（有机化学专业论文）井冈霉素生产工艺改进及其功能化树脂研究.pdf

中文摘要 本文利用微生物发酵的方法生产井冈霉素，从井冈霉素生产工艺 的菌种着手，对菌种的自然选育与纯化、发酵培养基配方的优化、发 酵工艺中染菌的控制和井冈霉素的提取精制等工艺做了改进。 利用体积排除效应，通过对交联剂和致- t l n 的选择，合成了新型 聚丙烯酸n a + 型树脂。根据井冈霉素分子中仲胺基在碱性介质中显正 电性的特点，提出了步法提取井冈霉素的工艺。 利用井冈霉素分子结构中富含邻羟基和间羟基的特点，在合成大 孔交联疏水聚苯乙烯网络的基础上，通过化学转化合成一种新型智能 疏水亲水性聚苯乙烯支载井冈霉素两亲聚合物微球。利用该材料的特 殊亲和性能和本身分子结构的体积排除效应，实现对分子大小不同的 化合物及天然产物的吸附分离。 l 井冈霉素菌种的自然选育和产素能力研究 采用自然选育方法对井冈霉素生产菌株进行了筛选，获得了遗传 性能稳定的高产菌株。考察了发酵培养基中碳源、有机氮源对菌种产 素能力的影响。结果表明：采用c ：n 为l ：0 4 5 - - 0 5 7 ，固形物含量 为1 2 左右的菌种培养基配方，得到的井冈霉素生产菌产素能力高。 2 正交法优化井冈霉素发酵培养基研究 以黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、肉粉、玉米粉、k h 2 p 0 4 、山芋 淀粉及大米淀粉8 因素3 水平的正交试验对井冈霉素发酵培养基配方 进行了优化。结果表明：最适碳源为大米淀粉，最适氮源为黄豆饼粉、 花生饼粉。最适碳氮比为1 ：0 4 5 - - - 0 5 7 。最适培养基为大米淀粉7 0 、 黄豆饼粉1 0 - - - 2 0 、磷酸二氢钾o 0 5 ；得到的发酵液易过滤，滤 液清澈。 3 井冈霉素发酵染菌的控制 通过对井冈霉素发酵工艺中种子、发酵培养基和发酵设备及其附 件的染菌分析，综合生产试验，获得了控制井冈霉素发酵工艺中染菌 的有效办法。应用于湖南微生物研究所，2 0 0 8 年染菌率从1 5 4 下降 到6 0 。 4 新型大孔聚丙烯酸树脂一步法提取井冈霉素工艺 根据井冈霉素分子结构中仲胺基在碱性介质中显电正性的特点， 合成了新型大孔聚丙烯酸n a + 型树脂，采用一步法吸附提取井冈霉素 工艺，同时考察了发酵液温度、浓度和酸度对树脂吸附的影响，探索 了树脂对井冈霉素动态吸附的工艺参数。获得了高浓度井冈霉素( 井 冈霉素a 含量达6 5 ) 产品。 5 聚苯乙烯支载井冈霉素微球的合成 以苯乙烯为单体，二乙烯苯作交联剂，用甲苯和液体石蜡作致孔 剂，通过对交联剂和致孔剂的比率调剂，采用悬浮聚合法合成不同孔 径的大孔疏水网络，然后将网络进行氯甲基化，再将氯甲基化的交联 聚苯乙烯( c m c p s ) 和井冈霉素在n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 中进行胺 化反应，得到几种不同孔径的新型聚苯乙烯支载井冈霉素两亲聚合物 微球。采用红外光谱、元素分析等手段分析了该树脂的结构，测定了 该树脂的孔结构、含水量、弱碱交换量和溶胀性能。 n 6 聚苯乙烯支载井冈霉素微球( i ) 对硼酸络合吸附性能研究 利用聚苯乙烯支载井冈霉素微球中井冈霉素分子结构中富含间、 邻羟基的特点，研究了该树脂对硼酸的络合吸附。得到了该树脂对硼 酸在不同温度下的吸附等温线，并利用热力学函数探讨了该树脂的吸 附机理，并将该树脂对硼酸的吸附效果与目前商用特效硼酸树脂做了 对照。结果表明其动态吸附能力是d 4 0 3 葡甲胺基硼酸特效树脂( 江苏 苏青水处理工程集团有限公司) 的3 倍。 7 聚苯乙烯支载井冈霉素微球( i i ) 对t d i 吸附性能研究 研究了聚苯乙烯支载井冈霉素微球对t d i 溶液在不同温度下的吸 附等温线，利用热力学函数计算出了该过程的吸附焓、自由能和熵， 探讨了该树脂对t d i 的吸附机理和吸附能力。结果表明：此树脂对t d i 有很好的吸附作用，其动态吸附量达到5 1 4 5 m g l j ( 溶剂溶胀) ；模拟 涂料t d i 浓度o 4 4 0 m g l ，其残留浓度为1 0 0 6 0 0l a g l 。 8 聚苯乙烯支载井冈霉素微球( i i i ) 对葛根异黄酮吸附性能研究 研究了聚苯乙烯支载井冈霉素微球对葛根异黄酮在不同温度下的 吸附等温线，利用热力学函数关系计算出了该吸附过程中的焓变、自 由能和熵变。结果表明该树脂对葛根异黄酮的吸附得率为8 5 。 关键词：井冈霉素，生产工艺，井冈霉素微球，应用开发 1 i i a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n , s t a r t i n gf r o mt h es t r a i nf o r t h ep r o d u c i n gp r o c e s so f j i n g g a n g r n y c i n ，s t r a i nc u l t i v a t i n ga n dp u r i f y i n g ，c o m p o n e n t so f t h ec u l t i v a t i n gm e d i u m ， c o n t r o l l i n go ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o na n dp r o d u c te x t r a c t i o np r o c e s sh a v eb e e n i n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l yb yu s i n gm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n an e wt y p eo fp o l y a c r y l a t er e s i nw a ss y n t h e s i z e dt h r o u g ht h ec r o s s - l i n k e ra g e n t a n dp o r e f o a m i n ga g e n tc h o i c eb a s e do nt h ev o l u m ee x c l u s i o ne f f e c t a c c o r d i n gt o m a n yo - h y d r o x y la n dm - h y d r o x y lg r o u p s i nj i n g g a n g m y c i nm o l e c u l a r , a l lo n e - s t e p t e c h n o l o g yo fe x t r a c t i o nj i n g g a n g m y c i nw a sp r o p o s e d u t l i z i n gt h ei m i n og r o u pi nm o l e c u l a rs t r u c t u r eo fj i n g g a n g m y e i n ，b a s e do nt h e s y n t h e t i co fh y d r o p h o b i cm a c r o p o r o u sc r o s s l i n k e dp o l y s t y r e n en e t w o r k s ，an e w i n t e l l i g e n th y d r o p h o b i c h y d r o p h i l i cp o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g r n y c i np o l y m e r m i c r o s p h e r ew a ss y n t h s i z e db yc h e m i c a lc o n v e r s i o n t h es p e c i a la f f i n i t y o ft h e m a t e r i a la n dt h ev o l u m ee x c l u s i o ne f f e c tb r o u g h tb yi t sm o l e c u l a rs t r u c t u r ew a su s e dt o r e a l i z et h ea d s o r p t i o na n de x t r a c t i o no fc o m p o u n d sa n dn a t u r a lp r o d u c t sw i md i f f e r e n t m o l e c u l a rs i z e s 1s t u d i e so nt h en a t u r a ls c r e e no fj i n g g a n g m y e i ns t r a i na n di t sp r o d u c i n gc a p a b i l i t y j i n g g a n g r n y c i np r o d u c i n gs t r a i n s ( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sv a r j i n g g a n g s i s y e n ) w e r es c r e e n e db yn a t u r a ls e l e c t i o nm e t h o d ，a n dt h eh i g h e r - y i e l ds t r a i n sw i t hs t a b l e g e n e t i cp e r f o r m a n c ew e r eo b t a i n e d t h ee f f e c t so fc a r b o ns o u r c ea n do r g a n i cn i t r o g e n s o u r c eo nj i n g g a n g m y c i np r o d u c i n gc a p a b i l i t yw e r eb o t hi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tj i n g g a n g m y c i n b a c t e r i ap r o d u c i n gc a p a c i t yw a sh i g h e rw i t ht h em e d i u m o fc ：nr a t i oo f1 ：0 4 5 0 5 7a n ds o l i dc o n t e n to f a r o u n d1 2 2 s t u d i e so no p t i m u mc u l t u r em e d i u mo fj i n g g a n g m y c i nb yo r t h o g o n a lt e s t t h em o l er a t i oo fs o y b e a r lm e a lp o w d e r s ，p e a n u tc a k ep o w d e r s ，y e a s t p o w d e r s ， m e a tm e a l ，c o r np o w d e r s ，p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t ea n ds w e e tp o t a t of l o u r r i c es t a r c h p o w d e r s w e r e e x a m i n e dt od e m o n s t r a t et h e o p t i m u mm e d i u mo f j i n g g a n g m y c i nb yl l s ( 3 ) 6o r t h o g o n a lt e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr i c ep o w d e r s w e r e t h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c e s ，s o y b e a nm e a lp o w d e r sa n dp e a n u tc a k ep o w d e r sw e r et h e o p t i m u mn i t r o g e ns o u r c e sa n dt h eo p t i m u mc ：nw a s1 ：0 4 5 - - 0 5 7 t h eb e s tr e c i p ew a s r i c ep o w d e r s7 0 s o y b e a r lm e a lp o w d e r s1 0 2 0 ，p e a n u tc a k ep o w d e r s1 o 2 0 a n dk h 2 p 0 40 0 5 t h eb r o t hi se a s yt ob et i l t e da n dg e tc l e a rf i l t r a t e 3 t h ec o n t r o lo fb a c t e r i a l - i n f e c t i o ni nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fj i n g g a n g m y c i n v b yt e r m so fa n a l y z i n gb a c t e r i a li n f e c t i o ni n d u s t r i a lo fv a c c i n e ，c u l t u r em e d i u m ， e q u i p m e n t sa p p e n d i x e s i na l l p r o c e s s ，a n ds y n t h e s i z i n gp r o d u c t i o ne x p e r i e n c e a c c u m u l a t e df o r m a n yy e a r s ，a s e r i e so fe f f e c t i v em e t h o d so fc o n t r o l i n g b a c t e r i a l i n f e c t i o no fj i n g g a n g m y c i nf e r m e n t a t i o nw e r es u m m a r i z e d a n dt h er a t i oo f b a c t e r i a l i n f e c t i o nd e c r e a s e df r o m15 4 t o6 0 b yo n ey e a rb yt h i sm e t h o d s 4o n es t e pt e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n gj i n g g a n g m y c i n sw i t ht h en e wt y p em a c r o p o r o u s p o l y a c r y l i cr e s i n a c c o r d i n gt ot h ep o s i t i v ee l e c t r i c a lp r o p e r t yo fi m i n og r o u pi nj i n g g a n g m y c i n m o l e c u l a ri na l k a l i n em e d i a ，t h en e wt y p eo fm a c r o p o r o u sp o l y a c r y l i ca c i dn a + r e s i n w a ss y n t h e s i z e d ，a n dao n e s t e pt e c h n o l o g yo f e x t r a c t i n gj i n g g a n g r n y c i nw a sa d o p t e d t h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e 、c o n c e n t r a t i o n 、a c i d i t yf o ra d s o r p t i o nw e r e s t u d i e d a n dt h ep r o c e s sp a r a m e t e r so ft h ed y n a m i ca d s o r p t i o no fj i n g g a n g r n y c i no n t h i sr e s i nw a se x p l o r e d t h e n ，h i 曲c o n c e n t r a t i o nj i n g g a n g m y c i np r o d u c t sw e r e o b t a i n e d ( t h ec o n t e n to f j i n g g a n g m y c i na r e a c h e d6 5 ) 5s y n t h e s i sa n d p r o p e r t i e so fp o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i nm i c r o s p h e r e s t a k i n gs t y r e n ea sm o n o m e r ，d i v i n y l b e n z e n ea sc r o s s l i n k i n ga g e n ta n dt o l u e n ea n d l i q u i dp a r a f f i na sp o r o g e n ，m a e r o p o r o u sh y d r o p h o b i cn e t w o r kw i t hd i f f e r e n tp o r es i z e s w e r es y n t h e s i z e db ys u s p e n s i o n p o l y m e r i z a t i o nt h r o u g hr e g u l a t i n g t h er a t i oo f c r o s s l i n k e r sa n dp o r o g e n s t h e n ，c h l o r o m e t h y l a t i o no ft h en e t w o r kw a sp e r f o r m e d n e wp o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i na m p h i p h i l i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e sw i t h s e v e r a ld i f f e r e n tp o r es i z ew e r eo b t a i n e db yt e r m so fa m i n a t i o no ft h ec h l o r o m e t h y l i z e d c r o s s l i n k e dp o l y s t y r e n e ( c m c p s ) a n dj i n g g a n g m y c i ni nn ，n - d i m e t h y l f o r m a m i d e ( d m f ) t h es t r u c t u r eo f t h eo b t a i n e d p o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i n m o c r o p o r o u sa m p h i p h i l i cr e s i nw a sc h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e ds p e c t r a , e l e m e n t a l a n a l y s i se t c t h ep o r es t r u c t u r e s ，w a t e rc o n t e n t s ，w e a kb a s ee x c h a n g ec a p a c i t i e sa n d s w e l l i n gp r o p e r t i e so ft h er e s i nw e r ed e t e r m i n e da tt h es a m et i m e 6s t u d yo nt h e a d s o r p t i o np r o p e r t i e s o fp o l y s t y r e n e s u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i n m i c r o s p h e r e s ( i ) f o rb o r i ca c i d t h ec o m p l e xa d s o r p t i o no ft h ep o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i nm i c r o s p h e r e s f o rb o r i ca c i dw a sm e a s u r e db a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c st h a tt h i st y p eo fr e s i nw e r er i c h i nm h y d r o x ya n do - h y d r o x yi nt h es t r u c t u r eo ft h em o l e c u l e t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m s o fb o r i ca c i df r o ma q u e o u ss o l u t i o no n t ot h en o v e lr e s i na td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ew e r e s t u d i e d ，a n dt h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e da c c o r d i n gt o t h er e l a t e d t h e r m o d y n a m i cf u n c t i o n sa n dc o m p a r e di t sa d s o r p t i o np e r f o r m a n c ew i t ht h ec u r r e n t c o m m e r c i a ls p e c i a le f f e c t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed y n a m i ca d s o r p t i o nc a p a c i t yo f t h ep o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g r n y c i nm i c r o s p h e r e si s3t i m e sa sl a r g ea st h ed 4 0 3 a m i n oa c i de f f e c t sp o r t u g u e s ea r e s i n ( j i a n g s us uq i n gw a t e rt r e a t m e n te n g i n e e r i n g g r o u pc o ，l t d ) 7s t u d yo nt h ea d s o r p t i o n p r o p e r t i e s o fp o l y s t y r e n e s u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i n m i c r o s p h e r e s ( i i ) f o rt o l u e n ed i i s o c y a n a t e ( t d i ) t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so fp o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i nm i c r o s p h e r e s f o rt d ii nd m fs o l u t i o nw a ss t u d i e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e t h ea d s o r p t i o ne n t h a l p y , g i b b sf r e ee n e r g ya n de n t r o p yw e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt ot h e r m o d y n a m i ce q u a t i o n s t h ea d s o r p t i o nm e c h a n i s ma n da d s o r p t i o nc a p a c i t yw e r ed i s c u s s e db a s e do ns u c h s t a t i s t i c s t h er e s u l ts h o w e d ：t h ef u n c t i o n a lp o l y m e rm i c r o s p h e r eh a sag o o da d s o r p t i o n t ot d i ，t h ed y n a m i ca d s o r p t i o nc a p a c i t yo ft d ir e a c h e d51 4 5m g l 叫( w e tr e s i n ) ；t h e s i m u l a t e dc o a t i n gt d ic o n c e n t r a t i o nw a s0 4 4 0 m gl 一，i t sr e s i d u a lc o n c e n t r a t i o n w a s1 0 0 6 0 0 嵋l 8s t u d yo nt h e a d s o r p t i o np r o p e r t i e s o f p o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i n m i c r o s p h e r e s ( 1 1 1 ) f o rp u e r a i ai s o f l a v o n e s t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so fp o l y s t y r e n es u p p o r t e dj i n g g a n g m y c i nm i c r o s p h e r e s f o rp u e r a i ai s o f l a v o n e sa td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw e r l - es t u d i e d t h ea d s o r p t i o ne n t h a l p y , g i b b sf r e ee n e r g ya n de n t r o p yw e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt ot h e r m o d y n a m i ce q u a t i o n s t h er e s u l t ss h o w e d ：t h ea d s o r p t i o ny i e l do fp u e r a i ai s o f l a v o n e sw a s8 5 k e y w o r d s ：j i n g g a n g m y c i n ，i m p r o v ep r o c e s s , j i n g g a n g m y c i nm i c r o s p h e r e s ， a p p l i c a t i o nd e v e l o p m e n t v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外， 本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 2 0 0 9 年1 2 月0 4 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书 2 、不保密n 。 作者签名： 导师签名： ( 请在以上相应方框内打“寸) 日期：2 0 0 9 年1 2 月0 4 日 日期：2 0 0 9 年1 2 月0 6 日 井冈霉素生产j i ：艺改进及其功能化树脂研究 1 文献综述 1 1 井冈霉素的性质 井冈霉素【1 】是采用微生物发酵法生产的种含井冈霉素各组分的 抗生素t 2 1 1 z n 图1 1 ，其有效成分为a 、b 、c 、d 、e 、f 、g ，其中a 成 分大于7 0 ，b 成分占2 0 左右【”。纯品易溶于水和甲醇，微溶于乙 醇和丙酮，不溶于乙醚、苯等有机溶剂，分解点1 3 5 ，吸潮性强， 呈弱碱性，常温下在中性及弱酸弱碱介质中稳定，在较强酸性或碱性 介质中易分解。对人、畜、鱼、蚕等无毒，动物口服井冈霉素可被肠 内细菌分解成葡萄糖和井冈胺，后者不被肠道吸收，可全部排出体外。 纯品小自鼠毒性实验l d 5 0 ) 2 0 0 0 0m gk g 一。 o ho h r ir 2r 3r 5氏 j i n g g a n g m y c i na h hh d d g l chh j i n g g a n g m y c i nb hh 0 h p d - g l c o hh j i n g g a n g m y c i nc hh a d g 1 c p d g l c hh j i n g g a n g m y c i nd hh hhhn d g l c a d g l c ( 1 ，4 、 j i n g g a n g m y c i ne h hhhh ) 1 3 - d g l c j i n g g a n g m y c i nf a d g l ch h p d g l c hh j i n g g a n g m y c i ng o hh h p d g l c hh v a l i d o x y l a m i n ea hhhhhh v a l i d o x y l a m i n ea hhhho hh v a l i d o x y l a m i n ea hhh o hhh g l c ：g l u c o p y r a n o s y l 井冈霉素分子结构式 f i g1 1 s t r u c t u r eo f j i n g g a n g m y c i r i 博士学位论文 1 2 井冈霉素的生产工艺 在七十年代初，水稻纹枯病( 俗称稻瘟病) 危害十分严重，染菌 水稻几乎是颗粒无收，没有好的防治农药。1 9 7 3 年，上海农药研究所 组织有关专家，参照日本防治稻瘟病的农药产品一有效霉素 ( v a l i d a m y c i n ) ，分别从江西井冈山地区和杭州植物园的土壤中定向筛 选，得到了一种菌株 吸水链霉菌井冈变种( s h y g r o s c o p i c u s v a r j i n g g a n g e n s i s ，y e n ) 】，通过对这一菌种的多次筛选，采用微生物发酵 方法，合成了一种抗生素农药1 4 , 5 一井冈霉素。其有效成份与日本生产 的有效霉素( 或百里达新) 相同【6 ，- 。 井冈霉素从研究开发三十多年以来，一直是我国治疗水稻纹枯病 的首选农用抗生素，已成为我国农民家喻户晓的理想生物农药，它的 生产可分为以下几个工艺阶段： 菌种_ 孢子制备_ 种子制备_ 发酵一发酵液预处理_ 提取及精制 _ 成品检验_ 成品包装 1 2 1 菌种 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种 筛选的过程，叫做菌种的自然选育或自然分离。 菌种选育的目的是改良已知菌种或生产菌株的特性，使其符合工业 生产的要求。根据菌种自然变异而进行的自然选育，用人工方法引起菌 种变异或形成新的杂种( h y b r i d ) ，再按照工业微生物学的要求进行筛选 来获得新的变株或杂种，这就是当前菌种选育的基本内容。 井冈霉素生产。j ：艺改进及其功能化树脂研究 菌种选育在抗生素工业中的地位越来越重要。抗生素产量和质量的 不断提高，是由于在菌种选育、发酵和提炼等三个方面不断取得进展的 结果，但其中菌种选育的作用是主要的、根本的。发酵培养基成份和发 酵条件的改进，充分发挥菌种的生产潜力，提高发酵单位，但这些因素 的改进不能离开菌种本身固有的遗传特性。提炼方法的改进，可以提高 发酵产物的收得率，但是理想的最高回收率也只能以达到菌种的潜在产 量为极限，而且实际上还受到工艺和成本核算的限制。总之，抗生素的 产量、质量及其抗菌性能，主要是由菌种特性所决定的。 菌种选育有两个基本任务：一个是抗生素工业生产方面的任务；另 一个是抗生素产生菌的遗传研究方面的任务。总的来说菌种选育的任务 是随着抗生素工业的发展而发展的，也是随着菌种本身特性的改变而变 化的。 在抗生素生产中，通过菌种选育可以达到以下几项目的： 提高发酵单位 对已经投入生产的菌种要通过菌种选育继续提高其发酵单位；对 新菌种更需要迅速提高其发酵单位，使之迅速投入工业生产。在工业 生产上所使用的菌种都是经过选育以后的变种，抗生素发酵单位的不 断提高主要是不断选育菌种的结果。 提高产品质量、减少多余的代谢产物 通过菌种选育，可以分离得到各种突变型菌株，其中生物合成障碍 突变型菌株的一部分酶引起遗传性阻断，积蓄了合成中间体，这样，就 有可能增添新抗生素或去除有毒或活性低的多余组分。 博+ 学位论文 自然选育以微生物的自然突变为基础。在工业生产中，抗生素产生 菌呈现出巨大的自然变异能力。这种自然变异的结果往往导致菌种的退 化，表现出生活力减弱、产孢子能力减少和生产抗生素能力降低等。菌 种退化实质上是遗传上的退化，严重的退化甚至造成菌种的死亡。但自 然变异有时也会出现生产抗生素能力提高的优良特性。因此，经常地从 大量的天然孢子群体中，淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，可以达到 纯化菌种、稳定生产的目的。 生产菌种在使用过程中，要在人工培养的条件下进行传代。虽然原 始斜面是由单菌落发育而来，但菌落上的许多分生孢子已经具有不同的 遗传基础，所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征。群体较纯的，传 代后变异较少；群体不纯的，传代后变异菌株将会占优势。因此，菌种 在传代过程中，很容易丧失一种或多种特性而导致退化。在抗生素生产 中，为使生产不断向前发展，要求发酵单位不断提高，需要反复对生产 菌株进行挑选。尽管生产上使用的菌种都用合理的方法保藏着，而且研 究工作者还在不断地改进保藏方法，但是菌种在保藏过程中仍不断发生 变异。 综上所述，自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、 提高产量的目的。自然选育的一般程序是把菌种制备成单孢子悬浮液， 经过适当的稀释以后，在固体平板上进行分离，然后挑选单个菌落进行 测定，从中选出优良菌落。 其选育流程如下： 出发菌株砂土，斜面生制成孢子悬浮液! 鲎_ 划平板分离 出发菌株砂土，斜面一制成孢子悬浮液二! 竺j _ 划平板分离 5 , - 一, 6 d 井冈霉素生产i ：艺改进及其功能化树脂研究 3 7 c 3 - - 4 d 2 8 c 效价测定 _ 挑取单菌落接种一筛选 或自然分离 5 6 d 确定菌株一砂土保藏 生产菌种制备工艺流程： 传至三代复筛 砂土管一砂斜_ 孢瓶斜面_ 摇瓶发酵_ 种子罐发酵 1 2 2 孢子制备 孢子制备是发酵工序的开端，也是一个主要的环节。抗生素的产量 和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子制备有密切关系。生产用的孢 子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定的孢子才能用来制各种子。 制备孢子时，一般是将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无 菌手续将其接种到灭菌的固体斜面培养基上，在2 8 3 7 下培养3 6 天。但这样培养出来的孢子数量还是有限的，为了获得数量更多的孢子 以供生产需要，可进一步采用有较大表面积的固体培养基( 如小米或麸 皮) 进行扩大培养。 1 2 3 种子制备 种子制备这一过程的目的是使孢子发芽、繁殖同时获得足够数量的 菌丝，以便接种到发酵罐中去。种子制备有的从摇瓶培养开始，再接入 种子罐进行逐级扩大培养。有的直接从种子罐开始进行逐级扩大培养。 摇瓶培养过程是否需要与种子扩大培养级数的多少有关，决定于菌种的 性质、生产规模的大小和生产工艺特点。种子制备般在种子罐中进行， 博士学位论文 扩大培养级数通常为二级。 摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后用无菌 操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。种子罐培养时，在接种前有关设 备和培养基都必须经过严格灭菌消毒。孢子接入一级种子罐的方法是制 成孢子悬浮液，通过微孔差压法( 也可采用火焰保护法) 接种，如用孢 子悬浮液接种，约为1 2 个孢瓶，具体视孢瓶内孢子丰富程度和种子 罐的大小而定；如用菌丝接种，酌情接入1 3 瓶，相当于o 1 2 0 ( 以罐内发酵液体积计算，下同) 。二级种子罐接种量一般为5 2 0 ， 培养温度一般为2 8 - - 一3 7 ，在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌 空气，控制罐温和罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态和进行 生化分析等，确保种子质量后方可移种。 1 2 4 灭菌 1 2 4 1 空气过滤除菌 空气的组成：氧气、二氧化碳、氮气的混合物，其中还有水 汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。空气需严格除 菌，达到无菌状态，才能使用1 8 1 。在井冈霉素发酵工业中、，采用 过滤介质( f i l t e rm e d i u m ) 除菌方法制备无菌空气。微生物体积 很小，空气中附着在尘埃上的微生物大小为o 5 - - 5p m 。其原理 在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性碰 撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗 粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大， 井冈霉素生产： 艺改进及其功能化树脂研究 截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一 定作用。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的 微生物。 1 2 4 2 蒸汽灭菌 湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，穿透 力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的 化学键破坏、降解，导致生物体死亡。一般在115 l4 0 ， 保持一段时间，可以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉，来 源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养 基和设备容器的灭菌。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增 加5 0 的保险系数。灭菌过程中，高温会使营养成分受到一 定程度破坏。灭菌活化能大大高于营养物质分解活化能，因此 应尽量减少灭菌时间和温度。从微生物死亡动力学方程可以看 出，随着温度的升高，微生物的死亡速率加快，而且比营养物 质分解速率快得多，因此高温短时灭菌可达到相同灭菌效果， 而营养物质破坏大大减少。这就是高温短时灭菌的理论基础。 井冈霉素发酵工艺中蒸汽灭菌温度采用121 ，维持3 0m i n 。 1 2 5 发酵 这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始 前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。井冈霉素接种量 博十学位论文 一般为5 ，发酵周期为4 0h 。在整个过程中，需要不断地通入无菌空 气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一定时间取样进行生化分析和 无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。在发酵过 程中往往要加入消泡剂控制泡沫，并加入酸碱控制发酵液的p h 。发酵 中可供分析的参数主要有菌丝的浓度和形态、残糖含量、氨基氮、溶解 氧浓度、p h 和抗生素含量。发酵过程中主要控制罐内温度、通气量、 搅拌转速以及添加酸、碱、消泡剂。每种抗生素发酵都有它自己的控制 点和最合适的参数进行控制。影响发酵的因素是错综复杂的，各种因素 相互影响，相互制约。因此抗生素发酵要得到预期