进的n m r 检测法相结合研究了究竟是部分降解的现成脂肪酸还是完全 降解的乙酰c o a 单元参与了l i p s t a t i n 的生物合成 2 “。 用”c 直接标记甘油三酯价格昂贵，a d e l b e r tb a c h e r 等人非常成功的解决了该问 题。他们利用一种以嵋c o 为唯一碳源的藻类生物s c e n e d e s m u so b b q u u s ，可提取出 u t 3 c 标记的油脂混合物。该混合物的主要成分是一些饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的 酯。将u ”c 油脂与普通的植物油充分混合后加入培养基中，用于研究。 l i p s t a t i r t 的烷基烃链可分为两部分：1 4 碳和8 碳部分。对发酵产物分析发现，烃 链的构建共有4 种方式：( 1 ) 1 4 碳和8 碳部分均无”c ，( 2 ) 1 4 碳和8 碳部分全为连续连 接的”c ( 如图2 示) ，( 3 ) 1 4 碳部分全为”c ，8 碳部分无1 3 c ，( 4 ) 8 碳部分全为”c ， 1 4 碳部分无”c 。这表明培养基中部分代谢的1 3 c 油脂和植物油为l i p s t a t i n 烃链的合 成提供了前体。同时c 2 和c 一3 间未检测到1 3 c 1 3 c 连接信号，证明了烃链是有两部 分装配成的。烃链中再未检测到其他不连续方式连接的”c ，说明利用小的构建板块 ( 如乙酸) 生物合成l i p s t a t i n 的路径在毒三素链霉菌中是不存在的。 叫- 武耋蠢。； o 太。? 父冀誉替毒抖孟盖多 图2u 一”c 油脂发酵得到的l i p s t a t i n 中”c 的连接方式 粗线为”c - ”c 连接 图3 氢化u - 1 3 c 一油脂发酵得到的l i p s t a t i n 中”c 的连接方式 粗线为”c _ 1 3 c 连接 随后他们将u 1 3 c 一油脂完全氢化，将其中的不饱和脂肪酸全部转化为饱和脂肪 酸，再掺入到培养基中。结果检测到l i p s t a t i n 的烃链构建方式只有两种：( 1 ) 1 4 碳和8 上海师范大学硕士学位论文文献综述 碳部分均无1 3 c ，( 2 ) 仅8 碳部分有连续连接的”c ( 如图3 所示) 。由此，他们大胆的 推断1 4 碳部分是来源于培养基中不饱和脂肪酸的代谢产物。氢化后的u ”c 油脂仍 可为8 碳部分和亮氨酸提供前体。u ”c 油脂中有多种不饱和脂肪酸，其中亚油酸 ( 1 8 ：2 ”。1 2 ，结构见图4 示) 双键的个数和位置与1 4 碳部分的双键完全一致，很可 能提供了1 4 碳部分的构建板块。亚油酸经b 氧化、脱氢、脱水反应得到一个1 4 碳化 合物。它与另一个来源于油脂的8 碳代谢产物经过c l m s e n 缩合反应合成了l i p s t a t i n 的烃链骨架( 如图5 示) 。油脂的完全降解产物也可用于亮氨酸的生物合成，但主要 来源于培养基中已存在的亮氨酸 2 2 】。 图4 来源于亚油酸的l i p s t a t i n l 4 碳构建板块 粗线为”c - j 3 c 连接 一、，；，：，工= 且s c 。 + i ：= ： 、 v = 、，= k 。、， 。：i ：蚯= = ：、v 、= 、一一= = 、_ | 、v ；! i ：盥：= = ；：! i ：疆 v 、= 一= = 、卜、- 、v l ；塞o - 0 & o ，。 = h 乞：、卜 、一、v 图5 假设的l i p s t a t i n 生物合成路径 粗线为”c - 3 c 连接 为了进一步阐明l i p s t a t i n 的生物合成路径，a d e l b e r tb a t h e r 等人又采用类似的实 验方法，对l i p s t a t i n 分子中的氢原子来源进行了研究，进一步验证了他们的假设是正 确的f 2 7 】 2 8 。 0 一 圭塑堕堇奎堂堡主堂垡堡壅 苎堕堡垄 可以这样总结，l i p s t a t i n 的生物合成有赖于1 4 碳前体和8 碳前体的生成。而亚油 酸在合成1 4 碳前体的过程中扮演了一个重要的角色。 3 微生物的诱变育种 从自然界分离所得的野生菌种，不论在产量或质量上，均难以适合工业化生产的 要求。理想的工业用菌种必需具备：遗传性状稳定；纯净无污染；能产生许多繁殖单 位：生长迅速：能于短时间内产生所要的产物；可以长期保存；能经诱变产生变异和 遗传；生产能力具再现性；具有高产量、高收率等特性。要获得这些优良性状就必须 高效地对微生物进行选育。而微生物的菌种选育主要是建立在遗传和变异的基础之上 的。一个菌种生物合成的产量和质量主要是由遗传结构和功能所决定，而功能由遗传 结构所控制，改变遗传结构就影响功能，功能的改变使生物合成产物的化学结构、合 成能力和活性也随之改变。微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突 变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的变异株，并且找出发挥这个变异株的最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境 条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突 变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方 法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成 就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大多数是人工诱变选育出来的。 诱变育种在抗生素工业生产上的作用更是无可比拟，几乎所有的抗生素生产都离不开 诱变育种的方法。 诱变是采用某些诱变剂以人工的方法使遗传物质结构改变，从而破坏细胞的自控 系统，引起细胞物质代谢障碍，使其产生人们所需要的产品，这就是变异。这种变异 对微生物本身来说是使其代谢向着异常方向发展，必然引起菌体基本代谢失常，此时 菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却显著地降低了。比如孢子数量由多变少， 生活周期延长，偶然也使某些目的产物( 抗生素、酶等) 的产量提高，这都表现了高 产菌株的特征。细胞生理代谢失调，菌体本身具有自我调节能力，如果由于d n a 损 伤引起失调，那么将对d n a 进行自我修复。菌体自我调节和修复的结果，可能恢复 原有遗传类型和生理状态，也可能发生对产量不利的回复突变或新的负变而使得产量 下降，称为负变。从总体上看，后者几率要比前者多。 高产突变型是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的。比如控制初级代谢 产物的基因、目的产物代谢途径上的结构基因、调节基因、渗透基因、辅助基因等， 这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变。即使是有这种可能，菌体d n a 由于一 次性改变太大，细胞代谢严重失调，而失去生存的可能。高产菌株的产量提高是通过 多代诱发突变逐渐积累的结果，只有那些每次诱变后有1 2 个控制产量的基因突变， 使产物合成稍有增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌株才能存活下来。当然对突变 圭塑堕垫盔兰堡圭兰垡堡塞 一奎堕! 塞查 后的高产菌株来说，由于某些基因突变，原有基因间的协调关系被打乱，对环境的适 应能力将降低，这时就需要调整环境条件，以达到新的平衡，否则将不能生存或被淘 汰。 诱变育种工作包括诱发突变、突变株的筛选和高产突变株最佳环境条件的调整。 诱发突变包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择，影响诱变效果的【习素e 突变株的筛 选包括筛选条件( 培养基和培养条件) 及选择一个简便、快速、有效的筛选方案。环 境条件调整是寻找突变株的最佳培养条件。这是决定诱变育种成败的三个主要方面 。 3 1 出发菌株的选择 出发菌株主要是指每代诱变的试验菌株。出发菌株的选择是决定诱变效果的重要 环节长期育种经验证明，诱变处理前选择怎样的出发菌株，以及对出发菌株的生物学 特征的了解是很重要的。特别是对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及生态、生理、 生化等特性研究，都有利于提高诱变效果。 对一般出发菌株常常要求： 从自然界样品中分离筛选出来的野生型菌株，虽然产量较低，但是对诱变因 素敏感，变异幅度大、正变率高； 在生产中使用的，具有一定生产能力的，并且在生产过程中经过自然选育的 菌株； 采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的 菌株； 由于某些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故而有时 可以考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。 采用一类被称之为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始 菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。增变菌株具有极高的自发突变率，这 是由一种“增变基因”控制的，一旦此基因发生变异，那么d n a 分子上多 数基因都非常容易发生突变： 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应该考虑至少能积累少量所需产物 或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已经通过几次 诱变并发现每次的效价都有一定程度的提高的菌株作为出发菌株； 选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株； 选择纯种以及生物合成能力较高、遗传性状比较稳定的菌株作为出发菌： 在连续诱变育种过程中应该挑选每代诱变处理之后均有一些表型上改变的 菌株，以利于突变率的增加； 采用多出发菌株进行同时诱变。一般采用3 4 株出发菌株，在逐代处理后 圭塑堕翌盔兰堡主兰堡堡塞 兰堂堡垄 将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。 另外，也可以考虑选择产孢予多、色素少、生活能力强、生长速度快、周期短以 及糖氮利用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株作为出发菌。 3 2 出发菌株的纯化 由于微生物易发生变异和染菌，一般丝状菌的野生型菌株多数为异核体，加上生 产菌在不断传代过程中菌丝间接触、吻合后易形成异核体、部分结合子、杂合二倍体 及自然突变产生变异株等，因此诱变前需对其进行纯化。纯种分离法一般采用划线分 离法和稀释分离法，有时也采用更高要求的纯化技术如显微镜操纵器分离单孢子。 3 3 单孢子( 单细胞) 悬液的制各 在诱变育种中所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面 分散状态的细胞可以均匀的接触诱变剂，另一方面又可以避免长出不纯的菌落。菌悬 液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或缓冲液制备而成，一般要求：供试菌种 的孢子或菌体要年轻、健壮；产孢子菌要处理其孢子而不是菌丝；不产孢子的真菌， 可直接处理其年幼的菌丝体。 另外，利用原生质体作为诱变材料也会取得理想的效果。优势有三：解除了细胞 壁对诱变剂的阻碍作用；去壁后的丝状菌的原生质体是异质的，提供了多种多样的诱 变材料；防止了多核菌丝体遗传上的不稳定性。 3 4 诱变剂及诱变剂量的选择 诱变剂的选择主要决定于诱变剂对基因作用的特异性和出发菌株的特性。实践证 明并不是所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。不同微生物对同一种诱变剂敏感 性有很大区别，这不仅是细胞透性的差异，也与诱变剂进入细胞后相互之间作用不一 致有关。所以，目前育种专家还无法做到在诱变工作中用某种诱变剂来达到定向改变 某一性状的目的。 凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变频率的物理因子或化学 物质称之为诱变剂。主要包括物理、化学和生物诱变剂三大类。 物理诱变剂是通常使用物理辐射中的各种射线，包括紫外线、x 射线、y 射线、 快中子、。射线、b 射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。其中对 微生物诱变效果较好、应用较广泛的是紫外线、x 射线、y 射线和快中子。物理辐射 可阻分为电离辐射和非电离辐射，它们都是以量子为单位的可以发射能量的射线。电 离辐射在照射物质的过程中能够把该物质分子或原子上的电子击中并产生正离子，产 生的离子数量随着射线发射的能量增高而增加。非电离辐射过程中被照射物质的分子 或原子中的内层电子级能提高，但不能得到或丢失电子，因此不产生离子。物理诱变 剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一 圭鲎堕蔓奎堂堕主差垡堡苎 一二壁墨! ! 查 系列复杂的连锁反应过程。 化学诱变剂是一类能对d n a 起作用，改变其结构并引起遗传变异的化学物质。 化学诱变剂神类很多，从简单的无机化合物到复杂的有机化合物都能引起诱变效应。 主要包括四大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂以及其他种类。用于诱发突变的 碱基类似物有5 溴尿嘧啶( 5 一b u ) 、5 - 氟尿嘧啶( 5 一f u ) 、5 - 溴脱氧尿嘧啶( b u d r ) 、 5 碘尿嘧啶( 5 - i u ) 等，它们是胸腺嘧啶的结构类似物；2 - 氨基嘌呤( a p ) 、6 一巯基 嘌呤( 6 ，m p ) 是腺嘌呤的结构类似物。最常用的是5 - b u 和a p 。常用烷化剂主要有 亚硝基化合物、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类、硫芥、氮芥等。移码 诱变剂主要包括丫啶黄、丫啶橙、原黄素、i c r 1 7 1 等，主要对噬菌体有较强的诱变 作用。其他化学诱变剂象秋水仙素、抗生素、重金属盐等也具有较好的诱变效果。 生物诱变剂按照诱变方式分为三类：( 1 ) 转导诱发突变。当烈性噬菌体侵人宿主 细胞后，通过随机转导能使宿主细胞的基因型发生改变；( 2 ) 转化诱发突变。受体细 胞吸收其他外源d n a 分子片段后，也能使受体细胞基因发生突变；( 3 ) 转座诱发突 变。d n a 中能够转移的片段若改变了位置就会导致微生物的基因突变。 在诱变剂的选择上应注意：首先对所使用的诱变剂的作用机制以及菌种的特性有 所了解：其次根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂；另外还要参考出发菌株原有 的诱变系谱来选择诱变剂口。 关于诱交的最适齐量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比 例，这样可以减少以后的筛选工作量。诱变剂量的选择是个复杂的问题，不单纯是剂 量与变异率之间的关系，而是涉及到很多因素，如菌种的遗传特性、诱变史、诱变剂 种类及处理环境等。前人的经验认为：经长期诱变后的高产菌株，以采用低剂量处理 为妥：对遗传性状不太稳定的菌株，宣采用较温和的诱变剂和较低的剂量处理。当选 育的目的是要求筛选到具有特殊性状的菌株或较大幅度提高产量的菌株，那么可用强 的诱变剂和高剂量处理。 实际诱变处理中如何控制剂量的大小，化学诱变剂和物理诱变剂不太一样。化学 诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件( 温度、p h 等) 。物理诱变剂主要控制 照射距离、时间和照射过程中的条件( 氧气、水等) 。 另外，在诱变处理的方式上既可以采用单因子处理，也可以采用复合因子处理如， 两个因子同时处理、不同因子交替处理、同一因子重复处理、紫外线光复活交替处理 等。 4 立题依据 近年来，国内肥胖病人不断增加，在不侵犯知识产权的前提下，国外已经上市的 有些减肥药已在国内仿制成功，如：芬氟拉明和西布曲明等，填补了国内减肥药物的 空白。目前由罗氏公司开发的塞尼可在中国的行政保护期限到2 0 0 5 年止，该药的前 4 上海师范大学硕士学位论文文献综述 体l i p s t a t i n 来源于微生物的次级代谢产物，制备过程十分的复杂。国内早在几年前已 有多家企业和科研单位开始研究。 上海来益生物药物研究开发中心在两年前确立了本课题。通过研究，在确证产生 菌的次级代谢产物化学结构的基础上，重点对产生菌的代谢调控和菌种选育进行研 究，以提高产生菌生物合成l i p s t a t i n 的能力，打通实验室制备z i p s t a t i n 的工艺路线，并 积累有关的工艺数据，指导中试放大工作，希望在行政保护期限结束时，可推出我国 自己的产品。 圭塞堕鎏盔堂堡主堂垡堡壅 墨堕堡堕 参考文献 1 2 3 4 5 6 7 8 9 i o 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 a t h l e e np ，m a t i n d a l e 。t h ec o m p l e t ed r u gr e f e r e n c e m ，t h i r t y s e c o n de d i to n l o n d o n ：p h a r m a c u e t i c a lp r e s s ，1 9 9 9 e r u l l ij ，l o m a e s t r ob m ，m a l o n em ，e ta l ，u p d a t eo nt h ep h a r m a c o t h e r a p y o fo b e s i t y j j ，a n n ，p h a r m a c o t h e r ，1 9 9 8 ，3 2 ：8 8 1 0 2 w e i s e rm f r i s h m a nw h ，m i c h a e i s o nd ，e ta l ，t h ep h a r m a c o l o g i ca p p r o a c ht o t h et r e a t m e n to fo b e s i t y j ，j c 1 i n p h a m a c o l ，1 9 9 7 ，3 7 ：4 5 3 7 3 m c n e e l yw ，g o ak l s i b u t r a m i n e ，ar e v i e wo fi t sc o n t r i b u t i o nt ot h em a n a g e m e n t o fo b e s i t y j d r u g s ，1 9 9 8 ，5 6 ( 6 ) ：10 9 3 l e a nm e ，s i b u t r a m i n e ar e v i e wo fc l i n i c a le f f i c a c y j j ，i n t j o b e s 1 9 9 7 ， 2 1 ( s u p p l e ) ：s 3 0 蒋伯诚，新药开发前沿动向3 ：褐色脂肪组织和b 。受体兴奋剂减肥药 j ，中国医药情 报，1 9 9 7 ，3