（植物学专业论文）具生物钟表达特性的rubisco活化酶和锰稳定蛋白的结构功能研究.pdf

摘要 高等植物中具有昼夜节奏和生物钟表达特性的基因参与了广泛的生理过程。 本文通过e d n a 阵列技术( e d n aa r r a y ) 分离出水稻中具有昼夜节奏和生物钟 表达特性的基因，并着重通过多种生化手段对具有生物钟表达特性的光合相关蛋 白r u b i s c o 活化酶( r c a ) 和锰簇稳定蛋白( m s p ) 结构功能进行了研究。主要 包括以下四方面的结果： 1 e d n a a r r a y 分析水稻中具昼夜节奏及生物钟变化的基因 我们构建了包含有5 8 3 7 条具3 端p o l y ( a + ) 的非冗余的表达序列标签( e s t ) 的水稻e d n a 阵列，用它检测一昼夜内不同光照条件下间隔4 小时的基因表达 谱。实验分离出1 9 0 条具有昼夜节奏表达特性的基因，进一步分析发现其中有 1 7 0 条基因的表达可能受生物钟调控。这些具有昼夜节奏和生物钟表达特性的基 因参与了广泛的生理过程，包括光合作用、糖酵解、水和矿质元素运输、基因的 转录和翻译等等，这表明生物钟在协调植物体内的各种生理中起着重要的作用。 通过对全部具昼夜节奏基因的聚类分析，我们发现这些基因存在1 0 种不同的昼 夜表达模式，这为理解昼夜节奏和生物钟调控提供重要的线索。 2 水稻叶片r u b i s e o 活化酶表达的昼夜变化 在4 8h 的自然光照、连续光照和连续黑暗处理下，水稻幼苗r c am r n a 的含量均表现出昼夜节奏特性，其中以自然光周期中变化最为明显，连续光照可 以使第一个周期的峰值提前，但连续黑暗和连续光照处理可使第二个周期的峰值 明显下降。在光暗交替的条件下，r c a 含量虽也表现出明显的昼夜节奏变化， 但连续黑暗处理和连续光照其含量则不具有昼夜节奏变化，说明它不发生节昼现 象。这些结果表明r c a 表达在转录和翻译水平上的调控机制不同，转录既由光 暗交替控制又可有生物钟调节，而翻译则更大程度上由光调节。 3 酪氨酸残基参与维持锰稳定蛋白功能构象的研究 利用乙酰咪唑( n a i ) 化学修饰m s p 中的酪氨酸残基( f y r ) ，结果发现8 个t y r 依其在m s p 空间构象中的位置可区分为暴露于表面，浅层包埋和深度包 埋三类。约5 ( 实际5 ，2 ) 个暴露于表面的t y r 很容易被修饰上，有1 2 个浅层 包埋的t y r 在较高浓度的n a i 条件下可以被修饰，至少还有1 个处于深度包埋 的y y r 只有在m s p 解析叠情况下才能被修饰上。5 个t y r 被修饰后不影响m s p 的重组和恢复放氧能力，内源荧光和远紫外圆二色谱( c d ) 显示结构没有变化， 表明这些暴露于表面的t y r 对于m s p 重组到p s i i 和恢复放氧活力并不重要。当 m s p 中被修饰的f y r 个数增总数达到6 4 时m s p 不能重组到p s i i 颗粒上去，放 氧活力也得不到恢复，荧光光谱和c d 光谱发生了明显变化，表明6 4 个t y r 被 修饰后的m s p 发生结构上的改变是其失去重组及恢复放氧活性的根本原因，有 1 2 个浅层包埋的t v r 在维持m s p 的功能构象中起重要作用。m s p 在8m 尿素 处理充分解折叠后进行修饰，可使全部8 个t y r 都被修饰上，此时荧光光谱和 c d 光谱发生进一步的变化，m s p 的结构更加解折叠，表明至少有1 个处于深度 包埋的m y r 也参与了维持蛋白的高级结构。 4 关键赖氨酸残基参与维持锰稳定蛋白功能构象的鉴定 实验用n - 丙酰基琥珀酰亚胺( n s p ) 对m s p 中的l y s 进行专一性的修饰，以 分析赖氨酸残基( l y s ) 在m s p 结构功能中所起的作用。o 5 m mn s p 浓度下修 饰的m s p 能较好的重组到p s i i 颗粒上，放氧活力也得到恢复。而4 m mn s p 浓 度下修饰的m s p 几乎失去重组到p s i i 颗粒上的能力，p s i i 颗粒的放氧活力也得 不到恢复。荧光光谱和c d 光谱显示4m mn s p 修饰的m s p 蛋白结构发生明显 变化，说明l y s 被修饰后m s p 失去重组能力的根本原因是m s p 的功能构象发生 改变。酶解结合m a l d i t o f 质谱检测修饰位点，发现参与维持蛋白稳定构象的 l y s 可能有l y s 2 0 、l y s l 0 1 、l y s l 9 6 、l y s 2 0 7 、l y s 6 6 ( 或l y s 7 6 ) 和l y s l 3 0 ( 或 l y s l 3 7 ) 等。 关键词：生物钟节奏；昼夜节奏；e d n a 阵列；表达谱；r u b i s c o 活化酶；锰 稳定蛋白；功能构象；化学修饰；酪氨酸残基；赖氨酸残基 i i a b s t r a c t i nh i g h e rp l a n t s ，c i r c a d i a nc l o c kp l a y sac r u c i a lr o l e i nr e g u l a t i o no fd i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i nt h i ss t u d yc d n aa r r a yc o n t a i n i n g5 8 3 7r i c eu n i q u eg e n e s w a su s e dt o e x p l o r eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n s a t4hi n t e r v a l st h r o u g h o u tad a yt o i s o t a t ed i u r n a ia n dc i r c a d j a nc a n d i d a t eg e n e si n r i c es t r u c t u r a a n df u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o no ft w oc i r c a d i a ng e n er u b i s c oa c t i v a s e ( r c a ) a n dm a n g a n e s e s t a b i l i z i n gp r o t e i n ( m s p ) w e r ea l s os t u d i e di n t h i sp a p e ra n dm a i nr e s u l t si n c l u d e s f o l l o w i n gf o u rp a r t s ： 1 e d n aa r r a ya n a l y s i so fd i u r n a la n dc i r c a d i a nc a n d i d a t eg e n e si nr i c e c d n aa r r a yc o n t a i n i n g5 8 3 7r i c eu n i q u eg e n e sw a su s e dt oe x p l o r eg e n e e x p r e s s i o np a t t e r n sa t4hi n t e r v a l st h r o u g h o u tad a y i tw a sf o u n d t h a tt h e r ew e r e19 0 g e n e sw i t hd i u r n a lc h a n g e s ，o fw h i c h17 0g e n e sc o u l dc h a n g ei nc i r c a d i a nm a n n e r a n a l y s i so ft h o s eg e n e ss h o w e dt h a tc i r c a d j a nc l o c kp l a y e dak e y r o l e i nc o o r d i n a t i o n o fm a n yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e ss u c ha sg l y c o l y s i s ，w a t e ra n dm i n e r a le l e m e n t s t r a n s p o r t b yc l u s t e r i n gd i u r n a lc h a n g eg e n e sf r o mc d n a d a t a ，w ef o u n d1 0c l u s t e r s w i md i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n s 2 d i u r a ic h a n g eo fr u b i s e oa c t i v a s ee x p r e s s i o ni nr i c el e a v e s i no r d e rt oi l l u m i n a t et h er e g u l a t i o no fr u b i s c oa c t i v a s e ( r c a ) e x p r e s s i o n ，w e i n v e s t i g a t e dt h ec h a n g e so fr c am r n a a c c u m u l a t i o ni nl e a v e so fr i c es e e d l i n g sg r o w n u n d e r1 2 - hl i g h v l 2 hd a r k n e s s ( l d ) ，c o n s t a n td a r k n e s s ( d d ) a n dc o n s t a n tl i g h t ( l l ) b vn o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i s t h ec h a n g e si nr c ac o n t e n t si n l e a v e s o fr i c e s e e d l i n g sg r o w nu n d e rt h e s et h r e et r e a t e dc o n d i t i o n sw e r ea l s os t u d i e dw i t hs i n g l e r a d i a li m m u n ed i f f u s i o nb yr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tr i c er u b i s c oa c t i v a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c c u m u l a t i o no fr c am r n ad i s p l a ) r e dat y p i c a l o s c i l l a t i n gp a t t e r nu n d e rl dt r e a t m e n t i nw h i c ht h e1 e v e l so ft h em a x i m u ma n d m i n i m u mw e r ed e t e c t e da t8 ：0 0a m a n d8 ：0 0p m r e s p e c t i v e l y t h er h y t h m i c a c c u m u l a t i o np a t t e mo fr c am r n al e v e lc o n t i n u e dt h r o i l g ht w oc y c l e sa f t e rb e i n g t r a n s f e r r e dt od da n dl l u n d e rt h el lt r e a t m e n t st h ep e a ko fr c am r n a a c c u m u l a t i o ns t a r t e de a r l i e ra n dt h ea m p l i t u d eo ft h ef l u c t u a t i o nf o rt h es e c o n dc y c l e w a sg r e a t l vr e d u c e dt oa p p r o x i m a t e l y2 0 u n d e rb o t hd da n dl lt r e a t m e n t s 1 1 1 e l i o b v i o u sd i u r n a lc h a n g e so fr c a p r o t e i nc o n t e n t sf r o mt h em i n i m u ml e v e l sb e f o r e d a w nt ot h em a x i m u ml e v e li nt h ea f t e r n o o nh a db e e no b s e r v e du n d e rl dt r e a t m e n t i tw a sd i f f e r e n tf r o mt h a to fd da n dl l t r e a t m e n t s ，i n d i c a t i n gt h a tt h et r a n s c r i p t i o no f r c aw a sr e g u l a t e db ya no s c i l l a t i n gc i r c a d i a nr h y t h ma n da l s ob yl i g h tb u t t h e t r a n s l a t i o no fr c aw a sr e g u l a t e db yl i g h tt oal a r g ee x t e n t 3 s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a ld i f f e r e n t i a t i o no ft h r e eg r o u p so ft y r o s i n er e s i d u e s b ya c e t y l a t i o no f n - a c e t ，r l i m i d o z o l ei nm a n g a n e s es t a b i l i z i n g i no r d e rt os t u d yi t sc o n t r i b u t i o nt ot h ea s s e m b l yo ft h eg r e e np l a n tm a n g a n e s e s t a b i l i z i n gp r o t e i n ( m s p ) i n t op h o t o s y s t e mi i ( p s i i ) ，t y r o s i n e r e s i d u e sw e r e s p e c i f i c a l l ya c e t y l a t e du s i n gn - a c e t y l i m i d o z o l ef n a i ) i ns o l u b l em s p , t h r e eg r o u p s o ft y rr e s i d u e sc o u l db ed i f f e r e n t i a t e db yn a ia c e t y l a t i o n ：a p p r o x i m a t e l y5 ( a c t u a l l y 5 2 ) t y rr e s i d u e sc o u l db ee a s i l ya c e t y l a t e d ( s u p e r f i c i a l ) ，l 一2t y rr e s i d u e sc o u l db e a c e t y l a t e dw h e nt h en a ic o n c e n t r a t i o nw a ss u f f i c i e n t l yh i g h ( s u p e r f i c i a l l yb u r i e d ) a n d1 - 2t y rr e s i d u e sc o u l do n l yb ea c e t y l a t e di nt h ep r e s e n c eo ft h ed e n a t u r a n t ，u r e a r d e e p l yb u r i e d ) a c e t y l a t i o no ft h e5 2t y rr e s i d u e sd i dn o ta f f e c tt h er e c o n s t i t u t i o no r o x y g e n e v o l v i n ga c t i v i t i e so f t h em s p , a n df a r u vc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d la n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ea l t e r e dm s pr e t a i n e dm o s to fi t sn a t i v es e c o n d a r ys t r u c t u r e t h e s e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a t5 2t y rr e s i d u e sa r en o ta b s o l u t e l ye s s e n t i a lt ot h ef u n c t i o no f m s p h o w e v e r ，f u r t h e rm o d i f i c a t i o no f t h e1 - 2s u p e r f i c i a l l yb u r i e dt y rr e s i d u e s ( f o ra t o t a la e e t y l a t i o no f 6 4t y rr e s i d u e s ) c o m p l e t e l ya b r o g a t e dt h em s pr e b i n d i n ga n d o x y g e ne v o l u t i o na c t i v i t i e s f i n a l l y , a tl e a s to n et y r o s i n er e s i d u ew a si n a c c e s s i b l et o n a iu n t i lm s pw a sc o m p l e t e l yu n f o l d e db y8mu r e a ap r o m i n e n tr e ds h i f ti n f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fm s p ( e x c i t e da t2 8 0o r2 9 5n l n ) w a so b s e r v e da f t e r m o d i f i c a t i o no f6 4t y rr e s i d u e s a n daf u r t h e rr e ds h i f tc o u l db ef o u n da f t e ra l l8r y r r e s i d u e sw e r em o d i f i e d i n d i c a t i n gag r e a tl o s so fn a t i v es e c o n d a r ys t r u c t u r e f a r - u v c dr e v e a l e dt h a tm s pw a sm o s t l yu n f o l d e dw h e n6 4t y rr e s i d u e sw e r em o d i f i e da n d c o m p l e t e l yu n f o i d e dw h e na l l8t y rr e s i d u e sw e r em o d i f i e d f l u o r e s c e n c ea n df a r u v c ds t u d i e sr e v e a l e dt h a t l o s so fm s pr e b i n d i n gt op s i im e m b r a n e sf o l l o w i n gn a i m o d i f i c a t i o nc o r r e l a t e dw e l lw i t hc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e si nm s pt o g e t h e r , t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a td i f f e r e n tt y r o s i n er e s i d u e sh a v ed i f f e r e n tc o n t r i b u t i o n st ot h e b i n d i n ga n da s s e m b l yo fm s p i n t op s i i i v 4 i d e n t i f i c a t i o no fc a n d i d a t el y s i n er e s i d u e si n v o l v e di n m a i n t a i n i n gt h e f u n c t i o n a lc o n f o r m a t i o no fm a n g a n e s es t a b i l i z i n gp r o t e i ni ns o l u t i o n t oc l a r i f ys t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i p so fl y s i n er e s i d u e si nm s rl y s i n e r e s i d u e sw e r es p e c i f i c a l l ym o d i f i e dw i t hn - s u c c i n i m i d y lp r o p i o n a t e s p ) w h e n m s pw a st r e a t e dw i t h0 5m mn s p t h em o d i f i e dm s pd i dn o ta f f e c ti t sr e c o n s t i t u t i o n o ro x y g e ne v o l v i n ga c t i v i t i e s a n a l y s i sw i t hf 蔚u vc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d lo r i n t r i n s i cf l u o r e s c e n c es p e c t r as h o w e dt h a to 5m mn s p m o d i f i e dm s pr e t a i n e dm o s t o fi t sn a t i v es e c o n d a r ys t r u c t u r ei n c r e a s i n gt h en s pc o n c e n t r a t i o nt o4 m m ，t h e m o d i f i e dp r o t e i nc a n n o tr e b i n dt op s i ia n dc o m p l e t e l yl o s tt h er e a c t i v a t i n gc a p a b i l i t y t h er e s u l t sf r o mb o t hf a ru v - c da n di n t r i n s i cf l u o r e s c e n c es p e c t r aa n a l y s i ss h o w e da c l e a r l yc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e su p o n4m m n s p - m o d i f i e dm s p , s u g g e s t i n gal o s so f i t sr e b i n d i n gt op s l lw a sp r i m a r i l yc a u s e db yc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e m a p p i n go ft h e s i t e so fn s pm o d i f i c a t i o nw a sp e r f o r m e db ys t a p h y l o c o c c u sv 8p r o t e a s ed i g e s t i o no f t h em o d i f i e dp r o t e i na n da n a l y s i sb ym a l d i t o fm s t h e s es t u d i e si n d i c a t e dt h a t s i xl y s i n er e s i d u e si n c l u d i n gl y s 2 0 ，l y s l 0 1 ，l y s l 9 6 ，l y s 2 0 7 ，l y s l 3 0 ( o r1 3 7 ) a n d l y s 6 6 ( o r7 6 ) w e r em o d i f i e do n l yw i t h4 m m n s rt h e s ec a n d i d a t el y s i n er e s i d u e s s e e mt op l a yac r u c i a lr o l ei nm a i n t a i n i n gf u n c t i o n a lc o n f o r m a t i o n o fm s pi ns o l u t i o n k e yw o r d s ：c i r c a d i a n ；d i u r n a l ；c d n aa r r a y ；e x p r e s s i o np r o f i l e s ；r u b i s c oa c t i v a s e ； m a n g a n e s es t a b i l i z i n gp r o t e i n ；f u n c t i o n a ls t r u c t u r e ；c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ；t y r o s i n e r e s i d u e ；l y s i n er e s i d u e v 本研究受 国家自然科学基金( 3 9 9 7 0 4 4 0 ，3 0 4 7 1 0 5 1 ) 国家重点基础研究发展计划一9 7 3 计划( n o ( 3 19 9 8 0 1 0 1 0 0 ) 国家教育部博士点基金( 2 0 0 2 0 3 3 5 0 4 ) 资助 t h i sp r e s e n ts t u d yw a sf o u n d e d b y t h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 9 9 7 0 4 4 0 ，3 0 4 7 10 51 ) t h es t a t ek e yb a s i cr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t p l a n ( n o g 1 9 9 8 0 1 0 1 0 0 ) p h d p r o g r a m sf o u n d a t i o no f m i n i s t r yo f e d u c a t i o no f c h i n a ( 2 0 0 2 0 3 3 5 0 4 ) c a b c d c h c a c h 】 c v t d c m u d h b d m b q e d c e s t f t i r l h c i i m a l d i t o f m s m s p n a i n b s n h s b i o t i n n s p o e c p 6 8 0 p a g e p b 0 p h e o p s i ，p s i i q a q b r c a r u b i s c o s a s d s t y r d t y r z z t 本文主要缩略词表 c h l o r o p h y l la ，b - b i n d i n gp r o t e i n s c i r c u l a rd i c h r o i s m n c y a n o 一4 一h y d r o x y c i n n a m i ca c i d c h l o r o p h y l 】 c y t o c h r o m e 3 一( 3 ，4 - d i c h l o r o p h e w l ) l ，1 一d i m e t h y l u r e a 2 ，5 一d i h y d r o x v b e n z o i ca c i d 2 , 6 - d i m e t h y l p - b e n z o q u i n o n e 1 一e t h y l 一3 f 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e e x p r e s s l o ns e q u e n c et a g f o u r i e rt r a n s f o t i ni n f r a r e ds p e c t r o m e t e r l i g h th a r v e s tc o m p l e xi i m a s s s p e c t r o m e t r i ct e c h n o l o g y o f m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m eo ff l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y m a n g a n e s es t a b i l i z i n gp r o t e i n n a c e t v l i m i d a z o l e n b r o m o s u c c i n i m i d e n h y d r o s u c c m i m i d o b i o t i n n s u c c i n i m i d y lp r o p i o n a t e o x y g e n e v o l v i n gc o m p l e x p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p - b e n z o q u i n o n e p h e o p h y t i n p h o t o s y s t e mi ，p h o t o s y s t e mi i p r i m a r yq u i n o n ee l e c t r o na c c e p t o r s e c o n d a r yq u i n o n ee l e c t r o na c c e p t o r r u b i s c oa c t i v a s e r i b u l o s e 1 ，5 - b i p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e - o x y g e n a s e s i n a p i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e z e i t g e b e r 叶绿素a b 结合蛋白 圆二色性 a 氰基4 - 羟基水杨酸 叶绿素 细胞色素 二氯苯二甲脲 2 ，5 二羟基苯甲酸 2 , 6 一二甲基对苯醌 乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺 表达序列标签 傅立叶变换红外吸收光谱 外周捕光天线复合体 基质辅助激光解析b 行时间 质谱 锰稳定蛋白 乙酰咪唑 n 滇代琥珀酰亚胺 琥珀酰亚胺生物素 n * 丙酰基琥珀酰亚胺 放氧复合体 反应中心叶绿素a 分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 苯醌 去镁叶绿素 光系统i ，光系统i i 初级醌电子受体 次级醌电子受体 r u b i s c o 活化酶 1 ，5 一二磷酸核酮糖羧化a n 氧 酶 芥子酸 十二烷基硫酸钠 d 2 蛋白第1 6 0 位的酪氨酸残基 d i 蛋自第1 6 1 位的酪氮酸残基 时间线索 文献综述第一节植物生物钟研究进展 第一章文献综述 第一节植物生物钟研究进展 一、概述 地球的自转导致自然状态下光照和温度产生昼夜交替变化，生活在地球 上的生物经历长期的自然选择后会形成各种内在的生理机制，使自身的生命 活动过程与确切的昼夜变化相协调，从而适应地球自转所产生的昼夜光温变 化，这种经历昼夜调整后形成的生理节奏亦被称为生物钟【1 - 5 。 早在公元前4 世纪，人类就已经认识了生物钟，1 7 2 9 年法国人j e a n j a c q u e sd o r t o u sd em a r i n e 通过实验手段报道了生物钟的现象【6 ，他观察到 含羞草的叶片和叶柄在夜晚闭合，在白天又重新展开，把含羞草放在持续黑 暗的条件下，含羞草的叶片和叶柄仍然象能感受到光暗交替一样，定时开合。 这一实验是最早关于生物钟即使在缺乏外界诱导条件下仍然运转的报道。事 实上，在这篇报道前后，人们就已经意识到植物的生物钟运转有可能是由昼 夜的光暗交替所造成。1 7 5 1 年l i n n e a u s 根据生物钟设计了一个花园，不同 植物的花朵在一日之内的不同时间开放，成为一个开花时钟 6 】。 人们对生物钟现象认识逐渐深入，并意识到可能有一种环境信号能被植 物所感受，进而诱导内源生物钟形成。1 9 世纪科学家们进一步发现含羞草在 持续黑暗条件下叶柄开合的周期并不是严格的2 4 小时，而是在2 2 小时至2 3 小时之间 7 】。1 9 3 5 年e r w i nb u n n i n g 利用普通大豆的两个具有不同生物钟节 昼的变种进行杂交，杂种后代的生物钟节昼差异介于父母本之间，表明生物 钟节奏是由遗传上的多基因位点所决定的 8 。随着人们对生物钟现象认识的 逐渐深入，普遍认为生物钟现象具有以下特征 2 3 ，9 1 1 】： 1 ) 节奏周期约为2 4 小时。随外界诱导条件不同，节奏周期存在差异； 2 ) 生物钟现象是可诱导的，是对外界环境信号的累积效应； 3 ) 诱导刺激一般是光照或温度： 4 ) 不同生物所需的诱导刺激时间不一样，果蝇只要1 5 分钟，而植物需要3 到4 小时： 文献综述第一节植物生物铈研究进展 5 ) 生物钟同其它生化周期不同的地方还在于其具有温度补偿特性。温度变化 会改变时钟节奏，一旦温度稳定，其对时钟节奏的长度影响并不大： 6 ) 生物钟经启动，即使在非周期的外界诱导刺激下仍能持续周期性的节奏 变化。 由上述这些特征可以看出，生物钟不能简单的定义成植物适应外界环境 而发生的生理波动，只有那些经昼夜变化产生的光暗交替等因素诱导而形成 的具周期性的生理节奏才是生物钟。 一般认为整个生物钟体系由信息输入途径，中心振荡系统和输出途径组成 2 ，3 。输入途径使内源生理节奏与光等信号同步，协调内源系统适应光温的 周期性变化；中心振荡系统是一负反馈系统，它可能受转录翻译等参数所控 制；输出途径使产生昼夜生理节奏的生理信息与广泛的生理学过程相关联( 图 】) 。 圈1 生物钟系统的简单模式图 生物钟系统包括三个基本组成：输入途径，中心振荡系统和输出途径。植物最主要 的两类光受体光敏色素和隐花色素，是诱导生物钟形成的第一环节。中心振荡系统 的各个成员( a d ) 相互作用形成一个自行的负反馈调节，这种调节产生约2 4 小时 的周期- 性节奏变化。中心振荡系统产生具有不同相位但周期仍一致( e - g ) 的输出 途径。( 引自文献f 3 1 ) f i g1 m o d e lo fas i m p l ec i r c a dj a ns y s t e m t h et h r e ep r i m a r yc o m p o n e n t si n c l u d e ；a n i n p u t ( e n t r a i n m e n t ) p a t h w a y ( s ) ，t h ec e n t r a lo s c i l l a t o r , a n da no u t p u tp a t h w a y ( s ) 文献综述第一节植物生物钟研究进展 二、输入途径 光是诱导植物生物钟形成最重要的因素，光质、光强和光周期都可以实 现对生物钟的调节 1 0 1 ，例如，脉冲光可重置生物钟振荡的相位，而即时改 变光强度则可能改变节奏的周期。一般情况下增加光强会使植物相对夜晚的 周期时间延长而白昼的周期时间缩短 1 2 1 5 1 。如果考虑到增加的是哪一种光 质的光强从而对生物钟产生影响，情况就会更复杂。植物体内存在多种光受 体对不同波段的光强进行响应。拟南芥基因组中的光受体包括5 个光敏色素 ( p h y t o c h r o m e ) 基因( p h y a 、p h y b 、尸h 陀、p h y d 、p h y e ) ，2 个隐花色 素( c r y p t o c h r o m e ) 基因( c r y i 和c r y 2 ) 1 6 1 8 】。另外可能还有其它的一些蓝 光受体如n p h l ( p h o t o r o p i n ) 、玉米黄质( z e a x a n t h i n ) 等等【1 9 】。 在植物生物钟研究中，利用叶绿素a b 结合蛋白( c h l o r o p h y l la b b i n d i n g p r o t e i n s ) 的启动子和荧光素酶( 1 u e i f e r a s e ) 的编码序列构建的报告系统 ( c a b 2 一l u c i f e r a s er e 口o n e lc a b 2 ：l u c ) 被广泛应用于检测基因表达的节奏变化 【1 3 。当荧光素底物存在时，启动子强烈激活转录，用摄录设备便可记录下 转化幼苗内的节奏性的荧光变化。运用这一体系，人们发现用红光或白光照 射拟南芥的光敏色素缺乏( 缺乏所有5 种光敏色素) 突变体砂j 一6 ，突变体的 节奏周期要略长于野生型 2 0 1 。 研究还表明，在不同的光强下，p h y a 和p h y b 都可介导红光信号启动生物 钟。弱红光条件下，缺乏p h y a 的突变株节奏周期比野生型的节奏周期要长2 个小时，而缺乏p h y b 的突变株仅在高红光光强下才使节奏周期延长。另外 p h y a 的突变株也有可能介导蓝光的信号输入，但也只是在低光强下才起作 用。隐花色素( c r y l 和c r y 2 ) 是对蓝光特异性强的光受体，c r y l 缺乏无论在高 蓝光强或低蓝光强下都会导致节奏周期延长，但仅缺乏c r y 2 对节奏周期的影 响却很小。这些实验证据表明植物能充分利用不同的光受体，即使在环境的 光强和光质发生变化时，仍能保证生物钟节奏的稳定 1 4 】。 光受体是接受光信号到生物钟的最初步骤，鉴定介导光受体和生物钟之 间的环节，或那些可以和其它光响应生理过程共享的生物钟途径也十分重要。 开展这些研究主要利用一些处于光受体下游的突变体( d e t c o l ，_ f u s ) ，这些突 变体的幼苗在黑暗条件下能表现出照光下生长的某些特性，但节奏周期的长 壅整堡垄篁二堇焦塑竺塑塑塑塞壅壁： 一 短同野生型却不一样 2 0 ，2 1 1 。对这些基因突变的研究推测它们可能是介导到 生物钟的几个平行信号途径的成员，其确切的功能或作用方式尚不清楚。 三、中心振荡系统 图2 真核生物生物钟的调节机制 p r o t l 和p r o t 2 两种位于核内的蛋白通过阻断两个具有b h l h - c o n t a i n i n g d n a - b i n d i n g 蛋白( p p l 和p p 2 ) 的活性进行负反馈调节其自身的转录。p p l 和p p 2 有一个共同的p a s 结构域，它能促进蛋白间的相互作用，还可与p r o t i 利p r o t 2 的启动子上的生物钟元 件( c i r c a d i a nc l o c ke l e m e n t ，c c e ) 相结合。当缺乏p r o