（微生物学专业论文）被孢霉不饱和酸gla高产菌株的研究.pdf

摘要 被孢霉是一种产多不饱和脂肪酸的真菌，由于多不饱和脂肪酸，在生物制药、 营养保健品、饲料等领域中的特殊作用，受到了广泛关注和应用。在动植物资源 缺乏的情况下，利用被孢霉生产多不饱和脂肪酸具有巨大的开发潜力。但目前， 由于被孢霉的目的产量不大，工业化生产应用成本太大。因此，有必要对该菌进 行诱变选育，筛选其多不饱和脂肪酸，特别是y 一亚麻酸产量高的菌株。 本文对被孢霉进行选育时，先用烟碱和紫外线对其孢子进行复合诱变，获诱 变株h 蝻，其菌体产量、油脂含量、g l a 含量分别比出发菌株提高了3 4 3 8 、 6 9 和2 0 8 3 0 ；然后通过孢子转化法，获得突变株m n - 7 0 ，它的菌体干重、油脂 含量和g i a 含量分别增加到了4 2 8g l 、3 2 1 3 和9 4 ；再通过原生质体的制 各，用亚硝酸和激光进行复合诱变。从菌株m 税- 7 0 中选育出一高产菌株m 心v o - 1 2 该高产菌株经碳饥饿和高碳培养等综合方法及遗传稳定性实验和酯酶同工酶检 验，证明它是一株稳定、有变异和高产的突变株。并经摇瓶培养，获得其菌体产 量、油脂含量和g l a 含量分别是出发菌株眦的1 9 8 6 、1 5 0 2 和2 6 0 4 。 同时，对该高产菌株影响菌体和油脂产量的培养基成分进行优化；通过单因 素实验，获得如接种量、温度、p h 值等对菌体的生物量、油脂产量和成分有较 大的影响的最优产脂条件。具体如下：葡萄糖1 2 0 9 l ，尿素5 9 几，( n 也) ：s 0 , 2 g l ，k h 一0 , 3g l ，s o , 7 1 t , 0 0 5g l ，柠檬酸钠1g l ，酵母膏0 5g u ， 蛋白胨0 3g l ，微量元素液1 l l ，定容至1 0 0 0 m l , p h ( 5 0 - 6 0 ) ；温度2 8 3 0 、接种重为5 - 1 0 等。 关键词；被孢霉 g l a 诱变剂孢子激光原生质体发酵 a b s tr a c t i nt h i sa r t i c l e ，s t r a i ns c r e e n i n g , s e l e c t i o no f p r i m a r ys c r e e n i n gm e t h o d s , o p t i m - i z a t i o no f f a t - p r o d u c i n gc o n d i t i o n sa n de n r i c h i n go f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sw e r c s t u d i e d m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n ai saf u n g io f p r o d u c i n gp o l y - u n s a t u r a t e df a t t ya c i d i t w a sn o 如e da n da p p l i e dw i d e l yb e c a u s eo f v a r i o u sa c t i o no fi t sp o l y - u n s a t u r a t e d f a t t ya c i di n p r o d u c i n g m e d i c a m e n t , n u t r i m e n t ，h e a l t h p r o d u c t sa n df o o d s t u f f o t a 1 i n d e f i c i e n c yb a d l yo f r e s o u r c eo f a n i m a l sa n dp l a n t s ，i tt a k eo ng r e a td e v e l o p m e n t p o t e n t i a l i t yb yp r o d u c i n ge f f e c t i v e l yp o l y - u n s a t u r a t o df a t t ya c i d b u ta tp r e s e n t , t h e n e e d f u lo u t p u to f t h em o r t i e r e l l ai sn o tq u a n t u ms u f f i c i e n ta n dt h ec o s to f p r o d u c t i o n i st o o e x p e n - s i r e s oi ti sn e c e s s a r y t ol u r ea n dc h a n g es e e ds e l e c t i o nt ot h i sf i 】丑g l 嗥 s g r c 。1 1i t so u t p u to f o i l ，e s p e c i a l l y 下l i n o l e n i ca c i ds t r a i nh i g l li no u t p u t i nt h ea r t i c l e , w h e nw em u t a n tt h em o r t i e r e l l ar a m a n n i a n a ，c o m p o u n dt om u t a n t t ot h ef u n g iw i t ht h en i c o t i n ea n du l t r a v i o l e tr a ya tf i r s t ；a n do b t a i n e dm f 2 ，i t sf u n g u s b o d yo u t p u t 。t h ec o n t e n to f l i p i da n dt h ec o n t e n to f g l a a r eh i g h e ra b o u t3 4 3 8 6 9 a n d2 0 8 3 t h a nt h eo r i e j n a ls t r a i nm 5 ；t h e n , d n at r a n s f o r mt h r o u g hi n t ot h e s p o r e ，a n do b t a i n e dm r s - 7 0 。i t sf u n g u sb e d yo u t p u t ，t h ec o n t e n to f 却i da n dt h ec o n t e n t o f g l a a r cr e s p e c t i v e l y 4 2 8g l ，3 2 1 3 和9 4 ：f i n a l l y , p a s s i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h ep r o t o p l a s t s ，c o m p o u n dt om u t a n tt h ep r o t o p l a s t sw i t hh n 0 2a n dl a s e r a m u t a t i o n s t r a i no f h i g hy i d dm f 2 - 7 0 q za p p e a r si nt h es e e ds e l e c t i o nf r o mt h eo d g m a ls t r a i n m f 2 7 0 t h i sf e r t i l es t r a i ni ss e l e c t e db y t h ec o m p r e h e n s i v em e t h o dt h a tt h el a c ko a g b o n a n dh i g hc a r b o nt r a i n se t c ，h e r e d i t a r ys t a b i l i t ye x p e r i m e n t , e s t e r a s ei s o e n z y m ee x a m - i n c m e n te t c t h er e s u l t ss h o wt h a tm m - 7 0 1 2i sam u t a t i o ns t r a i no f s t a b l e ，v a r i a n t , h e a v y p r o d u c i n g a n di ti st r a i n e di ns h a k i n gb o t c l e 。a n do b t a i n e di t sf u n g u sb e d yo u t p u t , t h e c o n t e n to f l i p i da n dt h ec o n t e n to f g l aa r er a i s i n gr e s p e c t i v e l yt o1 9 8 6 ，1 5 0 2 ， 2 6 0 4 b yt h eo r i g i n a ls t r a i nm 5 a tt h es a i l l et i m e ，o p t i m i z i n gt h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n o f t h i sf e r t i l es t r a i ni n i n f l u e n c et h ep r o d u c t i o no f f u n g u sb e d ya n dt h eo u t p u to f l i p i da n d p a s s i n g t h es i n g l e i l f a c t o re x p e r i m e n t ，t h er e s u l t ss h o w ：c u l t u r ec o m p o s i t i o n ，i n o c u l a t i n ga m o u n t ，t c m p - e r a t u r e ，p he t c h a v eg r e a ti n f l u e n c eo nt h ef u n g u sb e d yo u t p u t ，t h eo u t p u to f 岫i d a n dt h ec o m p o s i t i o no f 硅p i d a sf o l l o w s ：1 2 0 g l u c o s e 5 u r e a , ( n l - h ) 2 s 0 4 2g l ，k h z p 0 43 班，m g s 0 4 。7 h 2 00 5g l ，1 c i t r i ca c i d ，0 4 9 ly e a s tc r e a m o 3 9 lp c p t o n e , m i c r o e l e a n e n th p i dl m l , c o n s t a u tv o l u m et o1 0 0 0m l ，p h5 - 6 t e m p e r a t u r e2 8 - 3 0 i n o c u l 曲i l i 毋a m o u n t5 - 1 0 k e y w o r d s ：m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n a , g l a , m u t a g e n , s p o m , l a s e r , p r o t o p l a s t ， f e r m e n t a t i o n h i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印催和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：盈主童指导数师签名： 3 - 里多 w 影年月t 蛔彬年z 月t 媚 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行韵研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明羌表示谢意。 学位论文作者签名：劲5 也孔 拟年月s 咱 1 前言 篡一， l 单不饱 。母 油妇 在般的天然植物油料中是不存在的，这些物质与人体的健康有密切关系。研究 表明，p u y a s 是所有细胞膜的重要成分，对机体的激素代谢和许多酶的活性起着 调控功能，一旦缺乏将会引起机体生理失调而导致多种疾病；目前，n - 3 p u f a s 主要来自鱼油等，它主要包括a 亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。 n 6 p u f a s 主要来自玉米油等，包括贬油酸。微生物油脂在日本、英国等发达国 家早在八十年代中期就开始了工业化生产，并将发酵生产的g l a 等产品打入市 场m ，其发展前景非常大。但在我国还没有形成工业化大规模生产，对此，我国 许多科学工作者正在努力探索m 们。 y - 亚麻酸是多不饱和脂肪酸中一种具有多种重要生理功能的多烯不饱和脂 肪酸。是人体必需从外界摄取的不饱和脂肪酸之一。g l a 因其极其重要的生物活 性及其在营养和医疗等方面的应用价值，而成为油脂研究中的一个热点。 1 2g l a 的结构及理化性质 1 9 1 9 年h e i d u s h k aa n dl u f t n 1 从月见草的种籽油中发现了一种新的不饱和 脂肪酸，是吐一亚麻酸的圊分异构体，于是把它命名为y 一亚麻酸1 9 2 7 年 e l b n e r 等【1 2 ) 利用臭氧降解反应测定其结构为6 ，9 ，1 2 - - 十八碳烯酸。1 9 4 9 年 r i l e y 1 习进一步证实其结构为全顺式一6 ，9 ，1 2 一十八碳烯酸( 缩写为1 8 ：3 6 ) ，分子式为g 出。如，其分予结构为； p 、八c oo h = = g l a 为无色或淡黄色液体，不溶予水和乙醇，而易溶于乙醚、三氯乙烷、石油醚 等非极性有机溶剂中。其紫外特征波长为2 1 0 n m 。由于其高度不饱和性质使它在 空气中不稳定，尤其在高温下易发生氧化反应，在碱性条件下易发生双键位置及 构型异构反应，形成共轭多烯酸1 4 1 豇。 1 3g l a 的生理功能 g l a 是人体一种必需不饱和脂肪酸。近年来研究表明：g i a 和n - 6 p u f a s 共 用相同的去饱和酶和延长酶；g l a 对该类酶具有更强的亲和力，因此可以竞争 性地抑f l j n - 6 p u f a 的转化，降低a a 及a a 下游产物类花生酸类物质衄c 孤o i 2 的合成，产生抗炎和抗肿瘤作用。研究表明，g l a 可能通过多种途径抑制肿瘤 细胞的生长和转移；包括抑制环氧化酶2 ( c y l c o o x y g e n a s e - 2 ，c o x - 2 ) 、抑制脂氧 x 比酶( l i p o x y g e n a s e ，l o x ) ，增强脂质过氧化反应，干预b c l - 2 基因家族，r a s 基因 家族和a p 1 基因家族等基因的表达，抗肿瘤新生血管，影响蛋白激酶和蛋白磷 酸酶的表达，改变细胞周期调控系统和影响机体免疫功能等【1 们。 临床已将p u f a s 应用与心血管疾病、炎症、癌症及糖尿病等多种疾病的治 疗；由于它具有清除t l 由基、抗氧化及减肥的功能，在保健食品及面容化妆品领 域深受人们的青睐。还在促进大脑发育、维持正常的视觉功能、调理免疫系统影 响人的行为等方面具有其他功能因子不可比拟的功效口1 2 6 1 。具体表现为： 1 3 1 影噙类廿碳烷化舍物合成 细胞中g l a 经环( 加) 氧酶和脂( 肪) 氧化酶途径代谢生成类廿碳烷酸化合物， 如前列腺素( p g s ) 、白三烯( l t s ) 和血栓素( t x s ) 等，从而导致：t x a 2 的生成 减少( t ) 【a 。是一种有效的血小板凝集剂和血管收缩和) ：减少l t 8 。的合成( l t b 是一种炎症诱导物，并对血小板趋化和粘附有强的诱导力) ： 增加t x & 的形成 ( t x a | 是一种弱的血少板凝集剂和弱的血管收缩剂) 【2 ”o 】。 1 3 2g t a 在细胞膜中的作用 g l h 是细胞膜磷脂的重要成分，细胞膜磷脂成分是决定细胞膜功能的熏要因 素膜脂质成分的改交可影响膜流动性和某些酶活性以及激素与受体的结合和信 号的传递研究表明，g l a 可促进细胞膜的流动和组装，在细胞分裂期间需要一 定量的g l 支持线粒体膜的组装和复制。另外，脑和视网膜的功能发育也需要一 定量的g i a 3 1 。3 4 1 。 1 3 3f i l a 对基因表达的调控 g l a 可直接控制细胞核的活动，以调控某些基因的转录 2 9 1 。如g l a 对肝脏脂 肪酸生成的抑制作用是通过抑制肝脏脂肪酸生成和糖酵解基因实现的。另外g l 矗 因阻止s c d - - 1m r n ai 拘表达t 3 2 , 3 4 j ，从而可选择性地抑制由胰岛素和果糖单独诱导 的糖尿病小肝硬脂酰c o a 脱饱和酶- 1 ( s c d - i ) 基因的表达。实验证明，不同p u f a 对与生长有关的早期基因表达和细胞生长的影响不同阁。 1 3 4g l a 在防止心血管疾病中的作用 g l a 防止心血管病的作用是多方面的。游离形式的g l a 的直接和特异性电 生理效应阻断快电压依赖性钠离子通道，能使心肌细胞导电性更加稳定。同时， g l a 能显著地降低甘油三脂和极低密度脂蛋白帼固醇( v l d l - c ) 水平，而增 加低密度脂蛋白胆固醇( l d l - c ) 水平。此外，g l a 影响动脉硬化和炎症，是 因为其具有激活内皮细胞和细胞因子的功能g l a 具有明显提高高密度脂蛋白 ( 皿l ) ，降低机体总胆固醇( t c ) 的作用0 3 。临床结果表明对甘油三脂，胆固醇， b 一脂蛋白下降总效率分别是8 1 5 ，6 8 2 ，6 4 8 9 6 。其机理【2 1 五6 1 ：( 1 ) 作为 前列腺索一级( p g e ，) 前体而发挥降低t c 作用；( 2 ) 增大t c 极性，水溶性，易 被酸解；( 3 ) 可清除血液中甘油三脂，降低内源性t c 合成。血栓素a ：( t x a 2 ) 是内源性最强烈的血小板聚集剂和血管收缩剂而前列腺素( p g i ：) 为最强烈血 管扩张剂正常机体两者保持平衡，以维持血小板生理功能。一旦t x a ：合成增 多，p g i ，生成减少，则增加血小板聚集作用，引起血栓。g i a 抗血拴的血管机理 闭：( 1 ) g l a 作为p g e 。前体抑制血小板聚集；( 2 ) g l a 转化成d h y 亚麻酸抑制 血小板t x a , 合成酶活性。 1 3 5 抗癌活性 1 9 9 0 年h a y a s h i 等口刀利用a h - 1 0 9 鼠肝癌细胞发现g l a 的抗癌活性以及在体外 g l 对血清白蛋白的抗癌作用。马润娣等【2 9 1 报导，c , l a 对人癌细胞c e l l 2 0 ，3 0 k i ) 蛋白质合成的抑制效果及对脂质过氧化的增强作用后又发现 1 7 , 1 9 , 2 , 2 , 3 0 , 3 2 1 在体外 g l a 抑制人神经母细胞瘤细胞( n e u r o b l a s t o m ac e ll s ，g o t o ) 的生长，诱导其表性发 生逆转，抑制人结肠癌( c o l o nc a r c i n o m a ，c o l o3 2 0 d m ) ，人胃( g a s t r i c c a n c e r ， h g c - 2 ) 和人胰癌( p a n c r e a t i cc a n c e r ，p a n c - 1 ) 细胞d n a 的合成，但却不抑制1 2 - 0 - 十四酰佛波- 1 3 - 乙酸酯( t p a ) 增强细胞对己糖的摄入和3 h 渗入细胞磷脂的作用在 体内g l 抑制二甲基苯并蒽( n m b a ) 激发的，t p a 促进的小鼠乳头状瘤的发生。 另外g l a 还对予免疫系统【2 0 3 1 1 ，神经系统和大脑正常工作亦有重要作用。 1 3 6g l a 在生长发育中的作用 除g l a 能增加与生长有关的早期反应基因c - l o s t 和e g r e - i 的表达，从而诱 导细胞生长外，还能诱导p g 2 系列调节下丘脑功能 3 8 - , 4 2 ，其途径如下：刺激垂 4 体释放生长激素；促进下丘脑释放生长激素释放因子；调节垂体促肾上腺皮 质激素的释放；提高甲状腺组织对促甲状腺激素的反应：促进下丘脑催乳素 的释放 刺激下丘脑释放抗利尿激素( a d h 和a v p ) ，并调节其外周功能；刺 激促性腺激素的释放等。 i 3 7 抗脂质过氧化眦“1 g l a 是一种天然抗氧化剂，在体内首先被氧化，从而减轻机体内细胞膜脂质 过氧化损害。于庆海嗍等研究结果表嘎，其氧化作用可能是对抗或清除自由基 来完成。g l a 由于其重要的生理生化功能，在人体皮肤的营养，健美，保护及疗效 方面，可以起重要作用g l a 也属维生素f 样物质，外用是优秀的调理剂和营养补 充剂，能增强血液流通和细胞的新陈代谢冈。能显著抑制各种抗炎剂引起的毛细 血管遥透性增高，水肿和炎症增殖期的肉芽组织增生，痤疮及皮肤病，具有较好的 疗效【5 1 皿】。 1 3 8 减肥作用帆删 在正常饮食情况下，g l a 可降低肥胖患者体重2 8 k g 【4 9 1 ( 半年内) 。其机理 是；g l a 可刺激棕色脂肪组织，促进该组织线粒体酶活性，消耗体内过多热量， 达到治疗肥胖症目的。 1 3 9 用于营养和食品 一些公司已开发了一系列含g l a 的营养调节剂和特种食品。如日本光化学公 司于1 9 8 8 年起，陆续向市场推出了含g l a 的糖果、饮料、巧克力：瑞典的 k a b i v i t r u nab ，瑞士的n e s t l e ，s a ，法国的r o u s - s e l v o l a f s a 推出专供婴 幼儿及老年人和恢复期病人使用的g l a 营养滋补品、乳品群嗣。因g l a 为大脑和 视网膜的正常功能和生长发育所必需j 并与许多先天性、遗传性、代谢性疾病以 及行为紊乱性疾病有着密切的关系，有利于视觉敏锐度和中枢系统发育的改善 5 3 j 。因为婴几体内的酶系统尚未发育完全、而老年人的8 去饱和酶活力下降， 都会发生亚油酸的转化障碍，因而需要直接吸取g l a 来保证前列腺索p g 一级的 合成。 1 3 1 0 其他 g l a 还能抗h i v 感染、治疗经期综合症等妇科疾病、精神分裂症、风湿性关 节炎等炎症、特征性湿疹、抗衰老、哮喘、过敏、及抗菌作用、增强胰岛素和免 疫功能、抑制血小板聚集、血栓索a ：合成、溃疡和胃出血等作用a 多不饱和酸影响动植物的许多细胞和生理生化过程，包括对低温的适应、离 子通道的调节( 细胞) 内吞作用、病原微生物的抵御、植物叶绿体的形成及细胞 膜相关的酶的活性调节。同时还与动物的产子率、成活率、动物介导过敏及动物 细胞所含的营养成分等有关 1 4g l a 的来源 g l a 主要来自植物、藻类和微生物。植物资源中主要分布于高等植物柳叶菜 科( 0 n a g r a c e a e ) 、紫草科( b o r a g i n a c e a e ) 、玄参科( s c c r o p h u i a r i a c e a e ) 虎 耳草科( s a x i f r a g a c e a e ) 等： j a m e scp h i l l i p s ，y u n g - s h e n gh u a n g n a t u r a l s o u r c e sa n db i o s y n t h e s i so f l i n o l e n i oa c i d ；a no v e r v i e w ( a ) t h eu n i t e d s t a t e so fa m e r i c a ：h o c sp r e s s ，1 9 9 5 ，1 - 6 首先从柳时菜科中的月见草中发现， 月见草自然成为一种天然的g l a 资源【3 。月见草( o e n o t h e r a 出e n 口i ) 又称夜 来香( e v e n i n gp r i m o s e ) 。原产北美洲，为当地印第安人采集药用。1 7 世纪初移 植于歇洲，后传至世晃各地。月见草种籽又称山芝麻( w i l ds e s a m es e e d s ) ，含 油2 0 - - 2 5 ，油脂中含有7 0 - - 8 0 的亚油酸，7 一1 0 的g l 8 j 9 1 。我国月见草 主要分布于东北南部及东部山区的f 句阳山坡，荒地，河岸等地。g l a 还存在于其 它某些含浊的植物种籽中，如1 9 8 3 年w o l f 等 6 0 l 报导紫草科( b o r a a g i n c e a s e ) 中 n o n n e am a c r o s p e r m a 的种籽含有5 1 的g i a 。w h i s k e y 等【6 l 】发现玻璃苣( b o r a g e o f f i c i n a l i s v l ) 的种籽含有2 1 - 2 5 的g l a 。t r a i f e r 等 6 2 1 在黑加仑( b l a c kc 物e n t ) 的种籽中发现有较大量的g l a ( 含量1 5 - 2 0 ) 。黑穗醋栗( r i b e n l g r a m ) 种籽含浊 3 0 ，其中g l a 含量1 7 。我国特产的华山松( p i n u sa r m a n d if r a n c h ) 种子含 油量为5 1 2 ，g l a 含量为3 7 9 3 。另外，糙草、微孔草、红加仑等的种籽也含 有较丰富的g l a l 删。 蓝丝藻( s p i r u l i n ap a t e n s i s ) 【镧及小球藻( c h l o r e l a s p ) 【“棚生产g l a 其含量可达脂肪酸的1 0 ；另外，紫球藻( p o r p h y r i d i u my e z o e n s i s ) 、三角褐 脂藻( p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ) 、钝顶螺旋藻( e n g l e n ag r a c i l i s ) 、异形 鱼腥藻( a n a b o e n av a r i a b i l i s ) 、聚球藻( s y n e c h o c o c c u sp c c ) 、蒜头藻( m o n o d u s 6 s u b t e r r a n e u s ) 等等都能产生g l a 。y o n g m a m i t c h a i ! 删曾对各类微藻的脂质成份 进行了总结，绿藻可积累高水平的脂质成份，而且通常是g l a 的各种异构体。 g l a 的微生物资源主要是真菌，如少根根霉( r h i z o p u s 甜蝴j z 凶、小克银汉 霉( c u n n i n g h a m e l l ae c h i n u j a t e ) 、被孢霉( ? e o r t y e r e l a ) 、毛霉( m u c o r h i e m a l i s ) 、土曲霉( a s p e r i l l u st e r r e u s ) 、布拉克须霉( p h y c o m y c e s b l a k e e a n u s ) 、酵母菌等，人们作了大量的研究，并取得了一定成果。 1 5g l a 的生物合成与调控方法 在生产中，要高浓度地积累一种代谢产物，而这个浓度又常常超过细胞正 常生长和代谢所需的范围，提高生产效率，就必须打破微生物原有的代谢调控 系统。在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度地积累人们所冀 望的产物。为达到这一晷的：一是通过育种的方法，选育基因突变株，从根本 上改变微生物的代谢：二是控制微生物的培养条传，影响其代谢过程。一般， 真菌利用葡萄糖生物合成g l a 的发酵主要途径为： b l i p 乙畦 葡萄糖主i 零磷酸烯醇式丙酮酸c = 令丙酮酸c = 令7 酰c o a ：! 丙二酸单酰- a c p 毒 iiiip羧亿一 a 一亚麻酸 唏棕榈酸c = 硬脂酸c = 令油酸c = 亚油酸量参y 亚麻酸 l 6 - 脱氢酶 图2 丝状真菌利用葡萄糖生物合成r 一亚麻酸的代谢途径 f i g2 t h ep r o c e d u r eo fs y n t h e s i z i n gy l i n o l e n i ca c i du s i n g g l u c o s eb yt h ef u n g i 如果条件具备，y 一亚麻酸还可以继续反应，生成二高y 一皿麻酸( 8 ，1 1 ， 1 4 2 0 ：3 ) ，二高y 一亚麻酸再生成花生四烯酸( a a ) 和前列腺素；a 一亚麻酸则 可生成二十碳五烯酸( a s ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 - 2 0 ：5 ) 。从上面的反应链中可看出， 从葡萄糖开始至多不饱和脂肪酸y 一亚麻酸的合成，涉及多步酶促反应，经碳链 延长和脱饱和二个反应而来。它们分剐由相应的膜结合延长酶和脱饱和酶所催 化。链延长供体是丙二酸单酰c o a ，由乙酰c o a 羧化酶催化，该酶是第一个限速 7 酶有多个皿基组成的复合物，以生物索为辅基该酶结构中有多个活性位点， 如乙酰c o a 结合位点、生物素结合位点等，因此该酶能被乙酰c o a 、a t p 和生物 素所激活。a d p 是该酶a t p 的竞争性抑制剂，抗生物素蛋白可作用于生物素而抑 制该酶的活性，丙二酸单酰c o a 起反馈抑制作用。另外，丙酮酸盐对该酶有轻微 的激活作用。脱饱和体系有微粒体膜结合的细胞色素b 。、n a d h 一细胞色素b s 还原 酶和末端脱饱和酶组成所以，结合在此反应中的两个关键酶参与重要的催化反 应。 遵上所述，要达到目的产量。可从以下几个方面入手n 9 f l o ； ( 1 ) 强化能量代谢 提高菌体细胞内a t p 水平，有利于y 一亚麻酸的合成。如选育呼吸抑制剂( 丙 二酸，氰化钾，亚砷酸等) 抗性突变株、a d p 磷酸化抑制荆( 羟胺，2 ，4 一二硝 基酚等) 、抑制能量代谢抗生素( 寡霉素，缬氨霉索等) 抗性突变株。 ( 2 ) 改变分支代谢途径流向 如在赖氨酸的合成中，选育出解除了反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变 株，提高了赖氨酸的产量通过切断或减弱非g l a 生物合成的支路代谢，使更多 的磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰c o a 或亚油酸生成g l a 或e p a ，从而提高产量。据报 道，采用a 一亚麻酸缺陷株、e p a 缺陷突变株，均有助于提高g l a 或e p a 的产量， 花生四烯酸缺陷突变株有助于g l a 产量的提高。在y 一亚麻酸的生产中，可以朝 提高6 一脱氧酶活性、抑制a 一亚麻酸等的方向选育菌株。6 脱氢酶是微生物 合成g l a 的关键酶之一，其活性的高低直接与g l a 含景的高低密切相关，可采用 t t c 酶活测定法来反映6 _ 脱氢酶的活性，饿为一种无色的氧化还原剂，能被 6 一脱氢酶还原成红色的物质，红色越深，表明茁体内的6 脱氢酶活力越高， g l a 的积累越多 ( 3 ) 解除自身的反馈调节 如选育4 _ 氟代亚油酸抗性突变株，可以使被斑霉的花生四烯酸产量提高 0 6 5 倍。其次，选育耐高浓度的y 一亚麻酸的突变株，将有助于y 一亚麻酸产量 的提高。 ( 4 ) 增加前体物的合成 增强咖p 途径，n | ! i d p h 的数量增多，有利于不饱和脂肪酸产量的提高过量 3 的磷酸盐或通气不足会使e m p 途径增强。而产生n a d p h 的h m p 途径受阻碍，导致 不饱和脂肪酸的合成降低。通过选育对单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏 感突变株，均有利于加强h m p 途径，从而增加花生四烯酸及g l a 生物合成的前体 物，有助于目的产物的高产。 ( 5 ) 选育低温生长突变株 细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成，脂质分子中不 饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的流动性也就越大，即微生物生 长的温度也就越低。据报道嗍，选育在相对低温( 1 5 ) 条件下生长良好的突变 株，结果其g l a 的产量提高了1 4 倍。 ( 6 ) 选育耐高糖的突变株 在代谢调控发酵中，常采用耐高渗透压突变株g l a 发酵常与培养基中糖浓 度有密切关系。在一定范围内，g l a 的产量随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过 高就会抑制菌体生长，降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变株，可使 菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高g l a 的产量。 ( 7 ) 挑选脂肪粒大，密度高的突变株 对菌株镜检，可观察到菌株体内存在折光性很强的液滴一脂肪粒。用苏丹 m 对菌丝体染色，液滴呈红色。用苏丹黑对菌丝体染色，液滴呈深蓝色。挑选脂 肪粒大，密度高的突变株，有助于多不饱和脂肪酸产量的提高 ( 8 ) 加速限速反应 如将多拷贝的赖氨酸氨基转移酶( l a t ) 基因插入带小棒链霉菌 ( s t r e m p t o m y c e sc l a v u l i g e r u s ) 染色体中，使工程菌的b 一内酰胺抗生素的产 量提高了四倍把多拷贝的t c m 酰基载体蛋白基周转化到s s l a n c e s c e n s 中，使 重组菌的四塞诺霉素中间体的产量提高了2 0 - 3 0 倍。这样，有效地提高了目的产 量。 1 6g l a 的研究进展 在国外，1 9 8 5 年日本和英国开始利用微生物发酵法工业化生产g l a 油脂 o s a m as u z u k i 等p 1 1 对深黄被孢霉( m o r t i e r e l l al s a b e l l i n a ) ，葡酒色被孢霉 饵v i n a c e a ) - 拉曼被孢霉朋嬲加妇，国和矮被孢霉册棚) 进行了发酵培养， 9 菌体系数为2 0 4 0 9 ，油脂含量3 5 - 7 0 ，脂肪中g l a 含量3 - 1 1 9 6 。蓑岛良一等【7 2 】 用雅致小克银汉霉( c u n n i n g h a m e l l ae e g a n s ) 发酵生产g l a ，其含量可达1 8 左 右。a k i r a s e t o 7 3 1 则利用枝霉( t h a m n i d i u me l e g a n s ) 进行发酵，g l a 可达2 0 。 而这方面的研究仍在继续深入，s a j b i d o r 等肼】研究了不同碳源对于生长、油脂 量及油脂组成的影响；l i n d b e r g 和h a n s s o n u 5 j 6 】研究了m u c o r r o u x i ic b 瞰1 6 7 7 在油菜渣粉、糖蜜、甜菜渣等成本低廉的碳源、氮源的培养基上生产g i a 的实验， 油脂量达到2 8 9 l ，g l a 达到0 3 3 9 l ( i i 8 ) 。 在国内，目前有王卫卫等i 明以少根根霉r s # ( r h i z o p u sa r r h i z u s8 ) 为出发 菌株，采用h e n e 激光和化学诱变剂l i c i 对少根根霉r 8 = 孢子和原生质体进行 复合诱变，选育出高产菌株r c 3 7 8 ，摇瓶培养油脂含量4 7 8 、g i a 含量1 2 6 ， 比出发菌株油脂含量提高了1 3 0 8 、g l a 含量提高了2 7 6 7 。上海工业微生物 研究所u s 利用m 1 0 2 菌株进行5 0 0 升发酵生产g l a ，含量达到8 9 ，已完成中 试。张道海等【7 9 1 利用高山被孢霉( 彪a l p i n i ) 经钴6 0 、y 射线诱变得到其突变 株m a - 9 0 ，在最佳培养条件下g l a 的产量达到1 1 5 7 9 l 。黄建忠等【踟以深黄被 孢霉池i s a b e l l i n a ) a s 3 3 4 1 0 为出发菌株，经紫外线( u v ) 、硫酸二乙酸( d e s ) 和 亚硝酸胍( n t g ) 等复合诱变得到m 0 1 8 突变株，其6 0 l 罐发酵生物量达到3 7 8g l ，g l a 含量7 2 。扬革等1 8 1 】人以拉曼被孢霉( m o r t e r e l l ar a m a n n i a a ) 经 u v 、l i c ! 处理得到突变株s m 5 4 1 9 ，其生物量、油脂含量和从得率较亲本有较 大提高，分别达到2 8 8g l 、1 5 7g l 和0 6 2 3g l ，提高幅度达1 2 8 6 、 1 7 0 竹i 和9 4 1 。 近年来，围绕微生物生产多不饱和脂肪酸的遗传诱变育种。人们采用了大量 物理的、化学的和基因工程的方法。随着生物技术的发展，人们倾向于用基因工 程来提高目的产量嗍。如w a n gc h u n l i n 等在番茄中表达了酵母。脂肪酸脱饱和 基因，转基因果实中棕榈酸和亚油酸的含量上升；s a k u r a d a n i 等克隆了催化油 酸转化成亚油酸的”脂肪酸去饱和基因，并在酵母中表达；r e d d y 等在烟草中 导入兰藻脂肪酸脱饱和酶基因，结果，转基因烟草中r 一亚麻酸大为积累； c a h o o n 等从芜荽中分离克隆了软脂酰a c p 脱饱和酶基因，并于烟草中转化， 后者合成了占其总脂肪酸5 的岩芹酸；m i c h a e l s o n 等从高山被孢霉中克隆了从 和e p a 在生物合成中起关键作用的l 脂肪酸去饱和酶的基因；i e n i n i f e r 等 和b e a u d o i n 等分别将5 脂肪酸去饱和酶与延伸酶在酵母内共同表达，以c m 。 和c ，s ：4 为底物获得了a a 和e p a ，成功地实现了p u f a 生成合成途径的异源重组 t a n a k a 等从被孢霉细胞中克隆了a 一葡萄糖苷酶的c d n a ，并进行了其功能的表 达。p 云萍、李明春等1 8 3 3 向大豆导入深黄被孢霉l 月旨肪酸脱氢酶基因，也获得 了一定效果。另外，刘莉等【踟将深黄被孢霉m _ 2 2 一_ 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒 酵母中的表达。并取得了成效。 1 7g l a 的研究方法 一般来说，具有工业价值的生产菌株应有如下基本特征： 菌种应在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。高产菌株的运用， 可以在不增加投资的情况下能大幅提高目的产品的生产能力。 在发酵过程中不产生或少产生副产物这样，可提高营养物质的有效转 化率，降低成本提高产品的质量。 菌株生长繁殖能力强，有较快的生长速率，产孢子的菌种应具有较强的 产孢予能力。才有利于缩短发酵周期，减少种子罐的级数、杂菌污染的可能性等。 从而降低生产成本。 能高效将原料转化为产品。 对原材料的普适性，即对发酵原料成分的波动敏感性较小。 对器要添加的前体物质有耐受能力，且不能将这些前体物质当作碳源加 以利用。 在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量有重 要意义。 遗传特性稳定 以上是我们选育菌种的目标和需要解决的问题。对此，我们在实验中将高度 重视。具体的选育方法有： ( 1 ) 自然选育： 它是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生 产，提高产量静日的。但选育效率低，须与诱变交替使用，才能提高育种效率。 ( 2 ) 诱变选育： 它分为物理诱变( 如用紫外线、快中子、x 、b 、y 一射线和激光等物理因素 的诱变) 、化学诱变( 用亚硝基胍、亚硝酸、羟胺、硫酸二乙酯等化学试剂盼诱 变) 、生物诱变( 用噬菌体、转座子等生物因子的诱变) 三种诱变。基本方法是 a 出发菌株的选择：诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力、生长繁殖快、 营养要求低、产孢予多且早、对诱变剂敏感等，当然，还要了解它的产量、形态、 生理等方面的情况。b 诱变剂的使用；通常单一诱变剂处理适于野生菌株，老菌 种需用复合诱变剂处理。c 诱变剂的剂量：对不同的微生物使用的剂量不同， 剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有一定的关系。一般来说，诱变率随荆 量的增加而提高，但达到一定程度后提高剂量反使诱变率下降。但剂量也不宜过 低，高剂量可导致一些细胞核发生变异也可使另一些细胞核破坏，引起细胞死 亡或形成较钝的变异菌落同时，高剂量将引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨 大损伤，促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。d 突变株的筛选：经诱交后， 菌种的性能有可能发生变异，如营养变异、抗性变异、代谢变异、形态变异、生 长繁殖变异、和发酵温度变异等。可用不同的方法筛选出来。 ( 3 ) 杂交选育 通过诱变技