（生物化学与分子生物学专业论文）壳聚糖降解液的制备及其生物活性的研究.pdf

沈阳农业大学硕+ 学位论文 摘要 随着社会生产的发展，对于农产品安全有了更高的要求。化学农药尽管有高效、快 速的杀菌效果，但长期使用会带来严重的环境污染。因此，从天然活性物质中开发高效 杀菌剂，是减少农业环境污染的一个非常有效的途径。我国水产资源相对丰富，又是世 界闻名的蚕桑大国，但每年在进行渔业生产及丝绸生产过程中都有大量甲壳素制备原材 料被废弃或低效率使用。这使得宝贵的甲壳素资源不能被很好的利用。如何更好地开发 利用这部分资源是资源环境工作者的重要课题。本论文经过一系列研究，制备了具有高 效抑菌效果的壳聚糖降解液以及壳聚糖一硫酸铜混剂，并研究了壳聚糖降解液对植物活 体的诱抗作用，以及其对环境微生物的影响。 研究结果表明： 1 壳聚糖降解液最佳的制备条件为：温度6 0 、时间4 h 、双氧水浓度1 0 。最佳 工艺条件表明：在制备具有良好抑菌效果壳聚糖降解液的时候，保证合适的反应温度是 关键，可以适当增加双氧水浓度，反应时间不必过长。 2 壳聚糖降解液及壳聚糖硫酸铜混剂具有良好的稳定性。性能较为稳定，活性不受 光照、紫外线、酸碱性等因素的影响，宜常温贮藏。 3 壳聚糖降解液对植物病原真菌菌体的生长、菌丝生长量、孢子萌发率等各方面均 有良好的抑制效果。应用壳聚糖降解液对土壤微生物区系动态影响进行了测定，结果表 明：壳聚糖降解液对栽培番茄根际土壤的微生物区系和数量变化具有极为明显的影响作 用。其中放线菌数量比对照增加了3 0 余倍；自生固氮细菌、纤维分解细菌和乳酸细菌 增加了1 0 倍左右；而土壤中常见霉菌的数量明显下降，是对照的1 6 1 1 0 。壳聚糖降 解液能促进土壤中放线菌等有益菌群的增加，抑制霉菌和其它属于植物致病真菌的丝状 真菌，这对控制植物病害，改善植物根际微生态环境、调节有益微生物种群、提高植物 抗病特性，起到了重要作用。 4 壳聚糖降解液能在一定程度上提高番茄幼苗根冠的干物质积累，增加叶面积，提 高叶绿素含量，同时还能够降低丙二醛的含量，降低冷胁迫下的质膜透性。壳聚糖降解 液可诱导番茄植株体内防御酶系活性的升高。壳聚糖降解液处理后，各防御酶系( s o d ， p a l ，p o d 干 i p p o 等) 与对照相比均有酶活高峰出现或使酶活高峰提前出现，这几种酶 协同作用提高植株的抗逆性，对阻止病原菌入侵起到了重要作用。 关键词：壳聚糖；降解液；生物活性；诱导抗性 沈刚农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a l o n gw i t ht h ed e v e l o p m e n to fp r o d u c t i o n ，t h ed e m a n df o rs a f e t yo ff o o di s o nt h e i n c r e a s e t h ec h e m i c a lp e s t i c i d ew a ss l a t h e r e d ，w h i c hi n s u r e do u t p u to fc r o p s ，b u ta l s o c o n t a m i n a t e dh u m a nh a b i t a tb a d l y i tw a sa ne f f e c t i v ew a yt or e d u c et h ep o l l u t i o nb y e x p l o i t i n gt h eh i e , h l ye f f e c t i v eg e r m i c i d ef r o mn a t u r a lb i o a c t i v em a t t e r c h i n an o to n l yi sa c o u n t r yp o s s e s so fa b u n d a n ta q u a t i cp r o d u c tr e s o u r c eb u ta l s oi s t h em o s tl a r g ec o u n t r y b r e e d i n gs i l k w o r m c o n s e q u e n t l y ，i nc h i n a ，t h er e s o u r c eo fc h i t i ni sa b u n d a n t c h i n e s ee x p e n b e g a nt h er e s e a r c hj o ba b o u tc h i t i ni ne a r l yp e r i o d h o w e v e r ，t h el e v e lo fs t u d yi sl o w e rt h a n o c c i d e n t a l c o u n t r y c h i t o s a nd e g r a d a t e d s o l u t i o n a n dc h i t o s a n - c u s 0 4m i x t u r e sw h i c h e x p e c t e d t ob e c o m ee n v i r o n m e n t a lp e s t i c i d ep o t e n t i a l l yw e r ep r e p a r e dr e s p e c t i v e l y t h e b i o a c t i v i t i e so fc h i t o s a nd e g r a d a t e d - s o l u t i o na n dc h i t o s a n - c u s 0 4m i x t u r e sw e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l yt h r o u g has e r i e so fe x p e r i m e n t s t h er e s u l t so f t h es t u d yi n d i c a t e d ： 1 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o no fc h i t o s a nd e g r a d e d - s o l u t i o nw e r ea sf o l l o w s ： t h et e m p e r a t u r ew a s6 0 * c ，t h et i m ew a s4 h ，t h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2w a s l 0 t h eb e s t p r o d u c t i o nc o n d i t i o ns h o w e d ：w h e nw ep r e p a r a t i o no fc h i t o s a nd e g r a d e d - s o l u t i o n ，t h ek e y f a c t o rw a st ok e e pf i tt e m p e r a t u r e , w ec a ni n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2 ，a n dt h er e a c t i o n t i m ed o e sn o tn e e dt o ol o n g 2 r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tc h i t o s a nd e g r a d a t e d - s o l u t i o na n dc h i t o s a n - c u s 0 4m i x t u r e sa t e s t a b l ei nv a r i o u sc o n d i t i o n s i th a sal i t t l es e n s i t i v i t yt ot h e r m a lb u tp o s s e s s e ss t a b l et ou v ， l i g h ta n da c i d - a l k a l i n e 3 t h ee f f e c to fc h i t o s a nd e g r a d a t e d s o l u t i o no nt h es o i lm i c r o f l o r aw a st e s t e df o rt h ef i r s t t i m e t h er e s u l ts h o w e dt h a ts o i lm i c r o f l o r aa n dt h en u m b e ro fm i c r o b e sw e r es t r o n g l y a f f e c t e db yc h i t o s a nd e g r a d a t e d s o l u t i o n i ns o i lm i c r o f l o r a ，n u m b e ro fa c t i n o m y c e t e sw a s i n c r e a s e d3 0t i m e sa sm u c ha st h a to fc o n t r o l ，a n dn u m b e ro fn i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a ，f i b e r d e c o m p o s i n gb a c t e r i aa n dl a c t i ca c i db a c t e r i aw e r ei n c r e a s e d1 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f c o n t r 0 1 t h em y c e l i a lf u n g u sa n dm o l df u n g u sw e r ed e c r e a s e da n dt h en u m b e ro ft h ef u n g u s w a s1 6t o1 1 0o ft h ec o n t r 0 1 4 t h er e s u l tf r o mt h et e s t i n go fe f f e c to fc h i t o s a nd e g r a d a t e d s o l u t i o no ns e e d l i n g g r o w t hs h o w e d ，c h i t o s a nc o u l dp r o m o t es e e d l i n gg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft o m a t o ，s u c ha s s e e d l i n gu n i f o r m ，s e e d l i n gc o m eo u te a r l yf r o ms o i l ，f r e s hw e i g h to fr o o t sa n ds e e d l i n g 摘要 i n c r e a s ea n ds oo n c h i t o s a nd e g r a d a t e d s o l u t i o nc a ni n d u c eh i g h e ro fd e f e n s i v e e n z y m e s s o m ed e f e n s i v ee n z y m e s ，s u c ha sp h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s e ( p a l ) ，p e r o x i d a s e ( p o d ) ，p o l y p h e n o l o x i d a s e ( p p o ) a n dc a t a l a s e ( c a t ) ，w h i c hc o o p e r a t i o ni m p r o v e d t h er e s i s t a n c eo fp l a n ta n di n v a d e dt h ei n f e c t i o no fp a t h o g e n s ，a p p e a r e dh i g h e ra c t i v i t yi n t o m a t ol e a v e st r e a t e dw i t hd e g r a d a t e d s o l u t i o nt h a nt h a ti nt h o s et r e a t e dw i t hw a t e r k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；d e g r a d a t e d - s o l u t i o n ；b i o a c t i v i t y ：i n d u c e dr e s i s t a n c e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：。豸峰 时间： z 。驴7 年f , q 弘日 导师签名：时间 年易b 汐日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 李嗲 时问： 。一年月1 。日 导师签名 冽秘荫 时间 年多月动【_ 二 7 夕 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 甲壳质壳聚糖的研究历史 壳聚糖( c h i t o s a n ，简写c t s ) 是一种高分子阳离子多聚糖，是甲壳素脱去部分乙 酰基的氨基多糖。甲壳素又名几丁质( c h i t i n ) 、甲壳质，它广泛存在于多种节肢动物 如虾、蟹和昆虫等的外壳中，同时也是低等动物如菌藻类的重要成分，而它还是真菌细 胞壁的常见组分，与真菌细胞的发生、维持以及分隔的形成有关，对真菌的生长和功能 的实现具有特殊重要的意义。自然界中每年生成的甲壳素约为1 0 0 亿吨( 黄丽萍，刘宗 明，1 9 9 6 ) ，在所有天然聚合物中储量占第二位，仅次于纤维素，是一种非常丰富的自 然资源。 甲壳素首先是由法国学者b r a c o n n o 于1 8 1 1 年在蘑菇中发现的，1 8 2 3 年法国科学家 o d i e r 在处理昆虫外壳时得到一种碱不溶物质，并将其命名为c h i t i n ，希腊语中意为“外 衣”。1 8 5 9 年r o u g e t 将c h i t i n 用浓碱处理，得到了脱乙酰化甲壳素，并称之为变性甲 壳素。1 8 9 4 年，h o p p e s e y l e r 将变性甲壳素命名为c h i t o s a n 。1 9 3 7 年，l o b e l l 等人发现 能把甲壳素水解成甲壳素低聚糖的甲壳素酶。1 9 7 3 年，e v e l e i g h d e n g 等人发现能把壳聚 糖水解成低聚糖的壳聚糖酶。1 9 7 7 年，日本人首次将壳聚糖用作天然絮凝剂处理废水。 同年，在美国波士顿召开了第一次有关甲壳素壳聚糖的国际会议。1 9 8 3 年，日本农林 省与文部省提出一项大型研究规划，拨款6 0 亿日元，资助全国1 3 所大学和6 个国立研 究所，从事此方面的研究。1 9 8 6 年，日本成立了c h i t o s a n 研究会，此后每年召开一次 学术会议。1 9 9 2 年，欧洲成立了几丁质研究会，并举行了第一次学术研讨会，此后每年 召开一次学术年会。1 9 9 5 年，法国布勒斯特召开了首届欧洲地区国际性几丁质学术研讨 会。1 9 9 8 年，在我国台湾省召开了第三届亚太地区几丁质几丁聚糖学术研讨会。从此， 甲壳素壳聚糖的开发应用在世界范围内形成了一股热潮。 在我国，对于几丁聚糖的研究起始于1 9 5 8 年。其时，我国科技出版社出版了包光 迪先生编著的甲壳质的利用一书。并从此时起，国内开始生产几丁聚糖应用于印刷 业。1 9 9 4 年，中国c h i t o s a n 协会召开了几丁质在医学上应用的研讨会。1 9 9 5 年，在台 湾省召开了第二次c h i t o s a n 学术研讨会。1 9 9 6 年1 2 月，在北京召开了几丁质、几丁聚 糖国际学术会议。1 9 9 6 年1 0 月，在大连召开了中国第一届甲壳质化学与应用研讨会。 第一章前言 1 9 9 9 年1 1 月，在武汉召开了中国第二届甲壳质化学与应用研讨会。同时，国家自然科 学基金委员会也立项资助了重点基础研究项目：天然聚多糖的环境友好材料。综上所述 的一系列运作、举措，大大推动了我国几丁质几丁聚糖研究和应用的进一步发展。 1 2 壳聚糖的结构及一般性质 1 2 1 结构特征 壳聚糖是由乙酰氨基葡萄糖多聚物( 甲壳素，结构式见图卜1 ) 经部分脱乙酰基作 用而形成的衍生物( 结构式见图卜2 ) ，结构上主要由氨基葡萄糖和乙酰基氨基葡萄糖 连接成长链，壳聚糖溶于酸后，这种长链聚合物含有氨基葡萄糖所携带的带正电荷的氨 基和氨基葡萄糖与乙酰基氨基葡萄糖都拥有的带负电荷的羟基( 蒋挺大，1 9 9 5 ) 。 图1 - 1 甲壳质结构围 f i s t - 1 t h es t r u c t u r e c h i t i n 围1 。2 壳聚稽结构围 f i g l - 2 t h es t n l c 岫 c m t o s a n 1 2 2 物理性质 壳聚糖为阳离子聚合物，可溶解于强酸、有机酸及弱酸稀溶液。因制备工艺条件和 需求的不同，脱乙酰度为6 0 1 0 0 不等。脱乙酰度和平均分子量是壳聚糖的两项主 要性能指标。另外一项重要的质量指标是黏度，不同黏度的产品有不同的用途( 郑连英， 2 沈阳农业大学硕士学位论文 1 9 9 9 ) 。 1 2 3 化学性质 壳聚糖同时含有氮基和羟基，基本反应类型有：碱化、酸化反应( 杨俊玲，2 0 0 1 ) ， 酰化反应( 韩怀芬，单海峰，2 0 0 0 ) ，羧基化反应( 施建军等，1 9 9 8 ) ，醚化反应( 郭 立民等，2 0 0 2 ) ，席夫碱反应( 马全红等，2 0 0 0 ；高永红等，2 0 0 1 ) ，n 烷基化( 代昭 等，2 0 0 2 ) 酯化、季铵化反应( 陈蕾等，2 0 0 2 ) ，水解反应( 刘晓等，2 0 0 3 ) ，接枝交 联化( 吴根等，2 0 0 1 ) 等反应，常见的有n 羟乙基壳聚糖、n 酸化壳聚糖、o 羧甲基 壳聚糖等，通过不同的修饰反应形成不同结构和不同性能的衍生物( 李红霞，闫真芳， 2 0 0 6 ) 。 1 3 水溶性壳聚糖的制备 壳聚糖高分子的相对分子质量通常在几十万左右，一般可溶于稀酸但不能直接溶于 水；当壳聚糖降解为相对分子较小的低聚壳聚糖后，其理化性质及某些生理功能将会发 生变化。低聚壳聚糖可以直接溶于水中，其溶液粘度较低；由于分子上有许多亲水的游 离胺基及羟基，因此有较好的增湿性和保湿性；某些相对分子质量很低的低聚壳聚糖甚 至可以渗透到细胞内部起作用。因此，低聚壳聚糖在保健食品、食品保鲜、化妆品、生 物医药等方面都有许多应用，低聚糖的开发具有广阔的前景( 邢树文，2 0 0 6 ) 。 1 3 1 化学方法 酸水解法是制备几丁寡糖的传统方法，其中最常用浓盐酸。1 9 6 4 年r u p l e y 使用浓 盐酸水解几丁质，获得的产物经活性碳柱和硅藻土柱纯化，得到大量二糖和三糖，四糖、 五糖很少，水解度与盐酸浓度及反应温度成正比。n i s h i m u r a 等人( 1 9 8 9 ) 在用盐酸水 解几丁质时同时采用超声处理，提高了几丁六糖的产量，但不能得到七糖及以上的寡糖， 试验中他们用s e p h a d e x g - 2 5 层析过滤除盐，非常费时。张虎等( 1 9 9 9 ) 研究了酸水解 几丁质的条件，在4 0 时用浓盐酸作用2 h ，加入氢氧化钠中和，反应液通过活性炭柱， 先用5 的乙醇溶液洗去部分单糖和中和反应生成的盐，再用印的乙醇溶液将寡糖洗 脱出来，飞行质谱法分析目的产物，主要是四到六糖和少量七糖。有试验用无水氟化氢， 但需要移走大量氟化氢，且进行脱氟反应，条件苛刻，试验起来较困难，且产量低。a l l a n ，( 1 9 9 5 ) 在稀盐酸溶液中用亚硝酸水解壳聚糖，水解速率与亚硝酸和底物浓度有关，与 、 壳聚糖相对分子质量大小无关，壳聚糖的乙酰化度越高，反应活性越大，水解反应的限 速步骤是壳聚糖分子中胺的亚硝基化。l i n 等( 2 0 0 3 ) 用亚硝酸对不同脱乙酰度的壳聚 3 第一章前言 糖进行降解，得到不同分子量的壳寡糖产物，在对产物进行分离时，他改变了传统的透 析或超滤法，利用不同聚合度的寡糖在不同浓度甲醇溶液内溶解度的差异来进行分离， 逐步提高甲醇的浓度，直到4 倍于最初降解液体积，可依次分离得到不同分子量的产物， 壳聚糖底物的乙酰化程度对降解结果有较大影响，降解产物的水溶液( 1 ：2 ) 比壳聚糖 有更好的抗凝效果，可以作为临床血液抗凝的生物药品。酸水解法制备几丁寡糖工艺简 单，开展较早，是一种非特异的降解过程，反应过程及产物的相对分子质量分布较难控 制，产量低，且易对环境造成污染。c h a n g ，等( 2 0 0 1 ) 用h 2 0 2 研究制备几丁寡糖，先 用酸溶解几丁质后，加入h 2 0 2 利用氧化作用进行均相随机降解反应，碱中和反应产物， 无水乙醇分离，在8 0 以上时得到寡糖产物，反应温度、h 2 0 2 浓度对试验结果有较大 影响。这种方法速度快，产率高，但产物分子量仍较大。李瑞杰等( 2 0 0 3 ) 分别在酸性、 碱性、中性条件下，在过氧化氢溶液内加入几丁聚糖，于1 0 0 1 1 0 进行水解，水解 一定时间后将反应物取出，经浓缩、冷却、过滤后，再经沉淀，干燥及粉碎，便制得几 丁寡糖，此方法反应时间短、质量好、产率高、成本低、无污染，已获得国家专利。h a r i s h ( 2 0 0 5 ) 在n 2 环境下用过硫酸钾作用于壳聚糖( d d = 1 6 ) 2 h ，得到水溶性低分子量 壳寡糖，h p l c 分析产物以五糖、六糖为主，这些产物能抑制肿瘤血管的发生，并能通 过d n a 断裂诱导肿瘤细胞凋亡，另外发现这些寡糖片段内含的乙酰化的基团较多，认 为链的断裂可能倾向于在脱乙酰残基之间发生。 1 3 2 物理方法 到目前为止，国内外学者提出的壳聚糖的物理降解方法，主要有以下五大类：( 1 ) 超声波降解；( 2 ) 微波降解；( 3 ) y 射线降解；( 4 ) 光降解 ( 1 ) 超声波降解 对于壳聚糖来说，其超声波降解主要机理为：通过机械力将糖苷键破坏，从而导致 壳聚糖分子链断裂，发生降解反应。r e n a t a a c b 等( 2 0 0 5 ) 研究了3 6 0 k h z 超声波对水 溶液中的壳聚糖的作用。结果表明：超声波是一种有效的降低多糖分子质量的手段。在 这些研究条件下，降解由羟基自由基和机械化学作用引起。在充满氢气的，浓度为2 x l f f 2 m o l l 壳聚糖溶液中，p h = 3 ，1 7 0 w k g1 的超声波剂量率，0 9 0 m i n 的声波降解时 间，声化学的链平均切断产量是8 1 0 2 m o l j 。这个过程的声化学的链切断产量，取 决于聚合体浓度，超声波功率和充满溶液的气体。超声波降解后处理工艺简单、环境污 染低。但是该法突出的缺点是收率太低，导致生产成本过高，要实现工业化还有待进一 4 沈阳农业大学硕士学位论文 步的研究。 ( 2 ) 微波降解 对于壳聚糖来说，其微波降解主要机理为：微波诱导粒子移动或者旋转，导致极性 粒子产生偏振现象，使分子间发生摩擦，产生热量，分子转变为自由基，生成低聚壳聚 糖。j i a n s h a o 等( 2 0 0 3 ) 在微波辐射下，用中性的过氧化氢氧化降解壳聚糖，制备医用 低聚葡萄糖胺。结果表明：在微波辐射下，氧化降解壳聚糖，可以方便，有效的得到低 聚葡萄糖胺。壳聚糖的平均相对分子质量降低到9 0 0 1 0 0 0 。在很大程度上，低聚葡萄 糖胺产量的变化，取决于反应时间和h 2 0 2 浓度。微波辐射降解具有操作简便、反应时 间短、能源使用率高等优点，但是，由于微波使升温过快，导致单体容易挥发，反应不 充分。 ( 3 ) y 射线辐射降解 对于壳聚糖来说，其y 射线辐射降解主要机理为：溶液中的羟基自由基，通过氢原 子吸引，与壳聚糖分子反应，在碳原子处形成自由基，从而使糖苷键断裂发生重排。生 成低聚壳聚糖。壳聚糖在y 射线的辐照下可发生降解反应。w o n s e o k c h o i 等( 2 0 0 2 ) 研究了用不同剂量的c o 6 0y 射线辐照醋酸溶液( 2 ) 中的壳聚糖，得到壳聚糖低聚物。 结果表明：当辐射剂量达到1 0 k g y ，粘性很快地降低，然后随着辐射剂量的增加，粘性 逐渐缓慢地降低。当辐射剂量超过1 0 0 k g y ，会出现深褐色，从实际利用辐射技术的角 度看，要制备低分子量壳聚糖，有1 0 0 k o y 的辐射剂量，就能够实现用y 辐射降解壳聚 糖。辐射降解是无须添加物的固相反应，成本低，反应易控，无污染，产品品质高，降 解后得到的均一性较好的一系列低分子壳聚糖，生物相容性不受影响。为研究低聚壳聚 塘对微生物、动物、植物生物学的效能，提供理想的、丰富的试验材料，但它的实旌必 须建立在有电离辐射设备，且辐射强度相当高的前提下，这种方法在实际生产应用上有 一定的局限性。 ( 4 ) 光降解 对于壳聚糖来说，光降解的主要机理为：光被过氧化氢吸收，加速了过氧化氢光解， 产生了羟基自由基，作用壳聚糖的b ( 1 ，4 ) 糖苷键，随后破坏糖苷链接，使壳聚糖降 解。光降解与其他的降解方法进行优化组合，壳聚糖降解效果会更好。s h i m i n g w a n g 等( 2 0 0 5 ) 探讨了在紫外光照射下，h 2 0 2 氧化降解壳聚糖的情况，研究了h 2 0 2 质量分 数、紫外光照射的时间、壳聚糖质量分数、乙酸质量分数等因素对降解的影响。通过正 5 第一章前言 交试验，得到最佳反应条件：过氧化氢2 ( w v ) ，壳聚糖2 ( w v ) 。乙酸l ( w v ) ， 和辐照3 0 m i n 。试验结果表明：紫外光照射下，用h 2 0 2 氧化降解壳聚糖是可行的，也 是有效的，具有潜在的应用价值。在该反应条件下，制得了平均相对分子质量为2 8 万 左右的水溶性壳聚糖。光降解的优点是成本低，反应条件温和，不会产生二次污染。许 多难于降解的物质，都能通过光催化降锯为c 0 2 ，h 2 0 或毒性较小的有机物，但是，目 前对壳聚糖的光降解研究尚处于起步阶段，存在紫外光能量不高，导致反应速率较低， 降解效率不高等问题，有待进一步深入研究。 1 3 3 酶解法 1 , 3 3 1 几丁质酶对壳聚糖的降解 凡丁质酶专一性水解壳聚糖，使其降解为低聚物，可方便的得到聚合度低至2 7 的水溶性壳聚糖，甚至单糖。h u t a d i l o k 等( 1 9 9 5 ) 利用芽抱杆菌属几丁质酶对壳聚糖进 行降解，得到了低分子量的降解产物。i z 岫e 等以从b a c i l l u ss p n o 7 产生的几丁质酶 对脱乙酰度为9 9 的壳聚糖在乳酸溶液中进行降解，壳聚糖浓度为5 ( 质量分数) ， p h 为5 4 ，在3 7 。c 时反应6 h ，得到聚合度为2 6 的低聚壳聚糖。f e n t o n 和e v e l e i g h 发 现，从p e n i c i l l i u mi s l a n d i u m 中分离出的几丁质酶降解壳聚糖，其最佳底物是3 0 6 0 的n 乙酰化壳聚糖。 1 3 3 2 非专一性水解酶对壳聚糖的降解 ( 1 ) 溶菌酶。n i s h i m u r a 等( 1 9 8 6 ) 的研究发现，在3 0 时取代度为o 8 0 的水溶 性o 羧甲基甲壳素很容易被鸡蛋白中的溶菌酶所降解，1 6 h 内它的粘度从6 0 d g z 下降 到0 4 d g l ；但高羧甲基化的壳聚糖则很难降解。n o r d t v e i t 等( 1 9 9 6 ) 用鸡蛋白中的溶 菌酶对取代度为0 6 5 1 5 ，脱乙酰度为0 8 5 o 9 5 的羧甲基甲壳素在p h 值5 3 、离子 强度为0 1 m o l l 的条件下进行降解，发现反应符合米氏方程动力学模型。研究同时表明， 降解速度随着乙酰化度的提高而提高，随o 羧甲基化程度的提高而降低。l s h i g u m 等 ( 1 9 9 2 ) 研究发现，以聚合度为1 0 0 0 以上的部分脱乙酰甲壳素作为底物，经溶菌酶作用， 其水解产物的聚合度约为1 1 。 ( 2 ) 脂肪酶。脂肪酶( 1 i p a s e ) 是作用于水、有机界面上不溶性底物的酶。近年来， 有不少学者研究了脂肪酶对壳聚糖的降解作用，p a n t a l e o n e 等( 1 9 9 2 ) 研究了不同来源 的5 种脂肪酶( 1 种来自猪胰腺，4 种来自真菌) 在p h 3 6 时对壳聚糖的降解作用，发 现来自猪胰腺的脂肪酶对壳聚糖有强烈的水解作用。通过对降解产物的粘度分析可知： 6 沈阳农业大学硕士学位论文 在一定的酶蛋白质和壳聚糖比率下，粘度降低百分率可达1 0 0 。m u z z a r e u i 等( 1 9 9 5 ， 1 9 9 6 ) 的研究结果表明，在2 5 ，微酸性条件下，壳聚糖很容易被麦胚脂肪酶降解，相 对分子质量从7 0 0 0 0 0 降为1 3 0 0 0 ，且不改变壳聚糖的脱乙酰度，这酶解反应不遵循普 通的反应动力学模型，反应速度很快，体系粘度在开始反应1 0 r a i n 后就下降到初始值的 3 5 。研究还表明，n 羧甲基壳聚糖更容易被脂肪酶降解。 ( 3 ) 蛋白酶。y a l p a m 等( 1 9 9 4 ) 研究了胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和 胰蛋白酶对壳聚糖的作用，结果表明它们对壳聚糖都有明显的降解作用，其降解能力甚 至超过了几丁质酶和溶菌酶的降解能力。他们做了对比试验，将溶于去离子水的乙酸溶 液中的壳聚糖用相同剂量的蛋白酶( 胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和胰蛋白酶) 和溶菌酶处理，结果表明，蛋白酶使壳聚糖的粘度下降了8 9 9 8 ，而溶菌酶使壳聚 糖的粘度下降了7 7 。在低剂量的情况下，菠萝蛋白酶和胃蛋白酶比溶菌酶有更强的催 化作用。m u z z a r e l l i 等深入研究了木瓜蛋白酶对壳聚糖的降解作用。在微酸性条件下， 木瓜蛋白酶可有效的降解壳聚糖，其酶解反应并不符合简单的动力学模型，初速度随着 底物浓度的提高有很大的提高，而温度对其影响则较小。进一步研究表明，在室温下， 木瓜蛋白酶倾向于优先降解比较长的分子链。另外，木瓜蛋白酶只选择性的作用在两端 分别连接乙酰胺基单元和氨基单元的b 1 ，4 - 糖苷键上。所以，这种降解方法要求壳聚糖 的脱乙酰度不能太高，以6 0 左右为宜，从而保证分子链上含有一定数量的乙酰胺基葡 萄糖单元。叶眉等( 2 0 0 0 ) 研究木瓜蛋白酶降解壳聚糖过程中酶浓度、p h 、温度和时间 的影响。结果表明，在p h ：3 o 6 0 、温度3 0 6 0 、时间在2 h 8 h 内时，温度对 降解过程影响最大。而相对于酶浓度、p h 和温度，时间影响最小。最优的工艺条件为 p h = 4 0 ，5 0 、8 h 、木瓜蛋白酶浓度为1 5 m g m l 。 ( 4 ) 纤维素酶。壳聚糖和纤维素都是由d 葡萄糖经由1 3 ( 1 ，4 ) 糖苷键聚合而成 的多糖。若将壳聚糖分子中每个糖基上的乙酰胺基或氨基都换成羟基，就成了纤维素。 m u r a k i 等( 1 9 9 5 ) 研究了纤维素酶( c e l l u l a s e ) 对壳聚糖的降解作用。在5 0 ，p l a = 5 6 的乙酸钠缓冲液中，用浓度为o 6 的纤维素酶作用于浓度为3 的壳聚糖，最佳反应时 间为6 h ，得到的产物为聚合度为5 1 6 的低聚壳聚糖，其中聚合度为8 1 6 的低聚壳聚 糖占2 2 ，而聚合度为5 8 的占7 8 ，具有重要生理活性的聚合度为7 左右的低聚壳 聚糖占5 0 左右。 7 第一章前言 1 4 壳聚糖的应用 1 4 1 壳聚糖在食品工业中的应用 壳聚糖具有很好的成膜性、透气性、生物活性等优良性能，且无毒，无气味，并有 抑制细菌生长繁殖的防腐作用，使用操作方便、可喷涂、刷涂、浸泡、不需特殊技术和 设施。因此广泛应用于食品保鲜。赵玉清等( 2 0 0 2 ) 人研究表明巯基化壳聚糖可作为新 型水果保鲜剂，用于喷浸、涂膜，尤其可作为固体保鲜剂使用。携带方便、无污染、无 毒，0 5 的壳聚糖可达到可观的保鲜效果。王益等人( 1 9 9 9 ) 对鸡蛋涂膜保鲜试验证明： 壳聚糖能阻止细菌侵入鸡蛋内部，防止鸡蛋腐坏，保持鸡蛋的新鲜度，其中以2 的浓 度最佳。张莉等人( 2 0 0 2 ) 用壳聚糖涂膜黄瓜，结果表明1 0 的壳聚糖涂膜黄瓜6 0 s 保鲜效果较好，室温下贮藏可延长黄瓜的货架期。覃志英等人( 1 9 9 9 ) 研究结果表明， 在室温下，经壳聚糖处理过的芒果，贮藏时间比未处理的长达1 5 d ，产生霉点面积小， 用1 浓度的壳聚糖溶液保鲜效果最好。 1 a 2 壳聚糖在医学上的应用 壳聚糖有可生物降解的特点及很强的亲水性。可在酸性介质中膨胀形成胶体粘稠物 质而阻滞药物扩散及溶出，由此可制成缓释片，缓释丸剂等，普通的阿司片、匹林片， 在体内水解成水杨酸后对胃肠道黏膜有刺激作用，制成缓释片后，药物缓慢释出，在很 大程度上缓解其对胃肠道黏膜的刺激。黄秉南等人( 2 0 0 2 ) ，用壳聚糖配成的澄清剂对 山楂等中药复方水提液具有明显的澄清作用，快速简便。而且壳聚糖澄清剂对中药复方 重金属有捕集作用，从而可降低重金属含量，提高药品质量，提供一种有效方法。张洪 等人( 2 0 0 2 ) 把壳聚糖用作澄清剂制各芪黄口服液的试验表明用壳聚糖做澄清剂代替乙 醇，效果较好，壳聚糖能有效的保存多糖成分，并且干浸膏略有增加。朱立贤等人( 2 0 0 2 ) 研究表明壳聚糖对大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，但不同浓度 的壳聚糖的抑制作用不同。壳聚糖浓度为o 0 6 2 5 时即可起到一定的抑菌作用。 1 4 3 壳聚糖在日化上的应用 壳聚糖及其衍生物具有良好的吸湿性、成膜性、防静电和防尘性，对皮肤和头发具 有良好的亲和性，制成化妆品，可以形成透明的保护层，用以保护头发和皮肤，在化妆 品中可作保湿剂，在洗发精中作黏度调节剂。这些产品使用壳聚糖及其衍生物的优点是 基于壳聚糖与蛋白质有良好的成膜能力。与合成聚合物比，在高温下更为稳定，与传统 固发剂比，用壳聚糖处理头发，易梳理、静电少、有光泽。膏霜类化妆品中适量加入壳 8 沈阳农业大学硕士学位论文 聚糖可增加人体对细菌，真菌的免疫力( f a n kh a u s e r ，2 0 0 2 ) ，阻碍原菌生长，消除由 于微生物侵害而引起的皮炎、粉刺；对破损的皮肤会促使其愈合，消除面部疾患，用壳 聚糖制各含有福尔马林的化妆品，具有良好的杀菌效果；n 羧甲基壳聚糖由于化妆品可 辅助抗皮肤过敏( k r o c p k e ，2 0 0 2 ) 等，可作为膏霜的添加剂( 南伟，2 0 0 3 ) 。 1 4 4 壳聚糖在农业上的应用 壳寡糖是新一代海洋生物源农药，具有无毒害、不污染环境、兼有药效和肥效双重 生物调节功能的特点，可诱导激活植物免疫系统，提高植物抗病毒能力。 1 4 4 1 植物生长调节活性( 诱导抗性) 壳寡糖可作为植物生长调节剂，增强植物对病虫害的防御能力( r o b yd 等，1 9 8 7 ； u s o val ，1 9 9 3 ) 。其作为植物免疫激活因子的基础研究始于2 0 世纪6 0 年代。a y e r s 等于1 9 7 6 年发现细胞壁的寡糖碎片能诱导植物植保素( p h y t o a l e x i n ) 合成。1 9 8 5 年 a l b e r s h e i m ( a l b e r s h e i mp ，1 9 8 5 ) 首次提出了寡糖素( o l i g o s a c c h a r i n s ) 这个新概念和 新领域，并认为寡聚糖具有调控植物生长、发育、繁殖、防病和抗病等功能，能够刺激 植物的免疫系统反应，每种活性寡聚糖可发出调节特定功能的信息，激活防御反应和调 控植物生长，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成。活性寡聚糖是一类具有一 定结构和生物活性的聚合体，国际上研究较多的是植物及微生物细胞壁多糖降解的寡 糖越来越多的试验结果表明，植物细胞壁不仅能起到防御的结构屏障作用，而且当植 物受到病菌感染时能产生积极的防御反应( r o b yd 等，1 9 8 7 ) 。这是因为，一方面植 物细胞壁酶能水解病原菌细胞壁中的几丁质等，产生活性成分，诱导植物植保素等合成 酶系基因的表达；另一方面，病菌入侵植物时，必须水解植物细胞壁的多糖，其降解产 物也能诱导植保素的合成。因此，寡聚糖可有效地诱导植物产生防御反应，激活植物的 系统性获得免疫反应。壳寡糖是以壳聚糖为原料，经酶法降解成的具有一定聚合度和一 定结构的系列寡聚糖。壳寡糖的诱抗活性与壳寡糖的聚合度及脱乙酰度密切相关，低聚 合度及高脱乙酰度的壳寡糖诱抗活性高( l is h u - g u a n g 等，2 0 0 2 ) 。 1 4 a 2 杀菌活性( 抗菌、抑菌) 壳寡糖具有广谱抑菌活性并对人畜无毒，开发壳寡糖生物源农药是减少化学农药旌 用量的有效途径( k i msk ，r a j a p a k s en ，2 0 0 5 ) 。郑连英等( 2 0 0 0 ) 研究推测壳寡糖 通过渗透进入病原菌细胞体内，吸附其体内带有阴离子的细胞质，并产生絮凝作用，扰 乱细胞正常的生理活动，最终杀灭病菌。施用壳聚糖可直接抑制病菌生长或诱导植物的 9 第一章前言 抗病反应，提高植物的抗病性。经试验室生物活性测定和田问药效试验证明，壳寡糖对 番茄早疫病、黄瓜白粉病、棉花黄萎病、大豆病毒病、辣椒病毒病、木瓜病毒病等均有 很好的防效。早在1 9 8 9 年( h i r a n s os ，n a g a on ) 就有学者研究出了壳寡糖对植物病原 体的抑菌作用，结果表明壳寡糖对f u s a r i u mo x y p o r a m ，p h o m o p s i s f u k u s h i 和a l t e r n a r i a a l t e r n a t a 等植物病原体的抑制作用比壳聚糖要强。最近日本有学者( y o s h i h a r um ， m i m u a k ik ，1 9 9 5 ) 研究了一种安全、无污染的、能够促进植物生长和对植物病原体产 生拮抗作用的壳寡糖复合物( 壳聚糖：壳寡糖：它们的盐= 1 ：1 ：5 0 ，质量比) 。研究 人员在8 0 0 9 糊精和1 0 0 9 壳寡糖的混合物中加入一些无机盐，螯合后喷施于黄瓜叶面上， 可使黄瓜叶面上的霉菌消失，同时对蚜虫也有抑制作用。我国一些学者( z h a n gm i n 等， 2 0 0 3 ) 也对壳寡糖的抗菌功效进行了研究，发现壳寡糖对常见植物病原菌具有良好的抑 菌活性，且随着浓度提高抑菌作用增强。同时研究也揭示了壳寡糖的聚合度或平均相对 分子质量都与壳寡糖的抑菌性能有关，随着聚合度的增加或分子质量的降低，其抑菌作 用增强。 1 , 4 4 3 改良土壤结构和土壤中微生物分布 甲壳质和壳聚糖有利于改良土壤中微生物的分布，改善作物的生存环境，防止土壤 病害。甲壳质进入土壤后可促进有益菌如固氮菌、纤维分解菌、乳酸菌、放线菌的增生， 抑制有害细菌如霉菌、丝状菌的生长。有报道表明甲壳质及壳聚糖可以使土壤中放线菌 增加近3 0 倍。甲壳质壳聚糖有改善土壤性质的作用，加上壳聚糖的抑菌作用，可将壳 聚糖与可溶性蛋白( 如胶原蛋白) 合成液体土壤改良剂( 张敏恒等，2 0 0 1 ) 。应用甲壳 质和壳聚糖生产的土壤改良剂具有适当的稳定性和可降解性，降解后成为优质的有机肥 料，供作物吸收利用。并且这种液体土壤改良剂喷洒到土壤表面后，可形成一层薄膜， 起到土壤保墒作用；将这种土壤改良剂施加到土壤中，可改善土壤结构，进而提高作物 产量。 1 4 4 4 果蔬保鲜剂 水果和蔬菜呼吸作用比较旺盛，如果保藏不善很容易发生腐烂。据调查，国内一些 果蔬的腐烂率高达2 5 3 0 ，因此，果蔬保鲜技术的研究有切实的经济效益和社会效 益。众多研究表明，用壳聚糖在果蔬上涂膜后，所形成的膜有一定的隔氧性和阻水气性， 可调节果蔬生理代谢，对呼吸跃变型果实和非呼吸跃变型果实都有良好的保鲜效果。壳 聚糖贮藏保鲜果实是利用它们在果实表面形成的一层无色透明的薄膜，该膜对0 2 、c 0 2 、 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 c 2 h 2 具有一定的选择渗透作用，其使用浓度一般为o 5 2 。应用壳聚糖保鲜膜可较 好的控制桃子、日本梨、称猴桃、黄瓜、胡椒、草毒和西红柿的腐烂变质，延长贮存时 问和货架寿命( d uj 等，1 9 9 7 ：e l g h a o u t h a ，1 9