（分析化学专业论文）毛细管电泳预富集及二维毛细管电泳分离初步研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文 摘要 本论文详细综述了毛细管电泳的发展历史和研究现状，认识到毛细管电泳虽然具有分离 效率高、分析速度快等优点，但也存在毛细管的负载能力小、紫外检测的灵敏度较差等问题。 采用在线预富集方法可以克服毛细管电泳的缺限。论文深入研究了多种预富集方法，取得了 较好的效果；同时一维毛细管电泳由于分辨率和峰容量较低，难以满足复杂样品的分离要求， 论文对二维毛细管电泳分离复杂蛋白质的研究进行了初步探索，主要内容包括： 1 研究了毛细管电泳间接紫外检测分离测定烟草中的六种无机阴离子，考察了分离电压、 表面活性剂的种类及浓度、背景电解质的种类及浓度、d h 等因素对阴离子分离的影响。发 现背景电解质对无机阴离子的分离有较大影响，并详细研究了其原理。在选定的实验条件下， n g - 2c i 、n o 、n 0 3 、s 0 4 。、f 、h p 0 4 2 等离子，检出限为0 2 0 8m g l ，相对标 准偏差( r s d ) 为1 , 9 。47 ，并通过加标回收实验验证了方法的可行性。 2 研究了一种在柱顺序富集方法一阴离子选择性耗尽进样( a s e i ) 一碱堆积( b s ) 富集毛 细管电泳分离六种无机阴离子。用电渗流改性剂十四烷基三甲基溴化铵( r r a b ) 抑制电渗 流，毛细管内壁动态吸附缓冲溶液中的t t a b ，电动进样之前高差法引入一段水塞，吸附到 毛细管内壁上的t t a b 溶解到水中，使该段毛细管的z e t a 电势变负，向进样端的电渗流增 强。电动进样时，样品中的阴离子快速迁移并堆积在毛细管内水塞和缓冲溶液的界面上，同 时电渗流将水塞排出毛细管。这种方法可允许样品池中大部分阴离子进入毛细管内并形成很 窄的区带，同时避免了样品水区带对分离的影响。水塞在此起三个作用：溶解毛细管内壁吸 附的t t a b 使毛细管内电渗流增大，提供局部高场强和增大进样量。进样之后电动引入 n a o h ，快速迁移的o h - 与来自缓冲溶液的r r i s + 形成低电导区，进一步压缩样品区带，碱堆 积可使进样时间进一步增大。同常规电动进样相比，阴离子选择性耗尽进样一碱堆积可达到 ( 0 _ 8 1 3 ) x1 0 5 倍的样品富集。论文对实验条件和富集机理进行了研究。用该法测定了烟草 中无机阴离子六种无机阴离子的浓度检出限低下6n g l 。 中国科学技术大学博士学位论文 摘要 3 研究了一种基于离子交换保留历程的吲相萃取方法用于c z e 分离之前在线阳离子交换 预富集。整个装置包括预富集毛细管和分离毛细管，二者通过一段带孔的聚四氟乙烯( p t f e ) 套管和一个三通接头连接。预富集毛细管内壁键台羧基阳离子交换基团。进样时分析物阳离 子保留在预富集毛细管的固定相上，废液由三通阀流出而不进入分离毛细管。关闭三通阀后 用2m o l l 的氯化铵溶液洗脱被吸附的分析物，进行毛细管区带电泳分离。在o 0 3m l m i n 的进样速度下，进样1 0m i n ，可成功富集分离低浓度的待测物质，灵敏度比常规电动进样 提高3 个数量级。论文详细说明了预富集柱及三通接口的制作。在线富集分离过程包括毛细 管的冲洗、进样吸附、洗脱、区带电泳分离。昔萘洛尔在线富集后的浓度检出限为o 3 2 岭，l ( 进样1 0 r a i n ，进样速度为o 0 3 m l m i n ) ，朱寓集时浓度检出限为1 3 8 m g ，l ( 1 0k v 电动 进样1 0s ) 。该方法采用大体积进样浓缩，有效地提高了毛细管电泳分离一紫外检测的分析灵 敏度。 4 进行了二维毛细管电泳分离复杂蛋白质的初步探索，详细研究了作为第一维分离的毛细 管等电聚焦实验条件( 包括载体两性电解质的浓度、甲基纤维素的浓度、毛细管长度、聚焦 电压、缓冲溶液的组成和浓度、p h 、四甲基乙二胺和乙二醇的浓度等) 对蛋白质分离的影 响，以及毛细管无胶筛分电泳( c n g e ) 分离蛋白质的最佳条件( 包括缓冲溶液的浓度、筛分 介质、添加剂、缓冲溶液的p h 、十二烷基硫酸钠和硼酸的浓度等) 。分别用等电聚焦和无胶 筛分电泳的最佳条件分离了血红蛋白样品，证明了血红蛋白样品成分复杂，用一维毛细管电 泳难以将其分离，因此用血红蛋白样品来评价二维分离系统的性能非常合适。 中国科学技术大学博士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) p o s s e s s e si t sa d v a n t a g e so fh i g hs e p a r a t i o n e f f i c i e n c ya n df a s ta n a l y s i sv e l o c i t y , b u ti ta l s oh a si t sd i s a d v a n t a g e sd u et oi t ss m a l l i n n e rd i a m e t e gs u c ha sl o ws a m p l el o a d a b i l i t ya n dp o o rd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y t o o v e r c o m et h e s es h o r t c o m i n g s ，o n - l i n ep r e c o n c e n t r a t i o nh a sb e es t u d i e d ；i na d d i t i o n ， t h ep e a kc a p a c i t ya n dr e s o l v eo fo n e d i m e n t i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm a yb e l i m i t e di nt h e s e p a r a t i o n o fc o m p l e xs a m p l e s ，s ot w o d i m e n t i o n a l c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e ne x p l o r e d t h em a i nr e s u l t so f 1 i sd i s s e r t a t i o na l ea sf o l l o w s ： 1 ac a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n di n d i r e c td e t e c t i o nm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f i n o r g a n i ca n i o n si nt o b a c c os a m p l e sh a sb e e np r o p o s e d t h es e p a r a t i o nv o l t a g e ， m o d i f i e rc o n c e n t r a t i o no fe l e c t r o o s m o t i cf l o w ( e o f ) ，b a c k g r o u n de l e c t r o l y t e sa n d t h e i rc o n c e n t r a t i o n ，a n dp hv a l u eo fb u f f e rs o l u t i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d i tw a s f o u n dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n so fb a c k g r o u n de l e c t r o l y t e si n f l u e n c e de v i d e n t l yo nt h e e f f e c t i v em o b i l i t i e so f t h ei n o r g a n i ca n i o n s u n d e rt h es p e c i f i e dc o n d i t i o n s ，s i xa n i o n s w e r ec o m p l e t e l ys e p a r a t e dw i t h i n1 0m i n ，t h er e p r o d u c i b i l i t y ( r s d ) o f m i g r a t i o nt i m e a n dp e a kh e i g h tw e r ei nt h er a n g eo f1 9 4 7 a n d1 2 - 3 8 ，r e s p e c t i v e l na n dt h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r ei nt h er a n g eo f0 2 , - 1 9 8m g l t oe v a l u a t et h ep r o p o s e dm e t h o d ， i tw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oa n a l y z et h ei n o r g a n i ca n i o n si nr e a lt o b a c c os a m p l e s 2 ad u a la n ds e q u e n t i a le l e c t r o s t a c k i n gm e t h o db a s e do na n i o n - s e l e c t i v ee x h a u s t i v e i n j e c t i o n ( a s e i ) a n db a s es t a c k i n g ( b s ) w a sd e v e l o p e df o ro n c o l u m nc o n c e n t r a t i o n a n ds e p a r a t i o no fs i xi n o r g a n i ca n i o n sw i t hc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) t e t r a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( t t a b ) a sa ne o fm o d i f i e r ，w h i c hc a nb e d y n a m i c a l l ya d s o r b e do nt h ei n n e rw a l lo fs e p a r a t i o nc a p i l l a r y , w a sa d o p t e dt o s u p p r e s s e o fi nt h e c a p i l l a r y , b e f o r es a m p l ei n j e c t i o n ，a w a t e r p l u g w a s h y d r o d y n a m i c a l l yi n j e c t e di n t ot h ec a p i l l a r y , w h i c hp o s s e s s e st h r e ef u n c t i o n s ：( 1 ) d i s s o l v i n gt t a bf r o mt h ec a p i l l a r yi n n e rw a i la n dp r o d u c i n gan e g a t i v ez e t ap o t e n t i a l i i i 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t i nt h ec a p i l l a r ys e c t i o n ，( 2 ) s e r v i n ga sal o wc o n d u c t i v i t ym e d i t t mt oc r e a t el o c a l l y h i g hf i e l ds t r e n g t h ，a n d ( 3 ) i n t r o d u c i n gl a r g en u m b e r so fa n a l y t ea n i o n si n t o t h e c a p i l l a r y d u r i n ga s e lw i t han e g a t i v eh i g hv o l t a g e ，t h es a m p l ea n i o n sm i g r a t e d q u i c k l yt o w a r d t h eb o u n d a r yb e t w e e nt h ew a t e rp l u ga n db u f f e rs o l u t i o ni nt h e c a p i l l a r y ；m e a n w h i l e ，t h ew a t e rp l u gw a sr e m o v e do u to ft h ec a p i l l a r yi n l e tb yt h e l o c a le o f t h e nap l u go fh y d r o x i d es o l u t i o nw a si n j e c t e de l e c t r o k i n e t i c a l l y f o l l o w i n gt h es a m p l ei n j e c t i o na n dan e u t r a l i z a t i o nr e a c t i o nb e t w e e nh y d r o x y l ( o h 3 a n dt r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ( t r i s + ) f r o mt h eb u f f e rs o l u t i o np r o d u c e da l o wc o n d u c t i v i t yz o n e ，i nw h i c ht h ei n j e c t e da n i o n sw a sc o n c e n t r a t e df l n t h e nt h e p r e c o n c e n t r a t i o nm e t h o do fa s e i b sc o u l da f f o r d t h ep r e c o n c e n t r a t i o nf a c t o ro f ( 0 8 1 3 ) 1 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a l l ye l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o n t h ed e t c c f i o n l i m i t so fa s e i b s c z ef o rs i xi n o r g a n i ca n i o n sw e r el o w e rt h a n6n g l t h e p r o p o s e d m e t h o dh a sb e e nu s e dt oa n a l y z et h ea n i o n si nc i g a r e t t es a m p l e s s u c c e s s f l l l l v 3 a no n - l i n e p r e c o n c e n t r a t i o n m e t h o db a s e do ni o ne x c h a n g e c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) h a sb e e nd e v e l o p e d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp h a r m a c e u t i c a l c a t i o n s t h ep r e c o n c e n t r a t i o n s e p a r a t i o ns y s t e mc o n s i s t e do fap r e c o n c e n t r a t i o n c a p i l l a r y c o a t e dw i t hc a r b o x y lc a t i o n - e x c h a n g es t a t i o n a r yp h a s e ，as e p a r a t i o n c a p i l l a r yf o rz o n ee l e c t r o p h o r e s i sa n dat e ej o i n t i n t e r f a c eo ft w oc a p i l l a r i e s t h e c a p i l l a r i e sw e r ec o n n e c t e dc l o s e l yi n s i d ea0 3 m mi d p t f et u b eh a v i n gas i d e o p e n i n ga n df i x e dt o g e t h e rb yat e ej o i n t a no n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o na n ds e p a r a t i o n p r o c e d u r ei n c l u d e dw a s h i n ga n dc o n d i t i o n i n gt h ep r e c o n c e n t r a t i o na n ds e p a r a t i o n c a p i l l a r i e s ，a d s o r b i n ga n a l y t e s ，f i l l i n gw i t hb u f f e rs o l u t i o n ，d e s o r b i n ga n a l y t e s a n d s e p a r a t i n gb yc a p i l l a r 2 ，z o n ee l e c t r o p h o r e s i s t h e c a t i o n so fp r o p r a n o l o la n d m e t o p r o l o l ，a sm o d e la n a l y t e s ，w e r ei n t r o d u c e di n t ot h ep r e c o n c e n t r a t i o nc a p i l l a r yi n af l o wr a t eo f0 0 3m l m i nf o r1 0m i nh y d r o d y n a m i c a l l y , a n dr e t a i n e db yt h e i o n e x c h a n g es t a t i o n a r yp h a s ei n s i d et h ep r e c o n c e n t r a t i o nc a p i l l a r y t h ew a s t eo f s a m p l em a t r i xw a se x p e l l e dt h r o u g hav a l v ec o n n e c t e d t ot h et e ej o i n t b yt u r n i n go f f t h ev a l v e a ne l u t i o ns t e pw a sp e r f o r m e dw i t h2m o l ln h 4 c is o l u t i o ni n j e c t e db y i v 盟型兰垫查查兰堡主兰垡丝壅 垒墅型! ! e o fa t10k vf o r10s f i n a l l y , ac o n v e n t i o n a lc z ew a sc a r r i e do u tf o rt h ea n a l y t e s e p a r a t i o n t h ep r e c o n c e n t r a t i o nc a p a b i l i t ya n ds t a b i l i t yw e r ee l u c i d a t e d b y c o m p a r i n gw i t hn o r m a l l ye l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o n t h ep r e p a r a t i o no f p r e c o n c e n t r a t i o n c a p i l l a r ya n dt e ej o i n tw e r ed e s c r i b e di nd e t a i l s e v e r a lp a r a m e t e r s ，s u c ha st h e s a m p l i n gt i m e ，e l u t i n gs o l u t i o n s ，i n n e rd i a m e t e ra n dl e n g t ho ft h ep r e c o n c e n t r a t i o n c a p i l l a r y ，w e r ei n v e s t i g a t e d t h ep r o p o s e dm e t h o de n h a n c e dt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y o fc e _ u va b o u t4 2 0 0a n d3 4 0 0t i m e sf o rp r o p r a n o l o la n d m e t o p r o l 0 1 r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h en o r m a le l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i t so f p r o p r a n o l o l a n dm e t o p r o l o lw e r e0 0 2g g la n d0 1 g g l ，r e s p e c t i v e l y , w i t ht h ep r o p o s e dm e t h o d w h e r e a st h o s eo f 0 1m g la n d0 5m e c lw i t ht h ec o n v e n t i o n a le l e c t r o l d n e t i ci n j e c t i o n t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e t e c h n i q u ec o u l di n c r e a s et h e p r e c o n c e n t r a t i o nf a c t o re v i d e n t l ya n dt h ep r o p o s e dm e t h o dc o u l db eu s e di nc e u v a n a l y s i sf o rt r a c ec a t i o n sc o n v e n i e n t l y 4at w o d i m e n f i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sf o rt h es e p a r a t i o no f c o m p l e xp r o t e i n s a m p l e sh a sb e e ne x p l o r e d t h ec a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ( c i e f ) w a su s e da st h e f i r s td i m e n t i o ni nt h es e p a r a t i o n t h ec o n d i t i o n so f c i e f , i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o n s o fc a r r i e ra m p h o l y t ea n dm e t h y lc e l l u l o s e ，c a p i l l a r yl e n g t h ，f o c u s i n gv o i t a g e ，b u f f e r c o m p o s i t i o na n dc o n c e n t r a t i o n ，p h ，t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n ec o n c e n t r a t i o na n d e t h y l e n eg l y c o lc o n c e n t r a t i o ne t c h a v eb e e ni n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ec a p i l l a r y n o n - g e ls i e v i n ge l e c t r o p h o r e s i s ( c n g e ) w a su s e da st h es e c o n dd i m e n s i o ni nt h e s e p a r a t i o n ，a n dt h ec o n d i t i o n so fc n g e ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o n so fb u f f e r , s i e v i n gm e d i u m ，a d d i t i v e ，s d sa n db o r i ca c i d ，a sw e l la st h eb u f f e rd he t c w e r e i n v e s t i g a t e d a n db o v i n ee r y t h r o c y t e sh e m o g l o b i ns a m p l e sw e r es e p a r a t e dw i t ht h e o p t i m a lc i e fa n dc n g ec o n d i t i o n s ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hd e m o n s t r a t e dt h ec o m p l e x i t y o fh e m o g l o b i n t h e r e f o r e ，i ti ss u i t a b l eb yu s i n gt h eh e m o g l o b i ns a m p l et oe v a l u a t e t h ep e r f o r m a n c eo f t w o d i m e n s i o n a ls y s t e m v 中国科学技术大学博士学位论文第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 1 1 引言 第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 1 1 1 毛细管电泳的兴起与发展 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是近年来发展最快的高效分离技术之一。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 等【1 】在7 5p a n 内径的毛细管内用高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1 9 8 4 年t e r a b e 等【2 】发展了毛细管胶束电动色谱( m e c c ) 。1 9 8 7 年h j e r t e n 3 建立了毛细管等电 聚焦( c l e f ) ，c o h e n 和k a r g e r 4 提出了毛细管凝胶电泳( c g e ) 。1 9 8 8 1 9 8 9 年出现了第一 批c e 商品仪器。1 9 8 9 年第一届国际毛细管电泳会议召开，标志着一门新的分析技术和分支 学科的产生。短短的几年内，由于c e 配合了以生物工程为代表的生命科学各领域对生物大 分子( 蛋白质、肽、d n a 等) 分离分析的要求，得到了迅速发展，正逐步成为生命科学及 其它学科实验室中一种常用的分析手段。 1 1 2 毛细管电泳仪器及基本原理 c e 是以高压电场中的电动作用为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之 间淌度的差异，而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳的仪器装置如图1 1 所示，整 个装置包括高压电源、毛细管、在柱检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液 贮瓶。 f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f c ei n s t r u m e n t a t i o n 1 中国科学技术大学博士学位论文第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 其主要分离模式包括毛细管区带电泳( c z e ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、毛细管等电聚 焦( c i e f ) 、毛细管等速电泳( c i t ? ) 、胶柬电动毛细管色谱( m e c c ) 、毛细管电色谱( c e c ) 、 亲和毛细管电泳和非水相毛细管电泳等。可用于核酸核苷酸d n a 、蛋白质，多肽氨基酸、 糖类糖蛋白、药物分子、手性化台物和无机及有机离子有机酸分离、单细胞分析、药物与 细胞的相互作用研究等方面。 在电解质溶液中，带电粒子在电场作h f ，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的 现象称为电泳。c e 所用的石英毛细管在p h 3 时，其内表面带负电，和溶液接触形成一 双电层。在高电压作用下，双电层中扩散层的水合阳离子引起溶液在毛细管内整体向负极流 动，形成电渗流。带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流( e o f ) 二者速度的矢量和。带正电荷粒子最先流出 中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度 相当于e o f 速度；带负电荷粒子运动方向与e o f 相反，因e o f 速度一般大于电泳速度， 故它将在中性粒子之后流出；各种粒子因迁移速度不同而实现分析，这就是毛细管区带电泳 ( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e ) 的分离原理。c z e 的迁移时间t 可用下式表示： f ： 丛 l p e n p e 。) v 式中- 嘞为电泳淌度，心。为电渗淌度， 检测器间毛细管长度。理论塔板数n 为 ：( 4 p + t o ) v v 为外加电压，厶为毛细管总长度，b 为进样端到 ( 1 2 ) 式中，d 为扩散系数。分离度r 为 r = 。j ，( 卢，一卢z l z 翮vi 。3 ， 厂 0 5 式中，2 分别为二溶质的电泳淌度，。为二溶质的平均电泳淌度。 从式( 12 ) 可看出c e 分离效率高，主要有三个因素决定：一是c e 毛细管的表面积 体积比火，散热性能好，可以施加高电压；二是c ej 1 j 电渗流作为推动流体前进的驱动力， 整个流体呈扁平型的塞式流，使溶质区带在毛细管内不易扩散，而h p l c 用压力驱动使柱中 流体呈抛物线型，导致溶质区带扩散，使柱效下降。三是根据微通道层流效应样品在微通 道内轴向扩散小。 2 中国科学技术大学博士学位论文第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 1 _ 1 3 毛细管电泳的特点 1 1 3 1 毛细管电泳的优点 c e 将经典电泳技术和现代微柱分离有机的结合，取得了比h p l c 和平板凝胶电泳更多 的优点： ( i ) 分离效率高：每米理论塔扳数为几十万高者可达几百万乃至几千万。 ( 2 ) 分析速度快：许多分析可以在几十秒内完成。 ( 3 ) 所需样品少：只需皮升到纳升的进样量。 ( 4 ) 分析成本低：只需少量的流动相和低廉的毛细管。 ( 5 ) 应用范围广：适合于生物活性大分子分离，还可用于分离小分子( 氮基酸、药物等) 及离子( 无机及有机离子) ，甚至可分离各种颗粒( 如细胞、硅胶颗粒等) 。 1 1 3 2 毛细管电泳的限制及改进 由于毛细管电泳依据与色谱不同的分离机理，在开发新的分析方法上引起了分析工作者 的普遍关注，并且许多不能用普通液相色谱分离的样品( 如蛋白质等生物大分子) 可用毛细 管电泳分离。但在实际应用中，因为其检测灵敏度较低和重现性不够理想等原因，在很多领 域至今仍无法取代高效液相色谱，尤其是对痕量物质的测定，如生物样品中的毒素、药物残 留及代谢物等。 导致毛细管电泳检测灵敏度差的原因主要有两方面： 第一，常规紫) l - n 可见吸收法的灵敏度较差。紫外可见吸收法是一种通用型的检测方式， 在h p c e 中应用最广泛。h p c e 中，检测光程短是限制灵敏度的主要因素。分离毛细管的内 径通常为2 5 1 0 0 l a m ，由于毛细管的曲率，毛细管内的实际光程总是小于内径，因此所提供 的光程很短。对丁5 0u mi d 的毛细管若要获得5 1 0 4 a u 的紫外吸收信号，被分析物 的浓度人约为1 0 。5 m o l l ( 若摩尔吸光度为1 0 4 l t 0 0 1 c m ) 。但是，由于被分析物在分离过程 中的扩散或管壁的吸附，为获得良好的响应，进样时的浓度应更高，故毛细管电泳的检测灵 敏度较低。 第二，毛细管的负载能力小。在毛细管电泳进样过程中，减小样品塞长度非常重要。如果其 长度超过因扩散造成的区带分散。分离效率和分离度将受到损失。进样对分离峰总方差的贡 3 中国科学技术大学博士学位论文 第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 献可由下式表示 警 。， 其中，孵为进样长度。在理想状态下，样品塞跃度必须小于扩散引起的标准偏差( 2 d t ) 。 对进样长度的一个实用限制是低于毛细管总睦度的1 2 。 鉴于前者，为改进毛细管电泳紫外检测的灵敏度，应适当延长吸收光程。然而，增大毛 细管的内径会使电流和焦耳热增大，例如，毛细管内径增大两倍可使吸收强度增大两倍，电 流却同时增火了四倍，冈此，需要设计特殊类型的检测池。泡型池【5 】、z 型池 6 】、多次反 射检测池 7 】和矩形毛细管检测池 8 - 1 0 】的使j j 已有报道。图1 2 是泡型池的示意图。 f i g u r e1 2 s c h e m a t i co f b u b b l ec e l lc a p i l l a r y 5 但也同时会产生光路调整困难、制作困难、背景吸收较大、分离度下降等问题。此外使用 高灵敏度的检测器，如激光诱导荧光( l i f ) 【1 1 - 1 7 、质谱( m s ) 2 2 ，2 3 】、化学发光( c l ) 1 8 - 2 1 】、电化学( e c ) 2 4 2 8 检测器等，可将毛细管电泳的检测灵敏度问题得到显著改善。 但由于相关检测设备费用昂贵、多试剂引入或定量分析性能缺限，致使这些检测器未能得到 广泛应用。 由于上述原因，为改进紫外检测的灵敏度，通常采用样品预富集技术，利用萃取和电泳 两种技术，对样品进行预富集。增加注入毛细管的样品量，压缩注入样品区带的体积。这些 预富集技术与c e 分离有四种不同方式结台：( 1 ) o f f - l i n e ，预富集与电泳分离分开独立进行； ( 2 ) a t ，l i n e ，通过一机械系统将预寓集和电泳分离组合：( 3 ) o n 1 i n e ，两者经接口装置转换 结合；( 4 ) i n l i n e ，预富集直接在分离毛细管内进行。 1 2 样品预富集技术 4 中国科学技术夫学博 ：学位论文第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 l 2 1 基于电泳法的样品预富集 基于离子淌度和溶液电导差异的电泳富集法近年来得到迅速发展，如场放大样品堆积 ( f i e l d a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) ，大体积样品堆积( l a r g e v o l u m es a m p l es t a c k i n g ， l v s s ) ，等速电泳( 1 s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) ，乙腈法，p h 修饰法( p hm e d i a t e d ) ，动态p h 联接 法，胶束作用法( i n t e r a c t i o nb e t w e e na n a l y t e sa n dm i c e n a r , i n a m ) ，瞬间移动化学反应界面 法( t m c r b m ) 等。 1 2 1 1 场放大样品堆积( f a s s ) 1 9 7 9 年m i k k e r s 等 2 9 首次解释了注入低电导基体样品的效果。场放大堆积利用了样品 溶液与电泳缓冲液之间的电导率差，当快速迁移的离子从低电导率的样品区进入高电导率的 缓冲液区时，迁移速度剧减，从而在两者的界面处实现堆积。完成堆积实验最简单的方法就 是将样品溶解在水或低电导的缓冲溶液中( 如分析用的缓冲溶液浓度的1 1 0 0 1 1 0 0 0 ) 。进 样方式采取流体力学或电动方式均可，堆积可以自动完成，可以达到十倍以上的样品富集倍 数。如果样品的电导与缓冲溶液的相同，可以在进样前先引入- - d 段水塞来产生堆积效果 3 0 。另一种堆积的方法是将毛细管的- _ - , i s 充满样品缓冲溶液由电渗流逆向驱动，样品就 堆积在毛细管端的小区带中。在水和缓冲溶液界面上的电渗流压力差会限制这种方法的有效 使用，这个压力差会产生一个抛物面层流使区带扩张。当缓冲溶液的浓度约是样品浓度十倍 并且进样长度是扩散引起的峰宽的十倍时，才能获得最佳的堆积效果。b u r g i 【3 1 1 建立了一 个模型以优化样品区和管内缓冲液的浓度，并讨论了f a s s 中提高堆积效率的限制【3 2 】。 场放大进样时还要考虑到样品区带产生的热量。在堆积的条件下，大部分的电压降都加 在了堆积的区带上，会使温度升高。实际上，即使在毛细管恒温的条件下，样品区带的温度 达到9 0 的情况己有报道 3 3 1 。这一点对热敏感样品尤其需要注意。 目前f a s s 己应用到d n a 片断的分析 3 4 】，尿液中药物的分析 3 5 1 和违禁药物的分析 3 6 ，3 7 等。富集倍数高达1 0 0 0 倍的分析已有报道 3 8 。非水毛细管电泳【3 9 】及非水手性分离 1 4 0 体系中也实现t f a s s 技术。c h i e n l l b u r g i 【4 1 l a l b i n 4 2 都曾对f a s s 技术作过详细的讨 论。然而，f a s s 的限制就在于样品溶液的离子强度必须远远低于背景缓冲液的离子强度， 因此对于含有大量无机盐的生物样品难以直接应用。 中国科学技术大学博士学位论文第一章毛细管电泳的基本原理及其进展 1 2 1 2 大体积堆积( l v s s ) 大体积样品堆积是由c h i e n 和b u r g i 4 3 提出的一种样品堆积技术( 如图1 3 所示) 。 首先通过流动方式将溶解在水中的样品引入并充满毛细管的1 3 - - 1 2 。进样后在毛细管两端 加反极性高压，结果电渗流反向将样品中的水推出毛细管而阴离子分析物则以非常高的速度 移向检测端( 与e o f 反向) ，并在样品与高浓度缓冲液界面处进行堆积。在此过程中需监 测电流，电流值到达最初值的9 5 9 9 时，大部分水已被排出，这时恢复正常的电泳极性， 使样品区带的场强变得均匀。极性反向未恢复之前，一些阳离子和中性物质会从毛细管中样 品医迁移至缓冲液中：另外，如果来仔细观测电流并及时恢复正常的电极极性，也会使部分 阴离子损失。因此l v s s 技术的关键就是密切监测进样过程中电流的变化。 o0 h o0 f 蚺呦q 0 蛐f 8 b 姆曲喇炉科睡礴曲 f l 口1 孽 3 0 州 7 ”缸n m 删坤 g r o u n d t 窨。 。蝴啉桫 h 船h 1 蛹如姆e i 墨硎b 酣 3 0 脚 0 a 懒l 嘲啦瓣。争 g r o u n d , 8 u l f 制t 鼍冀 鼬轴r 0 像孽w 鼬科唔e 誊霉婶辨翻p 霉d 0 0 1 f i g l d f i g u r e1 3 s c h e m a t i cd i a