（微生物学专业论文）荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探.pdf

上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 摘要 本试验对采集自上海青漓、松江、奉贤、南汇、浦东、嘉定等地区的1 0 4 株荧光假单胞菌进行了c a s 固体平板检测和c a s 检测液检测，比较了不同菌株 产生p v d 荧光嗜铁素的产量，从中筛选出高产菌株s e 一6 ，其p v d 相对含量达到 0 6 5 4 。研究了荧光假单胞菌株s e 一6 在摇瓶培养下的培养基和发酵条件。通过单 因素实验和正交优化实验，确定了最佳发酵培养基( t u ) 组成为甘油1 5 9 ，水解 酪蛋白1 o g ，硫酸镁2 5 9 ，磷酸氢二钾2 5 9 ，发酵条件为温度2 8 c ，起始p h 6 5 ， 接种量2 ，装瓶量2 0 0 m l 5 0 0 m l ，发酵时间4 6 h 左右，f e “浓度0 8 m g l 时，s e 一6 菌株分泌的p v d 量达到最大。 对s e 一6 菌株的发酵液进行了分离纯化。发酵液先经过离心后，除去菌体， 再经过有机溶剂抽提，然后用s c p h a d e x g 2 5 柱层析分离，得到了p v d 提取液。 用傅立叶变换红外光潜研究了p v d 的主要功能集团，用a r n o w 分析法和a t k i n 分析法研究了嗜铁索的类型。前者用于儿茶酚型嗜铁索的检验，后者用于氧肟酸 型嗜铁素的检验。结果显示a i t i o w 分析和a t k i n 分析均成阳性，说明p v d 既含 有儿茶酚基团又含有氧肟酸基团，是一类混合型嗜铁素。 本试验还利用p v d 在螯合铁离子前后其在特定波长的吸光值会发生改变这 一特性，设计了一种用p v d 来检测水环境中铁离予的方法。首先建立了p v d 吸 光值变化和铁离子浓度之间的标准曲线，f c 3 + 在o 一2 2 5 1 0 4 m 0 1 l 1 范围内遵守 比尔定律。回归方程是：y = 0 0 0 0 1 4 + 0 1 1 1 2 3 8 x 。然后利用标准曲线来测定未知 样品中的铁离子浓度，并对这种方法的准确度和精确度作出了评估。使这种方法 可以应用于水环境的铁离子测定中，有助于了解和控制海洋中赤潮的形成。 关键词：荧光嗜铁素，筛选，发酵条件，分离提纯，铁离子检测 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁索的发酵条件及其应用韧探 p r e l i m i n a r ys t u d yo nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n d a p p l i c a t i o no fp y o v e r d i n e a b s t r a c t o n eh u n d r e da n df o u rp s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n ss t r a i n sf r o mq i n g p u ，s o n g j i a n g ， f e n g x i a n ，n a n h u i ，p u d o n ga n dj i a d i n gd i s t r i c t so fs h a n g i l a iw e r ed e t e c t e db yc a s a g a rp l a t e sa n dc a s s o l u t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fp v do fa l ls t r a i n sw e r ec o m p a r e d a n ds e 6s u r a i nw i t ht h eh i g h e s tp v de x c r e t i o nw a ss c r e e n e da si t sr e l a t i v e c o n c e n t r a t i o no fp v dw a s0 6 5 4 u n d e rt h ec o n d i t i o no fs h a k h a gf l a s k f e r m e n t a t i o n t h ep o t e n t i a la b i l i t yo fp v d p r o d u c e db ys e 一6w a ss t u d i e da td i f i e r e n t c o m p o s i t i o n so fc u l t u r em e d i aa n dt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n s s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s a n do r t h o g o n a le x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o m p o s i t i o nf o rt h ef e r m e n t a t i o n m e d i u m ( 1 l ) w a s ；g l y c e r o l1 5 9 ，c a s c a m i n o a c i d 1 o g ，m g s 0 4 7 h 2 02 5 9 ， k z p 0 4 3 h 2 02 5 9 t h eo p t i m u mf e r m e n t a i o nc o n d i t i o n sw e r e ：t e m p e r a t r u e2 8 ( 2 ， o r i g i n a lp h 6 5 ，i n o c u l a t i o na m o u n t2 ，m e d i aa m o u n t2 0 0 m i 5 0 0 m 乙c u l t u r et i m e a b o u t4 6 h ，t h ec o n c e n t r a t i o no ff e 。+ 0 8 m 以u n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n s ，t h e c o n c e n t r a t i o no fp v di st h eh i 曲e s t c u l t u r em e d i aw a si s o l a t e da n dp u r i f i e d c u l t u r em e d i aw e r ec e n t r i f u g e dt o r e m o v eb a c t e r i a t h es u p e m a t a n te x t r a c t e dw i t ho r g a n i cr e a g e n t s ，t h e ni s o l a t e db y c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw i t l ls e p h a d e xg 一2 5 s ot h ee x t r a c t i o no fp v dw a s a v a i l a b l e t h em a i nf u n c t i o n a lg r o u po fp v dw e r es u d i e db yf o u r i e rt r a n s f o f m i n f r a r e ds p e c t r u m ( r - i 0 。n et y p eo fs i d e r o p h o r e sw e r et e s t e dw i t ha i i l o w sa s s a ya n d a t k i n sa s s a y 伯ef o l m e rw a sf o rt h ed e t e c t i o no fc a t e c h o l t y p es i d e r o p h o r e sa n dt h e l a t e rf o rh y d r o x a m a t e t y p es i d e r o p h o r e s t h er e s u l t ss h o w e dp v di sak i n do fm i x e d s i d e r o p h o r ec o n t a i n i n gb o t hc a t e c h o la n dh y d r o x a m a t eg r o u p t h ea b s o b a n c eo fp v da ts p e c i a lw a v e l e n g t hc o u l dc h a n g e dw h e ni tb o u n d 誉“w h i c hc a nb eu s e dt o d e s i g nad e t e r m i n a t i o nw a yf o rt 若”i na q u e o u s c n v i r o m e n t aw o r k i n gc u r v eb e t w e e nt h ec h a n g eo fa b s o r b a n c eo fp v da n dt h ef e “ c o n c e n t r a t i o nw a se s t 曲l i s h e d i tf o l l o w e db e e r sl a ww h e nf e ”c o n c e n t r a t i o uw a si n t h e r a l l g e 0t o2 2 5 1 0 6 t 0 0 1 l - j t h el i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s ： v = 0 0 0 0 1 4 + 0 1 1 1 2 3 8 x f e ”c o n c e n t r a t i o ni ns a m p l e sc o u l db ed e t e c t e dw i t ht h e e q u a t i o n ，a n d t h e a c c u r a c ya n dp r e c i s i o n o ft h ed e t e r m i n a t i o n w a yw e r e a s s e s s e d t h u s i tw a sp r a c t i c a b l ei n d e t e r r n i n a t i o no ff c ”c o n c e n t r a t i o na n du s e f u l t or e a l i z ea n dc o n t r o lr e dt i d ei no c e a u k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n ts i d e r o p h o r e ；s c r e e n ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i n u s ；i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o n ；d e t e r m i n a t i o nf o rf e ” 2 上海师范大学硬士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 第一章文献综述 1 嗜铁素研究综述 1 1 嗜铁索的定义 铁是地壳中含量居于第四位的元素，但是因为溶解性差，它的生物利用性极 其有限。在生理条件下，也就是在有氧和中性p h 时，铁以f e ( o ) 。等形式存在， f e ”的浓度不超过1 0 。1 8 m o l l t ，而许多微生物生长的最低浓度约为1 0 4 m o l l 到 1 0 一m 0 1 几【3 1 。铁是微生物最重要的营养之一。它是电传递链中铁硫蛋白的氧化还 原中心，它参与核苷酸前体的还原反应，催化h 、o n 代谢中关键酶反应以及存在 于超氧化物歧化酶中，形成血红素等，是必不可少的的营养因子。因此微生物需 要形成一套高效的铁转运机制来获得它们生存所需要的铁离子。这些转运机制包 括：螯合机制( c h e l a t i o n ) 、还原机制( r e d u c t i o n ) 和质子化机制 ( p r o t o n a t i o n ) t 4 1 ，其中应用嗜铁素( s i d e r o p h o r e ) 来转运铁属于螯合机制。 s i d e r o p h o r e 这个术语是e 自l a n k f o r d 提出，随后被人们采纳并使用【3 1 。现在， 嗜铁素一般是指一类由微生物在低铁条件下合成的小分子量的，能特异地螯舍 f e ”的一种螯合因子峨s 1 。它们的合成受铁浓度的调节。它们被分泌到微生物的细 胞外或细胞表面作为螯合因子来获取f e ”或者将铁变为可溶形式以便微生物利 用。它们与f e ”的结合能力非常强( 解离常数k s 为1 0 2 2 - 1 0 ”) 并且有特异性。嗜 铁索可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走f e ”。这个过程通常包括三个 步骤：( 1 ) 可溶的f e ”配体即嗜铁素被分泌到胞外。( 2 ) 对铁一嗜铁索复合物有 特异性的膜受体把铁复合物转运入微生物细胞膜内。( 3 ) 在一个酶系统的作用下， 铁和嘈铁素在细胞内分开， 1 2 嗜铁素的分类 嗜铁素通常是在好氧和兼性厌氧微生物中产生，还没有发现在严格厌氧菌、 乳酸杆菌和高等生物中产生例。目前人们已经发现5 0 0 多种化学特征不同的嗜铁 素【l o l 。嗜铁素按照它的螯合基团的化学特性可分为三大类：一类为儿茶酚类 ( c a t e c h o l a t e ) 嗜铁素，女d a g r o b a c t i n 、p a r a b a c t i n 、e n t e r o b a c t i n 等，其特征 分子结构如图l 所示；一类为氧肟酸类( h y d r o x a m a t e ) 嗜铁素，包括f e r r i c h r o m e 、 1 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁紊的发酵条件及其应用初探 f e r r i c r o c i n 、a l b o m y c i n s 、f e r r i o x a m i n e 、f e r r i m y c i n 等，其特征分子结构见 图2 ；还有类为复合型( m i x e dl i g a n d ) 嗜铁索，如m y c o b a c t i n s 、p y o v e r d i n e 等f l l l ，它们的分子结构中同时含有儿茶酚和氧肟酸类基团。氧肟酸类嗜铁素大都 有高度水溶性，儿茶酚类嗜铁素则水溶性较低。 图1 儿茶酚型 图2 氧肟酸型 o 从产生嘈铁素微生物的种类对嗜铁素进行分类，可以分为由细菌产生的嗜铁 素和由真菌产生的嗜铁素两大类。现在的研究主要集中在革兰氏阴性菌，如假单 胞菌属( p s e u d o m o n a ss p p ) 产生的p y o v e r d i n e 、耶尔森菌属( y e r s i n i as p p ) 产生的y e r s i n a b a c t i n 、弧菌( v i b r t os o p ) 产生的v i b r i o b a c t i n 和a n g u i b a c t i n 及由肠杆菌属( e n t e r o b a t e i as p p ) 产生的e n t e r o b a c t i n 。另夕卜还有革兰氏阳 性菌，如分支节杆菌属( m y c o b a c t e r i as p p ) 产生的m y c o b a c t i n 和链霉菌属 ( s t r e p t o m y c e ss p p ) 产生的f e r r i o x a m i n e 等。几种不同的微生物产生的嗜铁 素见表l 【“】。 1 3 嗜铁素的功能 嗜铁寨的功能是多样的，它不但是依赖受体的高亲和性的铁转运系统。可以 是抗生素或毒力因子f t 3 。5 】，还是生长因子或萌发因子。 铁在微生物生长过程中的作用主要有：( 1 ) 构成有机化合物，合成菌体组 分：( 2 ) 作为酶的组成成分，维持酶的活性：( 3 ) 参与能量的储存和转运：( 4 ) 调节细 胞的渗透压：( 5 ) 与微生物生长繁殖和致病作用密切相关嘛”】。微生物通过嗜铁素 的铁转运机制来获得它们生存所需要的铁离子。一些致病菌也可合成嗜铁素，它 们分泌到胞外的嗜铁素先与寄主的铁结合形成铁一嗜铁素复合物，这种复合物与 表1 几种不同微生物产生的嗜铁素 4 、少 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 p r o d u c i n go r g a n i s m ( s ) m i x e d a g a n d p y o v e r d i n c p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s p p u t i d a 墨翌! 哑! c a t e c h o l s a g r o b a c t i n c h r y s o b a c t i n e n t e r o b a c t i n a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s e r w i n i ac h r y s a n t h e r a i e n t e r o b a c t e r i a c a e h y d r o x m a t e s a e r o b a c t i n c a n a d a p h o m c e p a b a c t i n c o p r o g e n d i m e r u ma c i d f e r r i c h r o m e f e i c h r o m ea f e t r i o x a m i n ee f c r r i r h o d i n f u s a r i n i n s f u s i g e n e c a r o t o v o r a e n t e r o b a c t e rc l o a c a e h e l m i n t h o s p o r i u mc a r b o n u m p c e p a c i a a l t t e r n a r i a s t e m p h y l l i u mb o t r y o s u m n e c t r i ac i n n a b a r i n a m i c r o d o c h i u md i m e r u m v e r a c i f l i u md a h i i a e u s 对l a g os p p s p h a c e l o t h e c aa n d o p o g o n i s u s a l a g os p p s t r e p t o m y c e ss p p e 船r b i c o l a b o t r y 6 sc i n e r e a f u s a r i u mr o $ l # n g l i o c l a d i u mv i r e n s e r o s e l l r a g i b b e r e l l a f u j i k u r o i 细菌外膜上存在的一种特殊受体结合，然后将铁释放到菌体内，提供细菌生长繁 殖所需耍的铁，从而使感染加重或扩散。细菌所产生的这些嗜铁索亦被证明对t 细胞可产生毒性作用，有助于病原体的侵入，并使机体免疫系统的防御机能出现 障碍。同时，嗜铁素还可催化生成羟基，进一步加重组织损伤，对细菌的生长繁 5 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 殖实际上起到了辅助作用。大多数微生物如克雷伯杆菌、沙门氏菌及假单胞菌等 都是通过释放铁鳌台物与宿主的铁结合蛋白竞争而获得铁【i b 】。 2 荧光嗜铁素的综述 2 1 荧光嗜铁素的结构 荧光嗜铁素是由荧光假单胞菌产生的胞外的，水溶性的黄绿色素。荧光假单 胞菌( p s e u d o m o n a d ar u o r e s c e n 幻是广泛存在于土壤中的一种植物益生菌，它们 能在植物根际定殖，其中一些菌株同时具有抑制植物病原菌和促进植物生长的双 重功能【1 9 删。用荧光假单胞菌对农作物种子进行处理后可以有益于作物的生长 m 。这种促进植物生长的作用与荧光假单胞菌分泌的荧光嗜铁素有关口懈1 。1 9 4 1 年，t u r f r e i j e r 把这种黄绿色素命名为p y o v e r d i n e ( p v d ) 嗍，也可以称为 p y o v e r d i n 、p s e u d o b a c t i n ，它们是荧光假单胞菌特有的铁载体，也是现在研究 的比较深入的铁载体。p v d 是一种呈黄绿色荧光的铁载体，正是因为它的存在荧 光类假单胞菌才会呈现出其特有的黄绿色荧光。这种现象一百多年前就被发现 【”，但是直到1 9 8 i 年t e i n t z e 才报导了引起这种现象的物质p y o v e r d i n e 的结 构。现在人们已经知道p v l ) 由三部分组成：一个发色基团( q u i n o l i n e c h r o m o p h o r e ) 、一条肽链( p e p t i d ec h a i n ) 和一条侧链( s i d ec h a i n ) 。发色基 团是2 ，3 一二氨基一6 ，7 一二羟基喹啉( 2 ，3 - d i a m i n o 一6 ，7 一d i h y d r o x y q u i n 0 1 i n e ) 的衍生物( 图3 ) ；肽链是由6 一1 2 个氨基酸组成，氨基酸的数量和组成随菌株不 同而不同，其中一些是非蛋白氨基酸或修饰过的氨基酸，如6 n - h y d r o x y o r n i t h i n e 和b h y d r o x y a s p a r t i ca c i d 。有一些是d 型氨基酸。这样 可以阻止蛋白水解酶对它的降解，见表2 ；侧链( s i d ec h a i n ) ，由二羧酸或者二 羧酸酰胺组成【巩州，见图4 。p v i ) 属于复合型铁载体，完整的p v d 结构如图5 所示。 p v d 结合铁的能力很强，其结合常数在p h7 o 时达到1 0 虬1 0 “。当荧光假单胞菌所 处的环境缺铁时，p y o v e r d i n 就会产生，同时产生的还有位于细胞膜表面的p v d 的受体。它们共同负责把f e “运输透过细胞膜，然后把f e ”释放到细胞里的周质空 间中。p v d 与其细胞膜表面受体有一定专一性，其专一性取决于连接在其生色基 团上的多肽链。 上海师范大学硕= b 学位论文 荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 图3p y o v e r d i n e s 的发色基团 n h - 一 表2p y o v e r d i n e 中的氨基酸【3 1 】 p r o t e i n o g e n i ca m i n oa c i d su n u s u a l ( n o n p r o t e i n o g e n i c ) a m i n oa c i d s a l a 2 ，4 - d i a m i n o b u t y r i c ( d a b ) a s h b - h y d r o x y - a s p b - h y d r o x y - h i s c y c l o - n - h y d r o x y - o m n - f o r m y l n h y d r o x y o m n - a c e i y l - n - h y d r o x y - o m g l y n - h y d r o x y b u t y r y l - n - h y d r o x y - o m 7 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用机挺 o n h 2 o s u c c i n l ca c da m i d e o k e t o g l u t a r i ca c i d m a l i ca c i d o c o o h o m a l i ca c i da m i d e c u c c i n i ca c i d o 圈4p y o v e r d i n e s 的侧链【3 2 ，3 3 g l u t a m i ca c i d n h 2 图5 p f l u o r e s c e n s a t c c l 3 5 2 5 产生的p v d 3 4 p v d 用三个双齿的螯合基团来螯合铁：一个儿茶酚基团，来自于发色基团 8 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用韧探 一个氧肟酸( 异羟肟酸) 基团，来自于肽链中的n6 - h y d r o x y o r n i t h i n e ；个 h y d r o x y a c i d 来自于b - h y d r o x y a s p a r t i ca c i d 或者另一个氧肟酸基团来自于n 6 一h y d r o x y o r n i t h i n e ，见图6 。 尝明。t o h 穸n nii 三坂r 图6p v d 和铁的复合物【3 5 】 2 2 荧光嗜铁素的功能与应用 荧光假单胞菌产生的p v d 可用于生物防治，p v d 螯合了环境中的铁，这样植 物的病原微生物就由于缺铁而不能生长繁殖【3 研l 。1 9 8 0 年有人首次推测并证实荧 光假单胞菌b i o 产生的嗜铁素与抑病促生作用有关，而在高铁浓度下，其抑病作 用将丧失。接着有人用t n 5 插入诱变证明一些荧光嗜铁素合成的缺陷突变株丧 失了抑病和促进植物生长能力，1 。p v d 是荧光假单胞菌在低铁的条件下产生， 它螯和了根围有限的f e ”，所形成的f e ”一p v d 复合物不能被大多数的微生物尤其 是病原微生物所利用，但其产生菌可以通过位于细胞外膜的特异受体加以吸收。 n a i r 和f a h y 认为荧光假单胞菌能使蘑菇褐斑病发生率从1 0 0 降到 7 6 - 1 1 1 【帅】。后来的研究结果认为主要是通过对铁离子的竞争影响病原菌的生 长，荧光假单胞菌产生的嗜铁素络合根围铁离子，使病原菌得不到足够的铁营养， 生长发育受到抑制，对植物的病害减轻，因而植物生长发育得到改善1 4 1 删。报道 过的p v d 可以抑制的几种植物病原菌如表3 。荧光假单胞菌产生的p v d 嗜铁素 还是植物诱导系统抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) 的诱导物。p v d 嗜铁素 9 o 孵、。 2 l 海师范大学硕士学位论文 荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 在水体环境中也可以发挥生防作用，它可以抑制某些鱼类致瘸菌m “。 表3p v d 可以抑制的几种植物病原菌 病原菌 病害 尖孢镰刀菌 亚麻萎蔫病 禾顶囊壳菌小麦、大麦全蚀病 终极腐霉 猝倒病 白地霉柑橘酸腐病 在临床上，嗜铁紊作为铁的螯合因子，可以用来治疗体内铁过量引起的疾病， 如治疗地中海贫血症盯l 。y o u d i m 等认为帕金森病也与铁过量有关【耱】。现在用于 治疗铁过量的嗜铁素是d c s f c r r i o x a m i n e ( d f o ) ，但是这种药对于过敏体质的患 者是不适用的，所以对其它类型的嗜铁素包括p v d 的研究有助于解决这个问题。 嗜铁素近年来在药物方面的研究也越来越多了，由于嗜铁素的主要作用是结 合f e “，并通过嗜铁素受体把铁复合物转入微生物体内，因此可以把嗜铁素和抗 生素结合在一起，使抗生素更容易的进入靶向微生物体内，从而更有效地杀死靶 向瘸原菌，这是一种特洛伊木马( t r o j a nh o r s e s ) 策略i l l 】。h e r b e r tb u d z i k i e w i c z 设计用p v d 和一内酰胺抗生素结合，形成p v d 和b 一内酰胺复合物，用这种复合 物来解决机遇致病菌p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 的多药物抗性问题。 3 铁离子的检测方法 - 本实验用p v d 来检测水环境中的铁离予。目前人们测定铁的方法有分光光度 法，原子吸收分光光度法，电化学分析方法，x 射线荧光法，中子活化法以及电 感藕合等离子发射光谱法。常用的方法有三种：一种是分光光度法；一种是原子 吸收法；还有一种是电化学分析方法。 传统的分光光度法，首先要把有机铁及水合氧化铁转化为游离铁，分析前要 作消化处理，主要采用湿法消化。常用的消化剂有高氯酸、疏基乙酸等。处理过 的样品在一定p h 条件下( 缓冲溶液控制) ，用盐酸羟胺把三价铁还原为二价铁， 加入一些显色剂，使二价铁与络合剂反应生成稳定有色络合物，进行分光光度测 定，来测定海水中的铁。近年来，由于铁在催化动力学上的研究的飞速发展，出 现了许多利用铁对某些指示剂的催化显色作用高灵敏度测定铁的新方法，显色剂 l o 上海师范大学礤士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 有结晶紫【5 2 1 ，变色酸2 r m ，酸性铬深蓝( a c b d ) 【5 4 】，紫脲酸铵l ，胭脂红【5 s i 等，并 己应用于淡水和食品中铁的测定，获得了较好的效果。 原子吸收法，在原子吸收分析之前必须对样品进行预富集处理。常用的预富 集方法有溶剂萃取法，螯合树脂离子交换法，共沉淀法等m 】。溶剂萃取法的原理 主要是首先用二硫代氨基甲酸盐络合金属，用有机溶剂萃取之后，再用酸性溶液 进行反萃取，最后用h a s 法进行分析。它首先是把对铁有强络合用的f e r r o n ( 7 一 碘一8 一羟基喹啉一5 一磺胺) 吸附在树脂上，然后在利用f e r r o n 来吸附水中的金属。 这两种方法它们的富集倍数都不大，只适用于测定痕量金属浓度较高的海水。而 且，溶剂萃取法还要接触易挥发，有毒害的有机试剂。 电化学分析方法，近年来，随着电分析方法的发展，准确、快速的测定海水 中的各种微量金属也已成为可能。传统的电分析方法是吸附c s v ( 阴极溶出伏安) 法，后来v a i ld e nb e r g 又提出了催化c s v 法p 8 i 可以大大的增大还原电流，使灵 敏度大大提高，是一种较好的测定海水中的溶解铁的方法。 铁的光度分析法中，常用的有硫氰酸盐，邻菲嗲啉，铬天青，罗米诺化学发 光系统等，这些方法有的存在色泽不稳定的现象，有的需要荧光光度计等复杂仪 器。本实验设计了一种用紫外分光光度计测定铁浓度的方法，原理是荧光假单胞 菌产生的p v d 嗜铁索与铁螯和前后，它的特定波长的吸光值会发生改变忡】，且在 一定范围内，这种变化值和铁的浓度成线形关系，利用这种线形关系制作成工作 曲线，用工作曲线可以测定未知样品的铁浓度，这种方法可以测定水环境中的可 利用铁。 4 选题的目的和意义 近年来，对荧光嗜铁素p v d 的研究已受到越来越多的重视，主要集中在生 物防治，诱导系统抗性，结构与功能关系以及假单胞菌分类方面，在这些研究中 都要涉及到荧光嗜铁素p v d 的分离纯化以及理化特征等。但国内对于荧光假单 胞菌嗜铁素的研究还比较少，杨合同等( 1 9 9 4 年) 研究了荧光假单胞菌嗜铁素 的部分性质f 舯j ，包括光学性质和化学性质，其余的有光荧光嗜铁索的报道大多集 中在生物防治方面。为了比较系统的阐述和研究荧光嗜铁素，本实验从筛选高产 p v d 的荧光假单胞菌菌株开始，在摇瓶条件下研究荧光假单胞菌分泌荧光嗜铁 紊的培养基组成以及它的最佳发酵条件，通过分离纯化研究荧光嗜铁素的部分理 化特性，为荧光嗜铁素的规模化生产应用以及进一步的研究奠定基础。由于铁离 1 】 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 子过量会造成饮用水及其他水环境的污染，本文利用荧光嗜铁素的部分光学特 性，探索荧光嗜铁素应用于铁离子检测的条件，确立一种标准的检测铁的反应体 系，为环境中铁的检测提供一种快速简便的方法。 上海师范大学硕士学位论文荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 第二章高产荧光嗜铁素的荧光假单胞菌株筛选 对嗜铁索产量多少的检测方法采用较多的是c a s 检测法，该方法是s c h w y n 提出的1 6 1 1 ，c a s 检测法的原理可以用f e d y e 3 - y + l x 一f e k l + d y e 7 - 来表示。当对铁 离子具有更强亲和力的配位体( l ) 如p v d 加入到含有f c d y e 3 叮复合物( 即 c a s f e - h d t m a ) 的溶液中后，复合物的f c 3 + 便会被配位体( l ) 络合，溶液的 颜色也就从蓝色变为橙黄( 红) 色，根据颜色变化的有无及程度即可定性或定量 地测出嗜铁素。 c a s 检测法可以分为c a s 固体平板检测和c a s 检测液检测两种，它们的检 测原理是一致的。c a s 固体平板检测法不能定量分析嗜铁素的产生量，但可以 通过菌株在平板上产生的颜色发生改变的晕圈的半径大小来初步判断嗜铁素含 量的多少，常用+ 、一、士来表示【6 3 删。m a c h u c a a 等设计了种改进的c a s 固体 平板检测用来定量检测嗜铁素含量。m i l a g r e s 等也用了改进的c a s 固体平板来 检测嗜铁素的产量，将c a s 法和生物检测相结合【6 7 j 。t r s k o v a 等在c a s 法的基 础上增添了流动注射技术( h a ) ，并对c a s 法进行了适当的改进 拥1 。 本实验中采用了s c h w y n 的c a s 检测液检测法，本方法不但简便易行，适 合于大批量样品的测试，而且结果直观。 1 实验材料 1 1 菌种 荧光假单胞菌株，由彭瑁提供。 1 2 培养基 液体种子培养基： k 2 h p 0 46 9k h z p 0 43 9 h 如s 0 4l gm g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 s u c c i n i ca c i d4 9 p h7 0 固体种子培养基： 液体种子培养基基础上加2 0 9 琼脂。 上海师范大学硕士学位论文 荧光嗜铁素的发酵条件及其应用初探 发酵培养基： 水解酪蛋白5 9甘油1 5 m l k 2 h p o t2 5 9 m g s o “7 h 2 02 5 9 双蒸水1 0 0 0 m l p h7 o 一7 2 液体抗生素培养基( 1 l ) ： 在液体种子培养基基础上加抗生索a m p5 0 r a g ，用以保持种子的纯度。 m m 9 孰培养基： n a 2 i p 0 46 9k h # o , 0 3 9 n a c l5 9 n h c ii g 双蒸水1 0 0 0 m l c a s 固体培养基的配制： ( 1 ) 取6 0 5 m gc a s 溶于5 0 m l 水中，并与l o m ll m m 6 1 l f e c l 3 溶液( 1 m m o l f e e l 6 h 2 0 + l o m m o l lh c l ) 混匀，得溶液a 。 ( 2 ) 取7 2 9 m gh d t m a 溶于4 0 m l 水中，得溶液b 。 ( 3 ) 将a 边搅拌边缓慢加入b 中，得染液c 。 ( 4 ) 将1 0 m m 9 盐溶液( n a z h p o , 3 0 9 ，k h z p o , 0 1 5 9 ，n a c l2 5 9 ，n h t c l5 9 ， m g s o , 7 也o0 5 9 ，双蒸水5 0 0 r a l ) l o o m l ，3 0 2 4 9p i p e s 加入盛有7 5 0 m l 心0 的瓶中， 混匀后，用5 0 n a o h 调节p h 至6 8 ，再加入琼腊粉1 5 9 得培养基d 。 ( 5 ) 将染液c ，培养基d 及l m n o l lc a c l “i m m o l 几m g s 0 4 7 h 2 0 ，2 0 葡萄 糖，1 0 酪蛋白氨基酸分别灭菌( 1 1 5 c ，2 0 m i n ) 后，置于5 0 水浴锅中保温待用。 ( 6 ) 分别取上述i m o l l c a c l 2l m l ，1 m m 0 1 l m g s o _ 7 h 2 02 0 m l ，1 0 酪蛋白氨基酸 3 0 m l 及2 0 的葡萄糖溶液l o m l 加入培养基d 中，再沿瓶壁加入染液c ，充分摇匀 ( 勿产生气泡) ，即得蓝色定性检测培养基。 ( 7 ) 然后按每皿3 0 m l 倾注于培养皿( 吐，9 0 m m ) 中。 1 3 试剂 铬天青( c a s ) ，北京瀛海精细化工厂； 8 一羟基喹啉，上海化学试荆采购供应站： 水解酪蛋白，b i ob a s i ci n c ； 1 4 上海师范丈学硕士学位论文荧光嗜铁囊的发酵条件及其成用韧探 h d t m a ，华美生物工程公司： a n h y d r o u sp i p e r a z i n e ，国药集团上海化学试剂公司； p i p e s ，国药集团上海化学试剂公司。 c a s 液体检测液的配制： ( 1 ) 取l o w a n o l lh d t m a ( 十六烷基三甲基溴化铵) 溶液6 o m l 加入l o o m l 容量 瓶内，用双蒸水适度稀释。 ( 2 ) 将1 5 m ll n m o l lf e c l 3 溶液( 1 m m o lf e c l3 6 h 2 0 + l o m m o l lh c i ) 与7 5 m l 2 m m o l lc a s 溶液混匀后，沿玻璃棒缓慢加入( 1 ) 中的容量瓶内，边加入边搅拌。 ( 3 ) 称取4 3 0 7 9a n h y d y o u sp i p e r a z i n e ( 无水哌嗪) ，溶解于3 0 m l 双蒸水中， 再小心加入6 2 5 m l1 2 m m o l l h c l ，即得p h = p k a = 5 6 的缓冲液将此溶液转入前述 的1 0 0 m l 容量瓶中并用双蒸水定容至l o o m l 。 1 4 仪器设备 7 5 2 型紫外分光光度，上海精密科学仪器有限公司； 离心机，上海安亭科学仪器厂； 摇床，哈尔滨市东明医疗仪器厂； 无菌操作台，上海上净净化设备有限公司； 2 实验方法 2 1 荧光假单胞菌发酵培养方法 一级种子培养： 分离出的荧光假单胞菌菌株在平板上2 8 c 活化2 4 h 后，用铂金接种环挑取 单菌落接入5 m l 抗生素液体培养基中，置于摇床中，2 8 ，1 5 0 r m i n 条件下培 养2 4 h ，然后接种到固体种子培养基中，在2 8 。c 下培养2 4 h 。 二级种子培养： 将培养好的一级种子用铂金接种环挑取一环，接入5 0 n l l ( 1 5 0 l l 摇瓶) 液体培 养基中，在摇床中2 8 c ，1 5 0 r m i n 条件下培养2 4 h 。 发酵培养： 将二级种子按1 的接种量接于1 5 0 m l ( 5 0 0 m l 摇瓶) 发酵培养基中，培养基预 先用8 一羟基喹啉处理除去痕量铁，起始p h 6 5 ，温度控制在2 8 c ，摇床15 0 r m i n ， 发酵时间4 8 小时左右。 上海师范大学硕士学位论文 荧光嗜铁囊的发酵条件及其鹰用初探 2 2 荧光嗜铁素的c a s 固体平板检测 取c a s 固体培养基加热融化，冷却到5 0 c 左右无菌操作倒入培养皿，每皿 3 0 m l 。完全冷凝后，用铂金接种环从分离到的荧光假单胞菌的新鲜斜面上挑取菌 苔在上述平板上划线接种。置2 8 c 培养，4 8 h 后观察菌落周围的颜色变化。 2 3 荧光嗜铁素的c a s 检测液检测 各荧光假单胞菌株摇床培养的发酵液离心1 5 m i n ，转速3 5 0 0 r m i n ，取上清 液3 m l 加入等体积的c a s 检测液，充分摇匀，静置1 h 后，用分光光度计测6 3 0 r i m 波长处的吸光值a 。取双蒸水调零。 另外取3 m lc a s 检测液与3 乩未接种的发酵培养基上清液充分混匀。同法测 定吸光值即为对照值a r t “】。 嗜铁素的相对量用公式( i - ( a a r ) ) x1 0 0 来表示。 3 结果与分析 3 1 荧光假单胞菌发酵培养的结果 各株荧光假单胞菌发酵4 8 h 后，均在三角瓶中产生黄绿色的、水溶性的荧光 嗜铁素素，见图7 。 图7 荧光假单胞菌产生1 蛩8 c a s 平扳法检测p v d 的黄绿色荧光色紊 3 2 荧光假单胞菌株的c a s 检测结果 图9c a s 液体法检测p v d 1 6 上海师范大学硕士学位论文 荧光嗜铁鬃的发酵条件及其应用初探 用c a s 平扳法检测法对1 0 4 株荧光假单胞菌的发酵液进行p v d 的测定，各菌 株在c a s 平板上都里阳性，在菌落周围产生了橙黄色的晕圈其结果见图8 。 用c a s 检测液检测法对1 0 4 株荧光假单胞菌的发酵液进行p v d 的测定，对照 和试样的颜色变化情况见图9 ，各菌株产生p v d 的具体含量见表4 。 表4 各荧光假单胞菌株的荧光嗜铁紊产生情况 编号来源c a s 固体平板检测1 - ( a i a r ) +0 - 3 2 3 0 3 6 5