（预防兽医学专业论文）猪囊尾蚴dUTPase的表达、活性分析及结构预测.pdf

摘要 猪囊尾蚴病( c y s t i c e r c o s i se e l l u l o s a e ) 是由猪带绦虫( t a e n i as o l i z o n ) 的幼虫猪囊尾蚴 ( c y s t i c e m u sc e l l u l o s e ) 所引起的一种人畜共患病。该病广泛存在于发展中国家，不仅严重影响养 猪业的发展，造成巨大的经济损失，而且还威胁着人类身体健康。因此，1 9 9 3 年世界卫生组织将 猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一。目前，囊虫病的防治以疫苗免疫和药物治疗为主，但 普遍存在疫苗保护力不够、药物的毒副作用太大等缺点，所以新型疫苗和药物的研制一直是人们 关注的焦点。d u t p 焦磷酸酶( d u t p a s e ) 是一种重要的d n a 复制修饰酶，广泛存在于各种生物有 机体中，可特异性水解d u t f 产生d u m p 和p f i ，防止d n a 复制过程中d u t p 浓度过高而引起的 错误掺入，提高了d n a 复制的精确性。近年来d u t p a s e 作为一种新的药物靶蛋白越来越受到人 们的重视，许多病毒、细菌和寄生虫的d u t p a s e 晶体结构被解析，研究d u t p a s e 在抗囊尾蚴病中 的作用，为d u t p a s e 的药物设计和开发提供了有力的支持。 本实验首次成功克隆出猪囊尾蚴d u t p a s e ( c y s h c e r c u s c e l l u l o s e d u t p a s e ，c y d u t p a s e ) 基因， 测序结果显示与已知的猪带绦虫六钩蚴d u t p a s e 基因的核苷酸同源性为1 0 0 。为进一步研究c y d u t p a s e 的生物学功能，将其与p e t 2 8 载体连接后在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中进行了大量表达， 表达产物主要以可溶性形式存在同时将p e t 2 8 空载体进行相同的表达纯化对照实验，重组表达 菌液的超声上清经镍琼脂糖凝胶纯化后进行s d s p a g e 检测，结果只是在重组猪囊尾蚴d u t p a s e 菌液上清中出现2 1 k d 大小的特异性条带，这说明本实验表达纯化的c yd u t p a s e 中完全排除了 宿主d u t p a s e 的污染。d u t p a s e 催化底物( d u t p ) 生成d u m p 和焦磷酸( p p i ) ，p p i 与钼酸铵形 成的复合物在5 7 5 n m 有特定的光吸收值，测定5 7 5 n m 的o d 值就能计算出p p i 的量。在c y d u t p a s e 的催化反应中，通过测定产物p p i 单位时间的生成量来计算底物的消耗量，以此计算酶的催化活 力。结果显示重组d u t p a s e 每分钟水解l n m o ld u t p 所需的酶量为2 1 3 0 9 5 l g ，纯化的d u r p a s e1 个酶活力单位为2 1 3 0 9 5 p g ；酶的比活力为4 6 9 2 9 u m g 。在酶促反应体系中加入不同金属离子或 e d t a 后测定d u t p a s e 活力的变化，结果e d t a 可以抑制c yd u t p 嬲e 的活性；而金属离子可以 增强酶的活性。同时金属离子还可以恢复被e d t a 抑制的d u t p a s e 的活性，其中以z n ”的恢复效 果最明显，可以使d u t p m e 的活性恢复9 9 6 5 。在所测定的四种金属离子中，m g + 对d u t p e 活性的增强作用最明显。 为进一步研究c yd u t p a s e 结构和功能的关系，用s w i s s - m o d e l 直接构建了c yd u t p a s e 的3 d 模型，通过w h a ti f 、p r o s a c 程序对模型进行立体化学结构、能量分布的质量评估，模型 评估的得分结果表明所建模型结构合理。c a s t p 程序的口袋分析显示c yd u t p a s e 共有2 7 个活性 口袋，其中第2 6 号口袋主要由c y d u t p a s e 的p 发夹构成，该发夹结构是大多数己知晶体结构的 三聚体d u t p a s e 活性口袋的重要组成部分，表明c yd u t p a s e 可能与其它三聚体d u t p a s e 具有同 样的催化机制。c y d u t p a s e c 端的g l y 富集区( o i y x - g l y - x - x - g l y ) ，a l a ( 8 3 ) 和t y r ( 9 0 ) 等 这些关键氨基酸与其它三聚体d u t p a s e ( h u m a nd u t p a s e ) 高度保守，这些氨基酸不仅能维持口 袋区正常的空间结构，同时也在酶与底物的识别中起决定性作用。通过对不同类型d u t p a s e 晶体 结构的分析，推测c yd u t p a s e 属于同源三聚体。用s y m m d o c k 程序预测了c yd u t p a s e 的四级 结构，该结构显示c yd u t p a s e 的活性区是由3 个亚基各自的p - 发夹、a 一螺旋和c 端环肽链共同 组成，这与大多数三聚体d u t p a s e 的催化活性区结构相一致。将c yd u t p a s e 的四级结构与已知 三聚体d u t p a s e 的晶体结构进行叠合，结果显示两者能很好的吻合，证明构建的c yd u l p a 靼四 级结构合理。成功构建的c y d u t p a s e3 d 模型为抗囊虫药物的设计和开发提供了个良好的研究 模型。 通过在线服务器设计c yd u t p a s e 的s i r n a 靶位点，针对靶序列设计s h d n a ( s h o r th a i r p i n d n a ) 时，在其3 端引入一段与鼠u 6 启动子3 端同源互补序列，5 端则加入一段下游通用引物， 设计好的s h d n a 由i d t 公司合成。从鼠的肌肉中提取基因组并扩增出u 6 启动子序列，将u 6 启 动子和s h d n a 一起退火延伸，分别用u 6 启动子的上游引物和s h d n a 的下游引物进行p c r ，采 用重叠延伸一步法制备c yd u t p a s e 的s i r n a 表达盒( s i r n ae x p r e s s i o nc a s s e t t e s ，s e c s ) 选取 猪囊尾蚴肌动蛋白基因( c l o n ep a t 5a c t i n ) 作为内参照，建立了c yd u t p a s e 基因半定量r t - p c r 的检测方法。c yd u t p a s e 干涉表盒的制备和半定量r t - p c r 的检测方法的建立，为c yd u t p 勰e 基因r n a i 的研究奠定了基础，同时也为囊虫病反义药物的研制提供了理论依据。 关键词：猪囊尾蚴，d u t p a s c ，克隆表达，活性分析，同源建模，s i r n a 表达盒 i i a b s t r a c t c y s t i e e r e o s i sc a u s e db yt a e n i as o l i u mi s a l li m p o r t a n tz o o n o t i cd i s e a s e i ti s p a r t i c u l a r l y p r e v a l e n ti nc e n t r a la m e r i c a , n o r t h e r ns o u t ha m e r i c aa n ds o m ep a r t so fa f r i c aa n da s i a t h e d i s e a s e ，o n eo fs i xu r g e n t l y - e r a d i c a t i n gd i s e a s e si s s u e db yw h o ，h a sn o to n l yb r o u g h ta b o u ta g r e a te c o n o m i cl o s s ，b u ta l s oe n d a n g e r e dt h ep u b l i ch e a l t h v a c c i n e sa n dd r u g sw h i c hh a v em a n y d e f e c t sa r ep r i m a r yw a y st op r e v e n tc y s t i c e r c o s i s t h ed e s i g no fn e wv a c c i n ea n dd r u gb e c o m e sa c r i t i c a le l e m e n tf o rd e v e l o p i n gs u c c e s s f u lc o n t r o ls t r a t e g i e s t h eu b i q u i t o u se n z y m ed u t p a s e ， w h i c hi se s s e n t i a li nb o t he u k a r y o t e sa n dp r o k a r y o t e s c a t a l y z e st h eh y d r o l y s i so fd u t pt od u m p a n dp p ia n dp r e v e n t sm i s m a t c hi nd n ad u p l i c a t i o n t h ed u t p a s eh a sb e e ns t u d i e da san o v e la n d v a l i dt a r g e ta g a i n s tm a n yd i s e a s e s t h eg e n ee n c o d i n gd u t p a s ef r o mc y s f j c e r c u sc e l l u l o s e ( c y ) w a sf i r s tc l o n e d t h en u c l c o t i d e h o m o l o g yi s l 0 0 b e t w e e no n c o s p h e r ea n dc c e l l u l o s eo f m ct s o l i u m i no r d e rt of u r t h e rs t u d yt h e b i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，t h ec yd u t p a s ew a sc l o n e di n t op e t 2 8v e c t o ra n de x p r e s s e di nb l 2 1 ( d e 3 ) a n dp u r i f i e db yn i 2 + - i d a s e p h a r o s e a tt h es a m et i m e ，t h ep e t 2 8v e c t o ra sac o n t r o lw a s e x p r e s s e db yt h es a m ew a y t h es d s p a g er e s u l ts h o w e dt h er e c o m b i n a n tc yd u t p a s e ( 2 i k d ) h a dn o tb e e nc o n t a m i n a t e db yh o s t sd u t p a s e d u t p a s ec a t a l y z e st h eh y d r o l y s i so f d u t pt od u m p a n dp p i t h ea c t i v i t yo f d u t p a s ew a sd e t e r m i n e db yo dv a l u e sa t5 7 5 n mo f t h ec o m p l e xo f p p i a n dm o l y b d a t es o l u t i o n t h eq u a n t i t yo ft h er e c o m b i n a n td u t p a s ef o rc a t a l y z i n gl n m o ld u t p e v e r ym i n u t ew a s2 1 3 0 9 5 p g o n eu n i to f e n z y m ea c t i v i t yw a s2 1 3 0 9 5 p g t h es p e c i f i ca c t i v i t yo f t h er e c o m b i n a t e dd u t p a s ew a s4 6 9 2 9 u r a ga n di t sa c t i v i t yw a ge n h a n c e db ym g z + a n di n h i b i t e d b y e d t a t h ea m i n oa c i dh o m o l o g yo fd u t p a s ef r o md i f f e r e n ts p e c i e sw a sm o r et h a n6 0 t h e3 d p r o t e i ns t r u c t u r em o d e lo fc c e l l u l o s ed u t p a s ew a sg e n e r a t e db ys w i s s m o d e li n i t sf i r s t a p p r o a c hm o d e t h em o d e lw a sr e f i n e db ys p d b va n dd s v i e w e r , a n dt h eq u a l i t yo fm o d ew a s a n a l y z e db yw h a ti fa n dp r o s a cp r o g r a m t h e r ew e r e2 7p o c k e t si nt h em o d ea n a l y s i s e db y c a s t pp r o g r a m i ts h o w e dt h es a m es t r u c t u r eb e t w e e nt h e2 6p o c k e ta n dh o m o t r i m e rd u t p a s e w h i c ht h ec r y s t a ls t r u c t u r ew a so b t a i ni np d b s o m ec o n s e r v e dr e s i d u e ss u c ha sa l a ( 8 3 ) 、t y r ( 9 0 1 a n dt h eg l y c i n e r i c hc - t e r m i n a lt a i l sw e r ec o n s e n s u sw i t ht h eo t h e rh o m o t r i m e rd u t p a s e s t h ec y d u t p a s ew ep r e s u m e db e l o n g e dt ot h eh o m o t r i m e rw h i c hw a sg e n e r a t e db ys y m m d o e ka n d s u p e r p o s i t i o nw i t h3 d 蜘m c t l l 舱o f h u m a nd u t p a s e i nc o n c l u s i o nw eh a v em a d et h em o d e lo f c y d u t p a s es u c c e s s f u l l y , w h i c hp r o v i d st h em a t e r i a lf o u n d a t i o nf o ran o v e ld r u gd e s i g na g a i n s t c y s t i c o r c o s i s t h es i r n as i t e sw e r ed e s i g n e db yp r o g r a mo n l i n e ，ah o m o l o g o u sa n dc o m p l e m e n t a r y s e q u e n c ea g a i n s tu 6p r o m o t e r3 t e r m i n a lw a sa d d e dt ot h e3 e n do f s h d n a ( s h o r th a i r p i nd n a ) w h i c hw a ss y n t h e s i z e db yi d tc o t h eu 6p r o m o t e rw a so b t a i n e db yp c rf r o mm o u s eg e n o m e f o rg e n e r a t i n gt e m p l a t eu s e di np c rf o rp r e p a r i n gs e c ( s i r n ae x p r e s s i o nc a s s e t t e s ) ，t h eu 6 p r o m o t e ra n ds h d n aa g a i n s tc yd u t p a s ew e r ee x t e n d e dt o g e t h e r t h es e c sw e r ey i e l d e db y i i l o v e r l a p p i n ge x t e n s i o ns i n g l e s t e pp c rw i t hu n i v e r s a lp r i m e r s t h em e t h o do fs e m i q u a n t i t a t i v e r t - p c r , i nw h i c ht h ec l o n ep a t 5g e n ew a su s e da sa l li n t e r n a ls t a n d a r d ，w a sg e n e r a t e dt od e t e c t t h ee f f e c to f r n a i p r e p a r i n gf o rf u r t h e rs t u d i e so nr n a ii nz s o l i u mc e l l sa n dd e v e l o p m e n to f n e w a n t i s e n s ed r u g sa g a i n s tc y s t i c e r c o s i s k e yw o r d s ：c y s t i c e r c u sc e l l u l o s e ，d u t p a s e ，c l o n i n ga n dp r o t e i ne x p r e s s i o n ，a n a l y s i s o fa 1 z y m e a c t i v i t y , h o m o l o g o u sm o d e l i n g ，s e c i v 英文缩略表 英文缩写英文全称 中文名称 c y d u t p a s e a a b p b s a b c a d e p c e d t a l p t g s d s s d s - p a g e o r f p c r p p i p d b r n a i d s r n a s s i r n a r i s c s e c c y s t i c e r c u sc e l l u l o s e 猪囊尾蚴 d e o x y u r i d i n et r i p h o s p h a t a s e 脱氧尿苷三磷酸酶 a m i n oa c i d 氨基酸 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 b i c i n c h o n i m i ca c i d 二辛可宁酸、二羟基而喹啉 d i e t h y p y f d c a f b 醐a l e 焦碳酸= 乙酯 e t h y l e n ed i a m i n e t e r t r aa c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l1 3 - d - t h i o g a l 8 c t o p y r a n o s i d e 异丙基一b - d - 硫代半乳糖昔 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s p o l y a c r y i a m i d eg e le l e c t r o p h o s i ss d s 聚丙烯酰氨凝胶电泳 o p e nr e a d i n gf r a m e 阅读框 p o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n 聚合酶链式反应 p y r o p h o s p h o r i ca c i d 焦磷酸 p r o t e i nd a t ab a n k 蛋白质结构数据库 r n ai n t e r f e r e n c er n a 干涉 d o u b l e - s t r a n d e dr n a s双链r n a s m a l li n t e r f e r i n gr n a小干扰r n a r n a - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e xr n a 诱导沉默复合物 s i r n ae x p r e s s i o nc a s s e t t es i r n a 表达框架 s h r n as h o r th a i r p i nr n a小片段发夹r n a o 独创性声明 本入声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：主。、者叛雪 时间：刃年6 月- 岁 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：1 守矗多 时问：幻叩年月侈日 导师签名：乡纯时间：朋年月。s 日 中周农业科学院博卜学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 猪囊尾蚴病的诊断和防治研究进展 1 1 1 猪囊尾蚴病概述 猪带绦虫病( t a e n i a s i ss o l i u m ) 是一种广泛分布的人畜共患寄生虫病，病原体必须通过人和 兽两种畜主才能完成其生活史，所以它和牛带绦虫病又称为真性人畜共患病( e u z o o n o s ) 。猪带 绦虫病是由猪带绦虫( t a e n i a s o l i u m ) 又名有钩绦虫、链状带绦虫、猪肉绦虫，寄生于人体小肠内 所引起的肠道寄生虫病，1 8 5 5 年k u o h e n m e i s t e r 首次通过人工感染试验阐明了猪带绦虫的生活史。 猪带绦虫的幼虫为猪囊尾蚴( c y s t t c e r e u sc e l l u l o s e ) 又名猪囊虫，主要寄生于猪和野猪等中间畜主 的肌肉以及一些组织器官内，引起猪囊尾蚴病( c y s t i e e r e o s i sc e l l u l o s a e ) ( w i l l i n g h 啪l i ie l a l 2 0 0 6 ) ， 世界动物卫生组织 w o r l d o r g a n i z a t i o n f o r a n i m a l h e a l t h ( 英) 褥该病列为b 类疾病。目前，该病广 泛存在于发展中国家，不仅严重地影响着养猪业的发展，造成巨大的经济损失。而且还威胁着人 类身体健康。因此，1 9 9 3 年世界卫生组织将猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一( m c c a r t h y e t a l ，2 0 0 6 ；w a n d r a 甜a l ，2 0 0 6 ) 。人也可以感染猪囊尾蚴，主要原因是猪带绦虫虫卵污染了食物造成 感染，同时猪带绦虫患者体内的虫体脱落孕节或虫卵在患者呕吐或肠道逆蠕动时可随消化内容物 进入胃，经胃液消化作用后再返回小肠，此时人就成了中间畜主( 郑福英等，2 0 0 3 ) 。 猪囊尾蚴感染人时多寄生于患者的眼睛、大脑和皮下组织等部位( p u s h k e r “a 2 0 0 5 ) ，也有 报道在一男性患者的唾液腺检出有囊尾蚴寄生( m a h a j a ne t a l ，2 0 0 7 ) 。囊尾蚴在患者体内寄生的部 位不同产生的危害情况也不同，可导致肌肉酸痛、无力、发胀、视力障碍( 甚至导致失明) ，严重 的可引起癫痫、失语、昏迷、甚至死亡。猪囊虫对猪的危害主要是妨碍猪的生长和发育，特别是 影响幼龄猪的生长。中、轻度感染囊尾蚴的病猪一般无明显症状，严重感染时多表现为营养不良、 生长发育停滞、贫血或局部出现水肿。囊尾蚴寄生在舌部会引起麻痹影响采食，寄生脑部刚会引 起严重的神经紊乱，癫痫、视觉障碍。 猪囊尾蚴病流行范围很广，呈世界性分布，除因宗教信仰而禁食猪肉的国家和民族外，世界 各地均有本病发生。本病主要以发展中国家多见，尤以不发达地区为主，中非、南非、拉丁美洲 和南亚地区发病率较高，前苏联与东欧各国和印度等国家以往均有本病发生( w i l l i n g h a mi i ie ta 1 2 0 0 6 ) 。1 9 9 9 年b e r n 进行的世界囊虫病调查结果显示，全球大概有2 5 0 万绦虫病患者，至少2 0 0 0 万囊虫病患者( b e r n e a 1 ，1 9 9 9 ) 。2 0 0 3 年m a f o j a n e 的调查结果显示，每年死于脑囊虫病的患者最 少在5 万人以上( m a f o j a n e e t a 。2 0 0 3 ) 。 我国囊虫病的流行和分布相当广泛，1 9 8 8 年1 9 9 2 年全国人体寄生虫病分布调查中，有2 7 个省的6 2 7 个县有囊虫病例。许隆祺等对收集到的全国各地人体寄生虫分布调查以及有关医院收 治的囊虫病例1 6 5 0 8 份进行分析，病人分布在2 9 个省( 自治区、市) 的6 7 1 个县( 市) 中( 许隆祺 中国农业科学院博。仁学位论文第一章绪论 等，1 9 9 9 ) 。据最近各地的食品公司调查结果显示，猪囊虫病在我国的3 1 个省( 自治区、市) 发生和 流行，东北、华北、西北、西南地区发病率较高，多为散发，但病例较为常见，在有吃生猪肉习 惯的云南西部和南部地区呈地方性流行( 郑福英等，2 0 0 3 ) 。2 0 世纪7 0 年代初，我国部分地区猪体 囊虫的检出率达1 0 2 0 ，随着驱绦灭囊工作的开展，猪体囊虫的检出率逐年降低。9 0 年代初， 已降至l 3 左右，但个别省区下降较慢。公茂庆等报道，我国屠宰场在屠宰中检出的囊虫病 猪数量是惊人的，一般为l 5 ，有的甚至高达1 0 。1 9 8 0 年全国食品公司屠宰后共检出1 1 0 万头囊虫猪；1 9 9 0 年，黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古4 省区因囊虫病造成的经济损失达3 3 亿元， 河南省损失1 1 亿元( 公茂庆等，1 9 9 7 ) 。据农业部1 9 9 2 年的统计显示，全国约有1 0 0 0 万头猪感染 囊尾蚴，每年因此而造成的经济损失达2 0 亿，给我国的养殖业和对外贸易造成了巨大的损失。我 国非常重视囊虫病的危害，在诊断和预防上都投入了大量的人力和财力，新型诊断试剂、诊断方 法的研究也取得了很大的进展。在传统全囊抗原的基础上运用分子生物学的手段和方法，开展了 重组基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和组织细胞苗的研发和应用，取得了重大的成果。 1 1 2 囊虫病的诊断 人囊尾蚴病的诊断一般比较困难，对于囊虫病患者询问病史有一定意义，眼囊尾蚴病用眼病 镜检查易于发现，对于脑和深部组织的囊尾蚴可用x 射线、b 超、c t 等影像仪器检查，并可结 合其它临床症状如癫痫、颅内压增高和精神症状等确诊。采用核磁共振技术可进一步提高诊断率， 同时这些诊断方法也存在许多缺点( s c i u r oe t a l ，2 0 0 0 ) 。猪囊尾蚴病多不表现临床症状，目前，该 病的检查方法有舌检查法和免疫学检查法。前者仅适用于舌上寄生( 2 7 3 0 ) 的病猪，后者包 括皮内变态反应、炭粒凝集试验、间接红细胞凝集试验、补体结合反应、琼脂扩散试验、免疫电 泳和酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 等( 顾有方等，1 9 9 8 ) 。 1 1 2 1 猪囊尾蚴病的免疫诊断方法 常规的猪囊虫病免疫诊断方法主要有以下几类：间接凝集试验、补体结合反应、沉淀反应和 酶免疫技术。间接凝集试验即利用某些与免疫反应无关的均一小颗粒将可溶性抗原( 或抗体) 吸附 于其表面，与相关抗体( 或抗原) 反应时，在有电解质存在的适宜条件下即发生凝集现象。碳凝集 反应( c a t ) 、间接血凝试验( i l i a ) 、卡红凝集试验和反向间接血凝试验都属于间接凝集试验的 方法。补体结合反应是一种很早就应用于囊虫病诊断的基础免疫试验，但由于假阳性率太高而逐 步被别的方法所取代。沉淀反应即可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在时，常形成肉眼 可见的白色沉淀物。沉淀反应分液相沉淀反应和固相沉淀反应，液相沉淀反应最常用的是环状沉 淀反应；固相沉淀反应包括琼脂扩散试验和将琼脂扩散试验与电泳技术相结合的对流免疫电泳等。 但沉淀反应在囊虫病的诊断中存在检出率太低的缺点酶免疫技术( e i a ) 是目前最可靠的一种猪 囊虫免疫检测技术，早期建立的酶联免疫吸附试验广泛地应用在猪囊虫病的诊断上，在此基础上 又发展了斑点酶联免疫吸附试验、生物素亲和素酶联免疫吸附试验、抑制性酶联免疫吸附试验等。 此外采用酶联免疫原理和胶体金层析技术制备的囊虫病快速诊断金标试纸条技术也取得了重大进 2 中国农业科学院博士学位论文第一荦绪论 展( 杆小仙等, 2 0 0 6 ；唐雨德等，2 0 0 3 ；刘玉冰等，2 0 0 2 ) 。唐雨德用抗囊虫单抗标记胶体金从而制备 出金标试纸条，检测血清申的囊虫循环抗原，该诊断方法法不仅操作更为简便、快速，整个检测 过程只需数分钟，而且检测试剂的制备更简单，稳定性更好。很适合于基层对囊虫病诊断的要求( 唐 雨德等，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 2 猪囊尾蚴病的诊断抗原 在猪囊虫病免疫诊断过程中，按检测对象的不同可分为抗原或抗体的诊断。抗体在畜主体内 的维持存在个持续期，寄生虫从畜主体内排出后其抗体的检测还可能呈阳性结果，抗原的检测 特别是一些寄生虫循环分泌抗原的诊断却更能真实地反映出宿主的感染状况( 郝建华等，1 9 9 4 ) 。免 疫抗原的特异性将直接影响到诊断的效果，囊虫病免疫诊断抗原有猪囊尾蚴全囊抗原、头节囊壁 混合抗原、囊液抗原等，全囊和囊液抗原具有较高的诊断价值。杨毅梅用猪囊尾蚴全囊及囊液抗原 作为e l i s a 诊断抗原，检测血清中囊虫抗体的敏感性无显著差异( 杨毅梅等，2 0 0 4 ) ，而头节抗原、囊 壁抗原、头节囊壁混合抗原较前两种抗原的敏感性差，表明囊虫的有效抗原成分可能主要存在于 囊液中( y a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 囊液抗原是猪囊虫病诊断抗原研究的热点，囊尾蚴囊液中糖蛋白分子质量为1 1 5 k u 2 6 k u ， 其中以小分子量糖蛋白的研究报道居多。g r o g l m 等证实囊液中分子质量为3 0 k u 6 4 k u 的多肽具 有抗原性，其中约有6 5 的成分与糖蛋白的结果相符合。1 9 8 9 年，t s a n gv c w 等以刀豆素亲和层 析所得的猪囊尾蚴糖蛋白建立了e l i s a 诊断方法，在对感染有两个以上包囊的囊尾蚴病人诊断中， 特异性为1 0 0 ，敏感性为9 8 ，并且该方法是自1 9 9 5 年以来，惟一一种被世界卫生组织和囊尾 蚴病诊断泛美洲健康组织所认可的免疫学诊断方法( 石团员等，2 0 0 5 ) 。 除了囊液抗原外，头节、囊壁抗原也广泛应用于囊虫病的诊断。据国内外研究报道，猪囊尾 蚴头节和囊壁抗原成分以b 抗原最为常见。b 抗原是由囊尾蚴体壁细胞产生并分泌到虫体外的一 种蛋白质，它由分子质量为1 0 5 k u 和9 5 k u 两种亚基组成，该抗原可通过抑制补体激活途径，在囊 尾蚴与宿主的免疫作用中对虫体起保护作用( t s a n ga n dm ，1 9 9 5 ) 。f l i s s e r a 等以b 抗原进行e l i s a 检测病人血清及脑脊髓液( c e r e b r o s p i n a l f l u i d ，c s f ) 。阳性检出率分别为8 0 和9 0 。但b 抗原作 为诊断抗原与细粒棘球蚴，细颈囊尾蚴等带科绦虫甚至血吸虫间存在广泛的交叉反应( d 甜口， 2 0 0 3 ) 囊尾蚴循环抗原和排泄分泌抗原也是十分理想的诊断抗原。寄生虫循环抗原( c i r c u a t i n g a n t i g e n ，c a g ) 是虫体排泄到宿主体内的寄生虫排泄分泌物或脱落物，具有抗原性，存在于各种组织 内，因其体内含量能客观的反映宿主的虫体感染量。血液中循环抗原早于循环抗体出现于宿主体内， 所以，近年来，检测血液中的循环抗原作为寄生虫病早期诊断和考核治疗效果的理想方法，己成功 应用于旋毛虫病、血吸虫病和丝虫病，在猪囊尾蚴病的应用尚在进一步研究中。翟春生等应用 e l i s a 双抗夹心法检测囊尾蚴病患者血清和c s f 中的c a g , 阳性检出率为9 2 0 2 。 1 ，3 猪囊尾蚴病的预防和治疗 目前对于猪囊虫病的防治主要有疫苗免疫和药物治疗两种方式。疫苗免疫的重点是筛选合适 3 中国农业科学院博f + 学位论文第一章绪论 的抗原基因，选择高效而稳定的表达系统。药物治疗主要是通过对囊尾蚴生长发育过程中各种物 质和能量代谢规律的研究，寻找新的靶酶设计相应的抑制剂，通过切断或干扰寄生虫的各种代谢 途径来抑制寄生虫的生长。 1 1 3 1 猪囊尾蚴病疫苗 传统猪囊尾蚴病的疫苗主要是天然的蛋白抗原，包括全囊抗原，异源性抗原、循环和排泄分 泌抗原、六钩蚴抗原等。这些抗原都具有很好的免疫原性，尤其六钩蚴阶段的抗原免疫效果更好， 传统疫苗为早期囊虫病的预防提供了重要保障。鹿振起用囊尾蚴全囊抗原油乳疫苗对猪囊虫病高 发区的1 4 2 2 0 头散养猪进行了田间试验，减虫率达到了9 9 7 ；p a t h a k 用猪带绦虫六钩蚴体外培 养分泌物给猪接种，减虫率高达9 4 9 ；v e r a s t e g u i 进行的租制猪带绦虫六钩蚴抗原的免疫保护试 验获得了1 0 0 的保护率( v e r a s t e g u ie la l ，2 0 0 2 ) 。传统囊虫疫苗虽然具有很好的免疫保护效果，但 同时也存在很大的缺陷，抗原的来源受虫体数量的限制，对寄生虫的需求量很大，难以进行质量 控制，不能满足大规模的人和动物免疫预防接种的需要。所以新型疫苗的研制就成了猪囊尾蚴疫 苗开发的重点，如结合分子生物学实验技术的基因工程疫苗、核酸疫苗、猪囊虫组织细胞苗、噬 菌体展示多肽疫苗、重组细菌等一系列的新型疫苗( l i g h t o w l e r s , 1 9 8 9 ；r i c k a r d ，1 9 9 1 ) 。 基因工程疫苗一般是通过构建猪带绦虫囊尾蚴或其它生长阶段的c d n a 文库。经免疫亲和筛 选得到候选抗原基因。将抗原基因转入各种表达载体进行高效表达，纯化的表达产物直接或与佐 剂混匀后进行动物的免疫接种。j o h n s o n 运用重组d n a 技术研制的羊囊虫疫苗4 5 w 获得了9 4 的保护率。此疫苗对其它带科绦虫的感染也可提供交叉保护，如猪囊虫和牛囊虫，是第一个达到 能实用的寄生虫基因工程疫苗( j o h n s o ne la l ，1 9 8 9 ) 。同样，基因工程疫苗在囊虫病的防治中发挥 着重要的作用( b e m i e r - v i l l a m o r 甜a l ，2 0 0 2 ；孙树汉等，1 9 9 7 ) 。 核酸疫苗又名基因疫苗或d n a 疫苗，是将外源基因插入真核表达载体中构建重组质粒，将 质粒直接注入动物体内而使动物获得免疫保护，核酸疫苗已作为一种新型疫苗而广泛应用于寄生 虫疫苗的研制和开发( c r u z - r e v i l l a e ta l ，2 0 0 0 ；g a u c ie ta ，2 0 0 6 ；g u o 甜a l ，2 0 0 7 ) 。然而核酸疫苗也 存在组织细胞吸收困难。免疫效果不佳等缺点，所以在进行免疫时会和基因工程疫苗同时使用， 或将免疫佐剂与目的基因进行融合表达。吴丹将猪白细胞介素基因i l 4 与c c l 融合表达，大大提 高了核酸疫苗的抗体水平( 吴丹等，2 0 0 1 ；吴丹等，2 0 0 0 ) 猪囊虫组织细胞苗是由天津市实验动物研究所和天津市畜牧兽医站共同承担和开发的一种新 型疫苗，通过体外组织培养的方法分离和纯化出稳定的猪囊尾蚴免疫细胞系。该课题组1 9 9 7 年初 完成了“猪囊尾蚴c c 9 7 免疫细胞系”的培育及其生物学性质的研究，刨立了一个生物新品系一猪囊 尾蚴四性细胞系”。该细胞系以其形态均一性、生长稳定性、以及高度的免疫原性和稳定的细胞 遗传学性质而称之为“四性细胞系”。田问试验证明：使用该细胞制成的疫苗不但安全，而且引起 免疫反应的时问早，免疫效价高，免疫期长。对免疫猪的攻虫试验中保护力高达9 5 4 6 ，开创了 寄生虫细胞免疫的新途径。 尽管基因工程抗原易于大量制备，但不同的表达和纯化条件可能会影响外源蛋白的生物学活 性，从而影响其免疫保护效果。另外，有的重组抗原还存在很强的免疫副作用等缺点。于是，研 究人员开始研制抗原表位疫苗即多肽疫苗来进行囊虫病的防治。g e v o r k i a n 首次根据理论推导的肥 4 中国农业科学院博卜学位论文第一章绪论 头带绦虫与猪带绦虫囊尾蚴期表达的重组抗原k e t c 7 序列合成了g k - i 、g k 0 2 和g k - 3 ，这3 种 多肽用于e l i s a 包被抗原后，与小鼠、猪和人囊虫病阳性血清发生反应，提示它们是可引起体液 免疫反应的抗原表位，并且可用于疫苗的设计( g e v o r k i a ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。除了合成多肽疫苗，噬菌 体展示作为一个非常高效的表达系统被用于肽疫苗的应用( m a n o u t c h a r i a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 2 囊尾蚴病的化学治疗 过去，我国所用的抗寄生虫药多为植物性药物，如山道年、二荆芥油、槟榔等，由于这些药 物来源少、成本高、毒性大，因而在家畜寄生虫病的防治中已不普遍使用。年代初，随着人们 对寄生蠕虫能量代谢过程的研究。发现糖类是大多数蠕虫寄生阶段唯一的能量来源。许多化学药 物就是围绕抑制蠕虫的糖代谢来设计开发的，特别是吡喹酮和丙硫咪唑的闯世。使囊尾蝴病的治 疗取得了突破性的进展。 吡喹酮( p r a z i q u a n t c l u m ) 是一种广谱驱虫药，为杂环吡嗪异喹啉衍生物。属于苯并咪唑氨基 甲酸酯类药物，其化学名称为2 - ( 环已甲酰基) 1 ，2 ，3 ，6 ，7 ，1 l b - 六氢- 4 h 一吡嗪并【2 ，1 2 】异 喹啉- 4 酮，1 9 7 2 年由西德怡默克和拜耳药厂研制成功。毗喹酮的作用机理是引起虫体的强烈收缩， 抑制虫体对a t p 的摄入，干扰葡萄糖的摄取，致使虫体能源耗竭；影响蛋白质和核酸的代谢，使 虫体d n a 和r n a 解聚和减少；破坏虫体的皮层、肠上皮、生殖系统和体壁各层组织而导致虫体 的死亡洲b e r m a n 甜以，2 0 0 0 ；p me ta 1 ，1 9 9 8 ) 。囊虫经药物作用后，虫体颈部微毛出现粘连、脱落， 表面布满泡状物，并可见局部皮层呈空泡化，基底膜变宽，基层肿胀，合体细胞疏松。利用电镜 观察吡喹酮对体外猪囊尾蚴的作用。得到了相似的结果，虫体挛缩变形，头节伸出，体表溶蚀， 皮层内质网和核糖体溶解，皮下层坏死。 丙硫咪唑( a l b e n d a z o l e a b z ) 又名阿苯达唑，商品名为肠虫清，国外商品名为z e n t e l ，其化学 名为 5 - ( 丙硫基) - i h 苯并咪唑2 基1 氨基甲酸甲酯，是当前苯丙咪唑类药物中最好的驱虫药之 一。该药1 9 7 5 年由美国史克( s m i t h k l i