（物理化学专业论文）泡沫分离法分离蛋白质的研究.pdf

摘要 泡沫分离蛋白质是利用蛋白质的表面活性对其进行分离的一种方法，分离过 程中的条件温和，对蛋白质的活性影响较小，是一种成本较小、有着很好应用前 景的分离方法。 实验中，以两种蛋白质b s a 和h s a 作为分离模拟体系的目标蛋白质，利用 自制的泡沫分离塔，作了一系列的泡沫分离实验，考察了各种操作参数对分离结 果( 回收率和增浓比) 的影响。实验发现，液柱高度、泡沫层高度、鼓入气体的 流速、进料流量和p h 值、料液浓度以及温度等对分离的效果有着不同程度的影 响：较低的进气速度、较高的泡沫高度与液柱高度、适宜的温度( b s a 在2 5 。c ， h s a 在3 5 。c ) 、适当的p h 值( 蛋白质的等电点附近) 以及较低的母液浓度有利 于得到较高的富集比。在最佳条件下富集比最高可达2 8 6 ，回收率可达9 3 1 。 在模型的建立过程中，假设吸附过程始终处于平衡态、气泡大小均一以及每 个气泡均为正十二面体，建立了分离的数学模型，得到可以求解的微分方程组。 在对分离中的一些情况进行合理的假设，并忽略泡沫上升过程中气泡聚并破裂对 分离的影响后，在合理的假设边界条件下，得到了方程求解所需要的参量的初始 值，利用m a t l a b 编程对微分方程组进行求解，对富集比与回收率在一定条件下 随泡沫高度的变化趋势进行了预测，并对结果进行了分析。认为模型建立过程中 对吸附过程的简化以及求解中对泡沫聚并的忽略是影响计算结果的主要原因。 关键词：蛋白质泡沫分离数学模型回收率富集比 a b s t r a c t f o a mf r a c t i o n a t i c n i sk n o w nt oh a v ep o t e n t i a l f o r s e p a r a t i o n o f b i 0 1 0 9 i c a lm o l e c u l e sw i t har a n g eo fs u r f a c ea c t i v i t i e s b e c a u s eo fi t s l o wc o s ta n dm i l do p e r a t i o nc o n d i t i o n s i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，f r a c t i o n a t i o no fb s aa n dh a sw a ss t u d i e d t h e e f f e c t so fg a sv e l o c i t y ，p h ，t e m p e r a t u r e ，p o o la n df o a mh e i g h t ，i n i t i a l f e e dc o n c e n t r a t i 。na n df e e dr a t eo ns e p a r a t i o nr e s u l t sw e r es t u d i e d t h e e x d e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t1 0 wv e l o c i t y ，h i g hp o o la n df o a ml e v e l s ， 1 0 wi n i t i a lc o n c e n t r a t i o n ，a n dp ha r o u n di s o e l e c t r i cp o i n to fp r o t e i n s a r et h eb e n e f i c i a lc o n d i t i o n st og e th i g h e re n r i c h m e n t t h eh i g h e s t v a l u e s o fe n r i c h m e n ta n dr e c o v e r yo b t a i n e dw e r e2 8 6 a n d9 3 1 ，r e s p e c t i v e l y t h em a t h e m a t i cm o d e lw a sd e v e l o p e dw i t hm a n ya s s u m p t i o n s s u c ha s a d s o r p t i o ne q u i l i b r i u m ，s a m e s i z eb u b b l e s ，d o d e c a h e d r o ns u b s t i t u t i n g r e a lb u b b l e u n d e rr e a s o n a b l e i n i t i a la n db o u n d a r yc o n d i t i o n s ，t h e d i f f e r e n t i a le q u a t i o n sw e r es o l v e dw i t h o u ta c c o u n t i n gf o rc o a l e s c e n c eo f b u b h l e sb ym e a n so fm a t l a ba n dt h ee n r i c h m e n ta n dr e c o v e r yw a sp r e d i c t e d a n dt h er e s u l t sw e r ed i s c u s s e d t h es i m p l i f i c a t i o no ft h em o d e la n dt h e n e g l e c to fb u b b l e sc o a l e s c e n e e r e s u l t e di nl o w e re n r i c h m e n ta n dr e c o v e r y k e yw o r d ：p r o t e i n ，f o a ms e p a r a t i o n ，e n r i c h m e n t ，r e c o v e r y ，m a t h e m a t i c m o d e l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。也不包含为获得墨鎏盘鲎或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 靴敝储鹕穆p 铷瓤力妒幽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤洼盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丕鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：蟛阻翩魏 签字吼衅f 妒；1 日 砂l 俊三 i 签字日期：沙矛，胡；1 日 第一章前言 1 1 泡沫分离法概述 第一章前言 泡沫分离法是2 0 世纪兴起的、以气泡作分离介质来浓集表面活性物质的一 种新型分离技术。辛辛那提大学的教授l e m l i c h i l 】对此进行了开创性的工作并总 结写出关于此领域的经典专著( a d s o r p t i v e b u b b l e s e p a r a t i o nt e c h n o l o g y ) ) 一 书。现在泡沫分离技术得到了很大发展，并获得了广泛的应用，在污水处理、 海水淡化和矿物浮选等方面的技术堪称成熟【2 j 。 所有的分离方法，无论是物理方法还是化学方法，都是基于所分离的组分之 间性质上的差异。许多我们熟悉的分离方法，都是利用这一原理。例如，精馏是 基于组分挥发性的差异，液液萃取是基于组分溶解度的不同。泡沫分离技术是 基于组分表面活性的不同。许多物质如表面活性剂、蛋白质( 高分子) 、胶体粒 子、大颗粒等都因其具有表面活性可以被吸附在气泡的表面，然后通过收集泡沫 相可以实现分离和纯化的目的。在工业生产中，早已应用泡沫分离方法来纯化啤 酒，使其达到某一口味的要求。 当溶液中需要分离的溶质本身具有表面活性时，可以通过鼓入与分离物质不 发生反应的气体，形成大量气液界面，使表面活性物质借此发生表面吸附，富集 到泡沫上，然后收集这些泡沫，进行破泡处理后就可以得到溶质的含量比原料液 高的溶液。被浓集的物质可以是表面活性物质。也可以是与表面活性物质相结合 的任何溶质，例如矿石颗粒、沉淀颗粒、阴离子、阳离子、染料以及某些有机溶 质等，当然也可以是蛋白质和酶等生物活性物质。虽然早在1 9 1 5 年，矿物浮选 就开始应用，但在其它领域，泡沫吸附分离仍然是一项有待开发和完善、有着广 阔应用前景的新型分离技术。随着工业的发展，废水的问题日益严重，泡沫分离 可用于多种工业废水的处理，很多国家已经对此开展了大量的研究工作。 长期以来，不同的领域对泡沫分离的称呼和解释不同，造成了不小的混乱。 1 9 6 7 年，k a g e r 把鼓泡吸附分离技术作了经典的分类，消除了理论与应用实践中 命名不一致引起的混乱。分类如图1 1 ，鼓泡分离技术分成两大部分：泡沫分离 和无泡沫分离。前者主要依靠形成的泡沫夹带出所要分离的目标物质。无泡沫分 离需要鼓泡，但不一定要形成泡沫层。鼓泡方式是从塔式设备底部鼓入气体，所 形成的气泡在富集了溶液中的表面活性物质后，上升至塔顶和液相分离，使溶液 得以浓缩。 第一章前言 泡沫分离法又根据分离对象是溶液还是带有固体粒子的悬浮液和胶体液分 成泡沫分馏法和泡沫浮选法两大类。我们平时所说的泡沫分离就是特指泡沫分 泡沫吸附分离技术 j 厂一i 泡沫分离非泡沫分离 厂l 厂l 泡沫分馏泡沫浮选鼓泡分离法溶剂消去法 l 矿物浮选粗粒浮选细粒浮选沉淀浮选离子浮选分子浮选吸附富集浮选 - 图1 1 泡沫吸附分离法的分类 f i g 1 1 c l a s s i f i c a t i o no f a d s o r p t i v eb u b b l e s e p a r a t i o nm e t h o d s 馏，被分离的物质可以是表面活性物质，也可以是能与某类表面活性物质螫合或 络合成具有表面活性物质的离子。在塔底鼓泡时，这些需要分离的物质吸附或富 集在上升的起泡表面。所以迸行泡沫分馏时应具备两个条件：( 1 ) 所分离的溶 质应该是表面活性物质，或者是可以与表面活性剂络合的物质；( 2 ) 富集剂在 分离过程中能在溶液主体上方形成比较稳定的泡沫层。分离泡沫后，进行破泡处 理得到富集的产物。整个过程的传质可分为两个阶段：一阶段发生在鼓泡区中， 是在液相主体和气泡表面和气泡表面之间进行的：另一阶段发生在泡沫区中，是 在气泡表面和间隙液中进行的。所以，表面化学与泡沫本身的结构和特征都是泡 沫分馏的基础。 蛋白质的泡沫分离在操作和设计的许多方面可以与精馏比拟，故又称泡沫分 馏或泡沫精馏。用于吸附分离的气泡，可以从外界鼓入气体生成，也可以通过溶 液内的电化学和化学反应产生，还可以由溶解在其中的气体释放实现。蛋白质的 鼓泡吸附分离，就是向泡沫塔中鼓入气体，形成大量气液界面( 气泡) ，使具有 表面活性的蛋白质在气液界面发生吸附，然后分离泡沫相并进行破泡处理后，就 得到了浓度较高的蛋白质溶液。 1 2 蛋白质分离原理 1 2 1 蛋白质的分子结构 第一章前言 蛋白质是一种结构复杂的分子，是由二十多种氨基酸通过不同的组合方式形 成的直链分子。 蛋白质分子中的主要化学键是氨基酸中的羧基和氨基形成的酰胺基。最常见 的支联方式是通过键能分别为2 0 9 j t o o l 4 和2 5 j m o l 。1 的双硫共价键形成的。 蛋白质分子同时拥有疏水基和亲水基两种基团。蛋白质分子中，极性基团分 布在分子的表面，而大部分非极性基团被包埋在分子的内部。极性基团容易与水 分子作用，而非极性基团则有助于将分子聚集在一起，使蛋白质分子表现出表面 活性。 从极性环境到非极性环境的任何一个蛋白质的非极性支链都获得4 k c a l 的稳 定自由能。这些能量的获得主要是由于熵变效应，这一作用也是蛋白质在含水介 质中保持分子稳定的主要因素。 当蛋白质处于界面上时，例如气液界面，亲水和亲油键都会受到外界的应 力，这种应力有时候比较大。表面上的应力可以引起蛋白质分子折叠结构的张开， 破坏蛋白质内的化学键，从而使蛋白质失活。尽管这些化学键可能离活性位置比 较远，但是分子内部的平衡却可能因此而被打破，进而使蛋白质的活性中心遭到 破坏。失活后的蛋白质虽然可以做饲料和食物等其它的用途，但已经不具有生物 功能了。这一点是在蛋白质分离过程中必须面对和解决的问题，也是蛋白质在传 统的分离方法的操作过程中无法克服的一个困难。 有些蛋白质会在表面或界面上发生这些所谓的失活变性f 3 “】，影响泡沫分离 的效率，但某些种类的蛋白质，如酶蛋白，在界面张力下不会发生对分子结构和 活性产生影响的变化。人肝脏中的乙醇脱氢葡化酶，在经过五级泡沫分离操作后， 也只有5 - 2 0 失活。 因为蛋白质同时拥有疏水基团和亲水基团，所以具有表面活性，能自动富集 在气液界面上，使溶液的表面张力发生变化。g i b b s 用热力学方法推出了浓度c 、 表面张力，和吸附量，之间的关系式，即著名的g i b b s 吸附等温式： 厂一告譬( 1 - 1 ) r rd c c ：溶液本体中的平衡浓度 ，：溶液的表面张力 f ：溶质在单位面积表面层中的吸附量 由于吸附主要发生在表面上，所以溶质只是在这一薄薄的表面层中有较高的 浓度。分离这一薄层，就可以得到比溶液浓度高的浓缩液。将其应用到蛋白质的 富集中，可以通过鼓入空气，人为地制造气液界面( 泡沫) ，使蛋白质不断吸附 第一章前言 到气液界面上，就能富集大部分的蛋白质，达到更快更有效率的分离提纯蛋白质 的目的。 1 2 2 基本原理 1 2 2 1 表面相的形成 当在蛋白质溶液中形成新表面时，随着时间的流逝，蛋白质分子会自动从溶 液本体向表面移动，表面浓度随之增加。因为表面和溶液本体间存在着浓度差异， 达到平衡时，溶液到表面存在浓度梯度。如图1 2 ： 3 r 。 k 1 一 a 开始时 浓度增长 月+6 专_ = = ： 开始 ；j t ， j 平衡 。 。； “岛 浓度减小 表面丁丁r r 几1 可 溶赦 b 平衡时 图1 - 2 表面与主体溶液的吸附平衡 f i g 1 - 2a d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mb e t w e e n s u r f a c ea n db u l ks o l u t i o n 平衡状态下，蛋白质在溶液本体中的化学势等于其在界面相中的化学势 ” _ “b = 熊 ( 1 2 ) 风：溶液中蛋白质的化学势 熊：表面相中蛋白质的化学势 实际上，达到平衡的时间需几分钟到几小时不等，即分离操作过程中吸附往 往是偏离平衡态的，蛋白质在溶液和表面相中的化学势不等，前者大于后者，此 差值就是蛋白质从溶液内部向表面转移的推动力。蛋白质在液相和泡沫相中化学 势的不同便其从化学势较高的液体相向化学势较低的表面相中运动，当在两者中 的化学势相等时，两相中的蛋白质浓度不再发生变化。 4 第一章前言 1 2 2 2 蛋白质从溶液内部到表面过程的推动力 上文已经提到，蛋白质从液相转移到表面相的推动力 的化学势差，在表面相中的化学势为： 从= ? + r t i n c ； 在液相中的化学势为： 地= ：+ r t l n c b c 。：表面相中蛋白质浓度 c 。：溶液主体相中蛋白质浓度 r ：气体常数 r ：绝对温度 版：蛋白质在表面相中的化学势 砖；蛋白质在表面相中的标准化学势 风：蛋白质在液相中的化学势 ：蛋白质在液相中的标准化学势 两相中化学势差为 b 一。= ：一心+ r t l n ( c b c 。) 而：一砖为解吸热。 蛋白质从液相吸附到表面相的传质速率为0 1 】： 警= 船一n 他) ) 鲁= 等妊? ) + l n ( c b c s ) 足：传质系数 s 矿：表面相单位体积的表面积 孵：溶质的物质的量 ，：吸附时间 是蛋白质在两相问 ( 1 - 3 ) ( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 - 6 ) f l - 7 ) 第一章前言 面v ：传质阻力 平衡时，物质在两相中的化学势相等，所以 卢：一a ? = 一r t l n ( e b c ；) = y( 1 8 ) f ：蛋白质的解吸热 由上式可以看出，蛋白质在表面相中最大浓度取决于与其所平衡的溶液浓度 和蛋白质的解吸热。 1 3 文献综述 1 3 1 蛋白质的分离实验工作 泡沫分离是从稀水溶液回收蛋白质的有效方法。分离的主要依据是蛋白质在 气液界面的吸附。利用蛋白质表面活性的差异对它们进行分离，可以从极稀的溶 液中富集并分离出蛋白质。泡沫分离蛋白质的最早应用是从工业淀粉的洗液中分 离出蛋白质作为牲畜的饲料。1 9 3 7 年，人们通过简单泡沫分离操作分离出了血 色素。现在，这种技术日益受到人们的重视，在过去的几十年中，许多研究者针 对此领域作了大量的研究。然而，此项技术仍然需要进一步完善，以使其得到广 泛的应用。 1 8 7 8 年，吉布斯建立吉布斯吸附方程，在蛋白质的泡沫分离过程中，成为 基础的理论支持。 本世纪初，z a w i d z d i 【1 1 开始利用在液体中鼓泡的方法在实验室中来验证吉布 斯方程。几年以后，矿物的泡沫浮选开始得到广泛应用。 七十年代以来，许多学者对蛋白质泡沫分离进行了系统研究，主要考察了影 响蛋白质分离效果的因素，通过实验，定性或半定量的说明了泡沫分离中存在的 一些问题。 e c h a r m 对泡沫分离蛋白质作了综述，提出了泡沫分离的主要原理。c h a r m 提出，在间歇式泡沫分离操作中，吲麒吸附热传质系数) 、泡沫的比表面积( 泡 沫层的表面积泡沫层的体积) 、回收的溶液的体积、所分离的溶液的初始体积、 所分离的溶液的浓度、气泡直径、表面浓度以及表面键都可能是影响表面浓度的 因素。 l b r o w n 和g n a r i s i m h a n i5 】采用4 5 厘米直径和2 米高的玻璃圆柱作泡沫塔， 用磷酸盐来调节液体的p h 值，对牛血清蛋白0 3 s a ) 进行了一系列的研究，以富 集率( 表面相物质浓度原料液物质浓度) 和回收率( 分离出的蛋白质的量原料液 第一章前言 中蛋白质的量) 作为衡量分离效果的标准，研究了气泡直径、进料浓度、泡沫相 高度、离子强度、p h 值等因素对蛋白质富集率和回收率的影响，并在l e m l i c h 和l e o n a r d l 6 】建立的数学模型的基础上，改进了分离模型，将分离效果的实验值 与预测值进行了比较，认为两者存在差异的主要原因是泡沫中气泡的直径不是相 等的，模型中采用的统计平均值不能代表所有泡沫，因而引起了计算偏差，而且 用摄像机拍摄到的气泡并不定具有代表性。 中科院化工冶金所的王立新r 等，采用连续泡沫分离的方法分离明胶，考察 了可能对分离效果产生影响的因素。发现通气速率较大时，由于夹带液体量增大 以及气液表面上的蛋白质浓度的降低使富集比降低。液体流量增大时，由于塔底 液相的浓度升高，降低了明胶富集度，但降至5 0 m g m l 时，进料浓度对富集比 的影响开始减小。在明胶的等电点( p h = 4 9 ) 下，获得了最大富集比。另外，泡沫 高度的降低，也会导致富集比的降低。他们还考察了不同的进料位置对富集比的 影响。 谢继宏 8 等用泡沫精馏塔来分离大豆蛋白质溶液中的蛋白，考察了进料浓 度、进气流量、p h 值和回流比等对分离过程的影响，找出了较佳的操作条件， 并着重研究了全回流和部分回流时气速对分离效果的影响，发现增大气速将导致 富集比下降。在实验过程中，还模仿精馏操作中的回流，采用回流操作，实验结 果表明回流对分离结果的影响很小，甚至可以忽略。他们在考察p h 值对分离效 果的影响时也发现，在等电点下蛋白质的分离效果最佳，认为等电点上，蛋白质 的排斥力最小，活性最高，气泡稳定性好，减少了泡沫中液体的夹带量，从而提 高了富集比。偏离等电点时，蛋白质重又带电，导致富集比下降。 清华大学的殷刚【9 】等利用内环流泡沫技术对若干糖一牛血清蛋白混合模拟体 系进行分离试验，研究了p h 值对溶液表面张力和分离效果的影响。在综合考虑 泡沫夹带量、蛋白质去除率、糖的损失率及分离因子的基础上，得到了泡沫分离 的最优p h 值，证明了泡沫分离在去除混杂在糖类中的蛋白质方面具有比s e v a g 溶剂萃取法更大的优势，并把此研究成果应用于泡沫分离螺旋藻多糖与藻蛋白的 初步分离过程，收到了较好的效果。 p s a r k a r 1 0 j 等人在从胎盘血浆中分离蛋白水解酶的实验中，同样研究了p h 值、蛋白质浓度、泡沫塔的几何尺寸与进气速率等对分离效率的影响，发现在等 电点附近蛋白质是最容易吸附在气泡表面上的，此时的分离效果也是最好的。他 们认为浓度较稀的溶液回收率较高的原因是因为蛋白质在低浓度时形成的泡沫 比较稳定。s a r k a r 等人认为分离塔的直径和高度不仅应该随所分离的溶液的不同 而不同，还应该随气速的变化而变化，以找出分离该溶液的最佳分离条件。他们 还对泡沫分离蛋白质的前景进行了展望，认为泡沫分离法所独具的温和的操作条 第一章前言 件，以及低廉的操作成本将会使其在具有生物活性的物质的分离中越来越具吸引 力。 1 9 9 8 年，h o s s a i n 与f e n t o n i l l 用酪蛋白酸钠、b 一酪蛋白、牛血清蛋白、 0 一乳球蛋白、a 一乳白蛋白和糜蛋白酶原等几种蛋白质的溶液做试验，同时采用 三个参量( 富集比、分离比和回收率) 来衡量分离效果，考察试验的操作参数对分 离效果的影响，发现在牛血清蛋白( b s a ) 的等电点，其它的蛋白质在等电点以 上，在其他的操作条件相同的情况下，待分离溶液的浓度越低，富集比越大。 2 0 0 1 年，s a l c h 与h o s s m n “j 用连续泡沫分离法，用o 1 m n a o h 和0 1 m h 2 s 0 4 来调节溶液的p h 值，从b s a 、旷乳白蛋白、乳铁传递蛋白组成的混合溶液中分 离b s a 。他们在实验中分离出了8 5 目标蛋白质，并获得了取得最佳效果( 富集 比，选择性和回收率) 时的操作数据，如气泡直径分布、气流速度、溶液原始浓 度与各种蛋白质的组成比率等，并计算出了传质系数。 为了使泡沫中的气泡尽可能的均匀，同时也为了解决泡沫夹带量过大的问 题，有研究者开始研究通过增大泡沫中气体的体积比，降低泡沫中的液体比率， 以期获得较“于”的气泡而使泡沫相浓度提高。y a m a s h i t a i l3 j 对泡沫层进行摄像 分析，发现气体量与泡沫层高度有一定的关系，泡沫层越高气体越多，而气体在 釜液中的比例则是恒定的。他发现泡沫层高度对泡沫中的持液量“影响非常 大，在液相高度很小时，两者的关系可以用方程口= 4 1 i l 一0 6 表示。f a r o o q u r a i z e e 和g a n e s a n n a r s i m h a n l l 4 1 7 对蛋白质泡沫分离的吸附动力学和气泡的聚并 现象进行了深入的研究。在考察前文所提的因素外，还对离子强度和泡沫的聚并 对分离产生的影响作了详细的研究。对比试验结果，证实在液相池面较低的情况 下产生的气泡容易破裂。 在以上这些人做的系统的实验来获得经验性的定性的东西以外，许多研究者 则重点从理论上分析泡沫分离过程中的影响因素。 s y e di f f i h a r a j l a m d i l 8 】研究了活性剂、甘油酯、糖以及盐等对白蛋白分离过 程的影响后认为，泡沫相在添加了水溶性离子后，生成了比胶束规整的结构，提 高了分离效率。糖的加入削弱了白蛋白在气泡表面上的吸附作用，从丽降低了分 离效果。a h a m a d 在它的研究中还发现，金属离子铝、钙和钠的加入，使蛋白形 成了对胶体的分散有利的带电胶体，从而削弱了溶液的起泡能力，产生了对分离 不利的影响。 j a m e sr r t u n t e r 【蚂1 等人则在研究了b 一自蛋白和溶解酵素在气一液界面上的吸 附情况后，得出了分子结构能影响物质吸附行为的结论，认为分子尺寸、形状以 及柔韧性都能影响蛋白质的吸附能力，而离子强度和质量浓度对两种蛋白质的竞 争吸附影响甚小。 第一章前言 泡沫相中气体的占有体积，在利用数学分离模型计算富集比和回收率时，是 很关键的一个变量，它的取值能对计算结果产生较大的影响，因为通过气体占有 体积才能估算表面积，并进一步估算传质系数。因此，人们对泡沫相的研究越来 越感兴趣。研究者希望通过获得均匀的气泡来获得接近建立数学模型中所假设的 理想条件，提高模型的预测精度。h u g h m a r k 唧】作了一些这方面的工作，研究了 泡沫塔中泡沫相所含气体分数与传质的关系。s a t o s h i a n d o u l 2 1 1 则研究了不同尺寸 的空气喷嘴对分离结果的影响，发现喷嘴的孔径越小，形成的气泡越均匀，泡沫 相中气体含量越大，越有利于提高富集比。 分离后的蛋白质溶液以泡沫的形式流出泡沫塔，进行破泡处理形成溶液后， 才能进行浓度检测。研究者在对泡沫进行破泡处理时多采用离心破泡技术。 s a t o s h ia n d o u l 2 2 1 还研究了离心破泡器在处理不同流量、不同密度、不同粘度的泡 沫应采用的转盘尺寸和离心机转速。r u b i n 通过实验提出了使泡沫基本上全部破 裂的最小转速”，的算式： 爷：3 5 2 x 1 0 4 ：泡沫导出管中心到转盘轴之间的距离( c m ) v f ：泡沫的体积流速( c m 3 s ) 1 3 2 蛋白质的分离模型 研究蛋白质的泡沫分离，需要建立一个完善的数学分离模型，便于进行相关 的数学计算，以利于操作参数的确定，也利于操作参数的确定和反应器的设计。 但由于泡沫分离过程的复杂性和不稳定性，以及影响因素的多样性，使得理论上 不可能有一个严密推导的精确的操作方程。所以，建立一个令人满意的实用的分 离模型显得非常重要。 对蛋白质泡沫分离模型的讨论一直受到研究者的关注。最先是m i l e s 和 s c h e d l o v e s k y 和j a c o b i 等人提出蛋白质泡沫分离的数学模型。初期的理想泡沫分 离模型的提出是基于以下五个主要假设：( 1 ) 泡沫是由直径均匀的气泡组成的， 所有气泡均为正十二面体；( 2 ) 气泡在泡沫塔中上升时是不会破裂的，即气泡是 稳定的；( 3 ) 泡沫中的液相分成两个区：厚度为j 的“表面区”和厚度后盯的“主 体区”。占是常数，而o - 在泡沫运动中是变化的；( 4 ) 泡沫中主体相的组成与主 体溶液的组成相等；( 5 ) 表面吸附是瞬间完成的。后来的研究者在理想模型的基 础上，对实际情况进行了更合理的数学描述，建立了更符合实际情况的数学模型。 第一章前言 l e o n a r d 与l e m l i c h l 6 3 考虑了表面浓度因素，并简化了对普拉特边界的几何假设， 得到了经典的泡沫分离模型。后来，d d e s a i 与r k u m a r t 2 3 对泡沫中的气泡结 构的几何关系进行了数学推导。g n a r s i m h a n 和r u c k e n s t e i n 2 4 6 】在他们的模型中 考虑了接界压力的影响，范德华力引起的气泡变大在模型的建立过程中也被考虑 在内。a k b r o w n 【2 7 】与f a u r a i z e e l l 4 - 1 7 1 在关于分离模型的建立方面作了大量的工 作。l b r o w n 口】建立了连续泡沫分离过程的数学模型。但是，由于泡沫层中的变 化很复杂，对吸附过程的动力学研究还不深入，他们所建立的模型不能得到令人 满意的效果。 1 4 泡沫分离蛋白质的意义 任何一种分离蛋白质的方法，都是利用蛋白质分子物理或化学性质的差异。 通常的分离方法主要是依据蛋白质电荷的不同和分子量的不同进行的【2 8 。 1 以蛋白质的电荷为依据的分离方法。具体的方法有： 1 ) 离子交换层析法：可以利用蛋白质电荷数的不同，使其在不同盐度下 与交换柱结合，再利用梯度洗脱或分段洗脱得到分离后的蛋白质。 2 ) 凝胶电泳法：利用蛋白质静电荷的不同，在适当的支持介质上，使其 在外加电场下产生不同的泳动速度，带不同电荷的蛋白质就会分布在 不同的区域内，分割介质进行洗脱，得到分离后的蛋白质。 3 ) 等电聚焦法：把几种两性电解质的有机带电分子的溶液置于电场中， 这些电解质由于电荷数的不同在电场中形成一定的p h 梯度，蛋白质 加入后，聚集在与其等电点相同的p h 处，从而得到分离。 2 基于蛋白质的分子量不同的分离方法。 1 ) 天然的多糖与人工的多聚物，可以通过链与链之间不同程度的交联形 成不同孔径的颗粒。把这些颗粒放入蛋白质混合溶液中，吸附后将其 分离，就可以使蛋白质得到不同程度的分离。 2 ) 超离心法：利用不同分子量沉降系数不同的原理，在不同的超离心条 件下，使不同分子量的蛋白质得到分离。 其他的方法还有高效液相层析和亲和层析等，但这些方法的缺点是很明显 的，分离的成本都比较高，分离的条件也是很容易引起蛋白质的变性。泡沫分离 是在温和的条件下进行的，这一点对于蛋白质等对温度敏感的具有生物活性的物 质具有重要的意义。另一方面，利用泡沫分离法分离蛋白质的成本也是相对较低 的，例如在蛋白质去除方面的应用 2 9 m 】。在药学上，短裙竹荪多糖是一种珍贵的 药用多糠，为了使其得到纯化，提取过程中必须把混杂其中的蛋白质去除。目前 第一章前言 多采用蛋白酶法和s e v a g 法进行两次纯化操作，才能除去其中的少量蛋白质。提 纯操作，消耗了大量的溶剂与能耗。若采用泡沫分离法，可以在糖分损失较小的 代价下，去除绝大部分蛋白质。泡沫分离法，还可以利用表面活性的差异将混合 在一起的几种蛋白质分离1 1 2 ，“j 。 尽管有一部分蛋白质会因为长时间的停留在表面上而失去活性 3 ，4 3 3 j ，但 我们可以通过优化操作条件，减少其在气液界面上吸附时间，在分离操作后仍能 得到大部分的具有生物活性目标分离物。泡沫分离独具的优点和在蛋白质分离中 的意义，已经吸引了很多研究者的关注，相信在不久的将来，定会得到广阔的应 用。 我们的实验是采用表面活性比较高的两种蛋白质b s a ( 牛血清白蛋白) 和h g a ( 人血清白蛋白) 的溶液作为分离的模拟体系，用富集比e ( 回收液浓度c ， 分离前溶液浓度c 。) 与回收率r ( 回收的蛋白质的质量m ，待分离的蛋白质的质 量m ，) 作为衡量分离效果的指标，考察各种可变的因素对蛋白质分离效果的影 响，探索蛋白质分离的最佳条件，寻找影响分离效率的可能原因，为以后结合吸 附动力学进行研究打下基础。同时尝试用数学模型来描述分离的操作参数对分离 效果的影响，为成熟的蛋白质泡沫分离作好基础工作。 第二章实验 2 1 实验药品与仪器： 2 1 1 药品 第二章实验 9 8 硫酸：分析纯，天滓市化学试剂五厂 氢氧化钠：分析纯，天津森昌工贸有限公司 盐酸：分析纯，天津市振兴化工试剂酸厂 9 8 牛白蛋白：s i g m a 公司 2 0 人白蛋白：四川蜀阳远大药业 去离子水 2 1 2 实验仪器 转子流量计：液相与气相各一只( 天津五环仪表厂) p h s 2 5 型酸度计：上海精密科学仪器有限公司。 7 2 2 紫外分光光度计：上海第三分析仪器厂 超级恒温槽：重庆银河实验仪器有限公司 滴体积法表面张力测定装置：自制 空气压缩泵，：广东饶平西新机电厂 f a 2l0 4 电光分析天平：上海天平厂 真空泵：上海真空泵厂 泡沫塔：自制( d = 5 0 m m ，h = 1 2 0 0 m m ) 2 2 实验内容 2 2 1 表面张力测量实验 实验中，我们采用准确但简便的滴体积法测量溶液的表面张力。 1 ) 挑选符合要求的0 , 2 m l 移液管，加工后将尖嘴磨平。 第二章实验 2 ) 在相同的平衡时间下测量不同浓度蛋白质溶液滴体积。 3 ) 查表得到校正系数，计算出对应的表面张力。 4 ) 做表面张力- 浓度图，求出临界胶束浓度。拟合出浓度对表面过剩的 函数关系式。 5 ) 作2 0 。c 下b s a 与h s a 不同p h 值的表面张力图。 2 2 2 蛋白分离实验 用于分离实验的装置如图2 1 所示。具体实验步骤如下： 1 ) 用电光天平称取需要测量的蛋白质，用去离子水配成所需浓度的蛋白质 溶液。 2 4 泡沫塔2 进料泵3 空气压缩机4 空气润湿瓶5 减压破泡器6 气相流量计 7 液相流量计8 残液接收瓶9 ，气泡发生嚣1 0 泡沫溢流口 图2 - 1 分离实验装置示意图 f i g 2 - i s c h e m a t i c d i a g r a mo f s e p a r a t i o ns y s t e m 第二章实验 2 ) 用1 5 热盐酸清洗泡沫塔，除去杂质和残留的蛋白质，并用去离子水冲 洗干净。 3 1 开启电子泵，并调节流量到需要刻度，同时调节出料口，控制液面和泡 沫高度。 4 ) 打开空压机，调节气相转子流量计到需要流量微调转子流量计到需要的 流量，再调节出料口，达到体系平衡。此时液面高度不变，泡沫高度不 变，转流量计读数不变，泡沫流出速度稳定。 5 ) 在泡沫出口收集蛋白质溶液，并用紫外分光光度计检测浓度，当检测到 浓度在一段时间内保持不变，可以认为操作体系达到平衡。 6 ) 收集泡沫，测量浓度和体积，计算分离效果。 7 ) 用0 1 m o l 1 的硫酸或氢氧化钠调节溶液的酸度，进行分离实验，计算不 同的酸度下的富集比和回收率。 8 ) 泡沫量大且稳定不易破碎时，采用真空泵减压破泡法对泡沫进行破泡处 理，得到溶液。 2 2 3 蛋白质溶液浓度分析 蛋白质在波长2 8 0 纳米处有吸收，采用分光光度计法测量蛋白质溶液浓度。 1 ) 配制浓度为1 0 l o f l m g l 的一系列蛋白质标准溶液。 2 ) 在2 8 0 r t m 波长下，用紫外分光光度计测量蛋白质的吸光度。 3 ) 利用朗伯一比尔方程做浓度吸光度曲线，得到工作曲线。 4 ) 测量收集到的蛋自质溶液的吸光度。对于浓度较高的回收液，进行稀释 后再测量其吸光度，然后通过工作曲线方程得到浓度值。 5 ) 计算富集比占和回收率r 。 1 4 第二章实验 图2 - 2 蛋白质吸光度一浓度曲线 f i g 2 - 2 t h ec u r v eo f a b s o r b e n c y c o n c e n t r a t i o n 拟合的浓度一吸光度方程为 c ( m g 1 1 = 1 8 9 2 2 a 一0 0 0 2 1 2 2 4 溶液粘度的测量 由于泡沫的稳定性，不仅与溶液的表面张力有关，而且与溶液的粘度有一定 的关系。由于溶液浓度很小，粘度不高，本实验采用乌氏粘度计来测量 1 ) 将乌氏粘度计洗净烘干。 2 ) 测量小球中的水流过毛细管所用的时间。 3 ) 测量溶液在相同条件同一粘度计中的流下时间 4 ) 查得水的粘度，用对比法，得到溶液的粘度。 结果发现，由于浓度太小的缘故，所有粘度实验中( 测量不同浓度、d h 值、 温度下的粘度) ，蛋白质溶液的粘度在相同的条件下与水相同。 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 平衡表面张力测定结果 2 0 。c 下b s a 与h s a 水溶液在不同p h 下的表面张力测定结果如图3 1 所示 o5 01 0 0 5 02 0 02 5 03 0 0 鼍m g “) 口 图3 - 1b s a ( a ) 与h s a ( b ) 水溶液的表面张力 v f i g 3 - 1s u r f a c et e n s i o n so f a q u e o u sb s a ( a ) a n dh s a ( b ) s o l u t i o n s 由图3 1 可以看出，b s a 与h s a 的表面张力均随p h 值的变化而变化。在 等电点附近两者的表面张力达到了最低值。这是因为在等电点处，蛋白质不再带 m 住 阳 制鸵驱：f舛 e j 他 阳 啦 明 弘 * 丘e x oo0 己 鲫 m 甜州b d 第三章结果与讨论 电，分子之间的静电斥力不复存在，此时的蛋白质具有更大的表面活性，亲水基 团与疏水基团可以最大程度的与水分子的发生相互作用，更明显的表现出亲水和 疏水的性质，从而降低了溶液的表面张力。当p h 值高于或小于等电点时，水溶 液的表面张力均大于其处于等电点时的表面张力。 经过拟合，得到b s a 在p h = 6 0 的浓度表面张力方程 y ( r a n m ) = 7 2 7 5 3 5 7 t n ( 1 + 0 1 l c ( m g 1 ) ) 3 2 操作参数对分离效果的影晌 本实验主要考察各种因素对蛋白质分离效果的影响。泡沫分离法分离蛋白 质，是基于溶液表面的吸附，即具有表面活性的蛋白质分子会在溶液表面上自动 富集，使得表面相浓度远远大于溶液本体浓度，然后分离表面相，得到浓度相对 较高的蛋白质溶液。在这一过程中，凡是对蛋白质表面张力和吸附过程产生影响 的因素都会对分离结果产生一定的影响。在实验中，我们采用两种目标蛋白质 b s a 与h s a 的水溶液作为模拟体系，考察可能对分离结果产生影响的因素。 3 2 1 液柱高度对分离效果的影响 实验过程中，我们采用的待分离蛋白质溶液的浓度为1 0 m g l ，主要考察 在气速、进料速度、泡沫相高度等参数变量不变情况下，液柱高度对分离效果的 影响。 图3 2 液柱高度对分离效果的影响 f i g ，3 - 2 t h ee f f e c to f l i q u i d h e i g h to n e n r i c h m e n ta n d r e c o v e r y a b s a 分离效果图( 上= 1 3 0 m l m i n ，g = 0 3 2 m 3 h ，z = 1 l e m ，t = 2 0 0c ) b h s a 分离效果图( 上= 1 2 0 m l m i n ，g = o 3 2 m 3 i t ，z ：1 i c m ，t = 2 5 。c ) 实验结果如图3 2 。由图可知，分离的富集比随着液柱高度的增加而增加。 在2 8 c m 时，b s a 的富集比为8 8 ，h s a 的为7 6 。b s a 的富集比在9 7 c m 处，达 第三章结果与讨论 到1 7 9 ，h s a 的富集比在6 5 c m 处也达到了1 1 。主要的原因是：液柱的增高增 加了气泡在液相中的运动距离，延长了气液界面存在的时间，使得发生吸附的时 间变长，提高了表面相的蛋白质浓度，有利于泡沫的稳定。结果，泡沫破裂引起 的气体损失减小，回收到的液体体积增加，导致回收率的提高。由上图可以看出， 在b s a 和h s a 的分离实验中都体现了这种趋势。 3 2 2 沫相高度对分离效果的影响 图3 3 泡沫层高度对分离效果的影响 f i g 3 - 3 t h ee f f e c to ff o a mh e i g h to ne n r i c h m e n ta n d r e c o v e r y b s a 分离效果图( 三= 1 3 0 m v m i n ，g = 0 3 8 m 3 h ，h = 2 8 c m ，t = 2 0 。c ) 气泡离开液面后，进入泡沫相，在泡沫相中发生一系列的变化。泡沫在下部 泡沫的推动下上升，夹带的大量液体在重力的作用下，向塔底方向回流；p l a t e a u 交界内的液体由于重力的作用发生排液；液膜在重力与p l a t e a u 交界中附加压力 的双重作用下也发生排液变薄。同时，泡沫受挤压、气体扩散和排液变薄等因素 的影响，发生聚并，生成的高浓度的液体被重新分配到液膜与p l a t e a u 交界中去。 由图3 3 可以看到，泡沫相的高度从1 l e m 增加到8 0 c m 的过程中，b s a 的富集 比从3 5 上升到2 8 6 ，回收率从8 2 降到1 6 2 。这是因为在泡沫高度比较低的 情况下，泡沫夹带的液体比较多，没有经过充分的排液，导致泡沫相流出导流口 时，浓度较低而体积较大，富集比较小而回收率很高。随着泡沫高度的不断增加， 液膜与交界内的液体排液充分，加上聚并现象的作用，使得液膜变得很薄，表面 粘度很高，产生了很大的流动阻力，使泡沫不能沿着塔壁做活塞流，得到的分离 后的溶液体积因此而变小，导致回收率的降低。同时，大部分的泡沫在受到阻滞 后破裂，形成的浓度很高的液体与上升过程中的泡沫发生进一步的吸附作用，导 致表面相浓度进一步提高，所以分离出的液体浓度随泡沫高度的增加而增加，富 1 8 第三章结果与讨论 集比越来越高。 3 2 3 温度对分离效果的影响 在实验过程中，温度对蛋白质的分离产生的影响比较大。如图3 - 4 显示 图3 - 4 温度对蛋白质分离效果的影响 f i g 3 - 4 t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo ne n r i c h m e n ta n d r e c o v e r y a b s a 分离效果( = 1 3 0 m l m i n ，g = 0 3 2 m 3 h ，z = 1 l c m ，p h = 6 ，日= 2 8 c m ) b h s a 分离效果( l = 1 2 0 m l m i n ，g = 0 3 2 m 3 m ，z = 1 l c m ，p h = 6 ，h = 2 8 c m ) b