（微生物学专业论文）九州虫草无性型鉴定暨虫草属分子系统学及虫草素与dna直接作用机理研究.pdf

山东大学博士论文 九州虫草无性型鉴定暨虫草属分子系统学及虫草素与 d n a直接作用的机理研究 中 文 摘 要 虫草属 c o r d y c e p s ( f r . ) l i n k 真菌是一大类昆虫病原真菌，仅清水大典就己记载 3 1 6 种。 亦有报道， 虫草属真菌迄今有记载达3 5 0 余种。 绝大多数为虫生真菌， 在我国分 布的有7 0 多 种。生活史分为有性型和无性型阶段即世代交替现象。虫草菌寄生昆 虫幼体 而形成的虫草亦即其有性型阶段有3 0 多种，其中最珍贵的，也是目 前广泛药用的我国特 产 于 青 川 滇 藏3 0 0 0 - 5 0 0 0 米 高 原 地 区 的 冬 虫 夏草( 。叻c e p s s in e n s is ) . 在 分 类 学 上 ， 分 类 学 家 把 有 性 型 作 为 虫 草 属 分 类 的 重 要 依 据。 探明 一 种 虫 草 和 其 无 性 型 的 真 正 联 系 不 仅 可以 丰富真菌分类学自 身内 容， 发现一些新的生物物质， 而且也是深入开展虫草开发利用研究 的必不可少的 基础性工作。 现在确定的虫草菌 无性型主要是根据从弹射的子 囊抱子、 内 菌 核、 及子座组织块分离的丝抱菌的形态鉴定， 其中不能排除误定的 可能。 亦曾有人把培养 物的化学成分与天然冬虫夏草的成分进行比较， 并以其与天然冬虫夏草的成分相似来说明 他们的分离物是中国冬虫夏草菌的无性型。 这种反证是不可靠的。 因为虫草属的另外一些 种， 如蛹虫草、 香棒虫草、 亚香棒虫草都与中国冬虫夏草成分相似。 甚至不是虫草属的真 菌菌丝体也有与之化学成分相同的报道。 梁宗琦提出: 可根据子囊袍子微循环产抱的方法 确定无性型， 不仅简便可靠且具有很高的实用性。 但是， 不同 种的虫草菌次生抱子萌发和 微循环产抱的条件各不相同， 因 此在只获得少量子囊抱子的情况下未必能实现微循环产抱 的操作。 蒙山九州虫草是我们在山东蒙山采取的，经由郭英兰先生确认为九州虫草 ( c . k y u s h u e n s i s ) 。 它的寄主是 豆天蛾( c l a m s b il i n e a ta w a l k e t r ) 幼虫， 俗称豆虫。这是目 前 唯一发现的寄主为豆虫的虫草菌。 根据我们现有的对该虫草与冬虫夏草的化学成分检测、 生药药效及体外抑瘤实验研究， 蒙山 九州虫草有望替代冬虫夏草应用于临床， 有着较好的 应用前景。 我们试图对该虫草菌的无性型及有性型阶段从经典的真菌分类学和应用现代分 子生物学技术两方面加以 研究， 以期为今后进一步研究工作打下良 好的 基础。 值得注意的 是，二十世纪8 0 年代分子生物学在真菌领域的研究取得长足进展，覃菌的分子生物学研 vi 山东大学博士论文 究迅速开展。在世代交替研究上，有报道r a p d - p c r 技术在虫草无性型的确定中 得到了 应 用，但是不容忽视的是，r a p d技术由于工作量大、重复性差，在实际实验工作中应用受 到限制。检索近期国外文献，r d n a区己成为人们研究的重点。核糖体 r n a ( r r n a )是 细胞中最古老的分子之一，具有结构、功能和进化的同源性。编码其r r n a前体的 基因 即r d n a ，它是基因组d n a中中等重复并有转录活性的基因家族。 本身具有进化的高度 保守性，同时又富含高可变区域，成为较为理想的虫草无性型鉴定及系统学研究对象。 核普类成分是虫草重要的 活性成分， 具 有明显的药理作用。 其中， 虫草素( c o r d y c e p i n ) 即3 一 脱氧腺昔，为含氮配糖体的核酸衍生物，属嗓吟类生物碱， 早在 2 0 世纪七十年代 就己被发现有抑制肿瘤、 抗疟原虫和抑制m r n a 翻译的作用; 九十年代研究发现， 添加a d a 抑制剂对其细胞毒性的表达起着重要作用， 虫草素的研究从而获得突破性进展， 美国1 9 9 7 年己 将虫草素用于一期临床实验， 治疗急性前b 和前t 淋巴 细胞白血病患者; 同时， 虫草 素还表现出极强的抗真菌、 抗h 工 v - i 型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性。 虫草素的存在 与否因虫草属菌种不同而异， 现有研究多集中于蛹虫草， 冬虫夏草亦有相关论文， 但尚未 见到其它虫草的报道。 目 前虫草核昔类组分的分离检测研究多采用薄层层析和高压液相色 谱法。 本文采用经典的形态分类学方法首次鉴定国内 新记录 种一 九州虫草的无性型为九州轮 枝菌，描述了其菌落、菌丝、产抱细胞、 分生抱子的形态、大小、 着生方式等特征;并利 用无性型菌株回 接其天然寄 主获得成功， 完整的重现了 该虫草的生活史， 获得了 有性型子 实体。 通过扫描电 镜和透射电 镜应用研究，比 较观察了 野生虫草及人工虫草的子座、子囊 壳、子囊、菌丝、疏丝组织细胞等特征最终对九州虫草的无性型予以确证。 从g e n b a n k数据 库1 1 种 虫草， 2 5 条 相应i t s 区 序列 着手， 使用p h y l i p 9 6分析 软件 包中d n a d i s t 程 序 建 立 距 离 矩阵 ; 应 用 邻 近 一 连 接 法 ( n e ig h b o u r - j o i n in g m e th o d , n j ) 聚 类:利 用c lu s t a l x软 件 构 建 进化 树比 较 其 序列同 源性 ; b o o t s tr a p in g 法 进行 检验， 构 建 了 虫草及可能无性型的进化树。 探讨其同 源性的同时， 认为开展核糖体d n a i t s 区 序列研 究， 与传统经典分类学相互印证进行虫草无性型鉴定是完全可行和必要的。 通过测定九州 虫草和九州轮枝菌的i t s 区序列并予以比 对， 为传统分类结果提供了 分子生物学的 有力辅 证。同时构建了虫草属3 3 种虫草， 5 1 条工 t s 区 序列的系统进化树， 探讨了属内工 t s 区现 山东大学博士论文 有报道各种的亲缘进化关系。 分别设计了扩增引物、 测序引物， 获得了九州虫草1 8 s r d n a , 2 8 s r d n a 相应序列， 并应用b l a s t 软件， 提交到g e n b a n k 数据库集中 进行比 对， 研究了 九 州虫草的遗传背景，进行了基因序列的有益探索。对九州虫草 0 - t u b u l i n 基因序列进行 了初步研究， 设计了序列特征引物， 扩增得到了基因组d n a 的部分序列， 并通过序列比对 予 以证明，从而为探索虫草属种间系统发育关系积累了有意义的数据信息。 应用毛细管区带电泳首次报道了九州虫草中虫草素的存在。 探讨了电 泳缓冲液浓度、 洲值、柱温及分离电压对样品分离检测的影响，最终确定电泳条件为:分离电压2 0 k v ; 检 测 波长2 5 8 n m ; 进 样量0 .5 p s i 进 样5 s e c ; 柱 温2 0 0 ; 0 .0 2 5 m o l/ l 硼 砂 溶液( p h 9 .4 ) 为 电 泳缓冲液， 0 .4 5 p m的微孔滤膜过滤: 运行时间为 5 m i n ;每次进样前依次用 0 .2 m o u l n a o h 、重蒸水、 缓冲液各冲洗 2 m i n , i m in , 2 m i n 。 讨论了 温度对样品预处理的影响， 比较了浸提法、 回流法、 索氏 提取法和超声法提取虫草素、 腺昔的差异以及提取试剂和超 声时间的影响。最终确定样品制备条件为:精确称取 6 0 低温烘干备用的虫草样品干粉 0 . 5 g ，加入1 0 m l 水， 冰浴4 0 0 w 超声处理2 0 m i n ， 每i作5 s e c ，间 歇5 s e c , 1 3 0 0 0 r p m 离心、过滤， 滤液过。 . 4 5 p m 微孔滤膜， 定容备用。 从而建立了 虫草样品制备、 检测的 整 套 方 法 。 分 离 、 测 定 了 野 生 和 人 工 九 州 虫 草 子 座 及 菌 丝 体 的 虫 草 素 、 腺 昔 含 量 ， 与 人 工 蛹 虫草和冬虫夏草子座样品进行了比 较， 得到了 满意的实验结果， 并初步对九州虫草子座其 它核昔类组分进行了定性检测，共确定了七种相关组分。 测定了虫草素与小牛胸腺d n a 作用前后的紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱和激光显 微共焦拉曼光谱，构建了二者相互作用的s c a t h a r d 方程图。利用光谱学方法揭示了虫草 素对d n a 作用使其构像发生变化的这一动态过程，探讨了虫草素与d n a 直接作用的 机理， 确定虫草和d n a 的作用方式为混合方式， 即存在虫草素与d n a 的磷酸基团作用( 通过静电 吸引力与磷酸根发生弱的结合) ，又存在虫草素插入d n a 双螺旋的嵌插模式，至于是否还 存在其他作用方式有待进一步研究。 从而为虫草素 应用奠定了 坚实的 基础。 靶向 及缓释给药由于其自 身优点受到医药学界的 广泛重视。本文研究了虫草素层状 双氢氧化物纳米复合材料的制备及表征。由x 一 射线衍射、 红外光谱、 透射电 镜结果可知， 虫草素通过与层间阴离子的 交换， 插层进入带正电 荷的层状双氢氧化物层间。 毛细管区带 电 泳实验进一步确认了虫草素插层的存在。 初步的实验结果表明， m g - a l - n 0 , 层状双氢 山东大学博士论文 氧化物有可能作为具有生物活性虫草素的载体或保护体， 这为进一步研究虫草素定向 给药 或缓释给药技术奠定了 坚实的工作基础。 关键词:九 州 虫 草 ; 无 性 型 ; i t s 区 ; 分 子 系 统 树 ; 带电泳;虫草素; 腺昔; 小牛胸腺d n a ;紫外光谱; 层状双氢氧化物;纳米颗粒;插层 3 8 srd n a ; 气 8 srd n a ; 毛 细 管 区 荧光光谱:圆二色谱;拉曼光谱; 山东大学博士论文 i de nti f i cati on of anamorp h of co rdy c ep s ky u s hu e n s i s , p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s i n t h e genus co rdy c ep s and i nteracti on of cordycep i n on calf thymus dna abs tract t h e c o n f i g u r a t i o n o f a n a m o r p h o f c o r d y c e p s h a s t h e a c a d e m i c a n d p r a c t i c a l i m p o rt a n c e . c o r d y c e p s k y u s h u e n s i s c o ll e c t e d fr o m m o u n t m e n g o f s h a n d o n g p r o v i n c e , w a s r e p o rt e d a s a n e w r e c o r d i n c h i n a . t h e s p e c i e s o f v e rf r c i l l i u m k y u s h u e n s is i s o l a t e d fr o m c . k y u s h u e n s i s w a s d e t e r m i n e d t o b e it s a n a m o r p h . t h e t y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f u n g i w a s d e s c r i b e d . s o m e f r u it i n g b o d i e s f o r m e d o n it s h o s t - c l a n i s b i l i n e a t a w a l k e r . t h e ir . s i g n a t u r e w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f n a t u r a l s t r o ma t a . p h y lo g e n e t ic r e la t io n s h ip a m o n g t h e g e n u s c o r d y c e p s a n d it s p r o b a b le a n a m o r p h w e r e e x a m i n e d b y u s i n g i t s r e g i o n s e q u e n c e s o f n r d n a . t h e d a t a w e r e a l i g n e d b y c lu s t a l x , a n a ly z e d b y n e i g h b o r j o i n i n g ( n j ) t r e e , a n d v a l u e d b y b o o t s t r a p i n g m e t h o d . t h e h o m o l o g y r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s e q u e n c e d i ff e r e n c e w i t h in i t s r e g i o n c o u ld p r o v id e a n a d d it i o n a l c h a r a c t e r i s t i c f o r i d e n t i f i c a t i o n t o a n a m o r p h o f t h e g e n u s c o r d y c e p s . s t u d y o n m o l e c u l a r s y s t e m a t i c t r e e w a s p e r f o r m e d o n t h e b a s i s o f e x a m i n a t i o n s o f 5 1 s p e c i m e n s . t h e 1 8 s r d n 人 2 8 s r d n a r e g i o n s o f c k y u s h u e n s is w e r e a l s o s e q u e n c e d . c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c o r d y c e p i n a n d a d e n o s i n e in c o 协c e p s k y u s h u e n s i s , a n d c o m p a r e d w i t h o t h e r c o r d y c e p s s p p . t h e e x t r a c t in g e ff e c t s o f f o u r m e t h o d s a n d d i ff e r e n t p r e t r e a t m e n t s t o t h e s a m p l e s w e r e c o m p a r e d , a n d t h e r e g e n t s f o r e x t r a c t i o n a n d d u r a t i o no f u l t r a s o n i c a t i o n we r e t e s t e d e le c t r o p h o r e s i s w a s u s e d t o s e p a r a t e a n d d e t e r m in e c o r d y c e p i n . o t h e r c a p i l l a ry z o n e n u c l e o t i d e s a n d i n t e r r e l a t e d b a s e i n c k y u s h u e n s i s w a s q u a l i t a t iv e a s s a i e d i n t h i s a rt i c l e . t h e r e s u lt s s h o w e d t h a t t h e c z e m e t h o d i s a s i m p l e , r a p i d a n d s e n s i t iv e m e t h o d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f c o r d y c e p i n a n d a d e n o s i n e w it h g o o d r e p e a t a b i l it y . 山东大学博士论文 t h e u lt r a v io l e t s p e c t ru m , fl u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t ry , c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r u m a n d l a s e r r a m a n s p e c t rum w e r e u s e d t o s t u d y t h e in t e r a c t i o n o f t h e a n t it u m o r c o m p o u n d c o r d y c e p i n w it h d n a . t h e r e s u lt s i n d i c t a t e t h a t c o r d y c e p in r e a c t s e l e c t r o s t a t i c a l l y w it h p h o s p h a t e b a c k b o n e o f d na. t h e r e a l s o e x i s t s a n i n t e r c a l a t i o n i n t o t h e d o u b l e - h e l i x o f d na a n o v e l n e g a t i v e l y c h a r g e d b i o m o l e c u l e - c o r d y c e p i n h a s b e e n in t e r c a l a t e d w i t h i n t h e g a l l e r y s p a c e s o f m g - a l - n 0 3 . r e s u lt s o f t e m , p x r d a n d f t - i r s p e c t r o s c o p y c o n f i r m e d t h a t c o r d y c e p i n c o u l d b e i n t e r c a l a t e d i n t o m g - a l - n o 3 i n t e r la y e r s a s t h e c h a r g e - c o m p e n s a t i n g s p e c i e s . i n it i a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e n e w b i o i n o r g a n i c n a n o c o m p o s it e m a y b e u s e d a s a n o v e l in o r g a n i c r e s e r v o i r o r c a r r i e r o f p h a r m a c e u t i c a l ly a c t iv e c o m p o u n d s . k e y wo r d s a n a m o r p h ; c o r d y c e p s 切s h u e n s i s ; i t s r e g io n ; m o l e c u l a r s y s t e m a t i c t r e e ; 1 8 s r d n a ; 2 8 s r d n a ; c a p i l l a ry z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ; c o r d y c e p in ; a d e n o s i n e ; c a l ft h y m u s d n a ; u 峨fl u o r e s c e n t s p e c t r u m ; c d ; r a m a n s p e c t r u m ; l a y e r e d d o u b l e h y d r o x i d e ; i n t e r c a l a t e ; f x r d; f t - i r s p e c t r o s c o p y . xn 山东大学博士论文 i de nti f i c a ti on of anamorp h of co rdy c ep s ky u s hu e n s i s , p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s i n t h e ge nus co rdy c ep s and i nt e racti on of cordyce p i n on c al f t hymus dna t h e c o n f i g u r a t i o n o f a n a m o r p h o f c o r d y c e p s h a s t h e a c a d e m i c a n d p r a c t i c a l i m p o r t a n c e . c o r d y c e p s 句 v u s h u e n s i s c o ll e c t e d fr o m m o u n t m e n g o f s h a n d o n g p r o v i n c e , w a s r e p o r t e d a s a n e w r e c o r d in c h in a . t h e s p e c i e s o f v e rf i c i l h u m k y u s h u e n s i s i s o l a t e d fr o m c . 彻 u s h u e n s i s w a s d e t e r m i n e d t o b e i t s a n a m o r p h . t h e t y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f u n g i w as d e s c r i b e d . s o m e fr u i t i n g b o d i e s f o r m e d o n it s h o s t - c l a n i s b i f n e a t a wa l k e r . t h e ir , s i g n a t u r e w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f n a t u r a l s t r o ma t a . p h y lo g e n e t ic r e la t io n s h ip a m o n g t h e g e n u s c o r d y c e p s a n d it s p r o b a b le a n a m o r p h w e r e e x a m i n e d b y u s i n g i t s r e g io n s e q u e n c e s o f n r d n a . t h e d a t a w e r e a l ig n e d b y c lu s t a l x a n a l y z e d b y n e i g h b o r j o i n i n g ( n j ) t r e e , a n d v a lu e d b y b o o t s t r a p i n g m e t h o d . t h e h o m o l o g y r e s u lt s i n d i c a t e d t h a t t h e s e q u e n c e d i ff e r e n c e w i t h i n i t s r e g i o n c o u l d p r o v i d e a n a d d i t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c f o r i d e n t i f i c a t i o n t o a n a m o r p h o f t h e g e n u s c o r d y c e p s . s t u d y o n m o l e c u l a r s y s t e m a t i c t r e e w as p e r f o r m e d o n t h e b a s i s o f e x a m i n a t i o n s o f 5 1 s p e c i m e n s . t h e 1 8 s r d n 人 2 8 s r d n a r e g i o n s o f c . 勺 ra s h u e n s i s w e r e a l s o s e q u e n c e d . c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c o r d y c e p i n a n d a d e n o s i n e i n c o r d y c e p s k y u s h u e n s is , a n d c o m p a r e d w it h o t h e r c o r d y c e p s s p p . t h e e x t r a c t i n g e ff e c t s o f f o u r m e t h o d s a n d d i ff e r e n t p r e t r e a t m e n t s t o t h e s a m p l e s w e r e c o m p a r e d , a n d t h e r e g e n 重 s f o r e x t r a c t i o n a n d d u r a t i o n o f u lt r a s o n i c a t io n w e r e t e s t e d . c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s w as u s e d t o s e p a r a t e a n d d e t e r m in e c o r d y c e p i n . o t h e r n u c l e o t id e s a n d i n t e r r e l a t e d b a s e i n c k y u s h u e n s i s w a s q u a l i t a t iv e as s a i e d i n t h i s a rt i c l e . t h e r e s u lt s s h o w e d t h a t t h e c z e m e t h o d i s a s i m p l e , r a p i d a n d s e n s i t iv e m e t h o d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f c o r d y c e p i n a n d a d e n o s i n e w it h g o o d r e p e a t a b il it y . 3i 山东大学博士论文 t h e u lt r a v i o l e t s p e c t r u m , fl u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t ry , c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r u m a n d l a s e r r a m a n s p e c t r u m w e r e u s e d t o s t u d y t h e i n t e r a c t i o n o f t h e a n t it u m o r c o m p o u n d c o r d y c e p i n w it h d n a . t h e r e s u l t s i n d i c t a t e t h a t c o r d y c e p i n r e a c t s e l e c t r o s t a t i c a l l y w it h p h o s p h a t e b a c k b o n e o f dn a. t h e r e a l s o e xis t s a n i n t e r c a l a t i o n i n t o t h e d o u b l e - h e l ix o f dna a n o v e l n e g a t iv e l y c h a r g e d b i o m o l e c u l e - c o r d y c e p i n h a s b e e n i n t e r c a l a t e d w i t h i n t h e g a l l e ry s p a c e s o f mg - a l - n 0 3 1 . r e s u l t s o f t e m, p x r d a n d f t - i r s p e c t r o s c o p y c o n fi r m e d t h a t c o r d y c e p i n c o u l d b e i n t e r c a l a t e d i n t o m g - a l - n 0 3 1 i n t e r l a y e r s a s t h e c h a r g e - c o m p e n s a t i n g s p e c i e s . i n it i a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e n e w b i o in o r g a n i c n a n o c o m p o s it e m a y b e u s e d a s a n o v e l i n o r g a n ic r e s e r v o i r o r c a r r i e r o f p h a r m a c e u t i c a ll y a c t iv e c o m p o u n d s k e y wo r d s a n a m o r p h ; c o r d y c e p s k y u s h u e n s i s ; i t s r e g i o n ; m o l e c u l a r s y s t e m a t i c t r e e ; 1 8 s r d n a ; 2 8 s r d n a ; c a p i l l a ry z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ; c o r d y c e p i n ; a d e n o s i n e ; c a l ft h y m u s d n a -,u 从fl u o r e s c e n t s p e c t r u m ; c d ; r a m a n s p e c t r u m ; l a y e r e d d o u b l e h y d r o x i d e ; i n t e r c a l a t e ; p x r d， f t - i r s p e c t r o s c o p y . 劝 原 创 性 声 明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中己 经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名: 趁五 日 期 :x3 . 1 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅;本人授权山 东大学可以 将本学位论文的全部或部分内 容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) r、产/ 丫 了 论文作者签名 山东大学博士学位论文 第一章 绪 论 1 . 1 概述 虫草属( c o r d y c e p s ( f r . ) l i n k ) 真菌是一大类重要的昆虫病原真菌，依据 1 9 9 6年 a l e x o p o u l o s 的分类， 属于子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ， 麦角菌目( c l a v i c i p i t a l e s ) ， 麦角 菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) .截至1 9 9 7 年己发现被报道的约有3 5 0 余种 肖 宏亮，1 9 9 7 , 仅清水大典 1 9 9 4 年编著的 原色冬虫夏草图鉴就己记载3 1 6 种，绝大多数为虫生真 菌，在我国分布的有 7 0多种 李增智，2 0 0 明。所谓虫草，是指真菌的菌丝体通过各种 方式侵染昆虫后，以昆虫体内的物质为生而行寄生生活，经过不断的发育和分化后，最 终成熟并伸出于虫体而形成的一种真菌与虫体外壳共存的独特的虫菌结合体。 在此过程 中， 侵染菌必须经过相对独立的分生 抱子阶段( 无性型) 和子囊抱子阶段( 有性型) ， 并实 现两个阶段的转变。 这就是虫草世代交替的生活史。 虫草菌寄生昆 虫寄主而形成的虫草 亦即其有性型阶段，现报道的有 3 0多 种;其中最珍贵的，也是目 前广泛药用的我国 特 产于 青、 川、 滇、 藏3 0 0 0 - 5 0 0 0 米高 原 地区 的 冬虫 夏草( c o r d y c e p s s i n e n s i s ) . 作 为 一 类复 型真菌的虫草其无性型有青霉属( p a e c i l o m y c e s ) 、层梗抱属( h y m e n o s t i b e ) 、多毛抱属 ( h i r s u t e l l a ) 、 绿僵菌属( m e t a r h i z i u m ) 、 弯颈霉属( t o l y p o c l a d i u m ) ， 等等。 虫草寄主 范围极其广泛，除寄生鳞翅目 外，还对同翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目 的幼虫、蛹、 成虫以 及少量蜘蛛类瞒类有致病作用; 同 时， 虫草菌与寄 主浸染结合的 情况也千差万别， 有专性侵染( 如戴氏虫草 c . t a i l ) ，又有非专性侵染( 一菌多虫或多菌一虫，如蛾蛹虫草 c . p o ty a r t h r a 、 垂头虫 草c n u t a n s 和 粉 被虫 草c p r u i n o s a ) 。 虫 草 属的 分 种依 据在于 子 座 和子囊抱子的形态、 大小、 颜色、 着生方式以 及所侵染的寄主，兼顾分生抱子阶段的产 抱结构。由于虫草属漫长的复型寄生生活时代， 增加了 个体的差异性和虫菌结 合的复杂 性， 使分类定种以及虫菌相关性的确定争议不断，歧见频繁 蒋毅 在食品、 害虫的 微生物防治，以 及细胞生物学研究中 有着广泛的应用前景。 此外虫 草属中许多种类还是名贵中 药材。 诸如， 历代本草记载， 冬虫夏草“ 功与人参同” ( 本 草纲目 拾遗 ) ， “ 保肺益肾， 止血化痰”( k 本草从新 ) 。 具有补虚损 益精气、 补肺 益肾、止咳化痰等功效，被古代医家称为治疗 “ 诸虚百损至灵上品” ，作为高级平温型 滋补药使用: 蛹虫草在药典中称为北冬虫夏草， 其药效被认为与冬虫夏草相近， 作为冬 虫夏草的替代品用于 肺肾两虚所致咳喘、 浮肿等症和各类肾病、 慢性支气管哮喘、 慢性 山东大学博士学位论文 肝炎、 更年期综合症的治疗， 以 及肿瘤的辅助治 疗; 蝉花在本草纲目 记载主治，/ j n j l 吊 惊、 癫痈、夜啼、心悸等等。 1 . 2 研究历史 虫草迄今最早的记载是唐代公元8 6 3 年段成式随笔集 西阳杂沮 ，点明了“ 菌生 于蜂”的自 然生态特点。1 7 5 6年赵学敏，1 7 5 7年吴仪洛先后在各自所著的 本草纲目 拾遗 、 本草从新中详尽的记载了 冬虫夏草及其药用， 世界虫草研究史由 此开端。 纵 观虫草研究的发展历史， 大致可以分为三个时期， 十八世纪前半叶至十九世纪中叶为前 期，十九世纪后半叶为中期，二十世纪至今为后期。 前期即冬虫夏草有中国传到西方开始的。1 7 2 3 年，法国科学院学士会所编辑的纪 要刊出了冬虫夏草的有关报道;同时， v a i l l a n t 在他所著的b o t a n i c o n p a r i s i e n s e 一 书中， 发 表了 蛹 草c .p o ly a r th r a 和 大团 囊 虫 草c .o p h i o g l o s s o id e s . 1 7 5 4 年， 西 班 牙 人j o s e t o r r u b i a 利用其在西印 度任职的 机会研究了印 度产虫草， 写成了附 有精制插图的“ 蜂变 草” 见闻录，从而又一次引起欧洲学者们的关注。1 7 6 3 年，h i l l 同样也给西印度产的 蝉 花起了 一个棒状 珊瑚菌c l a v a r ia s o o l if e r a 的 名字。 1 7 8 5 年d i c k s o n 发 表了 又 一 种虫 草 s p h a e r la e n te m o r r h iz a . 1 8 4 3 年 ， b e r k e l e y 仔 细 鉴 别了 从中 国内 地 获 得 的 虫 草 标 本， 正 式 将冬 虫 夏草 定 名 为s p h a e r ia s in e n s is ; ; 同 年k l o t z s c h 也正 式 把 蜂草 的 拉 丁 学 名 确 定 为 s p h a e c o c e p h a l a 。 总之，自 冬虫夏草由中国传到世界各国以后，人们逐渐地知道虫草菌 有许多 不同 种类， 而 且都 是寄 生 在各 种不同 的昆 虫 体上。 在中期阶段，各国虫草专家纷纷前 往世界各地进行调查，相继发表了由 他们采集 的各类虫草。 英国 真菌学鼻祖b e r k e l e y 在1 8 4 3 -1 8 8 3 年间共发表了2 1 种冬 虫夏草。 同期， q u e l e t 在 1 8 8 7 年发表tg 种虫草， 此外， p a t o u i l l a r d自1 8 8 5 年起， 3 0 年间共 报道了1 1 种虫草。 这期间， 欧洲之外的其他地区也进行了有关虫草调查和分类的研究， 先后有北美、新西兰和阿根廷的学者报道了发现的虫草。集合众多研究人员的成果， c o o k e 于1 8 9 2 年写就了 代表性著作 冬虫夏草志( v e g e t a b l e w a s p s a n d p l a n t w o r m s ) . 后期，世界上对虫草的研究逐渐转向区域性。出 现了专攻某一地区、专攻虫生菌 的研究者。柏林的h e n n i n g 1 8 9 2 - 1 9 0 2 年间，发表了1 2 篇论文，共3 3 种虫草。巴西学 者m o l l e r a 详细记载了1 3 种虫草的形态和生物特征。 同期， 爪哇的p e n z i g 和s a c c a r d o 合作， 也图解说明了1 3 种虫草。 c u n n i n g h a m 和邓叔群分别调查了新西兰和中国的虫草。 英国人p e t c h 研究了锡兰岛培拉德尼亚的虫生菌，1 9 0 2 -1 9 4 8 年发表论文3 5 篇，记载 山东大学博士学位论文 了1 2 个新种。密歇根大学的m a i n s 在 1 9 0 2 -1 9 5 9 年发表了1 9 篇论文，2 0 个新种。此 外，比利时的m o u r e a u 和原苏联的k o v a i 分别研究了刚果和俄罗斯地区的虫草。 二十世 纪中叶以来，日 本菌物工作者梅村甚太郎、白 井光太郎、川村青一、原摄鼓、日 野岩等 详尽的研究了日 本的虫草及其分布。 最为突出， 对当代虫草研究者影响最大的是日 本人 小林义雄( y . k o b a y a s i ) 。 前后研究虫草四十多年， 特