（物理化学专业论文）硒化物量子点标记dna电化学探针的研究.pdf

硒化物量子点标记d n a 电化学探针的研究 摘要 d n a 电纯学生物传惑器麴研究一蛊是个热点，这是出于英在生物分橇化 学中具有潜在的应用价值，比如疾病诊断、药物研究及通过遗传改良的生物体内 转基因的检测等。近年来随着对量子点研究的深入及其应用范围的扩大，量子点 在生物化学、缨脆生物学、免疫生耪学等学秘的研究中显示了巨大的发震潜力， 特别是量予点作为标记物臻于生物分析，很有应用前途。本论文以硒化物量子点 标记d n a 探针，制备d n a 电化学生物传感器，实现了对目标基因d n a 特定序 捌的高灵敏检测。主要包括以下内容： 将瑟化铙量子点作为寡聚核替酸攥针的标记物，用予转基羁植物终源基因序 列片段的检测。在水相中分别合成了表面修饰有十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 的p b s e 量子点，表面修饰有聚乙烯毗咯烷酮( p v p 的a 9 2 s e 量予点及表面由 谷氨酸修饰煞p b s e 量子点，将其分剩逯过静电侔爰、氢键作用及共徐挥用与不 同d n a 探针结合，完成量子点对探针序列的标记，利用紫外可见吸收光谱对量 子点标记探针进行了表征：将目标序列通过共价键合及静电吸附的方式固定在羧 基纯碳纳米管修饰的碳糊电极或者十六烷基三军基漠髭二镀( c 强b ) 修饰的碳糊 电极表葱，在一定条件下馒量子点标记s s d n a 探针与固定化的目标s s d n a 序列 杂交，利用硝酸溶解固定在杂交产物上的量子点，分别利用微分脉冲阳极溶出伏 安法及极谱络含吸附波法检测溶解产生的金属离子的信号，从两阕接完成对露标 s s d n a 痔列的电佬学检测。 利用量子点标记电化学杂交分析方法对转基因植物外源基因序列片段 ( c a m v3 5 s 、p e p 、p a t ) 进行了检测。结采表瞬，本实验方法对特定序列的检 溯有较高的灵敏度和选择性，可数较好的识嗣与霎标序列相关的碱基错配序列秘 非互於序列。 关键词：量子点，硒化物，溶出分祈，极谱络合吸附波，d n a 杂交，标记物 s t u d i e so nt h ed n ae l e c t r o c h e m i c a l p r o b e s l a b e l e dw i t hs e l e n i d eq u a n t u md o t s a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fd n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sh a sb e e nt h er e s e a r c h f o c u sf o rt h e i rp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , s u c ha sd i s e a s e d i a g n o s e s ，d r u gs c r e e n i n ga n dt h ed e t e c t i o no ft r a n s g e n i cg e n ei ng e n e t i c a l l ym o d i f i e d o r g a n i s m s q u a n t u md o t sa r en a n o p a r t i c l e sw i t hm a n yd i s t i n c tc h a r a c t e r i s t i c sa n dc a l l b eu s e di nt h ef i l e do fb i o l o g i c a lr e s e a r c h w i t ht h ei n c r e a s i n ga n db r o a d e n i n g a p p l i c a t i o n so fq u a n t u md o t s ，i th a sb e e nf o u n dt h a tq u a n t u md o t sh a v em a n y p o t e n t i a lu s a g e i nm a n yf i e l d ss u c ha sb i o c h e m i s t r y , c e l lb i o l o g y , i m m u n o b i o l o g ye t e 。 e s p e c i a l l y ，q u a n t u md o t sc a nb eu s e da sl a b e l sf o rb i o l o g i c a ls y s t e m s i nt h i s p a p e rl e a ds e l e n i d ea n ds i l v e rs e l e n i d eq u a n t u md o t sw e r eu s e da s o l i g o n u c l e o t i d el a b e l sf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no fd n as p e c i f i cs e q u e n c e so f t r a n s g e n i cg e n e si nt r a n s g e n i cp l a n t s t h r e ek i n d so fs e l e n i d eq u a n t u md o t s ，n a m e l y p b s e ， a g a s e a n d p b s e ， w e r e s y n t h e s i z e d i n a q u e o u s s o l u t i o nw i t h c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) ，p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e ( p v p ) a n d g l u t a m i ca c i do nt h es u r f a c e s ，r e s p e c t i v e l y t h es e l e n i d eq u a n t u md o t sw e r eb o u n dt o o l i g o n u c l e o t i d e sb ys t a t i ce f f e c t ，h y d r o g e ne f f e c ta n dc o v a l e n te f f e c t ，r e s p e c t i v e l y s s d n ap r o b e sl a b e l e d 址也q u a n t u md o t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu v 二v i sa b s o r p t i o n s p e c t r a t a r g e ts s d n aw a se o v a l e n t l yl i n k e do nc n t s c o o hm o d i f i e dc a r b o np a s t e e l e c t r o d e ( c p e ) o ri m m o b i l i z e do nc t a bm o d i f i e dc p eb ys t a t i ce f f e c t a f t e rt h e h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o nw a sa c c o m p l i s h e d ，t h eq u a n t u md o t sa n c h o r e do nt h eh y b r i d s w e r ed i s s o l v e di nt h es o l u t i o nb yt h eo x i d a t i o nw i t hh n 0 3a n df u r t h e rd e t e c t e db ya s e n s i t i v ed i f f e r e n t i a lp u l s ea n o d i c s t r i p p i n gv o l t a m m e t r i cm e t h o do rp o l a r o g r a p h i c c o m p l e xa d s o r p t i v ew a v e 髓ed e t e c t i o nr e s u l t sc a nb eu s e df o rm o n i t o r i n gt h e h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o na n df u r t h e ru s e df o rt a r g e td n ad e t e c t i o n 。 a c c o r d i n g t ot h i s p r i n c i p l e ，q u a n t u md o t sl a b e l e d e l e c t r o c h e m i c a ld n a l 至 h y b r i d i z a t i o na s s a yw a ss u c c c s s f u u yu s e df o rt h et r a n s g e n i cg e n ed e t e c t i o no f t r a n s g e n i cp l a n t s , s u c ha st h e3 5 sp r o m o t e rf r o mc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u sg e n e e 味耋v3 5 s ) ，t h ep r o m o t e ro fp h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s eg e n e ( p e p ) a n dt h e p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s eg e n e ( p a t ) t h ee s t a b l i s h e dm e t h o de x t e n d e dt h e q u a n t u md o t sl a b e l e de l e c t r o c h e m i c a ld n aa n a l y s i st ot h es p e c i f i cs e q u e n c es a m p l e s w i t hh i 醇s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y , w h i c hc a na l s oh a v eg o o da b i l i t yt od i s t i n g u i s h t h ec o m p l e m e n t a r y , n o n - c o m p l e m e n t a r ya n dt h em i s m a t c h e ds s d n as e q u e n c e s k e yw o r d s ：q u a n t u md o t s ，s e l e s i d e , a n o d i cs t r i p p i n gv o l t a m m e t r y , p o l a r o g r a p h i c c o m p l e xa d s o r p t i v ew a v e ，d n ah y b r i d i z a t i o n ，l a b e l l 薹薹 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 量子点在分析领域的应用背景 近年来，纳米分析化学已成为分柝化学的一今研究前沿。将纳米物质弓l 入 d n a 电化学生物传感器中，利用纳米物质极强的吸附能力、良好的定向能力以及 作为信号放大粒子的功能，可极大提高d n a 电化学生物传感器的灵敏度、重现性 和选择性。尤其是半导体纳米粒子( 也称量予点，简称q d s ) 具有独特约光学和 电学性质，使其应用领域越来越广泛【l 】，特别是其在免疫生物学和临床检验学等 研究中的潜在的应用价值。1 1 1 n i e 2 】等发表了将量子点应用于生物标记的文章后， 量子点在生物体系中的应用研究倍受关注。 b r u c h e z 3 】小组通过将0 d s 连接到免疫球蛋自g 和链霉胍上，合成了特异性免 疫荧光探针。探针在亚细胞水平有较高的标记效率，能在不同的甄细胞位置标记 不同类型的目标。此外，该小组还利用不同颜色的量子点在同一细胞中同时检测 了两种待测嚣标。g o l d 搬强l 【4 】小组利用4 种不弱颜色的量子点荧光试剂( 它们的最 大发射波长分别为5 1 0 ，5 5 5 ，5 9 0 和6 1 0n m ) 对多复杂组分的毒素进行分析。张 春阳【5 】等将量子点应用于标记天花粉蛋白( t c s ) ，研究了量子点标记天花粉蛋 白的吸收光谱、荧光光谱和酶活性变优。w 黼岔6 l 等将z n s 、c d s 、p b s - - 种不同的 量子点标记在三段不同序列的d n a 上，使与其分别互补的三段目标d n a 杂交，此 种方法可对多种不同序列的d n a 进行同时测定。 目前转基因产晶越来越多地走进入们的囡常生活，转基因产晶的安全性及萁 对生态环境的影响弓l 起了广大民众、各国政府和联合国等国际组织的广泛关注。 因而开展转基因产品的分析检测技术的分析具有十分重要的意义。而d n a 生物 传感器已经被用于转基因植物产品的检测，但随着量子点在生物分析中的应用， 用量子点标记的d n a 探针【7 】可以进一步提高检测的灵敏度，实现对转基因植物产 品分析的快速化、实用化，也将对发展新的生物传感器具有非常重要的意义。 1 2 量子点的性质及制备方法 1 2 1 量子点的性质 量子点( q d ) 是纳米尺寸的半导体纳米菇粒，学术界对其尺寸范围有不同的 描述，比较严格的看法是在2 2 0n m 之间。量子点主要由i i 族族( b a s 、b a s e 、 b a t e 、z n s 、z n t e 、c d s 、c d s e 、c d t e 等) 或m 族一v 族元素( g a a s 、m n g a 、i n p 、 硒化物蹙子点标记d n a 电化学探针的研究 i n a s 等) 组成。目前较多的是c d s 、c d s e 、c d t e 等。与传统的荧光染料分子相比， 量子点有如下优点： ( 1 ) 嵩量子产率，发射高强度荧光，保证嵩灵敏度检测。 ( 2 ) 荧光发射光谱窄，半峰宽 ，借助予其外端的氨基和羧基，可与生物分予相结合， 从而达到直接标记生物分子的目的。 l 。3 量子点在d n a 生物传感器中的应用 1 3 1 纳米粒子与d n a 生物传感器 d n a 生物传感器是种能将目标d n a 的存在转化为可检测的电、光、声信号 的装置。其基本组成包括一个d n a 探针和一个换能器。d n a 探针是合成的p n a 片段，其碱基序列与被测嚣标d n a 片段的碱基序列互枣| 、。换能器的功畿是将d n a 杂交信息转换为可测定信号，且对固定的单链d n a ( s s d n a ) 和杂交的双链d n a ( d s d n a ) 具有不同的响应。按照换能器的不同，可将d n a 生物传感器分为质量 3 硒化物麓子点标记d n a 屯化学探针的研究 敏感型、光学生物传感器以及电化学传感器三类。其中电化学传感器由于其便于 设计成高灵敏度、便携式的装置两得到了迅速的发展。 将纳米技术、核酸分子杂交技术与电化学分鸯盱技术相结合，研制具有高灵敏 度、高选择性的基于纳米物质d n a 电化学生物传感器，应用于对特定d n a 片断的 选择性测定和对d n a 链中的碱基尤其是单碱基突变的快速、灵敏和准确的识别， 为基因的快速分析测定提供了一种篱便、快捷、廉价的检测装置。基于纳米粒子 标记的d n a 探针和直接利用电信号柬进行d n a 序列检测的传感器，有望实现仪器 化、微型化。 纳米粒子标避法是将毫化学活性纳米粒子标记在d n a 上，通过杂交将概澄的 物质连接在电极表面，采用电化学方法对标记物进行检测，从而达到对目标d n a 的检测。一般是将标记物制备成溶胶的形态，然后用于标记d n a 。方禹之研究小 组在这方面做了大量的工作，主要研究有基于纳米金标记、纳米银标记、二氧纯 硅包裹联吡啶钴纳米颗粒标记以及硫化镉、硫化锻纳米颗粒标记的生物传感 器1 1 纯1 1 ，其检测限最低可达到10 + 1 2 数量级。 l 。3 。2 用于d n a 标记的量子点的类型 为提高电化学d n a 生物传感器的灵敏度，量子点在d n a 电化学传感器中的应 用通常有量子点标记法和改进固定化方法两种途径。其中，量子点标记法是最常 用的一种解决方案。作为一种新兴的标记物，量子点易于铡备、表面积大、吸附 量高、稳定性好且有较好的生物相容性，能大幅度提高检测过程中信号物质的灵 敏度。常见的用于d n a 标记的量子点主要有下述5 种类型： ( 1 ) 单核量子点：常见的有z n s 6 1 、c d s 1 s t2 h 、p b s 2 0 等。 ( 2 ) 核壳结构的量子点：如c d s c z n s i s 】，c d s z n o 1 瓠，c d t e , c d s l 2 2 】。 ( 3 ) 功能化的量子点：利用电活性物质功能化量子点，即在量子点上修饰 电活性物质【2 3 - 2 4 ，得到具有电化学活性的量子点。因在一个量子点上可以修饰多 个电活性物矮，实现电化学检测信号的放大：将功能优的量子点作为标记n a 酌 电活性物质，可进一步提高检测d n a 的灵敏度。 ( 4 ) 量子点与磁性微粒的结合：磁性纳米颗粒分离法是将具有磁性的纳米 颗粒固定在露标d n a 上，然后通过与标记电活性量子点的探针d n a 杂交后进行电 化学检测【2 5 - 2 6 ，也可以借助对单双链d n a 具有不同键合嵌入作用的指示剂来检测 2 7 - 2 9 】。磁性纳米颗粒的作用是使用磁性将杂交的d s d n a 与s s d n a 有效的分离， 从而达到检测d s d n a ，消除s s d n a 的存在产生的影响。 ( 5 ) 量子点与纳米管的结合：碳纳米管的发现是世界科学史上的里程碑。 在纳米材料中，碳纳米管被称为超级纳米材料。w a n g 等【3 0 】成功地将c d s 标记在 4 青岛科技大学研究生学位论文 碳纳米管增强的d n a 探针上，研制成了检测限达至l j p g 级的d n a 传感器。 1 3 3 量子点标记d n a 的方法 目前所使用的d n a 探针大多为人工合成的短链d n a ，一般使用已被公认的可 识别出靶序列所需的最短序列。制备好的量子点必须进行表面修饰后才能和d n a 分子相偶联，量子点标记d n a 是量子点d n a 探针的制备中的关键步骤。常用的方 法有共价键合法、生物素亲和素法、自组装法等。 ( 1 ) 共价键合法：目前共价键合法已普遍用于量予点d n a 探针的制备，即 在量子点表面上弓l 入活性基搦，也可对d n a 进行修饰，在d n a 末端弓l 入活性基团， 然厝通过共价键合将量子点标记至i j d n a1 - - 3 l 】，这种方法是将量子点的表面进行改 性修饰引入易于连接生物分子的官能团如羟基、胺基、羧基等后，再与本身进行 修饰过的d n a ，如带上巯基或衍生上宫能团的d n a 相连。如图l l 所示，先在c d s e 表巍引入羧基，再与端氨基化的d n a 共价键合【3 引。 钵 o o 翟 争p 弋厂、，、，、，、， h 图1 1纳米粒子共价键合渊a f i g 1 1n a n o p a r t i c l e sc o v a l e n d yi m m o b i l i z et od n a ( 2 ) 生物素。亲和素法：生物素亲稠素体系( b a s ) 是通过生物素亲和素的 特异性结合，在一定范围内敏感膜可制成有序的层次结构，生物素亲和素偶联固 化s s d n a ，具有较高的识别灵敏度f 姗。b a s 的固定化有多种形式：亲和素可宜 接不可逆地吸附至1 c d s 等量子点表面形成亲和素单分子层；也可以吸附在量子点 表面形成生物素分子固定层。如图1 2 所示，在量子点表面先复合一层链亲和素修 饰的聚合物，然后通过生物素亲和素的特异性结合将生物素功能化的d n a 结合 在量子点表面强列。 5 硒化物撼予点标记d n a 电化学探讣的研究 圈1 2 懿米粒子和d n a 通过生物素和素和素结合 f i g 1 - 2n a n o p a r f i e l e si n t e g r a t ed n a w i t hb i o t i n - a v i d i n ( 3 ) 岛组装法：一种是将d n a 链端巯基化，再通过s h 在量子点表面的自组 装作用制备量子点d n a 探针；一种是在量予点上形成特殊官能团的巯基自组装单 分子层，再共价键合或吸附d n a 制备量子) 氧d n a 探针【3 2 】( 图1 3 ) 。 图l ，3 通过自组装法将d n a 固定予纳米粒子表面 f i g 。l - 3d n a i m m o b i l i z a t i o nt on a n o p a r t i c l eb ys e l f - a s s e m b l y ( 4 ) 静电吸附法：利用量子点表面带有的阳离子表面活性粼，与d n a 的磷 酸骨架作用，通过静电吸附作用，将量子点标记在d n a 上。 1 3 4 纳米粒子标记物的电化学检测方法 电化学分析法是一种新的检测纳米粒子标涎物的方法。出予所用纳米粒子多 为金属微粒或量子点，根据组成纳米粒子的金属不同，其相应的氧化还原电位也 不相同，可以通过对纳米粒子标记物中的金属含量的测定，达到对纳米粒子标记 物的测定的麟的。常用的电化学手段有线性扫描伏安法、溶出伏安法、脉冲伏安 法等。 6 青岛科技大学研究生学位论文 ( 1 ) 线性扫描伏安法：线性扫描伏安法是在电极上施加个线性变化的电 压，即电极电位是随外加电压线性变化记录工作电极上的电解电流的方法。 ( 2 ) 溶出伏安法：溶出伏安法是以表面不能更新的液体或固体电掇 如悬 汞电极或汞膜电极) 作工作电极，使被测组分预先富集在工作电极上，蒜逐步改 变电极的电位( 向反方向外加电压) ，使富集在工作电极上的物质重新溶出，根 据溶出时的伏安曲线的峰离 9 5 ，内直径 a n dc t a b ( b ) 2 。2 2p b s e - d n a 的紫舞霹觅巍谱图 o t 4 0 05 0 0 w a v e l e n g t hl n m ) 毽2 - 5p b s e a ) ) 筵p b s e # l 寒辍子标记的d n a 撂 h b ，姆紫鳍可见光谱圈 f i g 2 - 5u v - v i ss p e e t r ao fp b s e ( a ) a n dt h ep b s en a n o p a r t i c l e s - l a b e l e dd n ap r o b e sc o ) 1 7 够晦糟舔嚣篓佰神酩w群=婚； 黪鬈蔗曩蠢露摹 硒化物量子点标记d n a 电化学探针的研究 p b s e 纳米粒子有大的表面积，与d n a 间存在着吸附作用；且p b s e 纳米粒子表 面修饰有c t a b 阳离子表面活性剂，可与d n a 上的负电性的磷酸骨架通过静电作 用结合；所以纳米p b s e g 艮容易标记在d n a 探针上。标记有p b s c 纳米粒子的d n a 探针的紫外可见吸收光谱见图2 5 ，可以看出，经寡聚核苷酸修饰的p b s e 纳米粒 子在约2 6 0n n l 处出现一个新的吸收带( 曲线b ) ，表明p b s c 纳米粒子已成功标记在 寡聚核苷酸表面。 2 2 3d n a 在c n t s c o o h c p e 上的固定和杂交 叩 o ： 图2 - 6 不同电极4 t o 5m o l lk c l + 1 0 x 1 0 。m m o l lk 3 f e ( c n ) 6 c p 的循环伏安图：( a ) 裸碳糊 电极，( b ) c n t s c o o h c p e ，扫描速率：1 0 0v s f i g 2 - 6c y c l i cv o l t a m m o g r a m so f1 0 x10 习m o l lk 3 f e ( c n ) 6 】i n0 5m o l lk c ls o l u t i o na tt h e b a r ec p e ( a ) a n dc n t s - c o o h c p e ( b ) ，s c a nr a t e ：10 0m v s c u t s c o o h 修饰的c p e 的电化学行为如图2 6 所示。曲线a 和b 分别为裸c p e 和c n t s c o o h c p e 在含有0 5m o l lk c i 溶液的1 o lo 3m o l lk 3 f e ( c n ) 6 】中的 循环伏安图。在裸电极上修饰c n t s c o o h 后，其峰电流显著增大峰电位差显著 降低。曲线a 中? e d 为o 6 l lv ，说明k 3 f e ( c n ) 6 】在裸c p ei - _ 的可逆性较差。曲线b 的? 耳为0 1 0 7v ，说明k 3 f e ( c n ) 6 在c n t s c o o f f c p e 上的可逆性得到了明显改 善。由于c l 盯独特的催化作用【2 6 】使得【f e ( c n ) 6 】3 棒的电极过程非常可逆，并且由 1 8 青岛科技人学研究生学位论文 于电极表面修饰有c n t s c o o h ，电极表面积显著增大，因此虽然电极表面的 c o o - 基团使具有同样电荷的【f e ( e n ) 6 】3 谗难以靠近电极发生电化学氧化还原反 应，但是峰电流依然德到了增强。 叩o ： 蹿2 7 不问电极在p h 7 o 的b 嵫冲溶液中的循环伏安图： ( a ) 裸碳糊电极，b ) c n t s - c o o h c p e ，e ) n h 2 - s s d n a c n t s - c o o h c p e ，扫描速率：1 0 0m v s f i g 2 - 7c y c l i cv o l t a m m o g r a m sa tt h eb a r ec p e ( a ) ，c n t s c o o h c p e ( b ) a n d n h 2 一, s s d n a c n t s , c o o h c p e ( c ) i nt h ep h7 0b rb u f f e rs o l u t i o n ，s c a nr a t e ：10 0m v s 图2 7 是以循环伏安法对目标n h 2 , s s d n a 在c n t s c o o h c p e 上的固定进行 表征。裸c p e 电极在p h7 0 的b r 缓冲溶液中无氧化还原峰( 曲线a ) ； c n t s c o o h c p e 电极在同样溶液中得到一对氧化还原峰，其氧化峰电位和还原 峰电位分别位于0 2 8 0v 和0 。3 5 4v ，这是电极表面羧基宫能团的氧化还原峰1 2 7 j ( 曲线b ) ；当目标n h 2 s s d n a 修饰于电极表面后，羧基的氧化还原峰消失，但充 电电流较裸c p e 电极大得多( 曲线c ) 。 1 9 0 5 0 5 o 5 o 5 o 5 o 5 o 5 o 彤一一尽口口0 0 彤 o ，2 硒化物耸子点标记d n a 电化学探针的研究 岬 o 图2 8 不同电极在0 5 m o l l k c i 十1 0 x 1 0 一m m o l l k 3 f e ( c n ) 6 】中的微分脉冲伏安图：( a ) c n t s - c o o h c p e ，( b ) n h 2 s s d n a c n t s c o o h c p e ，( ) p b s e d s d n a ，c n l 豇c o o h c p e ， 振幅：5 0 m v ，脉冲宽度：6 0 m s ，脉冲周期：0 2s f i g 2 - 8d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m o g r a m so f1 0 1 0 。m o l l k 3 f e ( c n ) 6 i n o 5m o l lk c i s o l u t i o na tc n t s c o o h c p e ( a ) ，n h 2 - s s d n a c n t s - c o o h c p e ( b ) a n d p b s e d s d n c n t s c o o h c p e ( c ) ，a m p l i t u d e ：5 0m v , p u l s ew i d t h ：6 0i n s ，p u l s ep e r i o d ：0 2s k 3 f e ( c n ) 6 】作指示剂，用微分脉冲伏安法( d p v ) 对目标n h 2 s s d n a 在 c n t s c o o h c p e 电极上的固定和杂交进行了研究。图2 8 为1 0 1 0 0m o l l k 3 f e ( c n ) 6 在0 5m o l lk c i 溶液中于c n t s c o o h c p e 及目标n h 2 s s d n a 固定和 杂交后的电极上的微分脉冲伏安曲线。曲线a 为k 3 f e ( c n ) 6 】在c n t s c o o h c p e 电 极上的d p v 曲线，在0 1 4 8v 左右有一个良好的还原峰。曲线b 为k a f e ( c n ) 6 在目 标n h 2 s s d n a j c n t s c o o h c p e 电极上f l 勺d p v 曲线，其还原峰电位不变，但峰电 流显著减小。固定于电极上的s s d n a f l , + , j 负电性磷酸骨架对同样电性i 拘 f e ( c n ) 6 】3 。 具有静电排斥作用，使其还原电流减小。曲线c 为电极表面的目标s s d n a 与互补的 标记有纳米p b s e 的p b s e - s s d n a 杂交后所得的p b s e d s d n a c n t s c o o h c p e 电极 上的d p v 曲线，较曲线b 的峰电流有显著增大，峰电位仍保持不变。杂交后的电 极表面带有p b s e 纳米粒子，其上附载的c t a b 带有正电性，可以吸引更多的 【f e ( c n ) 6 扣在电极表面还原，所以其d p v 峰电流较在 n h 2 - s s d n a c n t s - c o o h c p e 电极上大得多，甚至也大于在c n t s c o o h c p e 电 极上的峰电流。 2 0 青岛科技_ 入学研究生学位论文 2 2 4c a m v 3 5 s 基因片段的微分脉冲阳极溶出伏安法检测 姜 霉2 - 9 寡聚核替酸功能化的p b s e 纳米瓤子与芥同基西片段杂交后溶解的铅在陵镀镀汞膜玻 碳电极主的微分辣冲阳极溶出莰安鬻：a ) 互毒 鹤1 8 械基e a m v 3 5 s 基霹彦羧，( b 2 碱基 错浆戆寡聚核营酸序列，c ) 非点补的寡聚核苷酸序列，( d ) 空白溶液，振幅：5 0 m v ， 脉冲宽度：6 0 m s ，脉冲周期：0 2s f i g 2 - 9d i f f e r e n t i a lp u l s ea n o d i cs t r i p p i n gv o l t a m m o g r a m so f t h ed i s s o l v e dl e a da ta ni n - s i r e p r e p a r e dm e r c u r yf i l mg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e a f t e ro l i g o n u c l e o t i d e s f u n c t i o n a l i z e dp b s e n a n o p a r t i c l ep r o b e sh y b r i d i z e dw i t hc o m p l e m e n t a r y18 - b a s ec a m v 3 5 sg e n ef r a g m e n t ( a ) ，t h e t w o - b a s em i s m a t c h e do l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e s ( 妨，a n dt h en o n - c o m p l e m e n t a r yo l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s ( 螺a n dt h eb l a n ks o l u t i o n d ) f o rt h ed n ah ) 6 d d i z a f i o nd e t e c t i o n ， a m p l i t u d e ：5 0m v , p u l s e w i d t h ：6 0m s ，p u l s ep e r i o d ：0 2s 用d n a c n t s 。c o o h c p e 传感器教微分脒冲辫极潜出伏安法对转基嚣植物 c a m v 3 5 s 启动子基因片段进行检测。分别将1 0n l0 。5l 工m o l l 的1 8 碱基c a m v 3 5 s 基因片段、1 0 “l5i t m o l l 的1 8 碱基的2 碱基错配d n a 序歹l j 和l op l5p m o l l 的1 8 碱基菲嚣於戮暇序列固定于c n & 0 0 鞫隰p e 毫蔽表面，然后分别按实验方法与 c a m v 3 5 s 基因序列互替的p b s e 标记的s s d n a 杂交，用lm o l lh n 0 3 溶解，再以同 位镀汞膜玻碳电极对h n 0 3 溶解液进行微分脉冲阳极溶出伏安法测定，并同时对 固定有c a m v 3 5 s 基因片段但末进行杂交反应的电极进雩子同样的测定，维果示予圈 2 9 。益线a 莠露定c a m v 3 5 s 基因片段进行杂交瑟所褥豹溶出伏安曲线，在国，8 4v 得到溶解铅的良好溶出峰。曲线b 为两碱基错配的d n a 序列的测定曲线，其溶出 2 i 硒化物量子点标记d n a 电化学探针的研究 峰较曲线a 大为减小。曲线。为非互牢b d n a 序列的测定曲线，其溶出峰较曲线b 又 有明显减小，与空自试验( 表面未固定d n a ) 所测得的结果( 曲线d ) 相差不多。 曲线d 中较小的溶出峰为测定空囱峰。从图2 9 可知，由此方法测定c 蝴v 3 5 s 基因 片段具有很好的选择性，可以很好地鉴别c 州v 3 5 s 基因片段和非互謇b d n a 序列及 两碱基错配d n a 序列。 分别用l o 瑟l 不圈浓度魏1 8 碱基c a m v 3 5 s 基露片段匿定予c n t s c o o h c p e 电极表面，然后按标准实验方法与p b s e s s d n a 进行杂交、h n 0 3 溶解并进行微分 脉冲阳极溶出伏安法测定，结果示于图2 1 0 。其中a 为不同浓度c a m v 3 5 s 基因片 段所得到微分脉冲阳极溶嬲伏安凿线，以0 8 4v 的峰高作为检测1 8 碱基c a m v 3 5 s 基因片段的检测信号。以三次平行测定的峰高的平均值对c a m v 3 5 s 基因片段的浓 度的对数值在5 0 x 1 0 1 2m o l l e u 5 0 x 1 0 0m o l l 浓度范围内里良好的线性关系，其 线性方程回归方程为y = 0 8 2 5 2l o gx + 1 1 2 2 3 ( 其中x 为被测c a m v 3 5 s 基因片段 的浓度，单位为1 0 。1 2m o l l ；y 为p b 的溶出峰电流，单位为1 0 4a ) ，线性相关系 数r = 0 9 9 3 2 。在d n a 固定步骤中以不含c a m v 3 5 s 基因片段的空白溶液代替 c a m v 3 5 s 基因片段溶液进行实验并在同样实验程序下作测定，1 1 次平行测定的标 准偏差为s ，根据3 s 法计算此方法检测c 粼v 3 5 s 基嚣片段的检测限为6 1 x 1 0 _ ， m o l l 。所提出的方法检测转基因植物c a m v 3 5 s 启动子基因片段具有很宽的检测 范围和很低的检测限。 青岛科技犬学研究生学位论文 9l234)6 培( c 10 叶。m o l l l ) 图2 1 0 ( a ) 不同浓度的c a m v 3 5 s 基因序列的微分脉冲阳极溶出伏安图：( a ) 5 0 0 0 0 0 ，( b ) 5 0 0 0 0 ，c ) 5 0 0 0 ，d ) 5 0 0 ，( e ) 5 0 ，( f ) 5 ，( g ) 0 x l o - 轮m o l l ( b ) 浓度对教镳 与电流的线蛀关系曲线。其他参数同图2 9 f i g 2 - 1 0 ( a ) + d p a s vd i a g r a m sf o rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f c a m v 3 5 sg e n es e q u e n c e ：, ，( a ) 5 0 0 0 0 0 ，( b ) 5 0 0 0 0 ，( c ) 5 0 0 0 ，( d ) 5 0 0 ，( e ) 5 0 ，( 05a n d ( g ) 0 xlo 。m o l l ( b ) t h el o g a r i t h m i c s t a n d a r dp l o t 。o t h e rc o n d i t i o n sa r et h es a m ea si nf i g u r e2 - 9 2 3 实验条件的优化 2 3 1 杂交条件的优化 本文尝试了三种杂交方法。图2 - 1 l 中的a 曲线是a 方法( 把s s d n a 修饰电 极放入含有p b s e 纳米粒子标记d n a 探针的2 x s s c 杂交液中，在o 。4v 下恒电 位杂交1 0m i n ) 杂交所得的p b 的微分脉冲阳极溶出伏安曲线，b 曲线是b 方法( 取 1 0 此含有p b s e 纳米颗粒标记d n a 探针的2 x s s c 的杂交液滴在s s d n a 修饰的 碳糊电极表面，使其保持lh ) 杂交所得的隔的微分脉冲隰极溶出伏安醢线， 曲线是c 方法( 将s s d n a c n t s c o o h c p e 放人含有p b s e 纳米颗粒标记d n a 探针的2 x s s c 杂交缓冲溶液中，4 0o c 水浴中反应3 0m i n ) 杂交所得的p b 的微 分脉冲阳极溶出伏安曲线。以上三种杂交方法所用的2 x s s c 杂交液中含有褶网浓 度的p b s e 纳米粒子标记的d n a 探针。 7 6 5 4 3 2 l 0 w 硒化物嚣子点标记d n a 电化学探针的研究 e n 图2 1 l 基于不同的杂交方法溶解的铅在同位镀汞膜玻碳电极上的微分脉冲阳极溶出伏安 图：方法a ，b ，c 振幅：5 0 m v ，脉冲宽度：6 0 m s ，脉冲周期：0 2s f i g 2 一ll d i f f e r e n t i a lp u l s ea n o d i cs t r i p p i n gv o l t a m m g r a m so ft h ed i s s o l v e dl e a db a s e do nd i f f e r e n t h y b r i d i z a t i o nm e t h o d sa ta l li n s i t up r e p a r e dm e r c u r yf i l mg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ：m e t h o da ，ba n d c a m p l i t u d e ：5 0m y , p u l s ew i d t h ：6 0m s p u l s ep e r i o d ：0 2s 从图2 1 l 可以看出，c 方法杂交后所得到的p b 的微分脉冲阳极溶出伏安峰电 流最大。这种方法杂交效率最高，固载于电极表面的p b s e 纳米粒子最多。实验中 选择这种方法杂交。 在杂交过程中，温度和时间的