（微生物学专业论文）弗氏链霉菌及耐热链霉菌的遗传改造.pdf

中文摘要 替米考星是一种重要泰乐菌素的衍生物，合成方法是通过水解泰乐菌素得到脱 红霉糖泰乐菌素( d e s m y c o s i n ) ，然后以d e s m y c o s i n 为前体，通过胺化作用在泰乐 菌素内酯环的c - 2 0 位置上加上一个3 ，5 一二甲基哌啶基而成。泰乐菌素合成基因簇 中红霉糖糖基转移酶合成基因t y l c v 的中断会导致d e s m y c o s i n 的累积。本研究结 合s o e p c r 技术和p c r t a r g e t i n g 技术，建立了一种新的链霉菌快速基因中断方法。 以泰乐菌素工业生产菌株b i b l 0 2 8 为出发菌株，首先通过s o e - p c r 技术构建t y l c y 基因中断结构，将o r i t - a a c 盘) 肼断盒按开放阅读框完全置换t y l c v 基因，然后 通过弗氏链霉菌一大肠杆菌属间接合转移将该中断结构导入b i b l 0 2 8 ，通过同源重 组置换0 4 c v 基因，得到重组突变株b i b 7 1 5 。通过n e s t e d p c r 对t y l c v 基因置换 进行了验证，摇瓶发酵结果显示t y l c v 基因中断导致发酵产物主要为d e s m y c o s i n 。 通过f l p 重组酶作用于t y l c v 基因中断结构中的f r t 位点，得到t y l c v 发生读 码框缺失的基因置换结构，将该置换结构插入接合转移载体p b i b l 0 1 5 ，通过弗氏链 霉菌一大肠杆菌属间接合转移将该基因置换结构导入b i b 7 1 5 ，通过同源重组得到 o , l c v 基因发生读码框缺失的重组突变株b i b l 2 0 9 。通过p c r 、r t p c r 对置换结果 进行了验证，摇瓶发酵实验结果显示主要发酵产物亦为d e s m y c o s i n 。摇瓶菌种筛选 以后，在5 l 发酵罐上对出发菌株b i b l 0 2 8 和两突变株b i b 7 1 5 和b i b l 2 0 9 进行了发 酵试验，参照泰乐菌素的发酵工艺，d e s m y c o s i n 的产量分别达到7 3 9 l 和7 o g l ， 相比出发菌株的9 1 9 1 ，通过折算，两突变株的产能达到出发菌株的1 0 6 5 。 而且和出发菌株的四种组分( 泰乐菌素a 、脱红霉糖泰乐菌素b 、大霉素c 和雷洛 菌素d ) 相比，两重组突变株的组分主要有两种( d e s m y c o s i n 和l a c t e n o c i n ) ，通 过提取后，d e s m y c o s i n 能够占到总产量的9 5 ，组分更加单一。 我们还对替米考星的合成方法进行了探讨，与传统合成以泰乐菌素成品一磷酸 泰乐菌素为出发原料相比，本研究中所得重组突变株通过发酵得到的d e s m y c o s i n 只需要经过两三步简单处理就可以将9 0 以上的d e s m y c o s i n 转移至有机相进行替 米考星的合成。与传统泰乐菌素的7 0 8 0 回收率相比，不但简化了反应步骤，而 且提高了得率。h p l c - m s 结果显示：合成的替米考星与工业生产的替米考星结构完 全一致。 乙酰异戊酰泰乐菌素( a i v ) 是另一种重要的泰乐菌素衍生物，它是通过耐热 链霉菌生物转化泰乐菌素，在泰乐菌素的3 一羟基位置乙酰基化和4 ”一羟基位置 异戊酰基化而得。通过优化，本研究首次建立了优化的耐热链霉菌一大肠杆菌接合 转移系统，整合表达了血红蛋白基因( v h b ) ，摇瓶发酵结果显示血红蛋白基因的表 达对耐热链霉菌转化泰乐菌素几乎没有影响。通过p c r - t a r g e t i n g 和在弗氏链霉菌 中应用的快速基因中断法对负责相应酰基化功能的a c y b l - b 2 基因进行了功能研究， 先后得到a c y b l - b 2 基因中断菌株、a c y b l 基因中断菌株，并对相应中断菌株进行了 互补，得到相应的基因互补菌株。研究表明：a c y b l 基因的中断对a c y a 基因功能没 有影响，而以前报道的a c y b l 的正调控基因a e y b 2 的中断会导致了a c y a 基因表达 水平的下降9 5 以上。研究表明a c y b 2 基因应该是碳霉素生物合成基因簇中的一个 全局性正调控因子，它不仅负责对a c y b l 基因的正调控作用，而且还至少负责对a c y a 基因和红霉糖糖基转移酶基因的正调控。 在耐热链霉菌中存在两个抗性基因，分别为c a r a 和c a r b , 其中c a r a 类似泰乐 菌素的t l r c , 为a t p 结合转运蛋白；c a r b 为核糖体单甲基化酶，类似泰乐菌素的 t l r b o 为提高a i v 生物转化过程中菌体对泰乐菌素的抗性，通过整合表达红霉素 抗性基因( e r m e ) ，抗性平板结果显示耐热链霉菌对泰乐菌素的抗性提高四倍以上， 而相应的酰基化功能没有变化，这对解决工业生产上底物投料浓度问题有一定的 帮助。 本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因n s d a ( n e g a t i v er e g u l a t o ro f s t r e p t o m y c e sd i f f e r e n t i a t i o n ) 进行了研究。通过p c r t a r g e t i n g 的方法对耐 热链霉菌的n s d a 基因进行了中断，得到相应的突变株。摇瓶发酵结果显示：耐热 链霉菌n s d a 基因的中断可以提高其酰基化酶的酶活，与出发菌株相比，在摇瓶水 平，在相同投料浓度下，n s d 4 中断株a i v 的转化率从8 2 提高到9 3 。 本研究还对耐热链霉菌的底物耐受性进行了探索，得到了乙酰脱红霉糖泰乐菌 素和一种新的替米考星衍生物。 关键词：弗氏链霉菌；泰乐菌素；脱红霉糖泰乐菌素；替米考星：红霉糖糖基转移 酶基因t y c ks o e p c r ；p c r 介导的基因中断；耐热链霉菌；乙酰异戊酰泰乐菌素； a c y a 基因；a c y b l 基因；a c y b 2 基因；n s d a 基因；红霉素抗性基因；a t t p ；a t t b i i g e n e t i cm a n i p u l a t i o no f s t r e p t o m y c e s f r a d i a ea n ds t r e p t o m y c e s a b s t r a c t t i i m i c o s i ni sas e m i s y n t h e t i cm a c r o l i d ea n t i b i o t i cd e d v e df r o mt y l o s i n t h e t r a d i t i o n a lm e t h o do ft i l m i c o s i ns y n t h e s i ss t a r t sw i t ht h er e m o v a lo fl - m y c a r o s ef r o m t y l o s i n t o g e td e s m y c o s i n t h ed i s r u p t i o n o f t y l c vg e n e f r o m t y l o s i n p r o d u c e r - s t r e p t o m y c e s r a d i a ew o u l dr e s u l t i nt h ea c c u m u l a t i o no f d e s m y c o s i n , t h e d i r e c tp r e c u r s o ro ft i l m i c o s i n i nt h i ss t u d y , af l e wr a p i dg e n ed i s r u p t i o nm e t h o do f s t r e p t o m y c e sg e n e sw a s e s t a b o l i s h e db yc o m b i n a t i o no ff u s i o np c ra n dp c r t a r g e t e d s y s t e m t h et y l o s i ni n d u s t r i a lp r o d u c e rb i b l 0 2 8w a s u s e da st h es t a i rs t r a i na n dt h e t y l c vg e n ed i s r u p t i o nc a s s e t t ew a sc o n s t r u c t e db yt h en e wm e t h o d t h et y l c vi n f 1 3 m e r e p l a c e m e n ts t r a i no fs t r e p t o m y c e sf r a d i a e , b i b 7 1 5w a so b t a i n e dt h r o w i g hi n t e r g e n e r i c c o n j u g a t i o nb e t w e e ns t r e p t o m y c e sf r a d i a ea n dec o l i t h em u t a n tb i b 7 1 5w a s c o n f i r m e db yn e s t e d p c ra n dt h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t si nt h el e v e lo ff l a s ki n d i c a t e dt h e m a i nf e r m e n t a t i o np r o d u c tw a sd e s m y c o s i n t h ef l pr e c o m b i n a s ea c t so nt h e 册s i t e sf l a n k i n gt h ea n t i b i o t i cr e s i s t a n c e c a s s e t t ea n do r i t r k 2t og e n e r a t et h ed i s r u p t i o ns t r u c t u r eo f 砂f c yi n f r a m ed e l e t i o n t h e d i s r u p t i o ns t r u c t u r ew a si n s e r t e di n t ot h ec o n j u g a lr e o rp b i b l 0 1 5t og e tp b i b l 0 1 7 t h et y l c vi n f r a m ed e l e t i o ns t r a i no fs t r e p t o m y c e sf i a d i a e , b i b l 2 0 9w a so b t a i n e d t h r o u i g l li n t e r g e n e r i cc o n j u g a t i o nb e t w e e nb i b 7 1 5a n dec o l i t h em u t a n tb 1 8 1 2 0 9w a s c o n f i r m e db yp c r ，r t - p c ra n dt h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t si nt h el e v e lo ff l a s ki n d i c a t e d t h em a i nf e r m e n t a t i o np r o d u c tw a sd e s m y c o s i n a c c o r d i n gt h ef e r m e t a i o np r o c e d u r eo f t y l o s i n ，t h ey i e l do fd e s m y c o s i nr e a c h e d7 3g 1 4i n51j a rf e r m e n t o ra f t e ro p t i m i z a t i o no f t h ec u l t u r ec o n d i t i o n s c o m p a r e dw i t ht h e9 1g1 一o ft h es t a r ts t r a i n ，a f t e rc o n v e r s i o n ，t h e p r o d u c t i v i t yr e a c h e d10 6 + 5 o ft h es t a r ts t r a i n ，w h i c hc o u l db es c a l e - u pf o r i n d u s t r i a lf e r m e n t a t i o nt o p r o d u c el a r g ea m o u n to fd e s m y c o s i nf o rs e m i s y n t h e s i so f t i l m i c o s i nd i r e c t l y t h et i l m i c o s i ns y n t h e s i sm e t h o dw a sa l s oi n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y c o m p a r e dw i t h t h et r a d i t i o n a lm e t h o d ，d e s m y c o s i nf e r m e n t e db yt h eo b t a i n e dr e c o m b i n a n tm u t a n t so n l y n e e d e dt w oo rt h r e es i m p l et r e a t m e n ta n do v e r9 0 d e s m y c o s i nc o u l db et r a n s f e r r e di n t o u j t h eo r g a n i cl e v e lf o rs y n t h e s i so ft i l m i c o s i n c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lr e c o v e r yr a t e 7 0 - 8 0 o ft y l o s i n ，t h en e wm e t h o dn o to n l ys i m p l i f i e dt h ep r o c e d u r e ，b u ta l s oi n c r e a s e d t h er e c o v e r yr a t e t h er e s u l t so fh p l c m sa s s a y ss h o w e dt h es y n t h e s i z e dp r o d u c tw a s i d e n t i c a lt ot h ei n d u s t r i a lp r o d u c to ft i l m i c o s i n a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i n i sa n o t h e ri m p o r t a n td e r i v a t i v eo ft y l o s i n ，w h i c hi s o b t a i n e dt h r o u g hb i o t r a n s f o r m a t i o no fs t r e p t o m y c e st h e r m o t o l e r a n s a f t e ro p t i m i z a t i o n ， t h ec o n j u g a lt r a n s f e rs y s t e mb e t w e e nst h e r m o t o l e r a n sa n dec o l iw a se s t a b l i s h e d t h e g e n e sr e s p o n s i b l e f o rt h e a c y l a t i o n , a c y b la n da c y b 2w e r ei n v e s t i g a t e dt h r o u 曲 p c r - t a r g e t i n gs y s t e ma n dt h er a p i dg e n ed i s m p t i o nm e t h o da p p l i e di n f r a d i a e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta c y b 2s h o u l db ea p o l y p h o n i cf a c t o r , w h i c ha tl e a s tp o s i t i v e l yc o n t r o l t h ee x p r e s s i o no fa c y a , a c y b la n dt h em y c a r o s et r a n s f e r a s eg e n e t h e r ea r et w or e s i s t a n c eg e n e s ，c a r aa n dc a r bi nt h eg e n o m eo fst h e r m o t o l e r a n s c 矗叫( s i m i l a rt ot l r ae n c o d e sa l la t pb i n d i n gt r a n s p o r t e rp r o t e i na n di sr e s p o n s i b l ef o r t h ei t a n s m e m b r a n eo f t y l o s i n ；c n r b ( s i m i l a r t o t l r b ) e n c o d e s ar i b o s o m e m o n o m e t h y t r a n s f e r a s e e r m e d e r i v e df r o m s a c c h a r o p o l y s p o r ae r y t h r a e a ，w h i c h e n c o d e sar i b o s o m e ( i m e t h y l t r a n s f e r a s e ，w a se x p r e s s e di nst h e r m o t o l e r a n st oi n c r e a s e t h es u b s t a n c er e s i s t a n c ed u r i n gt h eb i o t r a n s f o r m a t i o no ft y l o s i nt oa i v t h er e s i s t a n c e e x p e r i m e n ts h o w e dt h ei n t e g r a t i n ge x p r e s s i o no fe r m ec o u l dd r a m a t i c a l l yi n c r e a s et h e r e s i s t a n c et ot y l o s i no f s t h e r m o t o l e r a n sa n dt h ea c y l a t i o na c t i v i t yw a sn o ta f f e c t e d t h en e g a t i v er e g u l a t o ro fs t r e p t o m y c e sd i f f e r e n t i a t i o n0 s 相) ，t h ew i d e s p r e a dg e n ei n s t r e p t o m y c e sg e n o m e w a sa l s oi n v e s t i g a t e di n 工t h e r m o t o l e r a n s t h ed i s r u p t i o nc a s s e t t e o fn s d aw a sc o n s t r u c t e dt h r o u g hp c r - t a r g e t i n gs y s t e m t h en s d a 。m u t a n tw a so b t a i n e d t h r o u g hi n t e r g e n e r i cc o n j u g a l t r a n s f e rb e t w e e ns t h e r m o t o l e r a n sa n de c o l i t h e f e r m e n t a t i o nr e s u l t si nt h el e v e lo ff l a s ks h o w e dt h ed i s r u p t i o no fn s d ag e n ec o u l d i n c r e a s et h ea c y l a t i o na c t i v i t yo f s t h e r m o t o l e r a n $ t h es u b s t a n c et o l e r a n c eo f 曼t h e r m o t o l e r a n sw a sa l s oi n v e s t i g a t e d t w ot y l o s i n d e r i v a t i v e s ，a c e t y l d e s m y c o s i na n d2 0 - d e o x y - 2 0 ( 3 ，5 - d i m e t h y l p i p e r i d i n 一1 y 1 ) t y l o s i n w a sa c q u i r e d k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c e sf r a d i a e ；t y i o s i n ；d e s m y c o s i n ；t i l m i c o s i n ；f u s i o np c r ； p c r - t a r g e t i n gs y s t e m ；g e n ed i s r u p t i o n ；s t r e p t o m y c e st h e r m o t o l e r a n s ； a c e t y l - i s o v a l e r y lt y i o s i n ；a c y a ；a c y b l ；a c y b 2 ；n s d a ；e r m e ：a t t b ；a t t p 甄 a a c ( 3 ) i v a c 户 a i v a m a m p a 姻 a f f 尸 b l a b d c a t d a m d c m d h d m s o d e p c e d l a e r g + c h p l c h i t i p t g 缩略语( a 岫r e v i a t i 伽) a c y l t r a n s f e r a s e a p r a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e a c 纠c a r d e rp r o t e i n 3 一a c e t y l - 4 - i s o v a l e r y lt y l o s i n a p r a m y c i n a m p i c i l l i n a t t a c h m e n ts i t eo fb a c t e n u m c h r o m o s o m e a t t a c h m e n ts i t eo fp h a g e b - l a c t a m a s eg e n e b a s ep a i r g e n ee n c o d i n gc h l o r a m p h e n i c o l a c e t y i t r a n s f e r a s e g e n ee n c o d i n gc h l o r a m p h e n i c o l a c e t y i t r a n s f e r a s e ，s y n o n y mo fc a t g e n ee n c o d i n gd n aa d e n i n em e t h y l a s e g e n ee n c o d i n gd n ac y t o s i n em e t h y l a s e d e h y d r a t a s e d i m e t h y ls u l f o x i d e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 。 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n o y l r e d u c t a s e p e r c e n t a g eo fg + c c o n t e n t h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y g e n ee n c o d i n gf o ri n t e g r a s eo fp h a g e i s o p r o p y l t h i o - b d g a l a c t o s i d e v 酰基转移酶 阿泊拉霉素抗性基因 酰基载体蛋白 3 乙酰4 一异戊酰泰乐菌素 阿泊拉霉素 氨苄青霉素 细菌染色体上的噬苗体附着位点 噬菌体d n a 附着位点 b - 内酰胺酶基因，编码氨苄青霉素 抗性基因 碱基对 氯霉素酰基转移酶基因，编码氯霉素 抗性基因 氯霉素酰基转移酶 d n a 腺嘌岭甲基化酶 d n a 胞嘧啶甲基化酶 脱水酶 二甲基亚砜 二乙基焦磷酰胺 乙二胺四乙酸 烯酰还原酶 g + c 百分含量 高效液相色谱 噬菌体整合酶基因 异丙基硫代一b d 半乳糖苜 k b k m k r k s 几e 0 o r f o 疗 o t p c r r t - p c r p k s r e p s d s t a eb u f f e r t eb u h e r 1 1 1 i o 研 k i l o b a s e s ( p a i r s ) k a n a m y c i n k e t o r e d u c t a s e k e t o s y n t h a s e g e n ee n c o d i n gf o rk a n a m y c i n o p e nr e a d i n gf r a m e o r i g i no fr e p l i c a t i o n o n g i no ft r a n s f e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t j o n p o l y k e t i d es y n t h a s e r e p l i c o n s o d i u md o d e c y is u l f a t e t r i s a c e t a t e e d t ab u f f e r t d s e d 呵- ab u 竹e r t h i o s t r e p t o n t h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c eg e n e v i 千碱基对 卡那霉素 酮基还原酶 酮基合成酶 卡那霉素抗性基因 开放阅读框架 复制起始位点 转移起始位点 聚合酶链式反应 逆转录聚合酶链式反应 聚酮合成酶 复制子 十二烷基磺酸钠 t 五s 乙酸e d t a 缓冲液 t r i s - e d t a 缓冲液 硫链丝菌素 硫链丝菌素抗性基因 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 足甭保密 否 如需保密，解密时间年月 日 独创i 生声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 闲亳 时间：加。6 年12 _ 月j d 甘 学位论文使用授权书 本人竞全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，印学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同3 - 式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 靴糍：闷禹锄张哳 签名日期：z 。0 6 年1 2 月) o 日签名日期：弘一6 年( 2 月乡口日 沣：清将木农i l 按比“ ! 学位沦文自7 j ：页和h 蒙z m 第一章泰乐菌素文献综述 泰乐菌素( t y l o s i n ) ，又名泰乐星、是一类1 6 元大环内酯类畜禽专用抗生素，它 的产生菌有弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e sf r a d i a e ) 、龟裂链霉菌( s t r e p t o m y c e sr o m o s u $ ) 和吸水链霉菌( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) ，其中s t r e p t o m y c e s p a d r e 是t y l o s i n 的主 要产生菌，也是其工业化生产菌株。t y l o s i n 是一种重要的畜禽专用抗生素，由美国l i l l y 公司在1 9 6 2 年开发成功并推向市场，其主要应用于饲料添加剂和动物治疗，它能明显 促进畜禽生长、提高饲料的利用率。1 9 8 8 年世界产量为1 5 0 0 吨，1 9 9 5 年达2 5 0 0 吨， 年均递增5 5 。1 9 9 7 年，h l l y 公司的主打产品泰乐菌素实现销售额近6 亿美元。迄 今为止，t y l o s i n 已经工业化生产4 0 多年，一直是畜禽专用的主要抗生素之一。 泰乐菌素通过与核糖体5 0 s 亚基结合而选择性抑制原核生物细胞蛋白质的合 成，属于生长期抑制剂。由于核糖体r n a 结构的改变可以引起对大环内酯类抗生 素的抗性，因此存在耐药性的问题。近年来的研究发现，t y l o s i n 在畜禽体内有药物 残留，再加之其与红霉素( e r y t h r o m y c i n ) 等人用抗生素的结构有很大的相似性， 所以为避免某些病原菌产生对某些人用抗生素的交叉抗性，欧盟已经禁止了t y l o s i n 作为饲料添加剂在畜禽养殖中的继续使用 泰乐菌素主要由泰乐菌素a 、泰乐菌素b ( d e s m y e o s i n ) 、泰乐菌素c ( m a c r o c i n ) 和泰乐菌素d ( r e l o m y c i n ) 四种组分构成，其中泰乐菌素a 为主要组分，且生物活性 最强。工业生产上要求a 组分含量8 5 ，a + b + c + d 总含量 9 5 。泰乐菌素化学结 构如图1 所示： h o q l o s i t l r 1哑r 3 f a c t o ra l - m y c a r o s ec h ! c h 0 l a c t o r b h c h ： c h o f a c t o rc l - m y c a ：0 s e hc h o f a c 0 70 l - m y c a r o s ec h ,c h i o h 图1 1 泰乐菌素化学结构 f i g u r e 1 1s t r u c t u r eo f l ，i o s i n 】 由图1 可知，泰乐菌素a 的主体结构为含有1 6 个原子所形成的环状内酯，即泰乐 内酯( t y l a c t o n c ) ，然后依次连上三个脱氧糖苷配基：碳霉氨基糖( m y c a m i n o s e ) ， 红霉糖( m y c a r o s e ) 和5 一脱氧一d 一阿洛糖( m y c i n o s e ) 。三个脱氧糖苷配基均来自葡 萄糖，n 上甲基基团则来自腺苷甲硫氨酸( s a m ) 。泰乐菌素生物合成的一般生化过 程如图2 所示： o m t d o m e t h y l - b c t e n o c l n 图1 2 泰乐菌素合成一般生化过程 f i g u r e 1 2b i o s y n t h e s i so ft y l o s i n 泰乐内酯在碳霉氨基糖基转移酶的作用下生成o - m y c a m i n o s y l t y l a c t o n e ，然后 o - m y c a m i n o s y l t y l a c t o n e 在去甲基化酶的作用下生成o m t ，o m t 在5 - 脱氧一d 一阿洛 糖基转移酶和红霉糖基转移酶的先后作用下生成去甲基大霉素 ( d e m e t h y l - m a c r o c i n ) ，然后在甲基化酶的作用下最终生成t y l o s i n a 。然而体内的 生物合成相关基因的中断实验研究发现，t y l o s i n 在体内可能存在着另外一条合成 途径，但到目前为止还没有被真正阐明。 1 1 泰乐菌素生物合成 已有的研究表明大环内酯类抗生素的生物合成基因成簇排列于一个或多个抗性 基因之间( c u n d l i f f e1 9 8 9 ) ，抗性基因的分离使得邻近抗生素生物合成基因d n a 的分离成为可能。t y i f 是第一个被分离克隆到泰乐菌素合成基因，该基因编码 m a c r o c i no - 甲基转移酶，催化泰乐菌素合成途径的最后一步反应。r v 1 砌克隆采用 2 了逆向遗传学的方法，即根据纯化的m a c r o c i n0 - 甲基转移酶n 一端的序列设计简并引 物作为探针杂交而得( f i s h m a ne ta 1 ，1 9 8 7 ：b a u e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。早在上世纪8 0 年代初，b a l t z 等就通过利用阻断突变菌株的方法阐明了t y l o s i n 的生物合成过程 ( b a l t z e t a l ，1 9 8 3 ) 。b e c k m a n 等在1 9 8 9 年克隆了t y l o s i n 的生物合成基因簇，并推断 出十三个基因位点( 钞翻州m ) 在s 尹a d i a e 染色体上的位置( b e c k m a n e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 目前t y l o s i n 的生物合成基因簇己被克隆并被成功测序，测序结果显示，t v l o s i n 的生 物合成基因簇( 4 3 0 r f s ) 位于弗氏链霉菌基因组一个约8 5 k b 的区域，其侧翼是抗性 基因t l r b 和t l r c 。泰乐菌素合成基因簇的具体结构如图3 所示： 2 6 2 5 2 4 2 3 2 2 一 2 1 2 0 1 9 。 霉羚 t l r b t y i nt y l e 劬d 母i h n 玲l h lt y | ft y u 1 3 。1 2 1 1 1 0 9 8 7 。 1 8 1 7 1 6 + 馨固谬 a t y i p 1 5 1 4 受勇 t y r ot y j s 6 。5 。4 + 3 。2 1 * * 噬。m t y r ry u劬vt y l c n l a v 聊c mt y l c vt y t c v # t l f d o c r t y i m it y l 矾| l y m i i - 一一_ y g v 妒船，yt y g i i i6 , i g f y l g i 11 a24356780 1 0 1 1 _ - 哼重 * 秀一势”一黪。嘞一 tt y l b 嘶t b t tt y a lt y l a i it y l ot y t c v tt y 旧m o t ( m e t ft l r c 图1 3 弗氏链霉酉中幂乐酉素生物合成基因簇 f i g u r e 1 3t h et y l o s i n - b i o s y n t h e t i cg e u ec l u s t e ro f $ f r a d a e 1 1 1 泰乐内酯( t y l a c t o n e ) 的生物合成 共占据4 1 k b 的5 个大o r f s 钞f g j 秒z g y 编码聚酮合成酶复合体( p o l y k e t i d e s y n t h a s ec o m p l e x ) 。其中包括有负责起始合成的装载模块( 1 0 a d i n gd o m a i n ) ，负责 碳链延伸的7 个模块( m o d u l e ) 和负责最后环化的硫酯酶( t e ) 。每一模块都携带 有参与一轮碳链延伸所需的全部信息，至少由酮基合成酶( k s ) ，酰基转移酶( a r ) 和酰基载体蛋白( a c p ) 组成，三者共同作用催化一个2 一c 单元的延伸。通常每 个模块中还存在其它结构域，如酮还原酶( k r ) 、脱氢酶( d h ) 和烯酯酰还原酶( e r ) 来完成碳链延伸后的修饰。由于每一模块中不同结构域的组合，从而导致了聚酮类 3 化合物结构的千差万别。泰乐内酯环的具体合成过程如图1 4 所示： t y i 硼聊删 c = = = = = = = = = = = ：= = = = = = = = ：= ， - b d u k 邕竺生1 2 j 图1 4 泰乐内酯生物合成过程 f i g u r e 1 4s y n t h e s i so ft y l a c t o n e 1 1 2 泰乐内酯的后修饰( p o s t p k st a i l o r i n g ) 。 在大环内酯类抗生素分子结构中，如在泰乐菌素和红霉素分子结构中，糖基的 性质、数量和空间结构决定了这类药物的药学动力特性( p o u l s e ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 没有被糖基化的泰乐内酯是没有生物活性的，因此泰乐内酯合成后的修饰对泰乐菌 素的生物合成至关重要。 ， 1 1 2 1 碳霉氨基糖的生物合成 在泰乐菌素生物合成基因簇中有共有7 个基因负责碳霉氨基糖的生物合成，分 别是f y 朋，叫、t y j # l - # i i - m i i i , t y l b 和t y l l a 。其中t y l a i - a i i 负责编码n d p 一 葡萄糖合成酶和n d p - 葡萄糖一4 ，6 - 脱氢酶，这两个酶也参与红霉糖和阿洛糖前体的 合成。t y l m i i t y l m i i i 负责碳霉氨基糖基转移酶功能，t y l m i i i 编码一种辅助蛋白， 基因互补实验表明t y i m i i i 的存在能显著增强t y l k 的糖基转移酶功能。早期的 研究认为t y l m i i i 负责编码异构酶，而最近的互补实验和体外表达实验研究表明在 泰乐菌素生物合成基因簇中一个一直没有赋予功能的t y l l a 基因负责该功能。 研究表明m y c a m i n o s o l t y l a c t o n e 的合成直接影响弗氏链霉菌中泰乐菌素的代 谢。当负责碳霉氨基糖合成的l r i # i - ，v i i - m i i i 和州占四个基因中的任何一个被中 4 断，所得到的突变株均不能积累泰乐内酯。但是当将外源的泰乐菌素前体物，如o m t 加入到以上的突变株中时，泰乐内酯又开始积累，这表明泰乐内酯的糖基化对泰乐 菌素的合成有反馈调节作用( b u l t e re ta 1 ，2 0 0 1 b ) 。 1 1 2 2 红霉糖的生物合成 在泰乐菌素生物合成基因簇中共有6 个基因专门负责红霉糖的生物合成，分别 是t y l c i i - t y l c v i i , 其中除了t y l c v i , 其它五个基因连续排列在一起的，t y l c v l 和 其它五个基因之间有5 0 k b 的距