（水生生物学专业论文）一个衣藻突变株产氢特性的初步研究.pdf

论文题目：一个衣藻突变株产氢特性的初步研究 学科专业：水生生物学 学位申请人：王荣荣 指导教师：吴双秀副教授 王全喜教授 摘要 世界性的能源危机和环境污染使开发可再生清洁能源成为当务之 急，其中莱茵衣藻( 劬锄肪历鲫傩形删b 蒯) 因其结构简单，遗传背 景清晰，培养成本低，生长速度快，氢化酶活性高，能够利用太阳能产生 氢气而被认为是非常有开发潜力的生物制氢模式物种。 目前利用衣藻制氢的最大瓶颈是氢化酶对氧气特别敏感，使得衣藻 氢气产量低，达不到工业化生产的要求，所以如何提高衣藻产氢效率是 当前的研究热点，目前国际上从以下三条途径来研究衣藻产氢代谢机理 和提高氢气产量：筛选耐氧的高产氢突变株或改造氢化酶结构使其耐 氧降低细胞内的氧浓度提高电子传递效率。 因为衣藻产氢的代谢机理比较复杂，目前还没有完全研究清楚，筛 选衣藻产氢突变株并进行产氢代谢机理的研究还十分必要。本实验室利 用对衣藻细胞核基因随即突变的方法得到一个产氢量提高约7 倍的突变 株，为深入研究衣藻产氢代谢机理提供了一个很好的实验材料。本研究 通过分子生物学和生理实验对该突变株产氢有关的代谢特征进行了初步 研究，为深入揭示莱茵衣藻产氢代谢机理和利用基因工程手段进一步提 高衣藻产氢量提供理论依据和实验基础。 本论文的主要内容及结果如下： 对细胞核基因随机突变获得突变株：利用玻璃珠转化法将含有腐 草霉素( z e o c i n ) 抗性的6 彪基因的质粒p s p l 2 4 sd n a 随机插入莱茵衣 藻藻种c c 8 4 9 的细胞核基因组中，得到1 0 5 个具有腐草霉素抗性的突变 株藻单克隆。 通过抗生素和气相色谱检测筛选产氢突变株：从具有腐草霉素抗 性的转化子中筛选到一株产氢量较高的突变株( 暂命名为t 1 ) ，在6 0 0 m l 体系培养、光照为1 0 0 m o l m 之s 、完全缺硫条件下，突变株t 1 的产氢 量为3 3 8 6 4 p l m g 。1 c h l ，而对照组衣藻c c 8 4 9 的产氢量为4 3 3 6 p l - m g _ c h l ， 突变株t l 的产氢量提高了6 8 倍，同时突变株t l 产氢培养体系中氧气 含量较低，为0 2 ，而对照组衣藻c c 8 4 9 的为1 4 。 通过p c r 和r 1 1 - p c r 实验对突变株t l 进行了d n a 和r n a 水平 的检测，初步证明外源6 彪基因成功整合到衣藻细胞核基因组d n a 中， 并得到正确转录。 通过对突变株t 1 生长情况的检测表明：在弱光( 3 0 u m o l m s 。1 ) 和强光( 1 0 0 u m o l i n - 2 s 1 ) 下突变株t 1 的生长都未受到抑制。 通过对突变株t 1 的光合放氧活性和呼吸强度检测发现：无论在 弱光下还是在强光下，突变株t l 的光合强度都比对照组衣藻c c 8 4 9 弱， 其最大真实光合速率为1 8 8 “m 0 1 m g c h l h ，而对照组衣藻c c 8 4 9 则为 3 1 0 l m o l m g c l l l h ；突变株t l 的呼吸速率比对照组衣藻c c 8 4 9 强，为 7 0 1 “m o l m g c h l h ，c c 8 4 9 的为5 7 2 m o g c h l h ，因而突变株t 1 的p 瓜 值比对照藻8 4 9 低。 通过检测突变株t 1 的p s i i 活性发现：突变株t 1 的p s i i 活性都 比对照藻8 4 9 低，突变株t 1 的f 训f m 值为0 4 0 5 ，对照组衣藻c c 8 4 9 的f v f m 为0 5 5 0 6 5 ；突变株t l 的f v f o 为0 7 1 0 6 ，对照组衣藻c c 8 4 9 的f 们。为1 4 5 1 7 5 。 检测硫元素对突变株t l 产氢的影响，结果表明：无论培养基中 硫元素含量为多少，突变株t l 的氢气产量都比对照组衣藻c c 8 4 9 的高。 且在培养基中完全缺硫的条件下，突变株t 1 和对照组衣藻c c 8 4 9 的产氢 量都达到最高、氧气含量最低，分别为4 5 5 7 “1 m 9 1 c h l 、2 0 8 “1 m g 。c l l l 和0 和1 4 ( 细胞浓度为1 5 m g b o t t l e d 叶绿素) 。 通过优化产氢培养的光照强度和细胞浓度，结果表明：突变株 t 1 在5 0 m l 培养体系中、叶绿素含量为0 5 m g b o t t l e 、光照强度为 3 0 p m 0 1 m 之s 1 时、完全缺硫条件下，氢气产量最高，为7 1 9 7 1 m g 。1 c l l ， l i 氧气含量占瓶中气体的o 9 。 外源碳源和氮源对衣藻产氢的影响：在正常培养基中添加葡萄糖 促进了产氢，当添加量为6 9 l j 时氢气产量达到最高，为1 5 6 p l m g 。1 c h l ； 但是在缺硫培养基中添加葡萄糖却没有促进产氢量，当添加甘氨酸和尿 素时，无论是正常培养基还是缺硫培养基都促进了产氢量，当在缺硫培 养基中添加甘氨酸为2 9 l 。1 氢气产量达到最高，为1 3 9 1 肛1 m g 。1 c h l 。 关键词：生物制氢；莱茵衣藻；细胞核转化；随机突变；产氢突变 株；培养优化 l l l t h e s i st o p i c ： p r e l i m i n a 巧s t u d yo nh y d r o g e np r o d u c t i o nc h a r a c t e r i s t i c s o fa c h l 口 t y a o m o 砼n sr e i n h n 砌n in u n a m p r o f e s s i o n a id i s c i p l i n e s ：h y d r o b i o l o g y d e g r e ea p p l i c a n t ：n gr o n 黟o n g i n s t 邝c t o r ：a s s o c i a t ep r o w us h u a n g x i u p r o w a n gq 1 l a n x i a b s t r a c t i ti su r g e n tt od e v e l o par e l l e 、a b l ea n dc l e 锄e n e 玛yf o rh u m a j lb e i n g s b e c a u s eo fw o r l d w i d e e n e 唱y c d s i sa n d e n v i r o m n e n t 硝p o i l u t i o n 。 国肠刀缈如肌d 刀傩彤砌j l z 口，胁f fh a v em a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha ss i m p l es t m c t u r e ， ac l e a rg e n e t i cb a c k 伊o u n d ，f a s tg r o 、矾hr a t ea n dh i g hh y d r o g 朗g e n e r a t i o n r a t ef 如ms o l a re n e r g y ，e s p e c i a l l yi t sh i g hh y d r o g e n a s ea c t i v i 够t h e r e f o r e ，i t i sc o n s i d e r e dt ob eap o t e n t i a lm o d e ls p e c i e sf o rt h e 咖d yo fb i o - h y d r o g e n p r o d u c t i o n c 唧n t l y ，t h ek e yp r o b l e mi st h a th y d r o g e n a s ei se a s i l yi n h i b i t e db y o x y g e nt or e s u l ti nl o wh y d m g e ny i e l dw h i c hc 皿o tm e e tt l l ei “d u s t r i a l r e q u i r e m e n t sw h e nw eu s ec 比f 玎办口砌玎t 0g e n e r a t eh y d r o g e n s oh o w t o i m p r o v em e l y d r o g e ny i e l d 舶mc 陀加j i z 口砌f 沲t h eh o ts p o t n o wm e r ea r e 3 印p r o a c h e st oi m p r o v et l l eh y ( h g e ny i e l do fc 旭砌乃口砌f ，：s c r e e i n go f h i 曲h 2 一y i e l da n d0 2 一t o l e r a i l tm 眈m to rm o d i f i n gh y d r o g e n a s es t r u c t u r e ， r e d u c i n gm ei n t r a c e l l u l a r eo x y g e nc o n t e n t ，i m p r o v i n gt l l ee m c i e n c yo f e l e c t r o nt m s f e rt ot h eh y g r o g e n a s e b e c a u s et h em e c h a n i s mo fh 2 p r o d u c t i o n 舶mc 陀砌 a 砌f fi sv e r y c o m p l e xa r l dn 供y e t 向l l yc l e a r l y t 1 1 er e s e a r c ho fs c r e e n i n go fh 2 一y i e l d m u t a n t sf o r 咖d yo ft l l em e c h a n i s mo fh y d r o g e nm e t a b o l i s mi ss t i un e c e s s a y i no u rl a b o r a t o a b o u t7 - f o l dk g h e rh y d r o g e ny i e l dm u t a i l t ( n 锄e dt 1 ) 、v a s s c r e e n e do u tb yt 1 1 em e t h o do fm d o mm u t 锄g e n s i so nc h r o m o s o m en u c l e a r v a c i do fc 化f 一办口砌f fa n d “sp r o v i d eag o o dm a t e r i a lt 0 s _ t u d y t h e m e c h a n i s mo fh y d r o g e np r o d u c t i o no fc 陀历，；讲协玎t h ec h a r a c t 嘶s t i c so f h 2 - p r o d u c t i o nm e t a b i o l i s mo ft h em u t a n tt 1w a sp r e m a r i l ys t u d i e do nt h e m o l e c u l a rl e v e la n dt h ep h y s i o l o g i c a l l e v e l i no r d e rt or e v e a l t h em e c h a n i s m o fh 2 一p r o d u c t i o no fc 膨历厅a ， 协玎a n dt oi m p r o v eh 2y i e l dofc 馏砌厅口砌舀 b y 吐l eg e n ee n g i n e e r i n ga p p r o c hi nt h ef u t u r e t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa 1 ea sf o u o w s ： t h em u t a l l g e n s i so nc h r o m o s o m en u c l e a ra c i d so fc 馏加加砌f fw a s c 删e do u tb yt r a n s f o m i n go ft h ed n ao fp l a s m i dp s pl2 4 si m oc 陀砌 删z f fc e l l s t h e6 比g e n e e n c o d i n gz e o c i n r e s i s t a l l te m 可m ew a si n s e r t e d 啪d o m l yi n t 0m ec l l r o m o s o m en u c l e a ra c i d so fc 陀加办口砌玎a j l d10 5 m u t 锄t sg r e w u po nt h es c r e e n i n gm e d i u mc o n t a i n i n g10 9 l 。lz e o c i n ah i 曲h 2 一y i e l dm u t a n tw a ss c r e e n e do u ta m o n gz e o c i n r e s i s t a n t m u t a n t s t h em u t a n tw a sn 锄e da st la i l di t sh 2 - y i e i dw a s3 3 8 6 “l m g 。1 c h l ， a b o m7t i m e sh i 曲e rt h a nt h ec o m m ls t r a i nc c 8 4 9 ，4 3 3 6 l l m g 。1 c h li n6 0 0 m l c u l t u r es y s t e mu n d e rl0 0 “m o l m s 1 锄ds d e p r i v e dt a pm e d i u m t h ef n u t a n tw a si d e n t i f i e db yt h ep c ra 1 1 dr t - p c rb a s e do nt o t a l d n a 锄di ar e a p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t6 彪g e l l ew a si nt l l e c h r o m o s o m e so fc 昭加，；删fa l l di t st r a n s c r i p t i o nw a sc o r r e c t r h eg r o 、砒o fm u t lw 2 u sn o ti i l l l i b i t e dc o m p a r e d 谢t h 也e c o n t r o ls t r a i nc c 8 4 9u i l d e ri l l 啪i n a t i o no fb o t t l3 0 u m 0 1 m 2 s 1 龇l d 1o o “m o l m - 2 s 1 t l l ep h o t o s y n t h e t i cr a t eo f t h em u t a n tt 1w a ss l o w e rt h a tt h a to f t h e c o i l 们ls | 吼i nc c 8 4 9b o mu n d e r l o wi l l u m i n a t i o na l l dl l i 曲i l l 呦i n a t i o n n e h i 曲e s tt r u ep h o t o s y n t h e t i cr a t eo fm u t a l l tt lw a s18 8 p m o l m g c l l l h ，、 ，h i l e i t 、v a s31 0 lp m o l m g c h l hf o rc c 8 4 9 1 1 1 er e s p i r a t i o nr a t eo ft h em u t a i l tt 1 w 嬲f 瓠t e rt h a nt 1 1 a to ft 1 1 ec o n t r o ls t r a j nc c 8 4 9 ，a b o m7 0l “m o g c h 卜ha n d 5 7 2 p m 0 1 m g c l l l hr e s p e c t i v e l y 耽e r e f o r e ，m ep rv a l u eo ft h em u t a n tt l v n a sl o w e rt h a nt l 】a to f t l l ec o n t m ls t r a i nc c 8 4 9 v i 1 1 1 ep s i ia c t i v 时o fm u 啪tt 1w a sl o w e rt h a nt h a to f t h ec o n t r o l s t r a i nc c 8 4 9 t h ef v 厅mo fm u t a n tt 1w a so 4 0 5a n di tw a s0 5 5 0 6 5f o r t h ec o n t r o ls t r a i nc c 8 4 9 t h ef v f oo f t h em u t a l l tt 1w a s0 7 1 0 6a n di tw a s 1 4 5 1 7 5f o rt l l ec o n t r o ls 妇i nc c 8 4 9 u n d e rv a r i o u sc o m e n t so fs u l f a t ei nt h em e d i u m ，t h eh y d r o g e ny i e l d o ft 1 1 em u t a l l tt lw a sh i g h e rt h a i lt h a to ft h ec o n t r o ls t r a i nc c 8 4 9 r h e m a ) 【i m mh y d r o g e ny i e l d sa 1 1 dm i l l i n a l0 x y g e n1 e v e lo fm u t a mt 1a n dt h e c o n 昀ls t r a i nc c8 4 9w e r eg a i n e du l l d e rs u l 缸d e 研v e dt a pm e d i 岫i t 、懈 4 5 5 7 p l m 百1 c l l la n d0 f o rt h em u t a n tt 1a r l d2 0 8 p l m g 。1 c h la l l d1 4 f o r m ec o n t r o ls t i 面nc c 8 4 9 ( u n d e rc e l ld e n s i t yo f1 5 m g b o 砌e 。c h l o r o p h y n ) t l l ec u l n 鹏c o n d i t i o no f 舢l _ t a n tt l 、糯o p t i m i z e df o rh y d r o g e n p r o d u c t i o n t h er e s u l t s s h 0 、e dt h a tt t l e h i 曲e s th y d r o g e np r o d u c t i o n ， 7 1 9 7 l l m g 。1 c l l l ，w a sg a i n e d u i l d e r0 5 m g b o t t l e 。1 0 fc h l o m p h y l lc o n t e n t ， 3 0 p m o l m - 2 s 。1o fi l l 啪i n a t i o na i l ds u l f 时d e p r i v e dt a pm e d i u m u n d e rt h i s c o n d i t i o n ，t i l el o w e s to x y g e nc o m e n tw a so 9 t h ee x o g e n o u sc a r b o nr e s o u l e s 锄dn i t r d g e nr e s o u r c e sa f f e c t e dt h e h y d r o g e np r o d u c t i o no fc 陀砌办以，协f f a d d i t i o n a lg l u c o s ei nt a pm e d i 啪 i m p r o v e dt h eh y d r o g e ny i e l do fc 膨砌厅口，功f th o 、v e v e r ，a d d i t i o n a lg l u c o s e i nt a p sm e d i u i nd i dn o ti i l l p r o v et 王l eh y d r o g e ny i e l d n ea d d i t i o n a lg l y c i n 觚du r e aa l s oi m p r 0 v e dm eh y d r o g e ny i e l do fc 彤f 珂五珊访f fi nb o t ht a p m e d i 啪a i l dt a p sm e d i u m t h e1 1 i g h e s th y d r o g e ny i e l dw a s15 6 p l m 分1 c h l w h e na d d i n g6 9 l o fg l u c o s ea n d13 9 1 p l m g 1 c m 、h e na d d i n g2 9 l 。1o f g l y c i n k e yw o r d s ：b i o - h y d r o g e np r o d u c t i o n ；( 协砌缈咖朋d 嬲馏砌厅口，协前 i m c l e a rt r a n s f o 衄a t i o n ；r a n d o mm u t a n g e s i s ；h y d r o g e n - y i e i dm u t a n t ； o p t i m i z a t i o no fh 2 一p r o d u c i n gc u l t u r e v i i 咖 a m p r z e o z e o r b p c d n a d n t p e b e d l a h m l n s r m i n k b o d p c r c h l s d s 而s l ( d a 她 v t 符号与缩写表 锄p i c i l l i n 氨苄青霉素 锄p i c i l l i nr e s i s t a n t 氨苄青霉素抗性 z e o c i nr e s i s t a n t 腐草霉素 z e o c i n 腐草霉素抗性 b a s e p a i r 碱基对 c o m p l e m e n t a 巧d n a 互补d n a d e o x 州b o n u c l e o t i d e 脱氧核糖核苷酸 e t h i d i 啪b r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 h o u r 小时 m i n u t e 分钟 s e c o n d 秒 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 l 【i l o - b a s 印a i r 千碱基对 o p t i c a ld e n s 时光密度 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 c h l o r o p h y l l 叶绿素 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 仃i s 一 ( h y d r o x y m e t h y l ) 锄i n o 】m e t h a i l e 三羟甲基氨基 甲烷 k i l o d a l t o n 千道尔顿 氨基糖苷3 腺苷酸转移酶基因 v i t a h l i n 维生素 1 ) ( 上海师范大学硕士学位论文论文独创性声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发 表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在 论文中做了明确的声明并表示了谢意。 储签名：谯日期：户。上；。 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公 布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。 保密的论文在解密后遵守此规定。 名：虢翩勰獬日期 彬乌d i 上海师范大学硕士学位论文1 文献综述 l 文献综述 1 1 生物制氢的背景 能源是人类赖以生存的物质基础之一，它与社会经济的发展息息相 关。目前人类所利用的能源主要是一些不可再生的矿物能源，这些能源 即将面临枯竭，据专家预测，如按现有开采技术和消耗速率来推算，煤、 天然气、石油的可使用有限年限分别为1 0 0 1 2 0 年、3 0 5 0 年、1 8 3 0 年，此外，这些矿物能源燃烧时释放的二氧化碳使全球气候发生了变 化，燃烧的其他副产物如氮氧化物、硫化物等，会造成严重的环境污染 【卜5 1 。为了缓解能源危机和环境问题，寻找清洁的可持续能源成为人类所 面临的一项重要课题。 新型的可再生能源有光能、风能、水能、氢能等，但这些新型能源 中大部分受地域和环境的限制，但其中的氢能因为没有这些限制而引起 人们的广泛关注，氢能是一种清洁的新型能源，其燃烧热值高( 为汽油 的3 倍) ，和氧气燃烧时只生成水，不含碳、硫及其他的有害杂质，不会 产生c o x 、s 0 x 和致癌物质，对环境无污染，能够维持自然界的生态平 衡。并且氢能除了具以上优点外，还有它的独特优点，即：可储存性、 可运输性好；不仅是所有已知能源中能量密度最大的燃料( 1 2 2 g 。) ， 还可作为其他初级能源( 如核能、太阳能) 的中间载能体使用；转换灵 活，使用方便。氢能是一种可持续性清洁能源。符合人类长期发展的需 要。因此从2 0 世纪7 0 年代起【6 堋，世界各国对氢能的开发研究十分重视。 我国“十五”国家重点开发技术项目中将新型能源的开发利用放在了极 为重要的位置。 氢能不是一次能源，氢气需要从含氢的化合物中制取。传统的制氢 方法有电解水、烃类水蒸汽重整制氢和重油( 或渣油) 部分氧化重整制 氢方法。电解水方法制氢是目前应用较广且比较成熟的方法之一。水为 原料制氢工程是氢与氧燃烧生成水的逆过程，因此只要提供一定形式的 能量，则可使水分解成氢气和氧气，提供电能使水分解制得氢气的效率 l 文献综述 上海师范大学硕士学位论文 一般在7 5 8 5 。其中工艺过程简单，无污染，但消耗电量大，因此 其应用受到一定的限制。烃类水蒸汽重整制氢反应是强吸热反应，反应 时需要外部供热。热效率较低，反应温度较高，反应过程中水大量过量， 能耗较高，造成资源的浪费。重油氧化制氢重整方法，反应温度较高， 制得的氢气纯度低，也不利于能源的综合利用【9 j2 1 。 生物制氢与传统的制氢方法相比，具有不消耗矿物原料、节约不可 再生资源、减少环境污染、具有可持续发展等优点，是未来氢能制备的 主要发展方向之一【l o ，1 3 。1 5 】。生物制氢在世乔上已经引起了广泛的重视。 如德国、以色列、日本、葡萄牙、俄罗斯、瑞典、英国、美国等都投入 了大量的人力物力对该项技术进行了研究开发。在美国和日本等一些国 家为此还成立了专门机构，并建立了生物制氢发展规划，以期通过对生 物制氢技术的基础和应用的研究，使在21 世纪中叶使该技术实现商业化 生产。 1 2 生物制氢的发展 早在1 9 世纪末，人们就已经认识到细菌和藻类具有产生分子氢的特 性。到2 0 世纪3 0 年代，第一次报道了细菌暗发酵可以产生氢气【i 叫。随 后在1 9 4 2 年g a 行r o n 和i 沁b i i l 报道了绿藻利用光能能够产生氢气【1 7 j ，1 9 4 9 年g e s t 和k 撇e n 发现了深红螺菌在光照条件下有产氢现象【1 8 1 9 1 。s p m i t 在1 9 5 8 年证实了藻类可以通过直接光解水过程产氢而与二氧化碳的固 定过程无关【8 】。1 9 7 0 年h e a l y 的研究表明氧气的产生会抑制衣藻 鳓肠朋v 如聊伽伽彤f 门而口砌。f f 的产氢过程【8 】。2 0 世纪7 0 年代的石油危机使 各国政府和科学家意识到急需寻求替代能源，生物制氢第一次受到关注， 自此，人们从获取氢能的角度进行了各种生物制氢技术的研究。2 0 世纪 8 0 年代初在世界范围内研究与发展计划( r & d ) 对可再生能源的支持逐 渐减少。到9 0 年代早期，世界范围内的环境污染和能源危机问题日益严 重，又使人们将注意力集中到可替代能源上。在德国、日本、美国生物 制氢r & d 的支持下，利用藻类制取氢气这一领域得到了广泛的研刭2 0 1 。 我国生物制氢的发展开始于2 0 世纪9 0 年代后期，其中以任南琪等 2 上海师范大学硕士学位论文1 文献综述 的研究最为成功，其以厌氧活性污泥为菌种来源，以高浓度有机废水为 原料，通过发酵微生物的代谢作用生产氢气，是一项利用非固定化菌种 进行生物制氢的新途径，由于此技术采用的是混合菌种，在运行过程中 方便操作和管理，并且实现了可再生清洁能源开发、废水综合治理的有 机结合，符合2 1 世纪可持续发展战略和建设和谐社会的需求，成为国际 上近年来生物制氢技术研究的热点【2 l 】。此外还有樊耀亭等以牛粪堆肥作 为天然混合产氢菌来源，以蔗糖和淀粉为底物，通过厌氧发酵制取氢气 【2 2 】 o 自发现微生物和藻类可以产氢已有半个多世纪了，生物制氢却还没 有工业化应用，这是因为还有许多技术问题没有解决，比如微生物、藻 种等的筛选、反应器的设计、操作条件的优化等问题还有待解决，以及 该技术的成本问题也是一个关键问题。从经济上讲，生物制氢技术在近 期还不可能投入到工业化生产。但是从长期环境保护的角度来看，生物 制氢的前景将是非常广阔的。 1 3 生物制氢种类 到目前为止，已报道的能进行生物产氢的微生物有5 种，分别是异 养型厌氧细菌、固氮菌、厌氧光合营养细菌、真核藻类和蓝细菌【2 3 1 。而 根据这些微生物的种类、是否需要光照以及底物的不同等方面可以分为 两个大的类别：发酵制氢和光解水制氢。其中发酵制氢可以分为暗发酵 制氢和光发酵制氢，光解水制氢可以分为绿藻光合制氢和蓝藻光解水制 氢【2 抛5 1 。 1 3 1 发酵制氢 发酵制氢是利用厌氧微生物将工农业废弃物里的小分子有机物转化 为氢气。 暗发酵制氢 暗发酵制氢是异养型厌氧细菌利用碳水化合物等有机物，通过暗发 酵作用产生氢气，比如许多专性厌氧和兼性厌氧微生物能够利用多种底 1 文献综述上海师范大学硕士学位论文 物在固氮酶或氢化酶的作用下将底物分解制取氢气。这些微生物利用的 底物有甲酸、丙酮酸、c o 和各种短链脂肪酸等有机物、硫化物、淀粉 纤维素等糖类。这些物质广泛存在于工农业生产的污水和废弃物中。目 前认为厌氧细菌产氢过程可通过丙酮酸产氢途径、甲酸分解产氢途径和 n a d h n a d + 平衡调节产氢途径等三条途径实现，丙酮酸产氢途径和甲 酸分解产氢途径有时也称为直接产氢途径，即葡萄糖首先通过e m p 途径 发酵形成丙酮酸、a t p 和n a d p h ；丙酮酸通过丙酮酸铁氧还原蛋白氧 化还原酶被氧化成乙酰辅酶a 、c 0 2 和还原性铁氧还原蛋白，或者通过 丙酮酸甲酸裂解酶而分解成乙酰辅酶a 和甲酸，生成的甲酸再次被氧化 成c 0 2 ，并使铁氧还原蛋白还原，最后还原性铁氧还原蛋白还原氢酶， 所形成的还原性氢酶当质子存在时便可将质子还原成氢气【2 5 1 ；而 n a d h n a d + 平衡调节产氢途径是当有过量的还原力形成时，以质子作 为电子沉池而形成氢气【2 铊7 1 。 光发酵制氢 光发酵制氢是光合细菌利用有机物通过光发酵作用产生氢气，光合 细菌是一类原始的古细菌，在光照条件下可以将有机酸转化为分子氢。 自1 9 4 9 年美国生物学家g e s t 首次证明光合细菌( 尺办d 幽印护f 刀甜聊厂“6 ，甜肌) 在光照条件下的产氢现象后，大量的研究表明，光合细菌产氢是与光合 磷酸化偶联的固氮酶的放氢作用下产生的圆。 光合细菌产氢的机制，一般认为是光子被捕获得光合作用单元，其 能量被送到光合反应中心，进行电荷分离，产生高能电子并造成质子梯 度，从而形成腺苷三磷酸( a t p ) 。另外，经电荷分离后的高能电子产生 还原型铁氧还原蛋白( f d ) ，固氮酶利用a t p 和f d 将氢离子还原生成氢 气( 图1 1 ) 1 2 7 j 。 4 上海师范大学硕士学位论文1 文献综述 低 i o w 高 h i g h c 0 2 + h + 十r 有机暖o i ：训心 c i d 图1 1 光合细菌光合产氢过程示意图 f i g 1 - lp h o t o b i o l o g i c a lp r o d u c t i o no f h y d r o g e nb y 肋d f 够朋历p 如6 口c 纪一z 册 暗发酵和光发酵耦合制氢 目前比较热门的还有暗发酵和光发酵耦合制氢，厌氧细菌和光合细 菌具有互补性，厌氧发酵过程中所产生的有机物可在夜间被厌氧细菌进 一步分解成氢气和有机酸，而光合细菌可利用这些有机酸在白天光照条 件下进行非氧化光合作用，他们联合产氢具有较高的能量转换效率( 图 1 2 ) 【1 ，2 7 - 3 1 1 。 d g 1 3 2 光解水制氢 光解水制氢是绿藻和蓝藻利用太阳能和水，通过光合作用及其特有 的产氢途径，将水分解为氢气和氧气。 蓝藻制氢 立献综述 上海师范人学硕士学位论文 6 c 藻光台产氡总的意目 蚓i 3 篮藻光合产氢示意崮。a 幽：蓝藻中同氟酶的产氢机制和暇氢酶的作用机 制；b 幽：监藻中可逆氧酶的作j h 机制；c 幽：监藻光合产氢总的示意图( 摘自文 献微藻光台作片1 制氢一能源危机的鹾终出路作者韩志国，李爱芬等) f 嘻1 - 3b i o s y n t h e s l sp m h ”a yo f p h o t o b l o 】o g i c mp m d u c t i o no f h y d r o g e n 蛐 c y a n o b a c t e a 蓝凛( 或称蓝细菌) 属革兰氏阳性菌，具有和高等植物同一类犁的 够 ，邋札。贩 上海师范人乎硕i _ 学位论文文献综述 光台系统及色素，能够进行氧的合成。蓝藻在形态上蔗异很大，有草细 胞的、丝状的、也钉聚居的。所需的营养非常简单，空气( n z 和o z ) ， 水、矿物盐和光照即u j u 蓝凛的许多种埘都含有能够进行氧代谢和氢合成的酶类，包括圃氮 酶和氢化酶。同氦睛催化分子氢，氢化酶既可以催化氢的氧化，i i l 可以 催化氯的合成，足种可逆双向酶( 图l 一3 ) 陋3 ”。已对蓝藻的1 4 个属 的众多凛种枉不同条件下进行了研究，随凛种和条件不同氢气产量差异 饭大，其中州6 删“藻氢的产量较高。p i n t 。等汪明一w f 坷6 船突变体 p k 8 4 的产氧量高于其野生藻，可达69 1 肿o l ( h 2 ) 吖g ( 蛋白质) h 】。 绿藻制氧 植物和藻类通过光台作用生成有机化台物，而产氢绿藻u ，通过相同 的生物过程生成氢气。 g m p s l l c y i ，女j # t s 蚓1 - 4 厌氧条引r 绿藻产氧示意图 f 镕l - 4pr 谢u c t l o no f h y d m b e n 矾k ”岫d o b j n d n l o n 这一过程涉及光吸收的两个不同系统：裂解水和释氧的光台系统i i ( p s 儿) 利生成土原剂还原c 0 2 的光系统i ( p s i ) 。p s i i 吸收光能后光解 水，释放出质子、电子和氧气，电子在p s l 吸收的光能的作用下传递给 铁氧还蛋白( r d ) 。可逆氯化酶接受还原态铁氧还蛋白传递的电子并释放 出氢气产生的气体叶1h 2 0 2 为2 ；l ( 图1 - 4 ) 【”圳1 。 在这两个系统中，2 个光子( 饵一系统。个光子) 用来转移水中的1 个电子和还原c 0 2 或形成h 2 。由：氢化酶对0 2 很敏感，当环境中氧2 i l 文献综述上海师范大学硕士学位论文 浓度接近1 5 时，氢化酶迅速失活，产氢反应立即停止，所以光合过程 产生的h 2 和0 2 必须及时进行分离。为此，产生了两相工艺：首先在第 一相经普通的光合作用将c 0 2 固定到含氢化合物中。然后在第二相中经 光照、厌氧发酵产生分子氢4 2 4 3 1 。k o s o r o v 等进行了c 馏f ”办册办f f 持续 表1 1 各种生物制氢方法的利弊 t a b l e1 1a d v a n t a g e 卸dd i s a d v 鲫t a g eo fd i 仃e r e n tb i o - h 2m e t h o d s 产氢的研究，产氢速率为每1 0 0 h7 9 5 m m o l ( h 2 ) l 一，相当于 8 倩师范人半颐十学伸论文文献综述 00 8 m m 0 1 ( h 2 ) “lh ) 1 1 “。 3 3 各种制氲方法的利弊比较 目前利用牛物制筑的力法还没哲达到d l l 化乍产的要求，这与t t 物 的自身条件和反麻器设计等外界条件都柯关系，表】i 足儿种产氢生物 制氧的利弊分析陋4 “。 1 4 莱茵衣藻的生理特征及遗传背景 莱卣投藻( k 抽m o ”d s m m “m ) 是雕细胞、带鞭毛的真核生 物( 图l - 5 ) ，隶属j ：绿藻门农藻属( 西抽硎咖卅a ，跏) 。衣藻的结构简 f l ，原_ 一质膜紧蛄着细胞壁，细胞直径约l o l n ，紧贴原生质膜有丑只 囱个大型杯状叫绿体，占细胞总体积的4 0 6 0 ，细胞顶端肯两根 鞭毛，侧面仃个眼点。 7 墨浮 o 。了 。各 0 j ? - 罔15 巢芮农菠的j ( 【片 f l e | - 5p h o s t l f cw m 口础i 衣藻具有拉染色体、叶绿体和线粒体等3 套基因组。它的拔基因大 约为1 0 0 m b ，g c 含量离，具有密码了偏爱性，叶绿体基因组是约2 0 0 k b 的环状d n a ，多拷贝，遗传方式是母系遗传，线粒体摹网组是约为158 k b 大小的线忡d n a 分子，具有父系遗传的特点4 “，并且衣藻的核基困 组、叶绿体基酬组和线粒体基冈组测序工作已经完成，这给设计外源基 圳转化和表达实验带柬微大的方便。 莱茵衣藻幽其自身的特点直被用作各种研究的材料，。泛的用于 l 文献综述上海师范大学硕十学位论文 研究鞭毛结构和鞭毛组装、配子发生和交配、趋光性和生理节律【4 0 】、细 胞循环和光合作用原理、叶绿体发育的分子生物学过程等f 5 们。这些研究 加深了人们对衣藻生理功能和遗传学的认识，使得衣藻的遗传学背景清 晰。衣藻因其细胞结构简单、培养容易、生长速度快、光合效率高，遗 传背景清晰等优点而有“绿色酵母 或者“光合酵母”之称1 4 6 ，5 。 自从m e l i s 等发现衣藻在缺硫培养时可以促进产氢之后，同时由于 能源危机，利用衣藻进行产氢研究成为欧美各国研究的热点。 1 5 衣藻生物制氢的研究进展 1 5 1 衣藻产氢的代谢机理 衣藻是目前发现的产氢效率比较高的藻种之一，在有氧条件下，衣 藻叶绿体类囊体上的光合系统i i ( p s i i ) 的叶绿素分子吸收光能，随后 在光合系统的反应中心p 6 8 0 分解水为质子h + 和0 2 ，并释放电子e 。 随后电子在类囊体膜上依次经过质体醌、细胞色素b 以复合体( c ”b c o m p l e x ) 和质体蓝素( p l a s t s o c y a n i n ，p c ) 等传递到光合系统i ( p s i ) ，并 在光合系统i 的反应中心p 7 0 0 藉由光能作第二次激发，将电子传递给铁 氧还蛋白( f d ) ，最终将电子传递给n a d p + 还原酶，形成n a d p h ( 还 原力) 。在电子传递过程中同时形成了a t p ，n a d p h 和a t p 用于参与 c 0 2 固定【5 2 - 5 4 1 。 而在厌氧状态下，衣藻中的氢化酶基因( 助旧) 会被诱导表达，这 时经过光合电子传递链传递给铁氧还原蛋白的电子将会传递给氢化酶 ( h y d m g e n a s e ，h 2 a s e ) ，继而将矿还原为h 2 【5 2 5 5 - 5 7 1 。由于衣藻中催化 产氢的氢化