（动物学专业论文）mtor信号通路在细胞生长调控中的作用与机制研究.pdf

内蒙古人学博士学位论文 t o r m t o r s 6 k l p 7 0 s 6 k s 6 勉 s 6 r p s 6 4 e b p l r h e b t s c 2 ，t u b r i n t s c l h a m a r t i n a k t p k b p 1 3 k p i k k f a k g f b s e g 1 k o b 一1 3 r a d 0 0 1 c c l 7 7 9 l g f - l r m t o r c l 脚t o r c 2 c d s o r f d m s o i c 5 0 r t - p c r c o n f o c a l f b s p b s e b b s a p l d m e m c d n a 3 7 r a c e 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s t a r g e to fr a p a m y c i n t h em a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n r i b o s o m a lp r o t e i ns 6k i n a s e s1 r i b o s o m a lp r o t e i ns 6k i n a s e s2 r i b o s o m a lp r o t e i ns 6 t h ee l f 4 e - b i n d i n gp r o t e i n1 r a sh o m o l o ge n r i c h e di nb r a i n t h et u b e r o u ss c l e r o s i sc o m p l e x2 t h et u b e r o u ss c l e r o s i sc o m p l e x1 p r o t e i nk i n a s eb p h o s p h o i n o s i t i d e - 3 - k i n a s e t h ep h o s p h a t i d y l i n o s i t o ik i n a s e - r e l a t e dk i n a s e f o c a la d h e s i o nk i n a s e g o a tf e t a lf i b r o b l a s t e s o p h a g e a lc a n c e rc e l ll i n e p r i m a r yn o r m a le s o p h a g e a le p i t h e l i a lc e l ll i n e e v e r o l i m u s t e m s i r o l i m u s i n s u l i nl i k eg r o w t hf a c t o rlr e c e p t o r m t o rc o m p l e x1 m t o rc o m p l e x2 c o d i n gs e q u e n c e o p e nr e a d i n gf r a m e d i m e t h y ls u l f o x i d e i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n5 0 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c o n f o c a lm i c r o s c r o p e f e t a lb o v i n es e r u m p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e e t h i d i u mb r o m i d e b o v i n es e r u ma l b u m i n p r o p i d i u mi o d i d e d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i a c o m p l e m e n t r a r yd n a 3 r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d 9 雷帕霉素靶蛋白激酶 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶 核糖体蛋白s 6 激酶1 核糖体蛋白s 6 激酶2 核糖体蛋白s 6 真核细胞翻译肩始因子4 e 结合蛋白l 蛋白激酶b 磷脂酰肌醇一3 激酶 磷脂酰肌醇相关激酶 黏附斑激酶 山羊胎儿成纤维细胞 人食道癌细胞系 人正常食道上皮细胞系 m t o r 特异性抑制剂 m t o r 特异性抑制剂 胰岛素样生k 因子i 受体 m t o r 复合体1 m t o r 复合体2 译码序列 开放阅读框 二甲基弧砜 半数抑制浓度 反转录聚合酶链式反应 激光共聚焦显微镜 胎牛血清 磷酸缓冲液 溴化乙啶 牛血清白蛋白 碘化丙啶 d m e m 培养基 互补d n a e d n a 3 端快速扩增 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究：r ：作及取得的研究成果。除本文已 经注明引用的内容外。论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得凼苤直塞堂及 其他教育机构的学位或证f 0 而使用过的材料。与我一同j r 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日 期： 三搠司 坦爱：笸：3 指导教师签名： 日期： 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学f 征论文的规定，即：内蒙古人学有权将学何论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部| 、i j 送交学位论文的复印r l ：和磁盘，允许编入有关数据库进行检索 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和 导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属了：内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期问主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读j 弱问导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古人学方可投稿或公开发表。 日 期：幽衅日期： 内蒙古人学搏上学位论文 m t o r 信号通路在细胞生长调控中的作用与机制研究 摘要 m t o r ( t h em a m m a l i a n t a r g e to fr a p a m y c i n ) 是一种存在于哺乳动物细胞中的 s e r t h r 激酶，可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞 的刺激信号，进而调节细胞生长。m t o r 信号通路影响胚胎干细胞和早期胚胎的 发育，并且与肿瘤、肥胖及代谢紊乱等疾病有关。目前己开展m t o r 信号通路 研究的有人及小鼠、大鼠、牛等哺乳动物。由于缺乏基本的基因、表达及功能方 面的研究数据，m t o r 信号通路在羊细胞中的研究尚属空白。本课题选择研究较 多的人肿瘤细胞为模式细胞，意图通过对模式细胞的研究为下一步开展绒山羊细 胞研究作好技术准备，同时将两种细胞作为比对，相互参照，证明m t o r 信号 通路在细胞生长调节中的关键性作用。 一、m t o r 信号通路在人肿瘤细胞生长调控中的作用与机制 1 人食道癌细胞s e g 1 和人正常食道上皮细胞k o b 1 3 中m t o r 基因和t s c 2 基因的克隆与表达检测 m t o r 激酶是m t o r 信号通路的中心协调器，t s c 2 是m t o r 的上游负调 节因子，它们在细胞中的活性与细胞生长调控密切相关。通过r t - p c r 从人食道 癌细胞s e g 1 中和人食道正常上皮细胞k o b 。1 3 中分别克隆到了m t o r 基因和 t s c 2 基因的c d n a 片段并比较了两个基因在两种细胞中的表达情况。结果表明： m t o r 基因和t s c 2 基因在肿瘤细胞s e g 1 中高表达。 2 m t o r 抑制对s e g 1 细胞生长的影响及机制 使用m t o r 特异性抑制剂r a d 0 0 1 处理s e g 1 细胞，结果显示s e g 1 细胞 王查塑 坐旦! 堕芏望堕堡型丝竺鉴塑丝! 堕堡旦：! 型! 型里堕! 对r a d 0 0 1 敏感。m t o r 抑制可引起s e g 1 细胞周期阻滞，细胞形态发生改变， 抑制细胞增殖甚至导致细胞死亡。m t o r 被抑制可强烈抑制其下游靶s 6 的磷酸 化，同时还抑制m t o r 、s 6 k 1 和s 6 基因的表达，且这些抑制效应都具有剂量 依赖关系。结果表明：r a d 0 0 1 抑制m t o r 信号通路的活性，通过抑制m t o r 及其下游靶s 6 的磷酸化和相关基因的表达抑制细胞生长。 3 f a k i g f i r 与m t o r 信号通路的关系 利用f a k 和i g f i r 抑制剂t a e 2 2 6 处理人食道癌细胞s e g 1 ，结果显示 s e g 1 细胞对t a e 2 2 6 十分敏感。t a e 2 2 6 对s e g 1 细胞具有细胞毒性，可使得 细胞形态发生明显改变，抑制增殖并可引起细胞死亡，且具有剂量依赖效应。 脚g f i r 被抑制，可导致a k t 、m t o r 、s 6 k 1 和s 6 磷酸化的强烈抑制，同 时抑制相应基因的表达。结果表明：髀匹2 2 6 对f a k 和i g f i r 的抑制导致了 m t o r 信号通路活性的强烈抑制，预示f a k 可能是m t o r 信号通路的调节因子。 二、绒山羊细胞中m t o r 信号通路的功能与作用机制 1 内蒙古白绒山羊m t o r 信号通路相关蛋白基因的克隆与基本表达模式分析 克隆了内蒙古白绒山羊m t o r 基因约8 6 k b 的全长c d n a 及s 6 k 1 、$ 6 k 2 、 s 6 和f a k 基因的部分c d n a 片段，序列分析表明几个基因在进化上都是高度保 守的。表达模式分析表明m t o r 基因、s 6 k 1 基因和$ 6 k 2 基因在脾、肾、睾丸 和肌肉中都有表达，在肾中表达稍强，脾中稍弱；s 6 基因在脾、睾丸和肌肉中 都高表达；f a k 基因在脾、睾丸和肌肉中都有表达，在睾丸中稍弱一些。这些 基因序列和表达模式数据都是首次获得，为开展进一步的研究奠定了基础。 2 m t o r 信号通路在绒山羊胎儿成纤维细胞生长调控中的作用与机制 使用m t o r 特异性抑制剂c c i 一7 7 9 处理内蒙古自绒山羊胎儿成纤维细胞 ( g f b ) ，结果表明g f b 对c c i 7 7 9 敏感，c c i 7 7 9 对g f b 具有细胞毒性。c c i 7 7 9 处理可导致细胞生长抑制，在2 4 小时内引起细胞死亡。m t o r 抑制可引起g f b 细胞周期阻滞，细胞骨架失去正常组织结构，形态发生明显改变。c c i 一7 7 9 微弱 塑鍪直奎兰竖：! ：兰篁笙茎 抑制m t o r 的磷酸化，强烈抑制s 6 的磷酸化，同时还抑制m t o r 、a k t 、s 6 k 1 + 和s 6 基因的表达，并可引起3 5 k dc a s p a s e 3 酶原量减少，且这些抑制均具有剂 量依赖效应。结果表明：c c i 7 7 9 抑制m t o r 信号通路的活性，抑制细胞增殖。 m t o r 被抑制不仅影响其下游s 6 的磷酸化，而且抑制a k t 、s 6 k 1 和s 6 基因的 表达，并可能具有诱导绒山羊胎儿成纤维细胞凋亡的作用。 综上所述，本研究首次对m t o r 信号通路在绒山羊细胞生长调节中的作用 进行研究，克隆了内蒙古白绒山羊m t o r 、$ 6 k 1 、$ 6 k 2 、s 6 和f a k 基因并研 究其基本表达模式，证明了m t o r 信号通路存在于绒山羊胎儿成纤维细胞中并 调控细胞生长。通过对人肿瘤细胞和内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞的研究，并 将对两种细胞的研究结果进行综合分析，认为m t o r 信号通路调控细胞生长的 可能机制为：m t o r 蛋白激酶被抑制后，通过调节下游靶s 6 k 1 和s 6 的磷酸化 及相关基因的表达调控细胞生长。 关键词：m t o r 信号通路，细胞信号转导，细胞生长调控，绒山羊胎儿成纤维细 胞，人s e g 一1 细胞系 s t u dyo nt h ef u n c t i o na n dm e c h a n i s mo f r o t o r s i g n a l i n gp a t h a yi nc e l lg r o w t h a b s t r a c t t h em a m m a l i a nt a r g e to f p a m ) ( m t o r ) s o fs e r t h rinmammalianr a p a m v c mri sak i n d k i n a s en i m a m m a l i a nc e l l s i tc a nr e c r u i ta n di n t e g r a t ei n p u ts i g n a l sf r o mn u t r i e n t s ，g r o w t h f a c t o r s ，e n e r g ya n de n v i r o n m e n t a ls t r e s st or e g u l a t ec e l lg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o nv i a d i f f e r e n tc e l l u l a r p r o c e s s e s t h em t o rs i g n a l i n gp a t h w a ya l s oa f f e c t st h e d e v e l o p m e n to ft h ee m b r y o n i cs t e mc e l l s ( e s c s ) a n de a r l ye m b r y o ，a n di n v o l v e di n c a n c e r sa n dm e t a b o l i s md i s e a s e t h em t o r s i g n a l i n gp a t h w a y h a sb e e n i n v e s t i g a t e de x t e n s i v e l yi nh u m a n ，m o u s e ，r a ta n dc a t t l e ，w h e r e a si ti sn o ty e ts t u d i e d i ng o a td u et ot h el a c k o fb a s i cd a t aa b o u tg e n e s ，g e n ee x p r e s s i o na n df u n c t i o n t h u s t h i ss t u d yu s e st h eh u m a nt u m o rc e l l sa sam o d e lt oc o m p a r ew i t ht h er e s u l t sf r o m g o a t t op r o v et h a tt h em t o rs i g n a l i n gp a t h w a y p l a y s ac r i t i c a lr o l e i nc e l l p r o l i f e r a t i o nr e g u l a t i o n 1f u n c t i o na n dm e c h a n i s mo fm t o r s i g n a l i n gp a t h w a yi nr e g u l a t i o no fh u m a n c a n c e rc e l l sg r o w t h 1 1 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fm t o ra n dt s c 2g e n e si nh u m a ne s o p h a g e a l c a n c e rc e l l sa n dp r i m a r yn o r m a l e s o p h a g e a le p i t h e l i a lc e l l s m t o ra n dt s c 2a r et w oo ft h em o s ti m p o r t a n tp r o t e i nk i n a s e sw i t h i nm t o r s i g n a l i n gp a t h w a yr e l a t e dw i t hr e g u l a t i o no fc e l lg r o w t h m t o ri sac e n t r a lr e g u l a t o r i nt h ep a t h w a y , a n dt s c 2w o r k sa san e g a t i v er e g u l a t o rt om t o r m t o re d n a s e g m e n ta n dt s c 2e d n as e g m e n tw e r ec l o n e db yr t - p c rf r o mh u m a n e s o p h a g e a l c a n c e rc e l l s ( s e g 1 ) a n dp r i m a r yn o r m a le s o p h a g e a le p i t h e l i a lc e l l s ( k o b 1 3 ) t h e e x p r e s s i o no fm r n a a n dp r o t e i n sb e t w e e nt h e s et w ok i n d so fc e l l sw e r ec o m p a r e d b y 4 内蒙古大学博士学位论义 r t - p c ra n dw e s t e r n b l o t ，s e p a r a t e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e g e n e s o v e r e x p r e s s e di ns e g - 1c e l l s 1 2e f f e c ta n dm e c h a n i s mo fm t o ri n h i b i t i o no ns e g - 1c e l l sg r o w t h s e g 一1c e l l sw e r et r e a t e dw i t hr a d 0 0 1 ，as p e c i f i ci n h i b i t o ro fm t o ra n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a ts e g 一1c e l l sa r es e n s i t i v et or a d 0 0 1c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l g r o u p r a d 0 0 1i sc y t o t o x i ct o s e g - 1c e l l s ，a n dl e a dt od e a t ho ft h ec e l l sa n d i n h i b i t e dc e l lp r o l i f e r a t i o n t h es h a p eo ft h ec e l l sc h a n g e da n dg 1 sc e l lc y c l ew a s a r r e s t e db ym t o ri n h i b i t i o n r a d 0 0 1w e a k l yi n h i b i t e dp h o s p h o r y l a t i o no fm t o r ， a n ds t r o n g l yi n h i b i t e dp h o s p h o r y l a t i o no fi t sd o w n s t r e a mt a r g e ts 6w h i l et h e e x p r e s s i o no fm t o r 、s 6 k 1a n ds 6g e n e sw e r ei n h i b i t e d t h ei n h i b i t i o n sd e p e n d e d o nd o s a g eo ft h ei n h i b i t o r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr a d 0 0 1i n h i b i t sa c t i v i t yo f m t o rs i g n a lp a t h w a y m t o ri n h i b i t i o ni n d u c e sm t o ra n ds 6p h o s p h o r y l a t i o n i n h i b i t e d ，a n di n h i b i t st h ee x p r e s s i o no ft h eg e n e s 1 3t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef a k i g f i ra n dt h em t o r s i g n a l i n gp a t h w a y t a e 2 6 6 ，ad u a li n h i b i t o rf o rf a ka n di g f i r ，w a su s e dt ot r e a ts e g 一1c e l l s s e g 1c e l l sw e r es e n s i t i v et o 眦2 6 6a n d 眦2 2 6h a dl e t h a lf u n c t i o nt os e g 1c e l l s t h ec e l l ss h a p ew a sc h a n g e dd i s t i n c t l ya n dc e l lp r o l i f e r a t i o nw a si n h i b i t e db yt h e i n h i b i t o rw i t hd o s e d e p e n d a n te f f e c t t h ep h o s p h o r y l a t i o no fm t o r ，a k ta n ds 6w a s i n h i b i t e ds t r o n g l yb yf a k i g f - i ri n h i b i t i o n ，a n dt h ee x p r e s s i o no fc o r r e s p o n d i n g g e n e sw a si n h i b i t e ds t r o n g l y i n h i b i t i o no ff a k a n di g f - i rl e a dt ol o wa c t i v i t yo f m t o r s i g n a lp a t h w a y t h e s ed a t ai n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo ff a km a y a f f e c tt h e a c t i v i t yo fm t o rs i g n a lp a t h w a y ，a n df a ks i g n a lp a t h w a yi sp o s s i b l yt h eu p s t r e a m r e g u l a t o r yf a c t o ro fm t o rs i g n a lp a t h w a y 2t h ef u n c t i o no fm t o rs i g n a l i n gp a t h w a yi ng o a tf e t a lf i b r o b l a s ta n di t s m e c h a n i s m 2 1c l o n i n go fm t o rs i g n a l i n gp a t h w a yr e l a t e d g e n e s i ni n n e rm o n g o l i a c a s h m e r e g o a ta n dt h ea n a l y s i so f t h e i rb a s a le x p r e s s i o np a t t e r n i nt h ep r e s e n t s t u d y , t h e8 6k bf u l ll e n g t hm t o rg e n ec d n ao f i n n e r m o n g o l i ac a s h m e r eg o a tw a sc l o n e d t h ep a r t i a lc d n as e g m e n t so f $ 6 k 1g e n e ， $ 6 k 2g e n e ，s 6g e n ea n df a k g e n ew e r ea l s oc l o n e di n t h eg o a t t h es e q u e n c i n g 5 千志铡m t o r 信号通路柚猢i 胞生长调控中的作用j 机制研究 a n a l y s i sw a sp e r f o r m e da n di n d i c a t e dt h e s eg e n e sa sah i g h l yc o n s e r v e dg e n et ob e v e r yc o n s e r v a t i v e m t o rg e n e ，s 6 k 1g e n e a n d $ 6 k 2g e n ew e r ef o u n dt ob e e x p r e s s e di ns p l e e n ，k i d n e y , t e s t i c l e a n dm u s c l e ，s h o w e ds t r o n g e r e x p r e s s i o n i n k i d n e yt h a ni ns p l e e n s 6g e n ew a so v e r e x p r e s s e di ns p l e e n ，t e s t i c l ea n dm u s c l e f a k g e n ee x p r e s s e di ns p l e e n ，t e s t i c l ea n dm u s c l e ，a n de x p r e s s e dt h i ni nt e s t i c l e t h e s e g e n e sw e r ef i r s tc l o n e da n dg e n e se x p r e s s i o np a t t e r nw e r ef i r s ts t u d i e di ng o a t ，a n d h a sl a i dab i o i n f o r m a t i c sf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n 2 2t h ef u n c t i o na n dm e c h a n i s mo fm t o rs i g n a l i n gp a t h w a yo nr e g u l a t i o no f g o a tf e t a lf i b r o b l a s tg r o w t h i n n e rm o n g o l i ac a s h m e r e g o a t f e t a lf i b r o b l a s t s ( g f b ) w e r et r e a t e dw i t h c c i 一7 7 9 ，am t o rs p e c i f i ci n h i b i t o r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tg f bc e l l sw e r e s e n s i t i v et oc c i - 7 7 9 c c i - 7 7 9i n h i b i t st h ea c t i v i t yo fm t o rs i g n a lp a t h w a ya n dc e l l p r o l i f e r a t i o n ，b l o c k sc e l lc y c l e ，a n di sc y t o t o x i ct og f b i nad o s a g ed e p e n d e n tm a n n e r g f bc e l l sw e r et r e a t e dw i t hc c i 一7 7 9 ，c y t o s k e l e t o nl o s tn o r m a ls t r u c t u r e ，c e l l m o r p h o l o g yc h a n g e d m t o ri n h i b i t i o nl e a d st ot h ep h o s p h o r a l a t i o ni n h i b i t e do fs 6 w h i l et h ee x p r e s s i o no fm t o r 、a k t ，m t o r ，s 6 k la n ds 6g e n e sw e r ei n h i b i t e d i ti s p o s s i b l et h a tc c i 一7 7 9c a ni n d u c ea p o p t o s i si ng f b c e l l s i ns u m m a r y , m t o r s i g n a l i n gp a t h w a yw a sf i r s ts t u d i e da n dm t o rg e n e 、$ 6 k 1 g e n e 、$ 6 k 2g e n e 、s 6g e n ea n df a kg e n ew e r ec l o n e df i r s t l y m t o rs i g n a l i n g p a t h w a yw a sp r o v e dt ob ef u n c t i o n a li ng f b c e l l sa n da c t sa sak e yr e g u l a t o rt o r e g u l a t ec e l lg r o w t h b yc o m p a r i n gt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so nt h em t o rs i g n a l i n g p a t h w a yf r o mh u m a n c a n c e rc e l l sa n dg o a tc e l l s ，t h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fm t o r s i g n a l i n gp a t h w a yo nt h er e g u l a t i o no ft h ec e l lg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o nm a y i n v o l v e s t h er e g u l a t i o no ft h ep h o s p h o r i l a t i o no fi t sd o w nt a r g e t s $ 6 k 1a n ds 6a n dt h e e x p r e s s i o no fr e l a t e dg e n e sa f t e rt h em t o r i si n h i b i t e d k e y w o r d s ：m t o rs i g n a l i n gp a t h w a y , c e l ls i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n ，c e l lg r o w t h r e g u l a t i o n ，g o a tf e t a lf i b r o b l a s t ，h u m a ns e g - 1c e l ll i n e 6 内蒙古人学博上学位论文 土上j l - 刖舌 细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到 营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生长的因子存在时，细 胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。尽管目前对细胞 生长和细胞周期分裂是如何协调的机制理解的还很少，但信号蛋白t o r ( t a r g e to fr a p a m y c i n ) 在从酵母到果蝇直至哺乳动物细胞中作为细胞生长的中心协调器的作用已为人们所认识，这 一在进化上保守的协调器调节着基本的生物加工过程i 。 t o r 通路在酵母中的基本功能是感受营养状况进而控制细胞生长。当条件适合时，t o r 通路被激活，酵母细胞生长、出芽1 2 l 。在蚊虫( a e d e s a e g y p t i ) 繁殖时，吸血激发脂肪体内卵 黄原蛋白( v i t e l l o g e n i n ，v g ) 基因的表达，血食( b l o o dm e a l ) 这一营养信号是通过t o r 信 号通路转导的。t o r 信号通路的阻断可以明显地抑制v g 基因的表达和卵巢的发育i 引。在哺 乳动物中m t o r 通路保留了在酵母和昆虫中的基本功能，同时又有许多重要的功能被发现。m t o r 信号通路与细胞的生长、分裂、存活、迁移、自我更新和细胞周期进程等生理过程密切相关。 它不仅调节细胞的生长，而且对小鼠的早期胚胎发育甚至出生后的生长都有影响。 虽然 m t o r 通路与哺乳动物寿命的关系还没有被揭示，但近年的研究成果已显示出t o r 通路在后 生动物的发育和成体代谢中起着重要的作用，t o r 调节着与营养相关的生理过程。 t o r 激酶属于p i k k ( t h ep h o s p h a t i d y l i n o s i t o lk i n a s e r e l a t e dk i n a s e ) 超家族，作为s e r t h r 激酶而起作用，是m t o r 信号通路的中心协调器。m t o r 首先在酵母中发现。随后在哺乳动 物中也发现了酵母t o r 的同源物，分别命名为f r a p ( f k b p - r a p a m y c i n a s s o c i a t e dp r o t e i n ) ， r a f t ( r a p a m y c i na n df k b pt a r g e t ) 和r a p t ( r a p a m y c i nt a r g e t ) 4 5 】，现统称为m t o r ( t h e m a m m a l i a nt a r g e to f r a p a m y c i n ) 。早期发现用产自链霉菌的大环内酯类抗生素r a p a m y c i n 处理 可以诱导酵母细胞和哺乳动物淋巴细胞g 1 期阻滞；而在其他类型细胞中，r a p a m y c i n 延滞细 胞周期的进程，而不是绝对的阻断。近年的研究已将t o r 与动物生理和病理、个体发育与生 长，尤其是细胞生长联系在一起【6 7 】。在果蝇中，幼期敲除t o r ( d t o r ) 基因导致了成体形 态变小，敲除了t o r 基因的细胞也引起细胞形态变小【8 9 1 。在哺乳动物细胞中，r a p a m y c i n 处理也可使细胞形态变小，而m t o r 信号的重建可以拯救这种缩小的细胞形态表型【l o l ，m t o r 汇聚了来自于细胞内外的营养、生长因子和环境压力的信号【5 ，1 1 ，1 2 1 3 t1 4 1 。除了这些因素可以 兰查塑竺! 竺篁竺望堕垒塑丝竺茎塑丝生竺堡旦! ! 生堕型! 窒 激发r o t o r 信号通路以外，是否有其它刺激因子的信号可以通过m t o r 介导也是近年来人们 关注的问题。一些研究预示细胞黏附斑( f o c a la d h e s i o n ) 的形成可能会通过f a k ( f o c a l a d h e s i o nk i n a s e ) 信号通路作用于m t o r 通路进而调节细胞生长1 1 5 1 6 】。但也有报道在体内组 织中f a k 磷酸化的减弱并没有引起a k t m t o r s 6 k 1 信号通路中相关蛋白激酶的表达和磷睃 化的变化【1 7 】。m a l i k 早在1 9 9 6 年的实验中发现，f a k 在由细胞黏附斑激发s 6 k 1 活性过程中 扮演重要角色，但机制并不清划1 8 l 。g a n 等( 2 0 0 6 ) 的研究进一步证明，在f a k 突变的2 9 3 t 细胞中，$ 6 k 1 和4 e b p 1 的磷酸化受到抑制。而在敲除了t s c 2 的细胞中，f a k 对s 6 k 1 活 性的调节则被消除了【1 9 j 。这些结果显示出f a k 可能是t s c 2 的上游调节因子，对$ 6 k 1 活性 的调节是通过t s c 2 实现的。所以，t o r 信号通路被认为是一个汇聚多种刺激信号进而调节 细胞周期进程和细胞生长的信号汇聚( c o n v e r g e n c e ) 点。 在哺乳动物中m t o r 与其它不同的蛋白结合，形成了两种复合体m t o r c i ( m t o r c o m p l e x1 ) 和m t o r c 2 ( m t o rc o m p l e x2 ) 。m t o r c l 对r a p a m y c i n 敏感，而m t o r c 2 不敏感 【2 1 。过去十几年的研究主要集中于m t o r c l 。基于对m t o r c l 的研究，目前认为m t o r 信 号通路的上游刺激因子主要有四类，即生长因子和胰岛素、营养因子、能量和环境胁迫压力。 生长因子和胰岛素的刺激作用通过p 1 3 k ( p h o s p h o i n o s i t i d e 3 k i n a s e ) m t o r 通路调节细胞生 长。营养因子特别是氨基酸进入细胞后直接作用于m t o r 通路中的效应分子，或通过l h j 接途 径对m t o r 通路起作用，能量( 低能) 和环境胁迫压力( 缺氧) 是细胞内的刺激因子，可通 过多种方式作用于m t o r 通路，进而调节细胞生长。已经揭示的人细胞中m t o r 的上游调节 激酶有p 1 3 k ，a k t ，t s c 2 瓜c 1 复合体和r h e b ，其中t s c 2 是重要的负调节激酶。 最具特色的m t o r 下游效应器包括两条信号通路，真核细胞翻译启始因子4 e 结合蛋白 l ( t h ee l f 4 e b i n d i n gp r o t e i n1 ，4 e b p l ) 和核糖体蛋白s 6 激酶( r i b o s o m a lp r o t e i ns 6k i n a s e s ， s 6 k s ，包括$ 6 k 1 和$ 6 k 2 ) ，它们形成了两条平行的调节m r n a 转译的信号通路 2 0 l 。r o t o r 可以使4 e b p 1 磷酸化，释放出真核细胞翻译启始因子4 e ，促进翻译；s 6 k 1 接受m t o r 的 磷酸化而增强活性，促使使s 6 磷酸化，加强蛋白质合成，进而调节细胞的生长和增殖。 对m t o r 信号通路中信号分子组成的研究已经揭示出m t o r 信号通路的紊乱和肿瘤的发 生有联系，m t o r 信号与r a s 和p 1 3 k 信号共同控制着肿瘤细胞的生长，2 0 0 6 年有两篇综述 总结分析了m t o r 和肿瘤发生、治疗及药物设计方面的研究成果1 5 2 。通过基因敲除的方法 证明敲除了s 6 k i ( s 6 k 1 - - ) 的小鼠出生时的体重比野生型小1 5 ；而同时敲除了s 6 k i ( s 6 k 1 - - ) 和$ 6 k 2 ( $ 6 k 2 - - ) 的小鼠，有1 3 在出生时就死亡了，活着出生的有一半在出生后即死亡， 能够存活的其发育速率和体重明显低于野生型【7 】；通过胚胎移植的方法证明，敲除r o t o r 1 2 塑茎直查兰堕：! ：兰垡笙壅 ( m t o r + ) 的小鼠胚胎没有子代出生，来自于m t o r - - 纯合子的早期胚胎的干细胞发育也被 抑制瞄1 ，敲除了m t o r ( m t o r + ) 的杂合子小鼠，自然交配后纯合子胚胎( m t o r