（植物学专业论文）濒危植物岷江柏（cupressus+chengiana+syhu）的保护遗传学研究.pdf

一 f 四川大学硕士学位论文 濒危植物岷江柏( c u p r e s s u s 。c h e n g i a n as y 。h u ) 的 保护遗传学研究 植物学专业 研究生都冰清指导教师王丽教授 摘要 岷江柏( c u p r e s s u sc h e n g i a n as y h u ) 是一种柏科( c u p r e s s a c e a e ) 柏 木属( c u p r e s s u s ) 乔本，俗称香柏、油柏、木香树，仅产于我国四川和甘肃两 省，是我国特有珍贵树种，作为国家二级重点保护植物被收录于中国植物红 皮书。该柏木生长在1 5 0 0 2 6 0 0 m 的干热河谷，为适应性强的树种，在土层瘠 薄的山坡甚至石灰岩峭壁也能生长，极耐干旱瘠薄，具有良好的水土保持和水 源涵养作用，是长江上游地区水土保持的重要树种和高山峡谷地区干旱河谷地 带荒山造林的先锋树种之一岷江柏木材质坚硬致密，有香气，为建筑、家具、 器具等的优良用材，亦可作为分布地区的行道树。因此岷江柏具有重要的保护 价值和经济价值。岷江柏的自然种群曾广泛分布于岷江流域，大渡河流域和白 龙江流域，是三条江河流域分布区内的主要树种之一然而由于长期以来的人 工采伐、生境的变化以及岷江柏自然更新缓慢的生物学特性，其自然群落的分 布地区和分布面积均曰益缩小，现存天然林不多，已面临濒危的处境。因此， 从物种保护的角度上研究其遗传多样性和遗传结构，探讨其濒危机制，并制订 有效保育措施具有重要意义。 为了解岷江柏居群的遗传学状况，探讨其濒危机制，为保护措施的制定提 四川大学硕士学位论文 供科学的理论根据，采用简单重复序列间标记( i n t e r - - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ， i s s r ) 对岷江柏居群的遗传多样性和遗传结构进行了分析；此外，将岷江柏不 同居群的化学组分比较研究应用于居群遗传学的研究，为岷江柏居群闻的多样 性研究提供了新的线索。主要研究结果如下： 1 采用i s s r 分子标记技术对8 个岷江柏自然居群的遗传多样性水平和居群遗 传结构进行了研究。用1 0 个i s s r 引物对来自8 个居群的9 2 个样品共扩增 出1 3 8 个清晰的扩增位点，其中多态性位点1 3 6 个，多态位点百分率( p p b ) 为9 8 5 5 。岷江柏在物种水平上具有较高的遗传多样性，而各个居群的遗 传多样性水平相对较低( 3 4 0 6 6 3 7 7 ) ，并且各居群多态位点百分率差 异显著：甘肃文县的遗传多样性水平最高( p p b = 6 3 7 7 ，h e = o 2 0 0 1 ，i = 0 3 0 6 4 ) ，四川金川县遗传多样性水平最低( p p b = 3 4 0 6 ，h e - - - - 0 1 1 2 5 ， i = o 1 7 0 5 ) 。个体聚类图表明，来自同一居群的个体大都聚在一起。n e i s 遗传分化分析表明，8 个自然居群间出现了较高程度的遗传分化( g s t = 0 4 7 9 1 ) 。a m o v a 方差分析得出，岷江柏自然居群内的遗传变异占变异成分 的5 3 7 5 ，4 6 2 5 的变异发生在不同居群问，居群间的基因流动频率较 低，为0 5 4 3 6 。m a n t e l 统计检验得到岷江柏自然居群遗传距离与地理距离 的相关系数r - - - - o 6 7 0 1 ( p = 0 0 0 8 ) ，表明居群间遗传距离和地理距离之间 里显著的正相关关系。人为干扰是导致该物种濒危的主要原因之一。 2 用c - c - - m s 仪对岷江柏7 各自然居群的岷江柏叶进行了化学组分研究共分 离鉴定出9 3 种组分，占主要地位的有：库贝醇和桃柘酚等；较主要的组分 的有：l r - a 一蒎烯，桧烯，大根香叶烯d ，棕罗汉松酚，和孕烯醇酮等。岷 江柏化学成分十分复杂。用s p s s l 2 0 和n t s y s p e2 1 0 软件进行了聚类分 析，主成分分析，相关性分析和m a n t e l 检验岷江柏化学组分与居群间关 系存在较强的联系，初步证明此方法可以应用于岷江柏居群间关系的研究。 关键词：岷江柏；i s s r ；遗传多样性；遗传结构；g c l i s ； 2 7 1 ， i 、| 四川大学硕士学位论文 s t u die so no o n s e r v a tio rg e n e tic s inc u p r e s s u s c h e n g i a n as y h u ，a ne n d a n g e r e ds p e c io s g a j o r ：b o t a n y a u t h o r ：姒o b i n g q i n g s u p e r v is o r ：p r o f w a n gl i a b s t r a c t c u p r e s s u sc h e n g i a n as y h u ，ac o n i f e ro ft h eg e n u sc u p r e s s u s i nc u p r e s s a c e a e 。 i sa l lp r e c i o u ss p e c i e se n d e m i ct os i c h u a na n dg a n s up m v i n c ei nc t 畦n a , w h i c hh a s b e e nn o m i n a t e du st h e2 日dc l a s sp r o t e c t i o np l a n t si n p l 柚tr e db o o ko fc h i n a - r a r e t h r e a t e n e dp l a n t n v i n gi na r i d - h o tv a l l e y sa ta ne l e v a t i o no f1 5 0 0 2 6 0 0 m , c c h e n g i a n as h o w ss i g n i f i c a n ta d a p t a b i l i t yt ot h ee n v i m n m e n tw i t hh i g ht o l e r a n c ef o r l e s sf e r t i l es o i l sa n dd i ) ra n dc o l dh a b i t a t s ，a n d 锄e v e ng r o wo nr o c k yc u 凰a n d h i l l s i d e s i ti sap r i o r i t yf o rf o r e s t a t i o na n ds o i la n dw a t e rp r e s e r v a t i o ni nt h eu p p e r r e a c h e so fc h a n g j i a n gr i v e rb e c a u s eo fi t sf i n ec a p a b i l i t yo fw a t e r g s o l l r c l 嚣 c o n s e r v a t i o n o nt h eo t h e rh a n d , s i n c ecc h e n g i a n ai sc h a r a c t e r i s t i co fi t sf i n e t i m b e ra n ds p e c i a la r o m a , i th a se x t e n s i v eh i s t o r i e so fu s ei nf u r n i t u r em a k i n g , t e m p l ec o n s t r u c t i o n , a n db o a tb u i l d i n g , t h en a t u r a lp o p u l a t i o n so fcc h e n e g i a n a o n c ed i s t r i b u t e de x t e n s i v e l yi nt h eu p p e rr e a c h e so fm i n j i a n g , d a d u h ea n db a l o n g h e r i v e r s h o w e v e r , r e c e n t l y , t h ed i s t r i b u t i o na r e a so fcc h e n g i a n ad w i n d l e dg r a d u a l l y a n di n d i v i d u a l sb e c a m ef e w e rs h a r p l yo w i n gt ob a d l yd e s t r o y e de n v i r o n m e n t s ， o v e r - l o g g i n g , g r a z i n ga n di t sb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s i nt h i sr e s e a r c h , t h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cs t r u c t u r eo fcc h e n e g i a n a 3 0 四川大学硕士学位论文 p o p u l a t i o n sw a ss t u d i e du s i n gi s s rm a r k e r sw i t ht h ea i m st oi l l u m i n a t et h eg e n e t i c b a c k g r o u n d so fcc h e n e g i a n a ，a n a l y z et h em e c h a n i s mo fi t se n d a n g e r m e n t , a n d c o m eu pw i t hc o n s e r v a t i o ni m p l i c a t i o n s i na d d i t i o n , c c h e n g i a l l a sc h e m i c a l c o m p o u n d sw e r ea n a l y z e di no r d e rt o f i n dan e wm e t h o dt os t u d yi t sg e n e t i c b a c k g r o u n d s t h er e s u l t sw e r e a sf o l l o w s ： 1 i s s rm a r k e r sw e r eu s e dt oa n a l y z et h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cs t r u c t u r eo f8 n a t u r a lp o p u l a t i o n so fc u p r e s s u sc h e n g i a n ai nc h i n a i s s ra n a l y s i su s i n g1 0 p r i m e r sw a sc a r r i e do u to n9 2d i f f e r e n ts a m p l e s a tt h es p e c i e sl e v e l , 1 3 6 p o l y m o r p h i cl o c iw e r ed e t e c t e d n cp e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cb a n d s ( p p b ) w a s 9 8 5 5 g e n e t i cd i v e r s i t y ( h e ) w a s0 3 1 2 0 , a n ds h a n n o n si n f o r m a t i o ni n d e x w a so 4 7 4 0 a tt h ep o p u l a t i o nl e v e l ，p p b - - 4 7 8 3 ，h e = 0 1 6 3 1a n di = 0 2 4 5 2 g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n ( g - s t ) d e t e c t e db yn e i s g e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i s s u g g e s t e d4 7 9 1 o c c u r r e da m o n gp o p u l a t i o n s t h ep a r t i t i o n i n go fm o l e c u l a r v a r i a n c eb ya m o v a a n a l y s i si n d i c a t e ds i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nw i t h i n p o p u l a t i o n s ( 5 3 7 5 ) a n da m o n gp o p u l a t i o n s ( 4 6 2 5 ) 1 1 l ca v e r a g en u m b e ro f i n d i v i d u a l se x c h a n g e db e t w e e np o p u l a t i o n sp e rg e n e r a t i o n ( n m ) w a s0 5 4 3 6 s a m p l e sf r o mt h es a m ep o p u l a t i o nc l u s t e r e di n t h es a m ep o p u l a t i o n s p e c i f i c c l u s t e ra n dt w og r o u p so fs i c h u a na n dg a n s up o p u l a t i o n sw e r ed i s t i n g u i s h a b l e a s i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e ng e n e t i ca n dg e o g r a p h i cd i s t a n c ew a s d e t e c t e d ( r - - - o 6 7 0 1 ) h u m a ni m p a c t sw e r ec o n s i d e r e do n eo ft h em a i nf a c t o r si n t h ec a u s eo ft h er a r i t yo f c c h e n g i a n a 2 t h ec h e m i c a lc o m p o u n d so f7n a t u r a lp o p u l a t i o n so fcc h e n g i a n aw e r ea n a l y z e d u s i n gt h eg c - m sm e t h o d 9 3d i f f e r e n tc h e m i c a lc o m p o u n d sw e r ef o u n d n c c o n t e n t so ft h e s ec o m p o n e n t sw e r et h e nc a l c u l a t e da n da p p l i e di nc l u s t e ra n a l y s i s ， p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ，c o r r e l a t i o na n a l y s i s a n dm a n t e lt e s t u s i n g s p s s l 2 0a n dn t s y s p c2 。1 0s o f t w a r e t h cr e s u l t ss h o w e dt h a tt h i sm e t h o dw a s a p p l i c a b l ei nt h es t u d yo ft h er e l a t i o n s h i p sa m o n gp o p u l a t i o n so fcc h e n g i a n a k e y w o r d s ：c u p r e s s u sc h e n e g i a n a ；i s s r ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；g e n e t i cs t r u c t u r e ； g ( m s 4 四川大学硕士学位论文 刖茜 1 岷江柏的形态特征和生物学特性 岷江柏( c u p r e s s u sc h e n g i a n as yh u ) 是柏科柏木属的种，俗称香柏、 油柏、木香树，因其系岷江河谷特有的树种面命名。岷江柏系常绿乔术，高达 3 0 4 0 m ，胸径可达2 m ：树冠尖塔形，老树常呈不规则的球形。1 3 年生枝条 颜色由黄绿色逐渐变为红褐色或紫褐色，被有鳞叶，斜向开展，不排成平面， 亦不下垂，无蜡粉；幼苗具二型叶，在1 - - 2 年生时全为刺叶，长4 6 砌，基 部无关节，轮生。3 一- 4 年生苗开始出现鳞叶，5 年生苗刺叶一般脱落。鳞叶斜 方形，长约l m ，交叉对生，排成四列，无蜡粉，叶背拱圆，中部有腺点。球 果近球形或长球形，成熟时红褐色或揭色，径1 - - 2 ( 2 5 ) c i l l ；种鳞盾形，多皱， 中央具有短尖突起，顶端一对常里不规则的扁四边形，其余各对为五边形。种 子多数，扁圆形或倒卵状圆形，长3 5 咖，宽3 4 m ，两侧有窄翅，宽约l 咖。 岷江柏根系发达，1 年生幼苗主根长可达苗高五倍以上大树的根系能深 入岩缝中，固定功能很强，能在悬崖峭壁上生长。在成、过熟期，小枝先端常 呈簇状，下部枝条多弯曲或呈平展状，其上方着生由不定芽形成的簇状短枝。 树皮呈片状纵向剥落，常在树干基部形成数列横向褶皱。树干常有类似瘸状物， 因而俗名又称疙瘩柏( 南坪) 、坨坨柏( 理县) 。能扦插繁殖，采伐后可由伐桩上 的不定芽萌蘖形成次生林 岷江柏材质良好，结构细密，纹理通直而清晰，质地坚硬，具有芳香味， 心材褐色，不翘不裂，是上等建筑及器具用材。 2 岷江柏自然居群的分布现状 岷江柏木原产于四川岷江流域( 茂县、汶川、理县) 、大渡河流域( 马尔康、 金川、小金、丹巴) 及甘肃白龙江流域( 南坪县和甘肃南部的舟曲、石门、武都) 的高山峡谷地区中山地带。以岷江柏木为建群种的森林，曾广泛分布于上述地 区，后经长期人为活动的破坏，现存天然林分不多，已属于渐危种。茂县境内 一 四川大学硕士学位论文 对其的破坏性最大，现保存完整的分布区不足l h r ，在茂县的中渠残存有稀疏 幼林( 1 9 5 8 年择伐后形成) ，原系当地“神林”。从马尔康县松岗乡开始，至丹 巴县的河段两岸，是岷江柏当前的主要分布区。马尔康种群的岷江柏林分所受 人为干扰最轻，境内设有岷江柏专门的保护区，总面积达2 2 7 万h 2 ，种群保 存较完好，有部分原始林存在。小金种群可能是由于离居民点近，人为破坏严重， 气候条件较差，岷江柏生长较差。 关于岷江柏木的散生木分布已有资料说法不一，四川珍稀濒危植物的 记载是氓江柏木生于海拔1 5 0 0 - 2 6 0 0 m 的干热河谷；四川植被记载为岷江柏 分布海拔2 0 0 0 - 3 0 0 0 m ；中国珍稀濒危植物中说岷江柏木产于海拔8 9 0 - 2 9 0 0 m 的峡谷两侧或干旱河谷地带；四川松杉植物地理记载是岷江柏木垂直分布 在海拔1 3 0 0 - 2 8 0 0 m ，以海拔1 8 0 0 - 2 6 0 0 m 常见；四川植物志记载岷江柏产于 海拔1 5 0 0 - 2 8 0 0 m ；中国珍稀濒危保护植物认为岷江柏木的分布海拔为1 9 0 0 - 3 4 0 0 m 。 3 岷江柏研究历史 早在1 9 0 4 年及1 9 0 8 年英人威尔逊在调查海拔1 3 0 0 2 5 0 0 的大小金川及 其支流的干热河谷时，报道此树生长较普遍。建国初期，由于当时国情所限， 没有对岷江柏木种群进行研究。自7 0 年代开始，中国植物志( 1 9 7 8 ) 首先将岷江 柏木载入其书，这是我国对岷江柏木研究的最早记录。8 0 年代起，四川植被 协作组( 1 9 8 0 ) 、四川i 植物志编辑委员会( 1 9 8 3 ) 、中国树木志编辑委员会 ( 1 9 8 3 ) 、四川i 珍稀濒危植物编辑委员会( 1 9 8 9 ) 、中国珍稀濒危植物编辑委员 会( 1 9 8 9 ) 相继对岷江柏木进行研究。由于国家在1 9 8 4 年7 月将岷江柏木列为国 家二级保护植物，所以此后对岷江柏木的研究有所加强。 有关岷江柏及其林分的研究主要基于2 0 世纪6 0 8 0 年代中期所获得的调 查资料，开展过岷江柏分布、分类学、群落和林分特征、林木生长过程等的初 步研究。2 0 世纪9 0 年代岷江柏分布核心区川西地区( 阿坝州) 的基层林 业部门对岷江柏进行了人工育苗，并将岷江柏广泛用于干旱河谷区造林。在四 川省马尔康也建立了岷江柏州级自然保护区。9 0 年代以后对岷江柏的分类学地 位( r u s h f o r t hc ta i ，2 0 0 3 ) ，化学成分( l a u r e n c ec ta i ，1 9 9 8 ；江玉师等，1 9 8 9 ) ， 细胞学( 石大兴和王米力，1 9 9 4 ，李林初和傅煜西，1 9 9 6 ) ，和资源保护生态学 ， i 四川大学硕士学位论文 ( 庞学勇和包维楷，2 0 0 5 ；袁志忠等，2 0 0 4 ) 进行了研究。 总的来看，我国对岷江柏木种群的濒危及其濒危机制的研究较少跟其他 珍稀濒危植物相比，对岷江柏木种群的研究力度还很欠缺。因此，我们对岷江 柏木种群的濒危原因还不清楚，许多认识和观点也缺乏相应的科学依据。由此 可见，对岷江柏木种群进行详细系统的研究，特别是濒危机制和致危原因的研 究，是十分必要和非常重要的。 7 h 。一 四川大学硕士学位论文 第一章岷江柏自然居群遗传多样性的is s r 分析 摘要：采用i s s r 分子标记技术对8 个岷江柏自然居群的遗传多样性水平和居 群遗传结构进行了研究。用1 0 个i s s r 引物对来自8 个居群的9 2 个样品共扩增 出1 3 8 个清晰的扩增位点，其中多态性位点1 3 6 个，多态位点百分率( p p b ) 为 9 8 5 5 岷江柏在物种水平上具有较高的遗传多样性，而各个居群的遗传多样 性水平相对较低( 3 4 0 6 9 6 6 3 。7 7 ) ，并且各居群多态位点百分率差异显著：甘 肃文县的遗传多样性水平最高( p p b = 6 3 7 7 ，h e - - - - 0 2 0 0 1 ，i = 0 3 0 6 4 ) ，四 川金川县遗传多样性水平最低( p p b = 3 4 0 6 ，h e = o 1 1 2 5 ，i = o 1 7 0 5 ) 个 体聚类图表明，来自同一居群的个体大都聚在一起。n e i s 遗传分化分析表明， 8 个自然居群间出现了较高程度的遗传分化( g s t = o 4 7 9 1 ) 。a m o v a 方差分析得 出，岷江柏自然居群内的遗传变异占变异成分的5 3 7 5 ，4 6 2 5 的变异发生 在不同居群间，居群问的基因流动频率较低，为0 5 4 3 6 。m a n t e l 统计检验得到 岷江柏自然居群遗传距离与地理距离的相关系数r = o 6 7 0 1 ( p = 0 0 0 8 ) ，表明 居群间的遗传距离和地理距离之间呈显著的正相关关系。针对岷江柏居群的遗 传多样性现状提出初步保护策略。 关键词：岷江柏；i s s r = 遗传多样性；遗传结构 引言 岷江柏( c u p r e s s u $ c h e n g i a n as y h u ) 是我国特有珍贵树种，是属于柏 科( c u p r e s s a c e a e ) 柏木属( c u p r e s s u s ) 乔本，俗称香柏，油柏、木香树，作 为国家二级重点保护植物被收录于中国植物红皮书( 傅立国，1 9 9 2 ) 该柏 木生长在1 5 0 0 2 6 0 0 m 的干热河谷( 高宝莼等，1 9 8 9 ) ，为适应性强的树种，在 土层瘠薄的山坡甚至石灰岩峭壁也能生长，极耐干早瘠薄，是长江上游地区水 土保持的重要树种和高山峡谷地区干旱河谷地带荒山造林的先锋树种之一，具 8 i 四川大学硕士学位论文 有良好的水土保持和水源涵养作用。岷江柏木材质坚硬致密，有香气，为建筑、 家具、器具等的优良用材，亦可作为分布地区的行道树因此岷江柏具有重要 的保护价值和经济价值岷江柏的自然种群曾广泛分布于岷江流域，大渡河流 域和白龙江流域，是三条江河流域分布区内的主要树种之一( 管中天，1 9 8 2 ； 四川森林编辑委员会，1 9 9 0 ) 。然而由于长期以来的人工采伐、生境的变化以及 岷江柏自然更新缓慢的生物学特性，其自然群落的分布地区和分布面积均日益 缩小，现存天然林不多( 四川森林编辑委员会，1 9 9 0 ；傅立国，1 9 9 2 ；刘庆， 2 0 0 2 ) ，已面临濒危的处境。因此，从物种保护的角度上研究其遗传多样性和遗 传结构，探讨其濒危机制，并制订有效保育措施具有重要意义 物种的基因库和其最大的遗传多样性的保育是成功保育一个物种的关键， 而对该物种遗传多样性的了解是保育遗传多样性的基础。前人用r a p d 、同功酶 等技术研究了柏属其它植物的遗传多样性进行过一些研究( b a r t e lc ta 1 ，2 0 0 3 ； r u s h f o r t he ta 1 ，2 0 0 3 ；s a b d n a & s a b r i , 1 9 9 9 ) ，但对岷江柏的研究仅见于其分类 学地位( r u s l d o n he ta 1 ，2 0 0 3 ；牟林春等，2 0 0 5 ) ，化学成分( l a u r e n c ee ta 1 ，1 9 9 8 ： 江玉师等，1 9 8 9 ) ，细胞学( 石大兴和王米力，1 9 9 4 ，李林初和傅煜西，1 9 9 6 ) ， 和资源保护生态学方面的报道( 庞学勇和包维楷，2 0 0 5 ；袁志忠等，2 0 0 4 ) ，对 其遗传多样性、居群遗传结构等信息尚一无所知。因此有必要对岷江柏的遗传 多样性进行研究。 近年来，随着分子生物学的迅速发展，d n a 分子标记技术广泛地应用于群 体遗传多样性和保护生物学的研究。简单重复序列间标记( i n t e r - - s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 技术是近年来在微卫星技术上发展起来的一种新型分 子标记技术。它主要是以一条与微卫星序列互补的并在3 或5 端含有2 4 4 个随机碱基的d n a 序列为引物对基因组d n a 进行p c r 扩增( z i e t l 【i e w i c z c ta 1 ，1 9 9 4 ) 。这项技术适用于任何在基因组中分布有足够数量s s r 单元的物种， 对目前尚不清楚基因组序列的物种尤为有用。由于i s s r 技术不仅可以快速、高 效和灵敏地检测出基因组d n a 的多态性，有很好的重复性，而且操作简单，成本 较低，特别适合于大样本的检测，因而在种群遗传学、种质资源、分类学与种 系发生学等方面得到迅速应用。目前己广泛应用于小麦( n a g a o k a & o s i h a r a , 1 9 9 7 ) 、水稻( , 他a s ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 、中国疣粒野生稻( 钱韦等，2 0 0 0 ) 等植物的 遗传多样性或品种鉴定等研究。本试验采用i s s r 标记对岷江柏自然居群进行遗 四川大学硕士学位论文 传多样性分析，旨在进一步从分子水平上阐明其居群间遗传关系，探讨岷江柏 的濒危原因，为其资源合理保护利用提供理论依据。 1 材料与方法 1 1 实验材料 表1 1 螺江柏8 个居群材料采样地点 t a b l e1 1 d e s c r i p t i o no f8n a t u r a lcc h e n g l a n ap o p u l a t i o n sa r t a l y z e d 在岷江柏分布的四川省和甘肃省采集t 8 个自然居群，每一居群选取1 0 1 4 个个体，合计9 2 份样品。8 个自然居群的分布见图1 1 各居群所在地见表1 1 。 每居群随机选取1 0 - 1 4 个样株，每样株间隔距离至少l0 i i l 以上，每株采集的叶片 装入自封袋中用硅胶干燥保存，并尽快进行总基因组d n a 的提取。 1 2 实验方法 1 2 1 岷江柏总d n a 的提取方法 1 2 1 1s d s 法( j 萨姆布鲁克等，1 9 9 2 ) ( 1 ) 取2 9 叶片，在液氮中迅速研磨成细粉状； ( 2 ) 将粉末转移至5 0 r a l 离心管中，加入1 6 m l 细胞提取液( 1 0 0 m mp h 8 0 1 0 四川大学硕上学位论文 图1 1 岷江柏8 个采样居群的分布 f i g 1 id i $ t r i b u t i o no fe i g h tp o p u l a t i o n so fdc h e n g l a n a t r i s h c l ：5 r a m p h 8 0 e d t a ；5 0 0 m m n a c l 1 2 5 s d s ；1 r a m b 巯基乙醇) ， 混匀，6 5 水浴保温2 0 m i n ； ( 3 ) 加入5m l 5 mk c i 溶液，冰浴2 0 m i n 后，4 0 0 0 r p m4 c 离心2 0 m i a ； ( 4 ) 取上清液，加等体积氯仿，异戊醇混匀，4 0 0 0 r p m4 c 离心5 m i a ； ( 5 ) 取上清夜，加等体积氯仿异戊醇，4 0 0 0 r p m4 c 离心5 m i n ： ( 6 ) 取上清液，加入2 3 倍体积的异丙醇，静置1 5 m i n ，离心获得沉淀物 用7 0 的乙醇洗3 次后，加入2 0 0 【i t e ( 1 0 m m o l l t r i s h c l ，1m m o i l e d t a ) 缓冲液，d n a 溶解后加入z “1 r n 觞e ： ( 7 ) d n a ：浓度和纯度的检测：1 的o 5 x t b e 琼脂糖凝胶电泳，以t a k a r a 公司1 5 0 0 0 d l m a r k e r 作为分子量对照，检测照像。 1 2 1 2c t a b 法 吨 、t ， 四川大学硕士学位论文 参照d o y l e 等( 1 9 8 7 ) 提出的方法并适当修改。 ( 1 ) 取2 9 叶片，用液氮研磨成细粉，将粉末转移到5 0 m l 离心管中，加 入2 0m l 预热至6 5 0 c 的2 xc r a b 缓冲液( 1 0 0 m m o l lp h 8 0 的1 协h c i ， 1 4 m m o l l n a c i ，2 0m m o l l p h 8 0e d t a ， 2 的c r a b ，2 b 巯基乙醇) ， 混匀，置于6 5 0 c 水浴中放置6 0 m i n ； ( 2 ) 混合物冷至室温后加入等体积的氯仿，异戊醇，5 0 0 0 9 离心1 0 m i n 分相； ( 3 ) 在上清液中加1 1 0 0 体积的r n a s c a ，3 7 0 c 保温3 0 m i n ： ( 4 ) 加入扔体积的异丙醇，室温放置1 5 m i n 后5 0 0 0 9 离心1 0 m i n ； ( 5 ) 将d n a 转移至5m l7 6 7 - - , 醇、0 2 m o l l n a a c 的离心管中，冰上放 置2 0 r a i n ，再转移至5m l 7 0 乙醇的离心管中，冰上旋转5 r a i n ： ( 6 ) 将d n a 溶于尽可能少的 r e 缓冲液； ( 7 ) 同s d s 法。 i 2 i 3 改良c t a b 法 采用d o y l e 等( 1 9 8 7 ) 提出的，经中国科学院植物研究所系统进化与植物 学开放研究实验室改进的方法( 邹喻苹等，2 0 0 1 ) ，并做适当修改。 ( 1 ) 取少量叶片，用液氮研磨成细粉，研磨时加入少量p v p 于粉，将粉 末转移到1 5 m - l 离心管中，加入l m l 预热至6 5 的2 x c r a b 缓冲液( 含有 1 0 0 m m o l lp h 8 0 的t r i s h c i ，1 4 m m o l ln a c i ，2 0m m o l lp h 8 0 的e d t a ， 2 c m 镭，2 b 一巯基乙醇，) ，混匀，置于6 5 水浴中放置6 0 m i u ； ( 2 ) 5 0 0 0 9 离心5 m i n 取出水相； ( 3 ) 水相加入等体积的酚氯仿，异戊醇( 体积比2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀后 8 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，取上清： ( 4 ) 上清液加入等体积的酚氯o 异戊醇( 体积比2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀 后8 0 0 0 9 离心1 0 r a i n ，取上清液； ( 5 ) 上清液加入2 3 体积的冰冷异丙醇沉淀d n a ，一2 0 放置至少3 0 m i n 后1 0 0 0 0 9 离心1 0 r a i n ： ( 6 ) 倒掉液体，7 0 乙醇洗沉淀两次，加入4 0 瞅l 无菌去离子水溶解沉淀， 加1 1 0 0 体积的r n a s c a ，3 7 水浴保温6 0 m i n ： ( 7 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 体积比2 4 ：1 ) ，8 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，取上 1 2 t 四川大学硕士学位论文 清； ( 8 ) 上清液加入2 倍体积冰冷的9 5 乙醇，一2 0 放置至少3 0 m i n 后 1 0 0 0 0 9 离心l o m i n ； ( 9 ) 倒掉液体，7 0 * 0 乙醇洗沉淀两次，自然风干后溶于5 0 , u l 无菌去离子 水溶解沉淀； ( 1 0 ) 同c i a b 法的( 7 ) 步。 1 2 1 4 岷江柏总d n a 的提取方法比较 待测d n a 样品用无菌去离子水稀释至3 m l ，保证其浓度范围在5 - 5 0 u g , m l t 间以无菌去离子水作为参比液调零，三种方法提取的d n a 样品作为待测液， 在u v 二ss p c c t r o p h o t o m e t e r ( t u 1 9 0 1 ) 型紫外分光光度仪上分别测定其在 2 6 0 r i m 和2 8 0 r i m 处的0 d 值。 1 2 2l s s r 扩增程序及p c r 产物的检测 i s s r - p c r 反应基本程序为：9 4 预变性5 m i n ，一个循环；9 4 变性3 0 s ，4 8 复性4 5 s ，7 2 延伸2 m i n ，进行4 0 个循环；7 2 延伸7 m i r a4 一终止反应。 p c r 仪型号为：p e r k i ne l m e rg e n ea m pp c rs y s t e m2 4 0 0 。 扩增产物以t a k a r a 公司l o o b p d n a l a d d e r 为分子标记，经1 5 琼脂糖凝胶电 泳分离，电泳结束后用髓染色，并在g e n e g e n i u sb i o i m a g i n gs y s t e m 凝胶成像 仪上成像观察。 ” 1 2 3l s s r 扩增步骤中实验条件的优化 参照g e s u n 的i s s r - p c r 反应中各成份的含量，对可能影响引物清晰度 和多态性的因子：d n a 模板浓度，引物浓度，m 9 2 浓度，d n t p 浓度，t a q 酶含量， 和退火温度进行了梯度实验，以寻找最佳的p c r 反应体系。p c r 反应采用2 0 pl 体系，各条件梯度设计见表1 2 。 1 2 4l s s r 引物筛选 用加拿大哥伦比亚大学( u b c ) 提供序列，t a k a r a 公司合成的i s s r 引物 以每个居群混合叶片提取的总d n a 为模板，用条件优化得到p c r 条件，并用 四川大学硕士学位论文 表1 2i s s r 条件优化中所测试的条件梯度 t a b l e1 2c o n d i t i o nd e s i g nf o ri s s r - p c l l 模板d n a引物d n t p 2 8 口o n a 聚合 i 1 9 2 + 变性温 编号 ( m 1 l ) ( u 2pl ) ( 蛐o l l ) ( g 2 0 ”l ) ( 胂o v 2 0 # l )u 2 0度( )( m 0 1 l ) pl ) 厦( ) 12 02 0 2 51 02 54 8 22 0 20 2 51 02 54 8 3 6 020 2 51 02 5柏 41 5 020 2 51 02 5 4 8 52 00 50 2 51 02 5 4 8 62 010 2 5 1 02 54 8 72 02 o 2 51 02 54 8 8 2 040 2 51 02 54 8 9 2 080 2 51 02 5 4 8 1 02 01 00 2 51 02 5 4 8 1 i2 020 11 02 5 4 8 1 22 020 2 5 1 02 54 8 1 32 020 5 1 02 54 8 1 42 02 0 2 50 52 5 4 8 1 52 02 0 2 51 02 5 4 8 1 62 020 2 52 02 5 4 8 1 72 020 2 5 1 02 04 8 1 82 02 0 2 51 02 54 8 1 92 0 20 2 51 03 0柏 。 2 02 0 20 2 51 05 04 8 2 1 2 020 2 51 02 54 7 2 22 0 20 2 51 02 54 8 2 32 0 20 2 51 02 55 0 1 4 四川大学硕士学位论文 i s s r p c r 反应基本程序进行扩增筛选从l o o 个弓1 物中选出扩增条带较多，信 号强，背景清晰的引物用于全部8 个居群d n a 样品的扩增。扩增产物以t a k a r a 公司l o o b p d n a l a d d e r 为分子标记，经i 5 琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后用 e b 染色，并在g e n e g e n i u sb i o l m a g i n gs y s t e m 凝胶成像仪上成像观察。 1 2 5 数据分析 电泳图谱中的每一条带均视为一个分子标记，并代表一个引物的结合位点。 按凝胶同一位置上d n a 带的有无进行统计，有带( 包括弱带) 的记为“1 ”，无带的 记为“0 ”将这样由“1 ”、“0 ”构成的表型数据矩阵用于进一步的分析。对 群体遗传参数的统计基于以下两个假设：1 ) 岷江柏群体处于h a r d y - - w e i n b e r g 平 衡；2 ) 统计条带时认为电泳迁移率相同的条带是扩增基因组上的相同d n a 片段的 产物。 采用p o p g e n e 软件( y e he ta 1 ，1 9 9 7 ) 对全部居群和各单个居群分别进行遗 传参数分析，分别计算了多态位多态位点百分率( 月暖p e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cb a n d s ) 、居群总遗传多样性( 肌，t o t a lg e n ed i v e r s i t y ) 、居群 内遗传多样性( 鼋g e n ed i v e r s i t yw i t h i np o p u l a t i o n ) 、各居群间的遗传分 化指数( g s t , c o e f f i c i e n to fp o p u l a t i o nd i f f e r e n t i a t i o n ) ( g s f = 1 一耐 h t ) 、基因流( 红t h el e v e lo fg e n ef l o w ) 、n c i s 基因多样性( h e ，n e i sg e n e d i v e r s i t y ) 和n e i s 遗传距离( 玑g e n e t i cd i s t a n c e ) 。s h a n n o n