（无机化学专业论文）含疏水基的大环金属配合物的合成、结构和性质研究.pdf

2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 摘要 探讨碳酸酐酶结构与功能的关系是生物化学、无机化学及计算化学等领域重 要的研究课题之一。为了进一步使模型物具有酶活性中心的生物环境，在过去三 年里，作者对现有最好的模型化合物进行了改造，即在保持原金属离子活性中心 结构的基础上，增加了功能基团和疏水环境，通过与b 环糊精的包合组装新型的 碳酸酐酶模型，在如何建造新型碳酸酐酶模型及相关领域做了些探索性的工作， 并研究了组装前后配合物的溶液性质。以下几个方面是本论文的主要研究结果和 贡献： 1 合成了具有疏水基团的大环配体，1 ( 对异丙苯甲基) 1 ，4 ，7 ，1 0 四氮杂环十 二烷( l = c 1 8 h 3 2 n 4 ) 及其锌( i i ) 和铜( i i ) 的配合物， z n l ( m e c n ) 】( c 1 0 4 ) 2 ， 【c u l ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 h 2 0 。分别用e a 、m 、1 hn m r 和e s i m s 对它们进行了表征。 2 通过单晶x - 射线衍射技术，确定了 z n l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2 、 【c u e ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 h 2 0 这两种配合物的分子结构。晶体结构分析表明：配合物 z n l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2 中锌( i i ) 原子和l 的四氮杂环上的四个氮原子配位，轴向上 与乙腈的氮原子配位，构成扭曲的四方锥构型。配合物四氮杂环部分的配位氮原 子靠附近游离的高氯酸根上的氧原子头碰头的以氢键链相连。配合物 【c u l ( h z o ) ( c 1 0 4 ) 2 i - 1 2 0 的结构亦相似，只是轴向上改为水分子上的氧原子与之配 位，形成扭曲的四方锥构型。配合物 c u l ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 h h ：o 轴向位置的配位水上 的氧原子与附近的游离水的氧原子形成了分子间的氢键链。 3 利用1 h n m r 、e s i m s 和u v - v i s 表征方法分别对配体l 及其锌n i ) 和 铜( i i ) 配合物与p 一环糊精的包合反应进行了研究，分析结果表明锌( i i ) 和铜( i i ) 配合物与d 一环糊精都能够进行有效包合。 4 通过p h 电位滴定法，测定了配体l 的质子常数蜀，金属配合物的配位 常数杨和金属配合物配位水的去质子常数岛) 的数据以及d 环糊精存在下 上述各常数值的变化。结果显示疏水基团的引入使得铜o r ) 配合物的p 岛值显著 降低，但与p 一环糊精的包合对铜( i i ) 配合物的厨m 1 和p k a本上无影响。而对锌 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 ( i i ) 配合物而言，结果相反，疏水基团的引入对锌( i i ) 配合物的k ( m l ) 和p k a 基本 上无影响，但与b 环糊精的包合却使得锌配合物的k ( m l ) 值降低，而p k a 值升高。 这一结果很可能是由于环糊精上c h 2 0 h 的氧原子与z n ( i i ) 配位造成，而所测的 实验p k a 值实际上是环糊精上c h 2 0 h 的p k a 值。 5 另外在本科毕业论文的工作基础上合成了配体4 ，5 二羧酸咪唑 ( d c b i ) ，并得到m n ( i i ) 配合物，配合物m n ( d c b i ) 2 o ) 2 的结构己通过x 射 线晶体结构检测仪检出。两个d c b i 配体与锰原子在同一水平面上，锰原子同时 与两个相同配体d c b i 上的两个眯唑氮原子和两个羧酸根上的两个氧原子配位， 轴向上锰原子分别与两个水分子上的氧原子配位，形成扭曲的八面体结构。配体 的两个羧酸根上的氧原子形成了分子内氢键，配位水与相邻分子上的羧酸根上的 氧原子形成分子间氢键，配体d c b i 上未配位的氮原子也与相邻分子上羧酸根的 未配位氧原子形成分子间氢键。这些分子间氢键的形成构筑了该化合物的三维结 构。 关键词：碳酸酐酶模型，四氮杂环，疏水环境，铜配合物，锌配合物 ! ! 竺旦坐查堂堡圭堂丝塑茎一! ! 二生 s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o n a n d p r o p e r t i e s o ft h en e w m e t a l c o m p l e x e so f p i s o p r o p y l b e n z y lc y c l e n m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：p e n gq i n g s u p e r v i s o r ：d r m a oz o n g - w a n a b s t r a c t t h es t u d yo nt h es t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po ft h ec a r b o n i ca n h y d r a s eh a s b e e no n eo ft h ei n t e r e s t i n gr e s e a r c hf i e l do fb i o c h e m i s t r y , i n o r g a n i cc h e m i s t r ya n d c o m p u t a t i o n a lc h e m i s t r y i n o r d e rt oc o n s m a c tm o d e lc o m p o u n d sw i t hn o l o g i c e n v i r o n m e n to ft h ea c t i v ec e n t e ro ft h ee n z y m e ，w er e c o n s t r u c t e dt h ep r e s e n tb e s t m o d e l ，t h a ti s ，a d d i n gs o m ea c t i v ef u n c t i o m dg r o u p sa n dh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n t o n b a s i so f k e e p m g i n i t i a la c t i v ec o o r d h m t e ds t r u c t u r eo ft h em e t a li o n i na n o t h e rw o r d ， w ed i ds o m ep r o b i n gw o r kh o w t oc o n s t r u c tn e wm d d e lf o rt h ec a r b o n i ca n h y d r a s ei n t h ep a s tt h r e ey e a r s t h em a i nc o n t r i b u t i o no f t h et h e s i si n c l u d e sf o l l o w i n g p a r t s ： 1 o n el i g a n da n dt h e i rz i n c ( i f ) a n dc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e sh a db e e ns y n t h e s i z e d a n dc h a r a c t e r i z e db y1 hn m r , i r ，m sa n de a t h e ya r e c u l ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 h 2 0a n d z n l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2r e s p e c t i v e l y , i n w h i c h l = 1 巾一i s o p r o p y l b e n z y l - 1 ，4 ，7 ，1 0 一t e t r a a z a c y c l o d o d e c a n e ； 2 t h ez i n c ( i i ) a n dc o p p e r ( ) c o m p l e x e sw i t hl i g a n dlh a db e e nc h a r a c t e r i z e d b yx r a yt e c h n i q u e i ts h o w e dt h a tad i s t o r t e ds q u a r ep y r a m i d a lz n - n 5 c o o r d i n a t e s t r u c t u r ew i t hf o u rn i t r o g e n so ft h ec y c l e nm o i e t ya n do n en i t r o g e no fa c e t o n i t r i l ef o r 【z n l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2 f o rt h ec o p p e r ( i i ) c o m p l e x c u l ( n 2 0 ) ( c l 0 4 ) 2 。h 2 0 ，f o u rn 1 1 i 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 a t o m sf r o mt h ec y c l e nm o i e t ya n do n e0a t o mf r o mw a t e rc h e l a t et ot h ec u ( i i ) i o n , a l s of o r m i n gad i s t o r t e ds q u a r ep y r a m i d a ls t r u c t u r e 3 t h es t u d yo ft h er e a c t i o no ft h ez n ( i i ) a n dc u ( i i ) c o m p l e x e sw i t l l 1 3 - c y c l o d e x t r i nb y1 hn m r ，u v - v i s a n de s i - m s ，i n d i c a t e dt h a tt h e yc o u l df o r maf e w i n c l u s i o nc o m p l e x e s 、i t l l1 3 - c y c l o d e x t r i n 4 t h e i n v e s t i g a t i o no i lt h ep r o p e r t i e so fl i g a n da n dt h ez n0 i ) a n dc u ( ) c o m p l e x e sw a sc a r r i e do u tb yap o t e n t i o m e t r i cp nt i t r a t i o nm e t h o d t h ev a l u e so f p r o t o n a t i o nc o n s t a n t s ( 盔) o f t h el i g a n d ，t h em e t a lc o m p l e x a t i o nc o n s t a n t s 皤洫) a n d t h e d e p r o t o n a t i o nc o n s t a n t s ( p k a ) o fm 1 i - b o u n di - 1 2 0h a db e e nc a l c u l a t e db yt h e p s e q u a dp r o g r a m i nt h ea b s e n c ea n dt h e p r e s e n c e o f1 3 - c y c l o d e x t r i n t h e e q u i l i b r i u mc o n s t a n t si n d i c a t e dt h a tt h ed e p r o t o n a t i o nc o n s t a n tf o rt h ec uo i ) ( 嗡) o f m i i - b o u n dh 2 0h a da v a i l a b l yb e e nd e c r e a s e db e c a u s eo ft h eh y d r o p h o b i cg r o u p ，b u t t h ec o p p e r ( i i ) c o m p l e x a t i o nc o n s t a n t ( k c l ) a n dt h ed e p r o t o n a t i o nc o n s t a n ta r en o t c h a n g e da v a i l a b l yi nt h ep r e s e n c eo f1 3 - c y c l o d e x t r i n ，w h e r e a st h em e t a lc o m p l e x a t i o n c o n s t a n to f z i n c ( i i ) c o m p l e xa n dt h e d e p r o t o n a t i o nc o n s t a n ta r en o tc h a n g e da v a l l a b l y i nt h ep r e s e n c eo ft h eh y d r o p h o b i cg r o u p ，o nt h eo t h e rh a n d ，t h ev a l u eo f k z n lw a s d e c r e a s e d p k a i si n c r e a s e db e c a u s eo f t h e p r e s e n c eo f l 3 一c d 5 am o n o n u c l e a r m a n g a n e s e ( i i ) c o m p l e x 谢t ht h es y m m e t r i c a l b i d e n t a t e l i g a n d4 ，5 - d i c a r b o x y i m i d a z o l e ( d c b i ) h a db e e np r e p a r e da n dc h a r a c t e r i z e d t w on a n dt w ooa t o m sf r o md c b ic h e l a t e dt ot h e m n ( i i ) i o n ，f o r m i n ga d i s t o r t e d o c t a h e d r a lc o o r d i n a t i o ns p h e r et o g e t h e rw i t ht w oo t h e ra x i a loa t o m sf r o mt w ow a t e r m o l e c u l e s e x t e n d e di n t e r m o l e c u l a r h y d r o g e nb o n d s a r eo b s e r v e dt ol i n kt h ec o m p l e x m o l e c u l e s ，f o r m i n gat h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e k e y w o r d s ：c a r b o n i ca n h y d r a s em o d e l ，e y c l e nm o i e t y , h y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n t ， z i n c ( ) a n dc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e s 2 0 4 届中山大学硬士学位论文 彭青 第1 章前言 碳酸酐酶( c a r b o n i ca n h y d r a s e ，c a ) 是一组广泛分布于动物、植物及细菌体 内参与酸碱平衡调节及离子交换等过程的含锌金属酶。它们最主要的生理功能是 可逆催化二氧化碳( c 0 2 ) 的水合过程如方程式( 1 1 ) 所示： c 0 2 + i - 1 2 0 = h c 0 3 + r 由碳酸酐酶可逆催化的c 0 2 水合过程已成为许多生物化学家、无机化学家、 理论化学家以及有机化学家感兴趣的研究课题之一 i - 8 1 。这是因为它们不仅具有重 要的生理功能，还有深远的实际意义。碳酸酐酶在动物代谢组织和肺部间、许多 分泌过程中、鸟外壳钙化及植物光合作用中的c 0 2 传输起有重要作用，其转换数 高达1 0 6 ，是已知金属酶中最高的之一【9 】，并维持细胞内的c 0 2 h c 0 3 的平衡。碳 酸酐酶除了能可逆催化c 0 2 的水合反应外，在生命体内还能催化酯( 羧酸酯、磷 酸酯等) 和醛类等物质的水解反应【10 1 。此外，它对非生命界c 0 2 的活化也有着重 要的实际意义。研究发现通过碳酸酐酶对自然界碳酸盐岩溶解的催化及在大气 c 0 2 沉降中有着重要的意义【1 ”，通过对大气中c 0 2 与环氧烷烃的聚合反应，所得 产物碳酸树脂具有易降解等特性口2 1 。 虽然1 9 3 3 年人们已从血液中提取出碳酸酐酶，但直到1 9 4 0 年才在动物红细 胞研究中确定碳酸酐酶含有锌。它是红细胞中仅次于血红蛋白的蛋白质组分，人 和动物血液中的碳酸酐酶相对分子量约3 0k d a ，由单一肽链组成，每个分子含一 个z n ( i i ) 离子，酶蛋白约含2 6 0 个氨基酸残基，其中脯氨酸含量最高，没有二硫 键。它们是发现最早的第一类锌酶。迄今为止至少发现了8 种碳酸酐酶的同功酶， 它们的结构、分布、性质各异，多与各种上皮细胞分泌出的h + 和h c 0 3 有关 1 3 】。 碳酸酐酶除了在生物一化学反应中起催化作用外，它们还具有识别某些分子的功 能。它们不仅能选择性识别c 0 2 和h c 0 3 作为底物和产物的分子，还能无规律地 识别羧酸酯、磷酸酯、醛类等分子。另外，它们很容易与卤素离子、羧酸根、酚、 醇、咪唑、羧酸酰胺、硫酰胺、s c n 等结合，也能起到特殊识别的作用，这些分 子或离子作为拟制剂拟制碳酸酐酶的催化活性。 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 在8 种同功酶中，以人碳酸酐酶i i ( h c a i i ) 的催化活性最高，所以针对它催 化c o z 的可逆水合过程研究得最多，天然酶的结构及多种反应机理都己提出。由 于天然酶分子量巨大，结构复杂，所以常用合成的小分子配合物去模拟碳酸酐酶 的结构和功能，在进一步探讨酶的结构与功能的关系及明确反应机理方面具有重 大的指导意义，并取得了可喜的进展。了解碳酸酐酶活性中心的结构、反应机理 及模型化合物的研究进展有助于我们设计和合成更新型高效的模型化合物。下面 简要介绍跟本论文碳酸酐酶模型设计相关的理论依据及研究进展。未经特殊说明 下文中提到的碳酸酐酶都是指t t c a i i 。 1 1 碳酸酐酶的活性中心及生物功能 酶的结构复杂，分子量大，但并不是任何一个部分对催化活性都是必需的， 只有酶的活性中，t l , ( 又名活性部位，即能与底物结合促使底物发生化学变化的部 位) 才具有催化活性。x 一射线晶体衍射结构研究揭示了h c ai i 活性部位的环境， 如图1 1 所示。活性中心大约宽1 5a ，深1 5a ，晶体结构显示它是由三个组氨酸 残基( h i s - 9 4 ，h i s 一9 6 和h i s l1 9 ) 和一个水分子与一个锌原子配位所形成的一个 畸变四面体结构所组成f 1 4 旧，锌原子处于h c ai i 结构中一个1 5p a n 的深凹中， 附近的环境分为疏水和亲水两个部分。疏水部分由疏水的氨基酸残基v a l 1 4 3 ， v a l 一1 2 1 ，t r p 一2 0 9 和l e u - 1 9 8 构成了一个疏水口袋。亲水部分由一些亲水的残基 h i s 6 4 、t h r - 1 9 9 和g l u - 1 0 6 及部分有序的水分子组成了一个大的氢键网络，提供 了个质子转移的通道。 研究表明在催化c 0 2 的水合过程中酶的h i s 3 z n - o h 。形式是活性物质，而在催 化碳酸氢根的脱水过程中h i s 3 z n - o h 2 是活性物质，来自模型化合物的动力学研究 为此提供了强有力的证据。中心z n ( i i ) 离子主要起着路易斯酸的作用，使得配位 水分子被活化，降低了其p k a 值产生亲核性高的o h - 去进攻底物分子脚， 图1 - 1 碳酸酐酶活性中心结构 此外它是个静电催化剂能稳定负电荷过渡态h i s 3 z n h c 0 3 - 的形成。在研究对硝基 乙酸苯酯的水解活性中【5 】，间接测得h c a 中配位水分子的酸离解常数p k , 值等 于6 8 。近年来对不同金属离子的碳酸酐酶模型化合物的研究发现，其金属离子的 催化活性z n ( i i ) c o ( i i ) n i ( 1 i ) “c u ( 1 d ，特别是c u ( 1 1 ) 取代的碳酸酐酶几乎 没有催化活性【l ”。研究表明四方锥构型的c u ( i i ) 配合物不具有催化活性，而具 有四方锥构型的z n0 i ) 配合物与c 0 2 h c c 3 。反应有最高的反应活性。 碳酸酐酶的活性中心除了z n ( ) 离子伴有重要的催化角色外，其周围的疏 水口袋也有不可忽视的作用。研究发现它是底物c 0 2 分予的结合部位，起着固定 c 0 2 分子的作用。另外，外层几个非配位的氨基酸残基也起了很大的作用。例如 h i s 6 4 作为质子接收基，通过氢键作用有利于配位h 2 0 中质子的离去形成活性物 质h i s 3 z n o h ，称质子“梭”，同时也可降低h i s 3 z n - h c 0 3 被h 2 0 取代时的反应 能垒【2 1 。有关t h r - 1 9 9 作用的报道很多，它从与z n ( i i ) 结合的氢氧化物得到一个 氢键，又提供一个氢键给o l u 1 0 6 ，就是通过这种氢键网络起至稳定h i s 3 z n - o h 结构的作用。另外有报道说t h r - 1 9 9 在h i s 3 z n - h c 0 3 中间体形成后的质子转移过 程中直接影响h c 0 3 单齿和双齿配位的转变 1 0 ，4 】。t h r - 1 9 9 中真正起质予传递作用 的基团是羟基o h 。 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 1 2碳酸酐酶的催化反应机理 碳酸酐酶的催化循环机理最广泛被人接受的是所谓的锌一羟基机理。机理认 为首先配位水分子被z n0 i ) 离子活化脱质子后生成活性物质h i s 3 z n o h ，由疏 水口袋结合底物c 0 2 分子到z n - o h 附近。其次与z n ( ) 离子配位的o h 进攻键 合的底物分子c 0 2 形成碳酸氢根中间体h i s 3 z n - h c 0 3 。( a ) ，最后h 2 0 快速取代 h c o f 完成催化循环( 如图1 2 所示) 。 + h c 0 3 7 - h 2 0 码z n o h 2 ；2 2 3 。2 2 。2 。 + h 2 0 - h c 0 3 。 + 一 r 3 z n o h + c 0 2 一c 0 2 玛z n o c o 灯嘞 图1 - 2 碳酸酐酶的催化循环过程 到底中间体z n - h c 0 3 中与z n ( i i ) 配位的h c o f 中的氧原予采取的是单齿配 位还是双齿配位，这个问题一直是化学家们争论的焦点。许多实验支持碳酸酐酶 催化c 0 2 水合和h c o f 脱水可逆过程中分子内的质子转移为反应速率控制步骤。 为了说明质子转移过程，l i p s c o m b 和l i n d s k o g 分别提出了涉及不同z n - h c o f 中 间体结构的两种反应机理【1 s 1 9 】。前者提出四面体配合物中h c o f 的两个氧原子间 有质子转移，使z n - h c 0 3 中间体具有双齿配位结构特征，后者提出在中间体形成 过程中没有质子转移，最后形成具有单齿配位特征的中间体z n h c 0 3 。f 如图1 3 所示1 。 但有关盈h c 0 3 中间体的配位模式仍然存在很大的分歧。在金属取代的碳 酸酐酶及模型物研究中发现z n ( i d 与h c 0 3 易形成单齿配位结构口们，但理论计算 却表明速控步骤是质子从配体h c 0 3 未配位的氧原子到配位氧原子的转移，从而 证明双齿配位的l i p s c o m b 中间体结构有利于质予转移，对催化活性有显著的贡献 。1 。最近两个h c 0 3 。配位的c u ( i i ) 配合物 c u ( p h e n ) 2 0 c 0 2 h c 1 0 4 和 qq c 0 iiiiiiii 一 孙 聃 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 c u ( p h c n ) 2 0 2 c o h c 1 0 4 被结构表征( p h e n = 1 ，1 0 邻菲罗啉) 2 3 1 , 在这两个配合物 中h c 0 3 分别与c u ( i i ) 以单齿和双齿形式配位，结构如图1 _ 4 所示。表征结果 说明了中间体中h c 0 3 的配位方式不是主要问题，邻近氨基酸残基t h r - 1 9 9 中的 羟基在催化过程中发挥更重要的作用。但在最新建议的机理中，上述两种中间体 结构均被包括【2 】。 lipscomb 1 。蒜i l i n d s k o j c o g 泉一 n 球 图1 - 3 l i p s c o m b 机理( 左) 和l i n d s k o g 机理( 右) 为了进一步探针酶活性中心的水合机理，最近用c u ( ) 离子作为动力学探 针已报道( 2 4 2 5 1 ，并提出了c u n 4 类配合物与h c 0 3 。的碳酸盐化反应及形成多核碳 酸盐配合物的建议性反应机理，其实这与碳酸酐酶及许多模型物存在碳酸盐化可 能性的事实也是相符合的。研究发现碳酸盐化引起的p h 变化与c 0 2 水合反应所 产生的p h 变化是相同的，并得出结论：对检测而言c 0 2 水合反应和碳酸盐多核 化是相同的，都使溶液p h 值增加，但后者将导致酶或模型物的催化性失活。 ， 丫v水 0 一 p 一 丫ui代 h o ， q 杉 甲萨 艇。- b 图1 - 4 配合物 c u ( p h e n ) 2 0 2 c o h i c l 0 4 ( j t ：) 和 c u ( p h e n ) 2 0 c 0 2 h c 1 0 4 ( ：右) 的分子结构 1 3碳酸酐酶的蛋白质工程 在前面的论述中我们可以发现碳酸酐酶活性部位各氨基酸残基都发挥着重 要的作用，碳酸酐酶的蛋白质工程研究就证实了它们的必要性。在h c a i if 图l - 2 ) 中，当h i s 9 4 被基因突变为带负电的a s p 后，发现蛋白质结构并没有发生明显的 改变，但p k a 值从原来的6 8 上升到9 6 ，催化对硝基乙酸苯酯水解的二级速率常 数降低了7 倍【2 6 】，而在模型物1 中引入一个羧基并与z n ( i i ) 配位，该配合物的 p 磁值从原来的7 3 上升到9 4 t 2 。”，基本上完全失活，两方面的结果均表明阴离子 配位将导致催化活性降低。 疏水口袋中的疏水氨基酸残基也很重要。如果疏水口袋中的l e u 1 9 8 分别被 亲水性氨基酸a r g 、g l u 、h i s 取代后，c 0 2 水合过程中的。以值分别降低1 7 倍、1 9 倍和l o 倍口8 1 。这些结果都充分证明了疏水i s i 袋是底物结合的关键部位。 在对h c ai i 的氨基酸残基t h r - 1 9 9 使用基因定点突变技术改造后发现 t h r - 1 9 9 中的o h 基团对酶的催化活性有重要的影响 2 9 - 3 0 】。用s e r 、a l a 、v a l 和p r o 分别取代t h r - 1 9 9 ，取代后酶的p 哎从原来的6 8 依次变为7 3 、8 3 、8 7 和9 2 ， 催化c 0 2 水合反应催化活性分别降低为原来的6 2 2 、0 8 2 、o 4 1 和o 3 3 ；而催 化h c 0 3 。脱水反应的催化活性分别降低为原来的5 2 8 、o 0 3 5 和o 0 2 1 ，p r o 1 9 9 则几乎没有活性，特别是在取代基如果不含有o h 基团，催化活性将迅速降低。 在新建议的催化机理中，认为t h r - 1 9 9 的催化作用是稳定z n h c 0 3 中间体的单齿 2 0 0 4 届中山大学硬士学位论文 彭青 配位结构，有利于质子转移，同时降低z n - h c 0 3 。中间体的双齿配位结构的稳定性， 以便h 2 0 取代配位的h c 0 3 ，加速h c 0 3 。的脱水过程。 1 4碳酸酐酶模型化合物的研究进展 在过去的2 0 年里，来自不同研究领域的化学家对碳酸酐酶及其模型化合物 进行了广泛而深入的研究，在确定酶的结构与功能的关系，反应机理等方面取得 了重大进展，特别是催化反应的活性物质是什么、p k a 值对催化的影响、t h r - 1 9 9 的功能、疏水环境的作用、质子转移通道等逐渐被揭示，目前对酶的研究也从催 化c 0 2 n c 0 3 。扩展到其它底捌“。 模拟金属酶是模仿酶的活性中心，即模拟其中某些活性氨基酸与金属的配 位，设计合成配合物，形成配位催化，以简化和模仿酶催化过程。进一步找出控 制催化过程的重要因素，探寻酶的高效及高选择性的根源，开发人工酶这类新的 非生物催化剂。 近年来，为了进一步了解碳酸酐酶活性部位与功能的关系，进一步明确催化 反应机理，基于碳酸酐酶活性中心结构的特点，各种金属配合物已被设计和合成 1 3 2 4 1 ，由于z n ( i i ) 模型物的催化活性最高，天然酶活性中心配位原子是显电中性 的氮原子，所以碳酸酐酶的模拟研究大多选择z n ( i i ) 的含氮多胺配合物，也有文 献报道了氮氧杂配体的模拟物 4 2 讲】，但数量很少。由于碳酸酐酶对底物的识别性 质在水溶液中受p h 值的影响，这就需要模型物稳定性高。大环金属配合物在水 溶液生理条件的p h 值环境中与其它配合物相比，具有热力学和动力学稳定性高 的特点，这正符合天然酶的要求，所以z n ( i i ) 的大环多胺配合物是最理想的模型 物。具有代表性的模型化合物及配体总结如图1 3 所示： 1 ，5 ，9 - 1 2 - 冠- t n 3 】( 1 ) 、1 , 4 ，7 ，1 0 1 2 一冠一i n 4 】( c y c l e n ) ( 2 ) 、大环四胺配合物3 、化 合物4 和配体5 的锌配合物已经被结构表征，其中配合物1 - 4 为h 2 0 键合的z n ( i i ) 配合物，由电位滴定方法确定了它们的l z n ( i i ) o h 形式的p k a 值分别为7 3 、8 0 、 8 3 和8 7 。其中配合物1 的p k a 值最与天然酶接近。观察到的随p h 变化的反应 速率常数表明溶液中的l - z n ( i i ) o h 形式是模型化合物的活性物质，相反，配合 物5 和6 并没有显示出这行为。因此配合物1 - 4 可以模拟酶中o h 。配位z n ) 中 2 0 0 4 属中山大学硕士学位论文 彭青 心对底物的亲核进攻。尽管配体5 8 的模型化合物与c 0 2 水合反应中显示有较好 的键合速率常数，但它们不能模拟碳酸酐酶催化活性的p h 分布特征。如配体8 的z n ( i i ) 的模型物，即使通过核磁技术研究表明它能快速催化c 0 2 的水合过程， 催化c 0 2 和h 2 t 7 0 之间的氧原子交换，但由于其水溶性差的特点，动力学数据没 法测得，因而也就很难解释其结构与功能的关系。 务h 2 0 鸯强 23 r 奄页焉窥r 囊n 矿- - 一、i 。七 567 9 h 2 例汐川8 m e 4 一e 险。) 3 3 8 图1 - 5 碳酸酐酶的主要模型化合物及模型物的配体 具有三齿大环配体的配合物1 在结构和化学性质上与h c ai i 最接近，且z n ( i i ) 对o h 的识别非常强，其晶体结构显示z n ( i i ) o h 键长为1 9 4a ，比各种其 它四面体配位环境中z n ( - n 的平均键长2 0 2a 要短【2 j 。研究发现它还能在o 类似碳酸酐酶催化乙醛及羧酸酯的水解。配合物2 具有大环四齿配体，z n ( i i ) 配 合物的几何构型为四方锥，配位水分子位于四方锥的轴向位置，p k a 值为8 0 。值 得提的是配合物2 具有极高的稳定常数，l o g l 3 为2 3 5 ，比碳酸酐酶( 1 0 9 p = 1 0 5 1 和配合物10 0 9 p = 8 6 5 ) 都要高( p = z n l l z n l 皿】) 。尽管配合物2 的p 岛值为 8 0 比配合物l 的要高，但它仍然能合理地接近天然的碳酸酐酶，并且动力学研究 表明在模型化合物中配合物2 具有最高催化水合和脱水反应速率常数，高达3 3 0 0 m 1 s ，几乎是h c a i i 的三分之一，其原因被认为与该配合物有极高的稳定常数 有关1 4 ”。配合物2 与配合物1 的结构与活性的比较研究显示，双齿碳酸氢根中间 体的形式可能会抑制模型物的催化活性。从而可推测单齿碳酸氢根中间体可能是 j 洲 洲 ) = ( 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 碳酸酐酶催化反应中的活性物质。总之，迄今为止配合物1 和2 被认为是最好的 模型化合物，因为它们分别在结构和动力学性质方面最接近酶本身而被详细研究 4 5 ，4 6 1 。 1 5 环糊精及其超分子组装 酶与普通化学催化剂相比，具有高效性、专一性和反应条件温和等优点，但 不稳定。人们试图继承酶的优点，改变其易变性失活的缺点，并且希望能用有机 合成的方法容易而大量地制备酶，从而开始进行酶功能的模拟研究。模拟酶是利 用有机化学方法合成的有催化活性的非蛋白质分子。它比天然酶简单，也不同于 蛋白质或多肽类的非天然催化剂一人工酶1 4 7 】。 两位美国化学家d j c r a m ，c j p e d e r s o n 和法国化学家j m l e l l n 相互发展 了对方的经验，他们的工作为实现人们长期寻求合成与天然蛋白质功能一样的有 机化合物这一目标取得了开拓性的进展。他们提出的主一客体化学( h o s t g u e s t c h e m i s t r y ) 【4 8 】和超分子化学( s u p r a r n o l e c u l a rc h e m i s t r y ) 【4 9 】已经成为模拟酶的重要 理论基础。根据酶催化反应机理，若合成出能识别底物又具有酶活性部位催化基 团的主体分子，同时底物能与主体分子发生多种分子相互作用，那就能有效地模 拟酶分子的催化过程【5 0 】。 对应于由原子与原子用化学键联结起来而生成的分子化学，超分子化学则是 分子与分子用分子间作用力联结起来而形成分子聚集体，简称为超分子。换言之， 超分子化学是研究分子通过非共价键作用形成的功能体系的科学【5 “。超分子化学 至少有两点重要启示：一是分子间弱相互作用力在一定条件下可通过加和与协同 转化为强的结合能；二是通过组装过程可使超分子体系具有完全不同于原组成分 子的新的特性【5 ”。 环糊精( c d ) 是一类由6 个或更多个d 葡萄糖分子以0 l 1 ，4 糖苷键结合形成 的环状低聚糖的总称。由6 、7 或8 个d 葡萄糖组成的c d ，分别称为伐、1 3 ，、7 - c d 。 c d 的外形如一轮胎，边框是亲水性的，分布在空腔周边的伯、仲羟基，作为质 子供体很活跃，而且这些立体地分布在空腔周边的羟基与底物配合容易达到有利 配置状态。分子内空腔由葡萄糖基的c - 3 h ，c 5 h 和1 , 4 苷键氧构成，是一个疏 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 水性的v 字型手性空腔，有利于对有机分子的选择结合和定位；而疏水环境能促 进某些有机反应的进行。环糊精这种“内疏水，外亲水”特殊的分子结构与酶所 具有的微环境相似。使得c d 能作为“主体”包合不同“客体”化合物，形成特 殊结构的包合物( i n c l u s i o nc o m p l e x ) ，由此而形成主客体分子化学，也属于当前 热门课题一超分子化学的一部分。利用c d 的包合作用，向c d 分子引入各种基 团，c d 可表现出很好的模拟酶性质。所以环糊精及其包合物常用来作为研究分 子问非键相互作用及酶作用机理的模型【5 ”。 上节中碳酸酐酶模型化合物的设计主要是模拟碳酸酐酶的配位内层，有关碳 酸酐酶配位外层，即疏水腔和质子传递单元等结构的模拟还未涉及。w a l t o n 【5 4 - 5 6 1 等人合成了些带多个疏水芳香基团的顺，顺三氨基环己烷类z n ( i i ) 、c o ( i i ) 和 n i0 i ) 的配合物，并测定了其晶体结构( 如图l - 6 所示) ，揭示了溶剂分子在疏 水腔内及金属离子周围的结合方式，并指出这种刚性的疏水腔结构适合模拟碳酸 酐酶活性中心的疏水口袋，但可能由于水溶性不好的原因，其催化活性的动力学 研究至今未见报道。但利用水溶性较好的p 环糊精( d c d ) 的疏水腔来模拟碳酸 酐酶的疏水环境就可克服这一缺点。如t a b u s h i 和k u r o d a 5 7 1 使用双组胺修饰b c d 合成了模型z n ( i i ) 的配合物( 如图1 - 6 所示) ，模拟研究中发现在咪唑缓冲溶液 中( 缓冲溶液中的昧唑氮原子也参与了配位) 可以加速c 0 2 的水合反应，其观察 到的催化速率常数在1 0 3m 1 s j 数量级，并且研究发现d c d 的疏水部位有结合底 物c 0 2 的作用。虽然此模型物的活性与天然酶相差甚远，但充分体现了疏水微环 境、z n ( 1 d 离子及碱基对活性的贡献。即使模拟碳酸酐酶的疏水环境的结构及催 化活性的研究早已有报道，但目前碳酸酐酶中有利于质子转移的非配位的功能基 如t h r - 1 9 9 的模拟还未见报道。如何设计具有生命体系中z n ( i i ) 离子的生物配位 环境( 包括非配位的t h r - 1 9 9 功能基团、疏水环境、质子转移途径等) 、探讨 t h r - 1 9 9 的在催化反应中的化学行为等是未来模型研究的发展方向，这就要求模 拟研究必须从小分子层次提升到大分子层次( 纳米级) ，并与酶的研究相结合。 我们相信通过进一步的研究，将会对设计人工催化剂、开发基因工具等提供基础。 ! 竺! 曼主些查兰壅主兰苎墼j ! 蔓 一旬电，饼 忿岛 m 、少 ，、- 一1 7 一一 图1 - 6 带疏水腔的模型配合物 1 6本论文的设计思路和创新之处 综上所述，碳酸酐酶配位外层对酶的催化活性影响也很大，但大部分模拟研 究工作只局限于配位内层的模拟，对配位外层重要基团的模拟还很少见报道。为 了使所合成的模型配合物具有更接近碳酸酐酶的催化活性，应对具有金属离子配 位内层的模型配合物进行结构修饰，使其具有近似的疏水腔及质子传递结构单元， 在结构上与碳酸酐酶相近。为此，本论文设计和合成具有酶的金属离子配位外层 的模型化合物。 我们设想在已发现的最好的模型物化合物氮四杂十二烷锌( i d 配合物f 如 图1 3 中的模型化合物2 所示) 的大环上引入一个带对异丙苯甲基的疏水基团， 目的为了利用其疏水性组装到环糊精疏水的内部空腔中，利用环糊精上的c i - 1 2 0 h 模拟碳酸酐酶中t h r - 1 9 9 上的o h 。这样利用超分子模型探究碳酸酐酶中z n ( i i ) 离子的生物配位外侧环境，特别是t h r - 1 9 9 功能基团对催化活性的影响。 1 7 本论文所取得的进展 本人已经完成的工作主要有以下四点： 1 设计和合成了碳酸酐酶的模型配体l ：l - ( 对异丙苯甲基) 1 ，4 ，7 ，1 0 四氮杂 环十二烷( 如图1 7 所示) 及其金属配合物即： z r t l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2 和 2 0 0 4 届中山大学硕士学位论文 彭青 c u l ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 ( s 2 0 ) 。金属离子主要选择z n ：+ 和c u 2 + 。 n h - - k h n 、 l 呶 图1 7 合成配合物中的配体l 对配体及其金属配合物进行了元素分析、红外、电喷雾质谱、核磁等波谱表征。 对 z n l ( m e c n ) ( c 1 0 4 ) 2 、【c u l ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 ) 2 ( h 2 0 ) 用x - 射线单晶衍射仪进