（物理化学专业论文）气相色谱检测农药残留的研究.pdf

南开人学坝i 卅f 究生毕业学位论文 摘要 气相色谱检测农药残留的研究 摘要 由于农药的大量和不合理地使用，农药残留问题越来越引起人们的重视，特别是食品 药品中的农药残留。食品安全质量问题已成为非常重要的贸易保护手段，因此建立常规农 药项目多残留系统检测方法，提高检测技术水平，对保证我国水果蔬菜出口和控制进口水 果中各类新农药残留项目将具有重要的积极作用：也有利于建立水果蔬菜农药残留的实验 室检测体系，禁止农药残留超标的水果蔬菜进入市场，确保我国消费者水果蔬菜消费的安 全。此外，农药残留也严重影响了我国中药材的质量，尤其影响了中药的出口，因此也有 必要建立快速准确的检测方法。 本文选择我国水果蔬菜生产过程中使用的和我国及主要出口国已设定残留限量要求 的1 0 7 种农药品种作为研究对象。采用气相色谱一质谱联用，建立了农药标准m s 谱图库， 弥补了美国n i s t 谱库的不足；研究筛选样品提取、净化方法，使提取效率、净化效果分 别满足方法回收率和仪器检测的要求；优化g c - m s 分析参数，以及g c e c d 、g c n p d 、g c - f p d 检测条件。实验表明：该方法的添加回收率及精密度实验符合农药残留分析的规定，各农 药的最低检测限既符合世界卫生组织规定的残留限量标准，也满足国家标准的最大残留限 量要求。该方法对1 0 7 种农药应用同的提取、净化及g c m s 测定程序，能减少检验时间， 提高检测效率，降低检验成本，具有同时进行快速筛选和准确确证能力，总体技术水平己 达到国际同类产品的先进水平。同时，研究建立了对七种中药中的九种有机氯农药残留的 毛细管气相色谱分析方法，对六六六和滴滴涕各四种异构体、五氯硝基苯的残留进行了测 定。实验表明：该方法的添加回收率及精密度实验均符合农药残留分析的规定，实现了残 留农药的快速准确检测。 关键词：农药残留水果蔬菜气相色谱一质谱回收率精密度 中药毛细管气相色谱 南开人学硕一二氍叶究生毕业学位论文 s t u d i e so nt h ed e t e r m i n a t i o no fp e s t i c i d e r e s i d u e s b y g a s c h r o m a t o g r a p h y a b s t r a c t f o rt h ev a s ta n di r r a t i o n a lu s eo f p e s t i c i d e ，t h ep r o b l e mo fp e s t i c i d er e s i d u e s b e c o m e sm o r ea n dm o r e r e m a r k a b l e ，e s p e c i a l l yt h ep e s t i c i d er e s i d u e si nf o o da n d m e d i c i n e t h es a f e t yo ff o o dh a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm e a n so ft r a d ep r o t e c t i o n ， s oi ti s n e c e s s a r yf o ru st oe s t a b l i s h as y s t e m i cm u l t i r e s i d u e sm e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fp e s t i c i d e sa n di m p r o v ed e t e c t i n gs k i l l si no r d e rt oe n s u r et h e e x p o r t o fo u rf r u i t sa n dv e g e t a b l e sa n dd e t e c tn e wp e s t i c i d er e s i d u e si nf r u i t i m p o r t s i na d d i t i o n ，i ti sn e c e s s a r yt oe s t a b l i s has y s t e mw h i c hi s t od e t e c tt h e p e s t i c i d e r e s i d u e si n l a b ，f o r b i dt h e f i u i t sa n dv e g e t a b l e sw h i c ho v e r f u nt h e l i m i t a t i o ne n t e r i n gt h em a r k e ta n de n s u r et h es a f e t yo fp e o p l e sc o n s u m p t i o no f f r u i t sa n d v e g e t a b l e s b e s i d e s ，p e s t i c i d e r e s i d u e sa r e a f f e c t i n g t h e q u a l i t y o f c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ，e s p e c i a l l yt h ee x p o r t ，s oi ti se s s e n t i a lt oe s t a b l i s ha q u i c k a n de x a c td e t e r m i n a t em e t h o d i nt h i sp a p e r , 10 7p e s t i c i d e sw e r ec h o s e nt ob es t u d i e dw h i c ha r cu s e di nt h e p r o c e d u r eo f f r u i t sa n dv e g e t a b l e s p r o d u c t i o ni no u rc o u n t r ya n ds e tal i m i ti n c h i n aa n dt h em a i n l ye x p o r tc o u n t r i e s g c m sw a si n t r o d u c e da n dad a t a b a s eo f m so fs o m e p e s t i c i d e s w h i c hd o n te x i s ti nt h en i s tw a se s t a b l i s h e d t h e e x t r a c t i n g a n d c l e a n i n gu p c o u r s ea n dt h e p a r a m e t e r s o fg c - m s ，g c - e c d ， g c n p da n dg c f p dw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l tp r o v e st h a tt h er e c o v e r ya n d p r e c i s i o n t e s t sa r ea c c o r d a n tw i t hr e l a t i o n a lr e g u l a t i o n sa n dt h em i n i m u m d e t e c t i o n 里茎叁兰堡! ：型垒竺兰些兰堡堡兰 皇! ! ! 竺! l i m i t sa r ea c c o r d a n tw i t hm a x i m u mr e s i d u e l i m i t sw h i c ha r e p r o v i d e db yt h e p r o v i s i o no ff a o w h oa n dc h i n e s es t a n d a r d t h em e t h o da p p l i e sas a m ec o u r s e t oe x t r a c t ，c l e a nu pa n dd e t e c t10 7 p e s t i c i d er e s i d u e s ，s oi tc a n r e d u c ee x p e r i m e n t a l t i m ea n dc o s ta n dh a sa c a p a c i t y t o q u i c k l y f i l t r a t ea n de x a c t l yc o r r o b o r a t e s i m u l t a n e o u s l y a saw h o l e ，i ti sa d v a n c e de v e ni fi t i sm a t c hw i t hi n t e m a t i o n a l t e c h n i q u e b e s i d e s ，a ，d e t e r m i n a t e m e t h o dw a se s t a b l i s h e dt od e t e c tn i n e o r g a n o c h l o r i n ep e s t i c i d er e s i d u e s ，i n c l u d i n gb h ca n di s o m e r , d d ta n di s o m e r a n dp c n bi ns e v e nc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e s b yc a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l tp r o v e st h a tt h e r e c o v e r ya n dp r e c i s i o nt e s t sa r ea c c o r d a n t w i t hr e l a t i o n a l r e g u l a t i o na n d t h em e t h o dc a n q u i c k l ya n de x a c t l yd e t e c tp e s t i c i d er e s i d u e s k e y w o r d s ：p e s t i c i d er e s i d u e ，f r u i t a n dv e g e t a b l e ，g c - m s ，r e c o v e r y , p r e c i s i o n ， c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ，c a p i l l a r y , g a sc h r o m a t o g r a p h y i l 南开大学硕i 研究生毕业学位论文 第一章绪论 第一章绪论 现代农业大量地应用农药控制农作物生长期间的病虫害及杂草生长，以杀菌剂解决水 果蔬菜储运及保鲜问题。农药作为杀虫剂、除草剂和杀菌剂的使用是农业发展史上一次重 大变革，它极大地提高了农作物的产量并延长储存期。随着化学工业的发展和农药使用范 围的扩大，化学农药的数量和品种都在不断增加，目前世界化学农药总产量( 以有效成分 计) 已超过3 0 0 万吨。我国的农药使用量己居世界首位，但农药有其利也有其害，其诸多 危害性已曰趋严重。随着农药的大量和不合理的使用，农药所造成的环境毒性问题，已引 起人们的高度重视。作为对环境和食品的重要污染源之一，残留农药对人体健康所造成的 影响也越来越受到各国政府和公众的关注”。加强对农药残留的监测和环境毒理研究，对 于合理开发和正确使用农药，保护生态环境，保障人类健康，避免和减少不必要的农业损 失，具有重要的理论和实践意义，这已成为人们的共识。而农药残留分析技术的提高也受 到了高度重视。世界上许多国家，特别是经济发达国家在这方面投入大量的技术、资金和 人力并制定了相应法规1 2 】。 1 1 农药残留检测分析的发展 农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细的微量操作手 段和高度灵敏的检测技术。现在农药残留分析要求多残留分析、回收率高( 7 0 ) 、重现 性好、低检出限、操作简单易行。 农药残留分析技术始于2 0 世纪5 0 年代，那时的农药残留分析技术方法仅限于化学法、 比色法和生物测定法。检测方法缺乏专一性，灵敏度也不高。气相色谱自2 0 世纪6 0 年代初 应用于农药残留分析，许多灵敏的检测器的使用，推动了农药残留分析技术的飞速发展， 大大提高了农药残留量的检测水平。高效液相色谱法在农药残留分析中广泛应用于对热不 稳定和离子型农药及其代谢物的分析。7 0 年代末，特别是8 0 年代，高效液相色谱的发展拓 宽了残留农药的检测范围。迸x 9 0 年代，农药残留分析技术日新月异，一些新技术已进入 应用阶段，一些虽尚存在一些理论和技术性难题，但已显示出潜在的应用前景。进n 9 0 年 代，新的检测方法，特别是多种类型农药的多残留检测方法，同类型农药的多残留检测方 法以及新的单个农药在多种试剂中的检测方法都取得了重要进展【2 】。近年来，国内外对农 药的生产、使用、管理、监控、检测等环节加大了立法和科学指导，尤其是检验方法学研 究取得了长足进步，其中农药多残留系统检测方法己成为欧、美等发达国家官方实验室的 r 常检测技术。从单一或数个农药应用同一仪器，同一方法检测：到十几个同类农药或几 南开大学硕士研究生毕业学位论文第一章绪论 十个性质相似的农药多残留检测；直至发展到如今不同种类数百种农药应用不同仪器、不 同检测方式的现代多残留系统检测技术。更高效率的在线式试样前处理和仪器分析检测技 术也在积极开发研制，多残留检测技术近年来得到迅猛发展。 1 2 农药残留分析样品前处理技术 农药残留分析方法通常包括样品前处理和检测两部分，而样品的前处理即农药残留的 分离、提取和净化是农残分析中工作量最大、对残留分析结果起关键作用的步骤。 1 2 1 传统的农药残留分析样品前处理技术 传统的农药残留分析样品前处理包括样品的提取、净化和浓缩。提取是指使用适当溶 剂将待测物连同样品基质从固态样品中转移至易于净化和分析的液态，净化指将待测物与 提取液中的干扰物质分离。经典的农药残留分析步骤通常是：水溶性溶剂提取一非水溶性 溶剂再分配一固相吸附柱净化一气相色谱或液相色谱测定吼 1 2 1 1 提取方法 1 浸渍、漂洗法将样本浸渍在提取液中，或用提取液漂洗样本。此法对附着在样 本表面的农药有很好的提取效果。测定叶类样品中非内吸性农药的效果也很好。如小麦中 杀螟硫磷就采用浸渍法提取 4 1 2 振荡法在盛有样本的容器中加入提取剂，振荡数小时。此法简便并且提取效果 好，较普遍采用【5 】 3 匀浆法 将样本放在匀浆杯( 捣碎杯) 中，加入提取剂，快速匀浆( 捣碎) 几分钟。 此法简便快速，效果好，普遍采用。尤其适用于叶类及果实样品，如对苹果、山楂中溴 螨酯的提取【6 l o 4 索氏提取法将样本放在索氏提取器套管中，园底烧瓶中加入提取剂，加热连续提 取数小时。此法提取效果好，但需时间过长，干扰物质较多。在套筒中加吸附剂( 与样本 混合) ，能起到净化或减少干扰物的效果。此法比较适合对土壤及籽类样品的提取【7 1 。 5 消化法样本中加入消化剂，加热使样本消化，再用溶剂将待测农药提取出。此法 多用于不易匀浆，不易捣碎的动物组织样本。 6 超声波提取法样本经粉碎或匀浆捣碎后，加入提取剂，在超声波仪中提取一定时 问。此法现己普遍采用。 1 2 1 2 净化方法 1 液一液分配法利用待测农药与干扰杂质在两种互不相溶的溶剂中溶解度( 分配系 数) 的差异而达到分离目的的净化法。通常采用极性溶剂和非极性溶剂配成溶剂对进行多 ，一 南开夫学颀l 研究生毕业学位论文第一章辩 论 次分配，使干扰杂质和待测农药分离，达到净化目的。 2 吸附柱层析法利用混合物中各组分在吸附剂上吸附解吸附能力的差异而达到分 离目的的净化方法。常用的吸附剂有弗罗里硅土、三氧化二铝、硅胶、活性炭、硅藻土等。 3 磺化法浓硫酸与样品提取液中的脂肪、蜡质等干扰物质发生磺化反应，从而使杂 质和农药分开的净化方法。 4 凝结沉淀法待净化溶液中加入一定量的凝结剂，使溶液中的蛋白质、脂肪、蜡质 等干扰物质沉淀析出，再经离心，达到分离净化目的的方法。 5 冷冻法采用低温处理样本提取液，待脂肪、蜡质、蛋白质等杂质析出后，在低温 条件下过滤除掉杂质。 6 其它方法如薄层层析法、离子交换层祈法、凝胶渗透层析法、高压液相柱净化法。 1 2 1 3 浓缩方法 1 自然挥发法将待浓缩的溶液置于室温下，使溶剂自然挥发。此法速度慢，但简便。 2 吹气法采用吹干燥空气或氮气，使溶剂挥发的浓缩方法。此法浓缩速度较慢，对 于易氧化蒸气压高的农药，不能采用此法。 3 k d 浓缩器浓缩法采用k d 浓缩装置进行减压蒸馏浓缩的方法。此法简便，农药不 易损失，是较普遍采用的方法。 4 真空旋转蒸发法在减压、加温、旋转条件下浓缩溶剂的方法。此法浓缩速度快， 农药不易损失，简便，是最常用的理想的浓缩方法 1 2 2 近期发展的农药残留分析样品前处理新技术 随着超高效农药的开发应用和待检样品量的增加，特别是要求现场快速检测样品量的 迅速增加，对分析的灵敏度、特异性和快捷性提出了更苛刻的要求。1 1 1 2 0 世纪8 0 年代以来， 一些新的样品前处理技术不断被引入农药残留分析中，这些新技术的共同特点是：节省时 间，减轻劳动强度，廉价，节省溶剂，减少样品用量，减少对环境的污染，提高提取或净 化效率和提高自动化水平。 1 2 2 1 固相萃取法( s p e ) 它属于吸附剂萃取法中使用较广泛的一种方法。s p e 克服了液液萃取( l l e ) 及一般柱 层析的缺点。与l l e 相比，可节省时问和溶剂约9 0 ，减少杂质的引入，对操作者更安全， 重现性好，可避免l l e 中乳化现象的产生，同时对农药残留物进行富集。 固相萃取法是一种基于液相色谱分离机制的样品制备方法。在液相色谱中，通过使样 品在吸附剂与溶液中溶解度及功能团的相互作用最佳化而达到分离目的：在s p e 技术中， 南开大学颂卜研究生毕业学位论文 第一章绪论 通过使这些相互作用达到最佳化状态来影响样品的滞留与洗脱，根据待测农药性质、样品 种类等，选用合适的微型柱和淋洗剂。对液体样品，在选择合适的萃取柱和洗脱液及其它 优化条件后，可使萃取、富集、净化一步完成，然后直接进行g c 或h p l c 分析。h o l l a n d l 8 1 等用c 1 8 柱筛选葡萄酒中7 4 种农药，方法快速，重复性也好。对固体样品，s p e 主要用于 净化，提取仍须先用溶剂萃取。根据需要，净化时可用单柱也可用多个柱串联使用。s c h e n c k 9 】 等用c 1 8 和弗罗里硅土s p e 柱串联，净化鸡蛋中有机氯及有机磷的乙腈提取液，以 g c e c d f p d 测定，可减少9 0 的溶剂消耗和8 5 的废液处理。另一种增强净化效力的方 式是用混合型柱。它可利用多种界面效应来分离和纯化分析组分。m i l l s 1 0 】等比较了两种不 同的混合柱在环境及临床化学中的应用。s p e 的另一优点是容易实现预处理的自动化。国 外已推出商品化的自动固相萃取装置a s p e c 。将其与h p l c 在线结合可实现许多农药残留 的全自动分析【l ”。由于s p e 技术的以上优点，它在农药残留分析特别是在脂肪和蛋白质含 量高的复杂样品中农药残留物以及农药多残留的分离、提取、净化和浓缩方面得到了广泛 应用。 1 2 2 2 超临界流体萃取法( s f e l 超临界流体提取( s f e ) 是当前发展最快的分析技术之一，国外很多实验室已经用来作 为液体和固体样品的前处理技术。1 9 8 6 年，c a p r i e l 【1 2 】等人首次将该技术用于土壤和植物样 品中结合态农药残留分析。s f e 技术利用超临界流体( s f ) 密度大、粘度低、扩散系数大、 兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中分离出 来。它能同时完成萃取和分离两步操作，分离效率高、操作周期短、选择性高、无环境污 染，减少一般提取方法所占用的玻璃仪器及实验室，能实现操作自动化。目前最常用的萃 取剂是超临界二氧化碳( s c c 0 2 ) 。此外，超临界流体提取的样品可直接用于分析，因样 本提取物可在室温常压下自然挥发去溶剂( 超临界流体) ，免去样品浓缩过程和对后来分析 的干扰【3 】。很多农药及代谢物在植物体内呈轭合状态，即所谓的不可提取残留物，如2 ，4 一d 类除草剂的代谢物2 ，4 一二氯酚在植物体内与糖结合成糖昔。过去用酸水解提取需6 小时，而用s c c 0 2 提取只需4 5 分钟( 样品中加少量酸) 【m j 。此法还可用于氨基甲酸酯类农 药与酯类物质分离，如邱明月等用s f e 提取粮食和茶叶中的有机氯农药f i ”。 s f e 技术在近几年的农药残留分析中的应用得到了迅速的发展，这主要是因为s f e 许 多特征很好的适应了农药残留分析的要求。首先，s f e 技术对较大分子量的农药有很强的 溶解能力并且能进行族选择性萃取，可以满足成分复杂、分析物性质各异的要求。另外， s f e 过程有很强的操作性，控制操作条件和加入改性剂可以优化萃取过程i l “。再者，s f e 南开大学硕士研究生毕业学位论文第一章绪论 富集效率高而易于联机分析，适用于痕量分析和过程的自动化。总之，s f e 是一项很有吸 引力的新技术，必将成为农药残留分析的有力工具和手段。 1 2 2 3 固相微萃取法( s p m e ) 固相微萃取技术( s p m e ) 是在s p e 的基础上发展起来的一种崭新的无溶剂萃取分离技 术。它是有c a r t h u r 和j p a w l i s z y n 首创于1 9 9 0 年i l ”，1 9 9 3 年推出商品化装置。随着技术 的不断完善，已经发展到了环境检测和农药分析等领域。s p m e 的原理是分析组分在样品 基质与提取剂之间的分配平衡过程。s p m e 具有操作时间短、无溶剂、样品用量少、重现 性好、灵敏度高、检测限低等优点，同时消除了s p e 中诸如堵塞和使用溶剂的缺点，并且 不需要特殊的热解吸和对g c 仪进行改装。 s p m e 实际上是一支微量进样器，一些气相色谱的固定相涂渍在熔融的石英纤维表面 构成萃取头，萃取头上可覆盖一层液膜或键合一层多孔固定相【l 引。s p m e 的选择性可以通 过改变涂渍材料或涂层厚度来调节。由于s p m e 的萃取装置轻巧，携带方便，适合现场取 样，且萃取头可循环使用，萃取头上的分析物可保存一天，低温保存时间更久，一般可达 三天。已有报道采用s p m e 和g c 配合进行水中有机氯农药、含氮除草剂、氨基甲酸酯 类除草剂的多残留分析唧1 。除了与g c 配合使用外，s p m e 还可以和h p l c 配合使用，即 通过一个特殊的装置将s p m e 纤维尚吸附的待分析物质洗脱下来，然后直接流入h p l c 分 离柱，分离后进行检测。 1 2 2 4 基质固相分散萃取法( m s p d e ) 基质固相分散萃取技术( m s p d e ) 是由s t a r t r e na b a r k e r 2 1 1 等在1 9 8 9 年首次提出。 m s p d e 的原理是：将涂渍有c 1 8 等各种聚合物的担体的固相萃取材料与动物组织样品一起 研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种 待测物洗脱下来。此法的依据是：采用脂溶性材料( c 1 8 ) 破坏细胞膜并将组织分散，c i s 充当分散剂( 被固定化的分散剂) 。m s p d e 的优点是不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、 d h 调节和样品转移等操作步骤。此法适用于药物的多残留分析，特别适合于进行某一类化 合物的分离或单个化合物的分离，内源物或外源化合物均可。除动物组织外，此法还适合 于植物样品。l o n g 2 2 1 曾采用此技术和气相色谱分析结合测定牛肉脂肪中9 种有机氯农药。 m a t i n l 2 3 j 曾将此法用于柑桔果实中的1 8 种杀虫剂的多残留分析。 i 2 2 5 加速溶剂萃取法( a s e ) 该法适用于固体和半固体样品的前处理。将样品置于不锈钢萃取池内，萃取池由加热 炉加热至5 0 - - 2 0 0 ( 2 ，通过泵入溶剂使池内工作压力达到1 0 0 a t m 以上。样品接收池与萃耿 南开大学硕歼究生毕业学位论文第一章绪论 池相连，通过静压阀定期的将萃取池内的压力同时得到缓解。经过静态提取5 l o m i n 以 后，打开静压阀，用脉冲氮气将新鲜溶剂导入萃取池中冲洗残余的提取物。每1 0 9 样品约 需1 5 m l 溶剂，每个样品的萃取时间一般不少于2 0 m i n 。加速溶剂萃取可用于环境样品中农 药、多环芳烃等的提取 1 9 】。 1 2 2 6 凝胶渗透色谱法( g p c ) 凝胶渗透色谱法是一种快速的净化技术，应用于农药残留分析中脂类提取物与农药的 分离，是含脂类样品农药残留分析的主要净化手段2 ”。s t i e n w a n d t e r ”1 总结了凝胶渗透色 谱在农药残留分析中的应用；李洪波【2 6 1 用交联聚苯乙烯凝胶净化食物样品中的o p s ； h o n g t 2 7 1 用溶剂提取，b i o - - b e a d ss x 3 净化，g c e c d 氮磷检测器( n p d ) 测定了大豆和大 米样品中2 5 种农药残留，并用g c m s 选择离子监铡( s i m ) 确证；s a n n i n 0 1 2 s l 用b i o b e a d ss x 3 的g r c 净化方法，分析了7 个脂质性食品中3 9 种o p s 及其代谢物，并进一步 进行g c m s s i m 确证和定量：h o p p e r 2 9 1 用g r c 净化，g c 测定了谷物中的o p s 、o c s 及拟除虫菊酯；h o l s t e g e l 3 0 1 采用凝胶渗透色谱净化，进行了4 3 种o p s 、1 7 种o c s 及1 1 种n m c s 多残留分析。 1 2 2 。7 微波萃取法( m e ) 微波能最早于7 0 年代被试用于分析化学的样品预处理。此法的原理是利用微波能强 化溶剂萃取效率，使被分析物从固体或半固体的样品基体中被分离出来。微波萃取法的特 点是快速、节省溶剂、适用于易挥发物质如农药等的提取，可同时进行多个样品的提取。 微波萃取是在一个不吸收微波的封闭容器内进行的，样品内部的温度和体系压力都较高。 微波萃取装置目前已自动化，可自动控制萃取温度、压力和时间等。但萃取完成以后，需 等待萃取溶剂冷却，然后倒出溶剂，进行离心或过滤等手工操作。c a m e l t 3 1 】等曾采用微波 萃取法从环境样品中提取目标物。 1 2 2 8 分子印迹合成受体技术( m i s r l 分子印迹合成受体技术( m i s r ) 是可用于制备合成受体的新技术。它的原理是：首先 使拟被印迹的分子或聚合物单体键合，键合方式有共价结合和非共价结合两种。然后将聚 合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提取出来，聚合物内部就留下了被印迹分子的印 迹。共价结合方式是利用被印迹分子衍生物，此衍生物在聚合物的交联过程中与聚合物单 体以共价键形成聚合物基体。此共价键必须是可裂解的。最常用的交联剂是羧酸酯、硼酸 酯、缩酮或亚胺等。非共价键结合方式是完全利用非共价键作用来分辨被印迹分子。常用 的非共价键作用有离子互作用、氢键、疏水作用等。与共价结合相比，非共价结合作用的 南开人学颂l 研究生毕业学位论文第一章绪论 通用性更好2 0 i 。分子印迹技术可以用于药物、激素、蛋白质、农药等各种化合物的分离工 作。如m a t s u i ( 3 2 1 等采用此项技术分离西玛津等除草剂，此受体用于固相萃取可将溶液中的 西玛津浓缩5 6 倍，回收率达9 1 。 1 3 目前农药残留分析的检测技术 1 3 1 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法实质上是以固体吸附剂( 如硅胶、氧化铝等) 为担体，水为固定相溶剂， 流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。薄层色谱法不需要特殊设备和 试剂，简便易行，快速，直观，灵活，可同时用于分析多个样品。但是，由于灵敏度不高， 近年来较少使用，多用于复杂混合物的分离和筛选。t l c 除用特殊的显色剂观察斑点颜色 和用r f 值定性外，与其它技术的联用不仅可以定性，而且可对样品中被分离的一种或多 种成分进行定量分析。8 0 年代发展起来的高效薄层色谱( h p l r i ) 与扫描技术结合，是一 种易于建立和掌握的半定量技术。欧盟国家采用自动化多通道展开技术，用h p t l c 定量 筛选了饮水中2 5 6 种农药残留。 1 3 2 气相色谱法( g c ) 气相色谱法( g c ) 是目前应用最多的方法，多达7 0 的农药残留量检测是使用气相色 谱来进行的。气相色谱法具有操作简便、选择性高、分离效能高、灵敏度高，分析快速 以及应用范围广等特点。易汽化，汽化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法 检测。使用气相色谱法，多种农药可以一次进样，得到完全的分离、定性、定量，再配以 高性能、高选择性的检测器，使分析速度更快，结果更可靠。 气相色谱应从两个方面考虑，即色谱柱和检测器。气相色谱法使用的色谱柱主要是填 充柱和毛细管柱。在农药残留分析方面，已由过去以填充柱为主，变到目前以毛细管柱为 主。由于弹性石英毛细管柱的出现，使操作更方便易行。进样系统的不断改进，不但提高 了毛细管气相色谱分析的精密度和准确度，而且大大增加了进样量，进一步提高了灵敏度 p ”。微机控制处理大量的分析数据，使得毛细管柱的优点得到更充分的发挥。对多种类型 或同一类型农药多残留分析来说，毛细管色谱是最得力的工具。用二维或多维毛细管柱分 离的农药可达二、三百种之多。 用气相色谱测定关键使如何选择检测器。理想的检测器应具备灵敏度高稳定性和重 复性好、线性范围宽、响应速度快以及结构简单、造价低、操作安全、应用范围广等特点。 用于气相色谱法的检测器主要有电子捕获检测器( e c d ) 、火焰光度检测器( f p d ) 、氮 磷检测器( n p d ) 等。e c d 是具有高选择性和高灵敏度的离子化检测器。其选择性只对具 ， 南开人学顾i 。砌究生毕业学位论文第一章绪论 有电负性的物质有响应。如：含卤素、硝基、氧原子等化合物都有很强的响应。它被广泛 应用于有机氯农药和其他含电负性原子的农药残留量检测。如对黄瓜、韭菜上的百菌清的 测定采用e c d 检测器，最小检出量为1 2 1 0 1 2 9 ，添加回收率为8 0 8 8 6 3 ，c v 为 3 5 ，番茄、甘蓝上氰戊菊酯的最小检出量为1 1 7 1 0 r 1 1 9 ，方法回收率为8 2 i 9 0 1 ， c v 为5 6 9 1 3 。f p d 是利用火焰中化学作用发展起来的一种高灵敏度、高选择性检测器。 它只对含硫、磷的化合物有讯号。目前广泛应用于含硫、磷农药残留量的检测。如涕灭威 在苹果中的残留检测用此检测器的最低检测浓度为o 0 0 4 m g k g 【35 1 。n p d 是在f i d 的基础 上发展起来的，用于有机氮和有机磷的类农药残留量检测。 1 3 - 3 气相色谱质谱法( g c - - m s ) 气相色谱一质谱法( g c - - m s ) 将气相色谱仪和质谱仪串联起来，成为个整机使用的 检测技术。它既具有气相色谱高分离效能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达 到同时定性、定量的检测目的。用于农药残留量检测工作，特别是应用于农药代谢物、降 解物的检测和多残留检测等具有突出的特点。例如牟俊p 6 】等用此法测定粮食和油籽中丰索 磷的残留量。最低检测限量为o 0 1 m g k g ，评价添加回收率是8 6 9 9 6 5 选择监测离 子种类为m z 2 9 3 、2 9 5 、3 0 8 ，其丰度比为1 0 0 ：1 l ：3 4 。但是由于质谱仪价钱比较昂贵，目 前在国内尚未广泛应用于农药残留量检测工作。 1 3 4 高效液相色谱( h p l c ) h p l c 是以液体作流动相的一种色谱法。高效液相色谱的应用越来越广泛，现己成为 农药残留检测不可缺少的重要方法。其原因主要是h p l c 能适合分离检测不易气化或受热 易分解、分子量大、离子型农药、强极性农药及其代谢物。这些农药用c j c 测定时，必须 先进行衍生化处理。其次是h p l c 可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和m s 、 计算机等系统联用，容易实现分析过程的自动化。同时，采用高效色谱柱、高压泵和高灵 敏度大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度和速度。 目前，应用于农药残留分析时使用最多的检测器是紫外吸收检测器( u v ) ，其次是荧 光检测器。紫外吸收检测器的优点是灵敏度高，流量和温度的变化影响小，是梯度淋洗的 一种比较理想的检测器，但是只能检测对紫外光有吸收性能的农药。蔬菜中伐虫脒盐酸赫 农药 3 8 1 的检测用紫外检测器，在2 5 4 n m 处测定，可准确的测得其在黄瓜、青椒、洋葱、笋 瓜、韭葱的平均回收率分别为8 5 a ：4 ，5 、8 6 士8 5 、9 1 e 6 1 、9 2 士6 7 、8 7 士36 。荧光检 测器( f d ) 是种灵敏度高、选择性强的检测器，比u v 的灵敏度要高l 2 个数量级。 但由于大多数农药本身不发射荧光，经衍生化反应又较麻烦，限制了f d 的应用。 南开人学坝i 研究生毕业学位论文 第一章绪论 1 3 5 液相色谱质谱法( l c m s ) 液相色谱一质谱联用技术( l c - - m s ) 是一种内喷射式和粒子流式接口技术将液相 色谱与质谱呋接起来，用于分析对热不稳定，分子量较大，难以用气相色谱分析的农药残 留的新方法。它具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点口7 1 。 l c m s 对简单样品可进行分析前净化并具备几乎通用的多残留分析的能力，用于对初级 监测呈阳性反应的样品进行在线确证，其优势明显。尽管l c - - m s 对分析技术和仪器的要 求高，但它仍是一种很有利用价值的高效率、高可靠性的农药残留分析技术。 1 3 6 超临界流体色谱( s r c ) 超临界流体色谱是以超临界流体作为色谱流动相的，可以使用各种类型的较长色谱 柱；可以在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定和极性较强的化合物：可与红外、质 谱联用。由于超临界流体具有气体和液体的双重性质，其粘度小、传质阻力小、扩散速度 快，其分离能力和速度可与气相色谱相比。另外，其密度、溶解力和速度可与高效液相色 谱相比。可以通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度，选择最佳色谱条件，综合利用 了气相色谱和高效液相色谱的优点，弥补了气相色谱和高效液相色谱各自的不足，成为一 种强有力的分离和检测手段。尤其突出的特点是s f c 可以与大部分气相色谱和高效液相色 谱的检测器相连，如f i d 、f p d 、n p d 、e c d 、u v 以及m s 、f t i r 等都能用。这样就极 大地拓宽了其应用范围，许多在气相色谱和高效液相色谱上需经过衍生化才能分析的农 药，都可以用s f c 直接测定。用s f c 可把氨基甲酸酯类农药与脂类物质分离，这对于在 含有脂肪的食品中的农药残留分析是具有重大的意义的。j a b l o n s k a 等和m u r v 【g a v e r l 等【4 0 1 分别报道了用毛细管s f c m c 测定有机氯及氨基甲酸酯类农药的残留。超临界流体提取和 超临界流体色谱在农药残留分析中中联合应用，为真正意义上的自动化分离分析体系的建 立提供了切实可行的技术基础。 1 3 7 毛细管电泳( c e ) c e 的工作原理是使用毛细管柱内的不同带电粒子( 离子、分子或衍生物) ，在高压场 作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向迁移，从而进行分离。根据样品组分的背景缓冲 液中所受作用的不同，c e 又被分为毛细管区带电泳( c z e ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、等 电聚焦( i e f ) 等几大类【2 5 1 。c e 具有分离效率高、快速、样品用量少等特点。a s h o kk m 等人综述了c e 在农药残留分析中的应用。在农药残留分析中，毛细管区带电泳( c z e ) 的运 用最为广泛。毛细管区带电泳( c z e ) 非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子 化样品的分离与分析。这一技术具有极高的效率和分离能力其分离效率可达数百万理论 南开大学坝十研f 究生毕业学位论文 第一章绪论 塔板数，操作简便。毛细管电泳所需样品量极少，一般只需几纳升( n l ) 。目前，毛细管电 泳尚缺乏灵敏度很高的检测器，可利用的紫外检测器能检测几个p g ，但因样品量只用几个 n l 的体积，故所用样品浓度被限制在l o 一。因此，只有研究开发灵敏度更高的检测系统， 毛细管区带电泳的优势才能充分发挥出来。 l 。3 。8 免疫分析( i a ) 免疫分析( i a ) 是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。通过对半抗 原或抗体进行标记，利用标记物的生物或物理或化学放大作用，对样品中特定的农药残留 物进行定性定量检测【4 2 1 。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分 析成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器，可大大简化甚至省去前处理过程，容 易普及和推广。若开发成试剂盒，可广泛用于现场样品和大量样品的快速监测 目前，酶免疫分析方法的研究十分活跃。该方法是利用有机磷和氨基甲酸酯两类农药 具有抑制靶标酶( 如乙酰胆碱酯酶) 活性的生化反应作用，用于对相应农药残留进行快速 定性定量检测。此法既可以检验单一农药残留量，又可以检出多种农药的综合残留量。利 用此方法对蔬菜、水果、果品和农产品进行农药残留量测定，灵敏度高，操作简单，检测 速度快。例如张俊引叫等用此方法准确、快速的测定了玉米、花生中黄曲霉素b l 的含量。 k a u f m a n 等【4 4 】先后综述了i a 在农药残留分析中的研究和应用概况，k r o t z k y 等h 5 】提出了免 疫测试在农业化学品残留分析中有关精密度、标准化和质量控制的建议。 1 4 农药残留分析的发展趋势 目前，人们越来越关心农药残留问题，因此要求更好的分析方法。根据需要，一是更 灵敏二是更快速。对于农药残留在生物链中的聚集，比如肉类食品、奶制品中农药残留， 就需要更灵敏的检测技术才能构检测出来；而对于在蔬菜水果中的农药残留，我们需要的 是快速方便的检测，最好是现场检测。 1 9 9 3 年在华盛顿举行的a o a c 国际会议上，举行了关于人体内农药和化学污染物残留 分析方法的专题讨论会。强调了人体样品如血、尿和母乳等与农产品和环境样品相比时， 新的残留分析方法非常缺乏。因而对人体样品分析方法的研究对各种类型的农药来说都 非常需要。还有，由于在线联用技术可以避免样品转移的损失，减少各种人为的偶然误差， 因此将是农药残留分析方法研究的重点。 同时，目前农药残留分析的成分大都是化学合成的农药，其多数是分子量在5 0 0 以下 的有机物，而在未来的1 5 2 0 年内，很可能有由生物工程生产出来的生物农药代替化学农 药的情况发生【4 6 i 。而那时，分析的重点将转向与生物组织成分很难区分的生物大分子农药。 10 南开人学坝 i j f 究生毕业学位论文 第一章绪论 要将这些分子量大的多的生物农药与原动植物组织中的蛋白质、多肽、核酸、细菌或病毒 等分离开将会更加困难。新的分析技术将要求有细胞化学、发酵化学、免疫化学和多肽排 列结构等多方面学科知识的支持【钉j 。那时，农药残留分析工作者必须掌握这方面的知识， 这也是他们面临的新课题。 1 5 选题意义和实验目的 在世界贸易组织成员国之间，以关税、配额、许可证等为特征的贸易保护措施受到了 限制。由于欧、美、日等发达国家对w t o 中t b t 、s p s 协议及相关规则十分精通，并且 在农药的生产、管理、监控及检测等方面均具较强的技术优势，他们便采取各种手段，以 种种名义实施新的贸易保护措施。其中，食品安全质量问题已成为非常重要的贸易保护手 段。美国、日本和欧盟不仅要求的农药残留检测种类多，而且相当部分的农残限量标准定 在检测方法的测定低限，个别项目限量标准要求已接近方法和仪器的最低检测极限，为超 痕量分析，b 1 p g k g 水平，甚至更低。如日本厚生省2 0 0 0 年颁布的农药残留限量标准中， 许多果蔬中毒死蜱的最大残留限量( m a x i m u mr e s i d u el i m i t s ，m r l s ) 为l o j g k g 【48 1 。目 前国外果蔬中农药残留有向多项目、低限量发展的趋势。相当数量的农药品种被禁用或严 格限用而不设定m r l s ，即规定在农产品中，采用当代国际上最先进的测定方法不得检出。 水果蔬菜中农药残留超标问题已成为我国食品出口的主要障碍，形势十分严峻。我国农药 残留检测领域中的单一种类农药多残留检测已和国外发达国家的技术水平接近。不同种 类、百种以上多残留系统检测技术水平尚有差距，并且这种差距有不断扩大的趋势。长期 以来，我国农产品中农药残留超标致使出口受阻局面不能得到彻底改变的原因是多方面 的，其中检测技术水平较低，检测方法与国外的质量标准不相适应。不具备高效的农药多 残留系统检测方法是一重要技术障碍。 国外一些发达国家