（发育生物学专业论文）泛素蛋白酶体途径参与小鼠spen家族mint蛋白的转录调控作用的研究.pdf

y8 8 7 1 3 l 羲麓麓舞赣 秉承学校严谨的学风与优良的科学道嚣，本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽捷所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本人或伯人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所徽的任何贡献均己在论文中作了明确韵说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若肓不宴之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：瘦丝日期：兰堡垒二12 纛慧囊产蓑声囊 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校 攻读学位期阔论文i 作蚂知识产权单位羁第四军医大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文i 作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学 较可以公布论文鹊全部或部分内容( 舍电子蕊，保密内容除外) ，可以采 用影印，缩印或其他复嗣手段保存论文。学校有权允许论文被查丽和借闻， 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 鼷露 论文作者签名：i 釜! i ! 垒辇 导霄签名：鳖鎏 日期：! 竺生! 兰! 第四军医大掌博士掌位论文 缩略语表 缩略语英文全称中文全称 a i d h a a - c i 乇_ y b pl a 1 p h aa c 叫s l a l l i n - b i n d i n gp m t e i nl qa 一晶状体蛋白结合蛋向l c b f ql c o r e b i n d i n gf k t o ra l p h a1核心结合因子a l p h al c o 。i p c o - i m m u n o p f e c i p i t a _ c i o n免疫共沉淀 d n v 1d a f 1 2i m e r a c t i n gp r o t e i n d a f - 1 2 相互作用蛋白 d m e m d u i b e c c o sm o d i 行e de a g l em e d i u m d m e m 培养基 d m s o d j m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 e b n a 2 e p s t e i 卜b a r rv i r u sn u c i e a r 龃t i g e n2 e b 病毒核心抗原2 g s tg i u t a t h i o n es - t 阻f l s f c r a s e 谷胱甘肽巯基转移酶 h d a ch l s t o n ed e a c e _ 【y l 私e 组蛋白去乙酰化酶 i p t g i s 叩m p y l - t l l i b - g a l a c t o s i d e异丙基硫代- b - d 半乳糖苷 m s x 2 i f l t e r a c t i “gn u c l e a rt a r g e t m i n t m s x 2 相互作用的核靶蛋白 p m c e i n m s x 2m s hh o m e ob o xh o m o l o g2 m s hh o m o 同源盒蛋白2 n l c dn o t c hi n t i 翟c e l l u l a rd o m a i n n o c c h 受体胞内段的区域 o co s t e o c a l c i n 骨钙素 f b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 成纤维生长因子驱动o c 基 o c f r e r e s p o n s i v ee l e r n e n to f o cg e n e 因的反应元件 o d o p t i c a jd 朝s i l y光密度 0 n p g o - n i t m p h e n y 峥d 到a c t o p y r a n o s i d e硝基苯- b - d - 半乳塘苷 r e c o m b n a l 0 ns i g i l a i b i n d i n g r b p j 重组信号结合蛋白- j k 叩p a p r o t e i n - jk a p p a r u n x 2 r u n t _ r e l a t e dn 町l s c r i p t i o nf h c t o r2 r m n t 相关转录因子2 r i 州 i a ”c o 鲥n o nm o t i fr n a 识别基序 s m a du b i q u i t i n a t i o n 佗g u i a t o r yf h “o r s m u r f l s m a d 泛素化调节因子l l u p s u b i q u i t i np r o t e 船o m es y s t e m 泛素蛋白酶体系统 第四牢匮大掌博士掌位论文 泛素一蛋白酶途径参与小鼠s p e n 家族m i n t 蛋白的转录调控作用的研究 博士研究生：李军锋 导师：韩骅教授 第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室 西安7 1 0 0 3 2 摘要 泛素- 蛋白酶体途径被认为是在哺乳动物细胞中选择性的降解 短寿命蛋白的主要系统。受调节蛋白主要与细胞周期进程、应激 反应、抗原呈递、信号传导、转录调控、d n a 损伤修复、凋亡、 细胞器官的生物发生有关。泛素化是一系列酶级联传递泛素的结 果。具体过程为，泛素激活酶e 1 催化泛素与底物蛋白结合，即 以a t p 依赖的方式通过硫醇酯键将泛素的c 端硫醇基与自身的半 胱氨酸结合，然后将活化的泛素传递给泛素结合酶e 2 ：泛素连接 酶e 3 将结合着泛素的泛素结合酶和底物蛋白连接，从而促进泛素 的羧基末端的甘氨酸与底物蛋白内部的赖氨酸e 的氨基之间形成 异肽键，泛素与蛋白结合i 部分底物蛋白尚需要多聚泛素化聚集 因子e 4 参与多聚泛素链的形成。之后，泛素多聚链的蛋白分子被 2 6 s 蛋白酶复合体识别和降解，泛素c 末端水解酶或者异肽酶酶 解释放泛素分子。 u b c h 8 是人的泛素结合酶基因u b e 2 l 6 编码的蛋白，属于主 要包含u b c 结构域的第一类泛索结合酶家族( c l a s sie 2 s ) 成员。第 一类泛素结合酶家族分子不能将泛素分子直接传递给底物蛋白， 提示这类e 2 需要借助泛索连接酶e 3 进行底物蛋白的识别。研究 表明：u b c h 8 可以与r j n g 矗n g e r 或者b rm o t i f _ c o n t a i n i n gd o m a i n ( i nb e t w e e nr i n gf i n g e r s ) 以及h e c t 6 】等结构域的蛋白发生相互 4 第四翠巨大掌博士掌位 e ? ，： 作用。该酶已被证明可以在e 6 e 6 a p 促进p 5 3 的泛素化中起作用。 另外u b c h 8 作为泛素连接酶还可以促进一种泛素样分子i s g l 5 的 传递。 核基质蛋白m i n t ( m s x 2 一i n t e t a c t i n gn u c i e a rt a r g c tp r o t e i n ) 是 1 9 9 9 年n e w b e r r y 等在研究与同源盒转录抑制因子m s x 2 相互作用 的蛋白时，发现的一个与m s x 2 共同参与颅面骨与神经的发育的新 的脚手架蛋白。与此同时，日本京都大学的t h o n j o 研究组在利用 酵母双杂交系统筛选可以与r b p j 相互作用的新蛋白时，也筛选 到了m i n t 分子( 未报道) 。m i n t 的转录物广泛分布于各个组织。 近年来的对m i n t 功能上的研究主要集中于：神经发育、软骨和 成骨，淋巴系统发育上。 m i n t 属于s p 吼蛋自家族。s p e n 蛋白家族成员具有的共同 特点是：含有多个r n a 识别基序( r n a r e c o 朗i t i o nm o t i f r r m ) 和一个保守的c 端的s p o c 结构域【。s p o c 结构域可以募集共抑 制复合物s m r l y n c o r 从而发挥转录抑制作用。m i n t 可在许多 不同的信号途径中调节关键的转录效应分子表达。k l l m d a 等和 o s 、v a l d 等发现m i n t 与n o t c h 信号途径的关键性转录因子r b p - j 相互作用，并可能通过与n o t c h 受体胞浆区竞争结合r b p i j 结合 位点从而抑制n o t c h 信号途径。t 0 w l e r 等研究认为：m i n t 具有 增强r u n x 2 募集于成纤维生长因子反应元件( o c f r e ) 的活性。最 近我们研究组的研究表明：m i n t 也可以参与aa 晶状体球蛋白结 合蛋白l 介导的c o l 2 a 1 基因的转录抑制。 m i n t 在人类中的同源物s h a r p 是以h d a c 共抑制复合物的 新组份的形式发现的。进一步的研究发现，h d a c 的抑制剂t s a 可以抑制m i n t s h a r p 所介导的转录抑制作用，这些说明 m i n t s h a r p 的转录抑制作用是h d a c 依赖性的。t o w l e r 等研究 表明m i n t 可以作为作为核基质的平台组织和整合骨钙素基因 第四军匿大攀博士掌位论文 的转录反应；最近，f r a n zo s w a l d 等研究s h a r p m i n t 的转录机 制时发现：一个包括c p c t b p 的抑制复合体可以促进 r b p j s h a r p 介导的n o t c h 靶基因的转录抑制。总之，m i n t 可 以通过蛋白蛋白相互作用，募集h d a c 或者c t i p 和c t b p 等方式 调节许多包括m s x 2 ，r b p - j ，核受体，a l p h a a - c r y b p l 等转录因 子介导的转录；另外在核基质中，m i n t 可以作为脚手架蛋白的平 台组织和整合多个调控信号。m i n t 作为位于细胞核内的大分子脚 手架蛋白。广泛分布于各个组织，其功能是复杂的，转录调控的 机制也是多样的。对这两方面的研究还存在许多空白点。 为了进一步深刻理解a 踟的功能和介导转录调控的机制， 我们首先使用了酵母双杂交的方法，对m i n t 蛋白进行了相关蛋 白的筛选。其中在对其c 末端区域的筛选中，使用人的淋巴结的 c d n a 文库我们筛选到了一个编码人泛素结合酶u b c h 8 的 u b e 2 l 6 基因。进而使用不同的m i n t 的截短体，利用酵母双杂交 的方法再次对m i n t 与u b c h 8 相互作用的区域进行了初步定位。 结果发现m i n t 的s p o c 结构域介导它与u b c h 8 之间的相互作用， 该区域已经被认为是介导m i n t 与其他分子相互作用的界面。之 后，我们又使用了一系列的生物化学的方法( g s t p m l d 倒ma s s a y 、 哺乳动物细胞内双杂交及免疫共沉淀实验) 对m i n t 与u b c h 8 之 间的体外和体内相互作用进行了深入验证，确证它们之间存在物 理上的相互作用。最后：利用报告基因实验证实m i n t 与u b c h 8 之间相互作用的生理意义。结果显示：m i n t 抑制r b p - j 介导的转 录对于泛素蛋白酶体途径的抑制剂m g l 3 2 是敏感的。低剂量的 m r n t 可以抑制n o t c h 受体胞内段( n o t c h 矾r a c e l l u l a rd o m a i n ， n i c d ) 激活n o t c h 信号途径的关键转录因子r b p j 调控的报告基 因的活性，并且u b c h 8 可以增强m i n t 发挥转录抑制。因此我们 初步得出结论：m i n t 介导的转录调控可以至少部分依赖于u b c h 8 6 第四军匮大掌博士掌位论文 所在的泛素蛋自酶体途径( u b i q u i t i np r o t e a s o m es y s t e m ，u p s ) 的调 节。 此外，在确定u p s 调节m i n t 调控的底物蛋白时，我们使用 不同于n i c d 的激活物：e b n a 2 和v p l 6 激活的r b p j 调节的报 告基因系统。结果发现：加入u b c h 8 后，并不能增强m i n t 抑制 e b n a 2 和v p l 6 激活的r b p - j 介导的转录活性，所以排除了r b p j 是u b c h 8 和m i n t 介导的泛素化底物。新的底物蛋白的筛选是先 理论假设某底物蛋白可以被u p s 泛素化后而被降解，并且该底物 蛋白与m i n t 和u b c h 8 关联。在m i n t 相关的n o t c h 信号途径中， n i c d 分子可以被泛素化，并可通过u p s 降解【2 0 。那么m i n t 能 否与n i c d 相互作用，并将泛素分子传递给n i c d ? 我们首先使用 酵母双杂交来验证上述假设的理论。通过酵母双杂交，我们初步 得出：m i n t 的_ n 末端可以与n i c d 相互作用，符合了理论假设 的前提条件。然而m i n t 是否在与u b c h 8 的相互作用中扮演泛素 连接酶的作用向底物传递泛素分子? 或者两者之间的相互作用可 以介导m i n t 的泛素化修饰，或者m i n t 是以e 2 e 3 泛素化复合 体的形式扮演脚手架的结构平台作用? 其底物蛋白是什么? n i c d ? 与m i n t 相关的已经被证明可以被泛素化的r u n x 2 7 亦或 是其他蛋白呢? 这些问题仍需要进一步的深入研究。总之，本文 提供的结果可能提示一种新的m i n t 介导的调控机制，这种新的 调控机制有助于全面理解m i n t 蛋白的功能。 关键词：m i n t ，转录，u b c h 8 ，s p o c 结构域，泛素，n o t c h 受体 胞内段的区域 7 第四军医大掌博士掌位论文 u b i q u i t i np r o t e a s o m ep a t h w a yp a r t i c i p a t ei n s p e nh o m o l o g m i n l l - m e d i a t e dt r a n s c r i p t i o n r e g u l a t i o n c a n d 试a t ef o rd o c t o r ：l ij u n f c n g s u p e i s o r ：h a l lh u a d e p a n i n e n to fm e d i c a ig e n e t i c sa n dd e v e l o p m e m a ib i o l o g y ， f o u 曲m d 岫i ym e d i c a lu n i v e r s i 吼 a 1 17 1 0 0 3 2 c 1 1 i ：【1 a a b s t r a c t i nm a m m a l i a nc e l l s ，t l l eu b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a yi st h e p r i n c i p a is y s t e m m a tm e d i a t e s s e l e c t i v e i y t h e d e g r a d a t i o n o f s h o r t l i v e dp r o t e i n sr e l a t e dt os u c hc e u u l a ra c t h 试e sa sc e l lc y c l e p r o 掣e s s i o n ， t 1 1 e r e s p o n s e t os t r e s s ，a n t i g e n p r o c e s s i n g ， s i g n a l t r a l l s d u c t i o n ，仃a i l s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ，d n ar 印a i r ，印o p t o s i s ，a n d o r g a n e l l eb i o g e n e s i s ，u b i q u i t y l a t i o no c c u r sa sar e s u l to f t h es e q u e n t i a l a c t i o no ff o u rc l a s s e so fe n z y m e s ，e 1o ru b i q u i t i na c t i v a t i n ge m 可m e ， e 2o ru b i q u i t i nc o n j u g a t i n ge 1 1 z y m e ，e 3o ru b i q u i t i np r o t e i nl i g a s ea n d e 4o ru b i q u i t i nc h a i na s s e m b l yf k t o lel ，t h ef i r s te 1 1 z y m ei nt h e u b i q u i t y l a t i o np 砒州a y ，f o m sa t h i o l e g t e rb o n db e t w e e ni t sa c t i v es i t e c y s t e i n ea f l dt h ec a r b o x y l - t e 吼i n a lg l y c i n co fu b i q u i t i n 1 1 1 ea c t i v a t e d u b i q u i t i no ne 1i ss u b s e q u e n t l yt m n s f b 玎e dt ot h ea c t i v es i t ec y s t e i n e o fa t le 2b yt r a n s e s t e r i f i c a t i o n e 3b i n d su b i q u i t i n c h a f g e de 2a n d s u b s t r a t ea 1 1 df a c i l i t a t e sf 0 h n a t i o no f a ni s o p e p t i d el i n k a g eb e t w e e nm e c a r b o x y l t e r i i l i n a lg l y c i n eo fu b i q u i t i na n dt t l c a m i n og r o u po fa n i n t e m a i i y s i n er e s i d u e 0 nt h cs u b s t r a t e ，o ra nu b i q u i t i na i r e a d y a t t a c h e dt om ep r o t e i n ，u b i q u i t i nc h a i na s s e m b l yf a c t o ro re 4i s 第四军匪大掌博士掌位论，： i n v o l v e di nm u l t i u b i q u i t i nc h a i na s s e m b l yi ns e v e r a is u b s t r a t ep r o t e i n s p r o t e i n sl i g a t e dt op o l y u b i q u i t i nc h a i n sa r er e c o g n a i z e da n dd e g r a d e d b yt h e2 6 sp r o t e a s o m ec o m p l e xa n df k eu b i q u i t i ni sr e l e a s e db yt h e a c t i o no fu b i q u i t i n - c t e r n l i n a lh y d r o l a s e so ri s o p e t i d a s e s u b c h 8i se n c o d e db yt h eh u m a nu b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e g e n eu b e 2 l 6a n db e l o n g s t oc l a s s1e 2 st h a tc o n s i s ia l m o s t e x c i u s i v e i vo ft h ec o n s e r v e du b cd o m a i n c l a s sie 2 sa r e 吼a b l et o t r a l l s f e ru b i q u i t i nt op r o t e i ns u b s t r 丑t e s ，s u g g e s t i n gt h a tt h j sc l a s so fe 2 s m a yr e q u i r ee 3u b i q u i t mp r o t e i nl i g a s e sf o rs u b s t r a t er e c o g n i t i o n u b c h 8c a ni n t e r a c t 、v i t hr i n gf i n g e r i b rm o t i f - c o n t a j n i n gd o m a i n ( i n b e t w e e nr i n gf i n g e r s ) p r o t e i n sa n dh e c td o m a i np m t e i n s t h i se n z y m ei sd e m o n s t r a t e dt o c t i o ni nt h ee 6 ，e 6 a p - i n d u c e d u b i q u i t i n a t i o no fp 5 3w h e ni n t e r a c t sw i t ht 1 1 eh e c td o m a i n1 i g a s e e 6 ap - t h eu b c h 8u b i q u i t i ne 2e n z y m ei sa l s ot h ee 2e “可m ef o r i s g l 5 ，a i lu b i q u i t i n l i k ep r o t e i n t h en u c l e a rm a t r i x p r o t e i nm s x 2 - i n t e r a c t i n g n u c l e a r t a 昭e t p r o t e i n ( m i n t )i so r i g i n a l l y c l o n e db yn e w b e 吖g r o u pa sa n i n t e r a c t i n gp r o t e i no fm s x 2 ，ah o m e o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nr e p r c s s o r f u n c t i o n i n gi nt 1 1 e c r a n i o f k i a ls k e l e t a la 1 1 dn c u r a ld e v e l o p m e mi n 19 9 9 i ti sa l s oc l o n c d b yt h o n j og r o u pa sa na s s o c i a t e dm o l e c u l a ro f r b p j ，ak e yt r a n s c 衄i o nf a c t o rd o w n s t r e 锄o fn o t c hr e c e p t o r ( n o t r e p o n e d ) t h et r a n s c r i p t o fm i n ti s w i d e l ye x p r e s s e di nd i v e r s e t i s s u e s s t u d i e so nm i n th a v eb e e nf o c u s e do ni t s 劬c t i o n si nt h e d e v e 】o p m e n to f n e u r a l ，s k e j e t a 】c a n i l a g e ，a n dl y m p h o c ”e s m i n tb e i o n g st ot h es p e n ( s p l i te n d ) p r o t e i n i l yw h i c hp l a y s a ne s s e n t i a lr 0 1 ei nm u l t i p i ed e v e l o p m e n t a ie v e n t s s p e np r o t e i n sv a r y i naw i d er a n g ei ns i z e ( 9 0 一6 0 0k d ) b u ta r en e v e n h e l e s sc h a m c t e r i z e d 第四军医大掌博士掌位论文 b yac o n s e r v e dd o m a i ns t m c t u r e ，i n c l u d i n gt 1 1 r e er e p e a t e dr n a r e c o g n i t i o nm o t i f s ( r r m s ) n e a rt h en t e 咖i n u sa n dac o n s e r v e ds p o c ( s p e np a r a i o ga n do r t h o i o gc t c h n i n a id o m a i n ) d o m a i na t t h ec t e r m i n u s w h i c hm e d l a t e si n t e r a c t i o nw i t ht h es m r t ，n c o rc o r e p r e s s o r s m i n ti sa t r a n s c r i p t i o nf a c t o rt h a tr c g u l a t e st h ee x p f e s s i o no f k e y t r a n s c r i p t i o n a le 豌c t o r si nd i v e r s es 噜n a l i n gp a m w a y s k u r o d ae ta i a n do s w a l de ta ld 锄0 n m a t e d 也a tm 玳tc 唧e t e sw i t h 血e i n t r a c e l l u l a rr e 百o no fn o t c hf o rb i n d i n gt oad n ab i n d i n gp r o t e i n r b p ja 1 1 ds 印p r e s s e sm e 廿a i i s a c t i v a t i o na c t i v i t yo fn 0 t c hs i g i l a l i i l 晷 t o w l e re ta ld e m o n 啦a t e dm i n te n h a n c e sr u n x 2a c t i v a t i o no f m u l t i p r o t e i nc o r r l p l e x e sa s s e m b l e db yt 1 1 e 矧) r o b l a s t 孕o 、叭hf k t o r r e s p o n s i v ce l e m e n t ( 0 c f r e ) r e c e n t l y t h es t u d i e so fo l l rg r o u p s h o w e dm a tm i n ta i s oi n v o i v e di nc r y b p 卜m e d i a t e dc o j 2 a lg e n e r e p r e s s i o n t h eh u r n a i lh o m o l o go fm i n t s h a rp ，h a sb e e ni d e n t i n e da sa c o m p o r l e n t i n t r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s i o nc o m p l e x e sr e c n l i t e db y n u c l e a r r e c e p t o r s t h e m i n l y s h a r p - m e d i a t e d r c p r e s s i o n w a s s e n s i t i v et 0m eh d a ci n l l i b i t o rt s a a r l ds h a i 己pi san o v e l c o m p o n e n to ft l l e h d a cc o r e p f e s s o r c o 瑚l p l e x ， s u g g e s t i n g 山a t m i n t s h a r pr c p r e s s e st m s c r i p t i o ni na 1 1h d a c d e p e n d e n t 风h i o n k u r o d ae ta la n do s w a l de ta ld e m o n s t r a t c d 恤a tm i n ta l s oi n t e r a c t s w i t hr b p - j a 1 1 dr e p r e s s e s 也er b p j m e d i a t e dt m s a c t i v a t i o nb y c o m p e t i n g f o r t h e b i n d i n g s i c ea n db y r e c r u i t i n gc o - r e p r e s s o r s i n c l u d i n gs m r t ，n c o ra r l dh d a c ，a n dm a yt h u sr e g u i a t et h en o t c h s i g n a l i n gp a 也w a y r e c e n t l y f r a n z0 s w a l ds h o w e dt h a tac o r e p r e s s o r c o m p l e xc o n t a i n i n g c t i p c t b pf a c i l i t a t e sr b p - j s h a r p m e d i a t e d 1 0 第四军医大掌博士掌位论文 r c p r e s s i o no fn o t c ht a 唱e tg e n e s ，t b w l e re t a ld e m o n s t r a t e dm i n t m a ys e r v ea san u c l e a rm a t r i xp l a t f o m lm a to r g a n i z e sa n di n t e g r a t e s o s t e o g e n i ct r a n s c r i p t i o n a lr e s p o n s e s t of u r t h e ru n d e r s t a n dt h ef u n c t i o na n dm e c h a n i s mo fm e m i n t - m e d i a t e dt m s c r i p t i o nr e g u i a t i o n ，t h ey e a s t t w o h y b r i ds y s t e m w a se m p i o y e dt os c r e e np r o t c i n sm a ti n t e r a c tw i t ht t i ec - t e n n i n a i f r a g m e n to fm i n t if r o mac d n al i b r a r yo fh u m a n1 y m p hn o d e s ，a c d n ae n d i n g 吐佗 u b i q u i 血一c o 吗u g a t i n ge n z y m eu b c h 8w a s i d e n t m e d u s i n gd i 雎r e mt n m c a t e dv e r s i o n so fm i n t ，w es h o wt h a t t h es p o cd o m a i n w m c hh a sb e e nd e m o n s t r a t e dt om e d i a t e i m e r a c t i o n sb e t w e e nm n q ta n dap a r l e lo fo m e rm 0 1 e c u l e s ，m i g h tb e r e s p o n s i b l ef o ri m e r a c t i o nb e t w e e nm i n t a i l du b c h 8i n y e a s t ，a s c o n f i n n e db yt h ep g a l a c t o s i d a s e a s s a yt h ei n t e r a c t i o n b e t 、v e e n m i n ta 1 1 du b c h 8i nm a m m a 】i a nc e l l s 吼s 缸t h e rp r o v e db yas e 五e s o fb i o c h e m i c a la s s a y si n c l u d i n gm em 猢a l i a j lt v v o h y b r i d a s s a y ， g s tp u l l - d o 、v r la s s a y a n dc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y u s i n ga r e p o r t e rs y s t e m ，、v e f o u r l d 血a tm i n t m e d i a t e d t r a i l s c r i p t i o n s u p p r e s s i o nw a ss e n s i t i v et om g l3 2 ，a ni r m i b i t o ro ft l l ep r o t e a s o m e s y s t e m i nt 1 1 e p r c s e n c e o fi o wc o n c e n t r a t i o no fm i n t t h e t r a n s a c t i v a t i o no fr e p o r t e rg e n ed e p e n d e n to nr b p - jb yn i c d ( n o t c h i n t r a c e l l u l a rd o m a i n )w a ss l i 曲t l y s u p p r e s s e d 。 c o t r a l l s f e c t i o no f u b c h 8s i g n m c a n u ye n h a n c e d 也e 拄a n s c r i p t i o ns u p p r e s s i o na c t i v i t yo f m i n tt h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt r a t l s c r i p t i o ns u p p r e s s i o no fm i n t m i 曲tb e a tl e a s tp a n i a l l yd e p e n d e n to nt l l e u b i q u i t i n - p r o t e a s o m e s y s t e m 。 w h e n s e i e c t i n gt h es u b s t r a t ep m t e i n s ，、v eu s e de b n a 2a n dv p16 d i 玎e r c n tf r o mn i c dl ot r a l l s a c t i v a t e r e p o r c e rg e n ed 印e n d e n to n 第口军医大掌博士掌位论文 r b p jc o t r a n s f e c t i o no fu b c h 8c o u l d n te n h a n c et h et r a n s c r 工p t i o n s u p p r e s s i o na c t i v i t yo fm i n ts ow ee i i m i n a t et h ep o s s i b i i i t yt h a t u b c h 8a n dm m tc o u l dt r a n s f e ru b i q u i t i nt or b p - ja 1 1 dd e g r a d ei t t h r o u g hu b i q u i t j np r o t e a s o m es y s t e m( u p s ) ， s u b s t r a t ep r o t e i n s s e i e c t i o nf i r s t i yd e p e r l d so nt h ca s s u m p t i o nt h a ts u b s t r a t ep r o t e i n s 、v e r e u b i q u i t i n e db yu p sa i l da s s o c i a t e dw i c hm i n ta n du b c h 8 i nm i n t a s s o c i a t e dn o t c hs i g l l a l i n gp a t h w a y ，n i c dc a l lb eu b i q u i t i n e da n d d e g r a d e db yu p s c a nm i n ti n t e r a c tw i t ha n dt r a n s f c ru b i q u i t i nt o n i c d ? w eu s e dy e a s tt w oh y b r i dt ot e s tt h eh y p o t h e s i s t h er e s u l t s t h a ts h o w e dt h en t e n n i n a lo fm i n tc a l li n t e r a c t 、v i t hn i c da g r e e d w i t ht h ea s s 啪p t i o n h o w e v e r ，i tr e m a i n st ob ed e t e 朋b i n e dw h e t h e r m i n tc o u l dp l a yar o l e i nm e d i a t i n gm eu b i q u i t i nt r a n s f e rt h r o u g hi t s i m e r a c t i o nw i t hu b c h 8 ，o rm i si n t e r a c t i o nc o u l dm e d i a t eu b i q u i t i n m o d m c a t i o no fm i n t ，o rm t n tf i m c t i o n sa sas c a f r o l dp r o t e i nw i 也i n a ne 2 e 3u b i q u t y l a t i o nc o m p l e x m i c hp r o t e i ni st h es u b s t r a t e ? n i c d ? m i n t - a s s o i c a t e dp r o t e i nr u n x 2 ( w h i c hh a sb e e np r o v e dt ob e u b i q u i t i n e db yu b i q u i t i np r o t e a s o m es y s t e m ) ? s o m eo t h e rp m t e i n s ? t h er e s u l t sp r e