（茶学专业论文）茶叶中黄酮类物质的色谱分析及相关性质研究.pdf

摘要 黄酮甙，花色甙是茶叶中的一类重要的水溶性色素，对成茶汤色，叶底及 茶叶品质有显著的影响，同时其本身也具有多种药理功效。 本文建立了反相高效液相色谱测定茶叶中杨梅素、槲皮素、山奈素含量的方 法。采用k r o m a s i lc 1 85 1 a m ( 4 6m i n i d x 2 0 0 m m ) 色谱柱，甲醇- 0 铴磷酸为流动相， 梯度洗脱，紫外检测波长为3 7 0 r i m ，流速为l m l m i n 结果表明杨梅素、槲皮素、 山奈素在选定的浓度范围内，线性关系良好，平均回收率分别为1 0 2 6 ，、 9 9 5 、1 0 1 3 ，r s d 分别为3 8 、3 6 、2 2 该法简便、快速、准确，可用于 实际样品的测量。 本研究首次建立了茶叶中黄酮甙元的h p t l c 分析方法：经过水解后的茶 叶样品溶液，带状点样于g f 2 5 4 板上1 5 皿，然后经过展开剂【氯仿：甲醇：甲酸 ( 4 4 8 ：5 ：0 2 ) 1 薄层分离后，自然干燥，在3 9 0 r i m 波长下，单波长反射法吸收扫描测 定黄酮含量。此法稳定性、重现性良好，且取样量少，操作简便，适宜于大量 样品的快速测定。 本文对茶叶黄酮的提取工艺进行了研究，极差分析结果表明，各因素对茶叶 黄酮提取效果的影响程度从高到低依次为：乙醇浓度 超声时间 料液比 浸泡 温度。故选择最佳的提取工艺参数为：乙醇浓度为6 0 ，超声时间为1 5 m i n ，浸 泡温度为7 0 ，料液比为l ：1 5 。 本文研究了热、光、氧化剂、还原剂、v e 、金属离子、酸度对花青素稳定 性的影响。结果表明：不同的p h 值下，花青素的吸收特征会不同；光和热都 会使花青素发生降解，并且温度越高，加热时问越长，花青素越容易降解；只 光曝照相比室内自然光来说降解更快；f e 2 + 和c u 2 + 离子，对花青素的有一定的 增色效应，而c ，m 9 2 + ，c a 2 + 离子对花青素的影响甚微；h 2 0 2 、n a 2 s 0 3 能使 花青素的光谱特性发生改变，其在5 2 0n m 的吸收值减小，说明所提花青素抗氧 化能力和耐还原性都差；v c 的加入不会马上改变其吸收特征，但是时间越长， v c 浓度越高对花青素的降解越多。 本文以常见的0 ：、d p p h 、o h 这三个体外抗氧化模型，并以芦丁为对 照来研究其清除超氧阴离子自由基o ：能力、清除d p p h 自由基能力、清除 羟自由基o h 能力。试验结果表明在给定的浓度范围内，花青素对三个体系 的清除效果均大于芦丁。 关键词：茶叶；黄酮甙；花青素；高效液相色谱法；高效薄层色谱法 n a b s t r a c t f l a v o n o l ，a n t h o c y a n i n sf r o mt h et e ai sa k i n do f i m p o r t a n tw a t e r - s o l u b l e p i g m e n t ，m a k i n gas i g n i f i c a n ti m p a c to nt e ac o l o r , t e al e a f q u a l i t y ，b u ta l s ob e c a u s e o f i t sav a r i e t yo f p h a r m a c o l o g i c a le f f e c t i o na n dh e a l t hf u n c t i o n s t h r o u g hr e s e a r c h so nt h ec h r o m a t o g r a p h ya c t i o no f t h r e ck i n do f t e a f l a v o n o i d s ，t h ee f f e c t so f m o b i l ec o n s t i t u e n t s ，g r a d i e n te l u t i o nc o n d i t i o n s , d e t e c t i o n w a v e l e n g t h 、c o l u m nt e m p e r a t u r e0 1 1t h ei s o l a t i o no f f l a v o n o i d s ，t h er p i - i p l c a n a l y s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e d n em e t h o di ss i m p l e ，r a p i d ，a c c u r a t ea n dc a nb e a p p l i e dt ot h es a m p l es u r v e y 。k r o m a s i lc 1 85 肛m ( 4 6 2 0 0 m mm m i d ) c o l u m ni s u s e d m e t h a n o l - 0 4 p h o s p h o r i ca c i da sa m o b i l ep h a s eg r a d i e n te l u t i o na n du v d e t e c t i o na t3 7 0 砌w a se x a m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dm y r i c e t i n , q u e r c e t i na n d k a e m p f e r o li ns e l e c t e dc o n c e n t r a t i o n s ，l i n e a rr e l a t i o n s h i p 、t h ea v e r a g er e c o v e r yr a t e i s1 0 2 6 、9 9 5 、1 0 1 1 3 r e s p e c t i v e l y ；3 8 ，3 6 ，2 2 r e s p e c t i v e l y t h eh i g hp e r f o r m a n c et h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o do f f l a v o n o l s i nt e a w a s d e v e l o p e d b y u o f c h l o r o f o r m ：m e t h a n o l ：f o r m y - l a c i d ( 4 4 8 ：5 ：0 2 1 0 n s i l i c a g e l g f 2 5 4 p l a t e t h er f v a l u eo f t h r e ek i n d so f f l a v o n o l sw a sb e t w 0 3 no 3 - 0 7 t h e c a l i b r a t i o nc u r v e sa l el i n e r a l 1 1 圮r e s u l t ss h o w e dt h i sm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f f l a v o n o l si nt h eh y d r o l y s i ss a m p l eo f t e ad i yl e a v e sw a ss i m p l e , r a p i d ，s e n s i t i v ea n d r e p r o d u c i b l e t h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n so ff l a v o n o l sc o m p o u n d sf r o mt e ab yt h e a l c o h o l e x t r a c t i n ga n du l t r a s o n i ce x t r a c t i n gm e t h o d sa r es t u d i e d t h er e s u l tss h o wt h a tt h e u l t r a s o n i ce x t r a c t i n gi st h eb e t t e rw a y ，w h i c hi st e s t n f i c o lb yu s i n gt h ef a c t o r i a la n d o r t h o g o n a ld e s i g n t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sa r e1 ：1 5 o f7 0 e t h a n o lt od o u s et h e d r i c dt e a a n du l t r a s o n i ct r e a t m e n tl a s t e df o r1 5m i n , t h e nd i p p e di nw a t e r7 0 cf o r t w oh o u r s ，t h ee x t r a c t i o no f f l a v o n o l si sa sh i g ha s5 8 7 m g g i nt h i sp a p e r , t h et h e r m a l ，o p t i c a l ，o x i d i z e r , r e d u c e r , v c ，m e t a li o n s ，a c i d i t yo n t h es t a b i l i t yo f p r o a n t h o c y a n i d i n s t h er e s u l t ss h o w e d ：d i f f e r e n tp h ，a n t h o e y a n i n a b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c sw i l lb ed i f f e r e n t l i g h ta n dh e a tw i l lc a u s ed e g r a d a t i o no f a n t h o c y a n i n s ，a n dt h eh i g h e rt h et e m p e r a t u r e ，t h el o n g e rt h eh e a t i n gt i m e ，t h em o r e e a s i l yd e g r a d a b l ea n t h o c y a n i n s ；s u n l i g h te x p o s u r ec a ni n c r e a s ed e g r a d a t i o na s i i i c o m p a r e d w i t hi n d o o rn a t u r a ll i g h t ；f e 2 + a n dc u 2 + i o n sh a v ea g r e a t e re f f e c to nt h e e o l o u ro f a n t h o c y a n i n st h a nk + ，m g + ，c a 2 + i o n sd o ；h 2 0 2 ，n a 2 s 0 3c a nm a k ea c h a n g i n ga ta n t h o c y a n i n ss p e c t l a lc h m ”a c t e r i s t i c s ，s oa b s o r b a n c ev a l u ed e c r e a s e sa t 5 2 0n n l 。w h i c hs h o w st h ea n t i o x i d a n t & t h er e s i s t a n c ec a p a c i t yo f f m t h o e y a n i n sa r c b o t hn o ts og o o d a b s o r b a n e ec h a r a c t e r i s t i c so f a n t h o c y a n i n sw i l ln o tb ec h a n g e d i m m e d i a t e l ya sa d d i n gt h ev i t a m i nc ，h o w e v e r , t h el o n g e rt h et i m ei s ，t h em o r et h e c o n c e n t r a t i o no f v i t a m i nca n t h o e y a n i nd e g r a d e s b a s e dc o m m o no l 、d p p ha n d ohv i t r oa n t i o x i d a n tm o d e l s r u t i ni su s e d a sc o n t r a d i s t i n g u i s ho nt h er e m o v a lo f s u p e r o x i d ea n i o no j c a p a c i t y 、f r e er a d i c a l s c a v e n g i n gc a p a c i t y ，r e m o v i n gh y d r o x y lr a d i c a l o hc a p a c i t y t e s tr e s u l t ss h o w t h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f t h eg i v e nc o n t e x t ，t h et h r e ep r o a n t h o e y a n i d i n ss y s t e m s c a v e n g i n ge f f e c t sa r eg r e a t e rt h a nm t i n k e yw o r d s ：t e a ；f l a v o n o l ；a n t h o e y a n i n s ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ；h i g hp e r f o r m a n c et h i n e rc h r o m a t o g r a p h y ( h p t l c ) i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 碱燧辄、p 鼍 帅：扣7 叫肌咽 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名了各衫专 导师躲芸萌c 弋 时间：v ? 年6 月p p 日 时间：沙0 年6 n 7 7 _ e t 刖舌 1 黄酮类化合物研究进展 黄酮类化合物( f h v o n o i d s ) 是天然产物中非常重要的一大类化合物，是植物次 生代谢产物，广泛存在于药用植物、水果和蔬菜中，以游离态或与糖结合为苷的 形式存在，不仅数量繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类化合物表现出多种多 样的生物活性，是重要的抗氧化剂，临床应用非常广泛。能防治心脑血管和呼吸 系统的疾病；具有抗炎、抑菌、降血耱、抗氧化，抗辐射、抗癌、抗肿瘤、抗艾 滋病以及增强免疫能力等许多的药理作用 1 - i s 。 1 1 黄酮类化合物的基本结构和分类 黄酮类化合物是一类多酚化合物，泛指两个苯环通过中央三个碳链相互连 接而成的一系列具有c 6 - c 3 - c 6 基本结构的天然产物。天然黄酮类成分是以1 5 个碳【a ( c 6 ) c ( c 3 f b ( c 6 ) 为母核的黄酮苷元及苷类衍生物，根据中央三碳链的不 饱和程度、b 环连接位置、以及三碳链合环的不同，可将天然黄酮类化合物分为： 黄酮( f l a v o n e ) 及黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 类、二氢黄酮( d i h y d r o f l a v o n e ) 及二氢黄酮醇 ( f l a v o n o n 0 1 ) 类、黄烷酮( f l a v o n o n e ) 及黄烷醇( f l a v a n 0 1 ) 、异黄( i s o f l a v o n e ) 类及二氢 异黄酮( d i h y d r o i s o f l a v o n e ) 类、双黄酮( b i f l a v o n e ) 类以及其他如查尔酮( c h a l c o n e ) 、 花色素( a n t h o c y a n i n ) 等。 茶叶中的黄酮多数以苷类结合状态，均属黄酮醇类，是茶叶水溶性黄色素的 主体，占茶叶干重的1 3 1 5 。y n b r h o b a , m c 己探明，苏联格鲁吉亚茶树中存 在山奈素，榭皮素、杨梅苷、紫云英苷、异榭皮素、杨梅苷- 3 葡萄糖苷、和榭 皮素- 3 半乳糖昔和榭皮素7 葡萄糖苷的报道。u h k b h i i i b h j i h , h ，i i ，等于1 9 8 6 年从 格鲁吉亚茶树变种柯尔希达种的一芽三叶中成功地分离并鉴定了1 4 种次要的黄 酮醇类复合物组合分，其中9 种属于黄酮醇化合物，即槲皮素、三鲸腊素、紫云 英苷、槲皮素- 3 0 p d 葡萄糖苷、杨梅苷3 - 0 p - d 葡萄糖苷、山奈素3 n p d - 芸 香糖苷、槲皮素- 3 - o b - 芸香糖苷、山奈素3 0 鼠李二葡萄糖苷、槲皮素3 - 0 鼠李 二葡萄糖苷。还有2 种黄酮醇类化合物，即洋芫素一8 cbd 葡萄糖苷和芹菜素6 ， 8 二- c 葡萄糖苷。大岛和中林等人用纸层析法检出了茶叶中黄酮醇2 3 个斑点， 并探名其中几个斑点成分的化学结构。 绿茶中现已发现1 9 种黄酮类物质，其中4 种已检出为c 葡萄糖基黄酮( 牡 荆苷) 、异牡荆苷、两种6 ，g - 二葡萄糖芹菜苷系无定形黄色粉末，极易溶于水， 溶液呈深绿黄色，是绿茶汤色的重要组分。程启坤等1 9 8 3 年研究了茶、红山茶和 油茶的黄酮醇和花青素的含量，茶叶黄酮醇总量为1 2 2 4m g g 1 2 黄酮类化合物的分析测定 随着对黄酮类化合物的深入研究和不断开发利用，其分析方法近年来也得到了 迅速的发展。分析方法主要有分光光度法、荧光法、极谱法、库仑测定法、离子 选择电极法、薄层色谱法、气相色谱法以及结合紫外检测( u v - v i s ) 、荧光检测 ( f d ) 、电化学检测( u v 二v i s ) 、二极管阵列检测( p d a ) 、生化检测( b c d ) 的 高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、超临界液体色谱，同时高效液相色谱法和 质谱联用( h p l c m s ) 以及高效液相色谱法和质谱质谱联用( h p l c m s m s ) 也被用来分析自然界的黄酮类化合物。h e i d i n 等【1 6 】采用e i m s 对一系列黄酮类 化合物进行分析，探讨了不同苷元的质谱特征。z i n s m e i s t e 等【1 7 l 对含有一个或多 个糖的黄酮类t m s 衍生物的质谱行为进行了研究。b a i z a 等l i 柳分析明确了 c i - m s 在黄酮和二氢黄酮醇鉴别中的优势。近年来f a b m s 、e s i - m s 、 a p c i m s 被广泛用来分析测定热不稳定、极性较大的黄酮苷类化合物1 9 - 2 n 。高 效液相色谱法因为具有分离效果好、精确度高、分析速度快等优点，被广泛应用 于黄酮类化合物的分析和鉴定2 3 1 。钱秋霞脚】等用高效液相色谱法以水一乙腈 一磷酸为流动相分离测定不同干燥方法的贯叶连翘中黄酮类化合物的含量。 h o l l m a n , m a l a v e i l l e ，k a z u oi s h i i ，p e t rs o l i c h ，s a m i ra r o s s ，a b a s i l e d e 等t 2 5 - 3 0 1 利 用反相高效液相色谱法( i 心h p l c ) 来分析不同植物中的黄酮类物质。余佳红【3 1 1 等采用超临界流体萃取高效液相色谱法测定银杏叶中租提物中黄酮类化合物的 含量，得出最佳的萃取条件。a n d r e w ss c h i e b e r 等 3 2 1 利用新型色谱柱采用二极管 阵列检测及质谱检测技术分析酚酸及黄酮类化合物，在一个小时内使用梯度洗脱 分离2 6 种黄酮类化合物对照品。杨洁【3 3 1 等对血浆中芦丁和槲皮素的h p l c 检测 方法及其在大鼠体内的药物动力学进行了研究。金东日等利用半微柱高效液相色 谱法电化学检测器( h p l c e c d ) 开发一种高灵敏、高选择性的方法分离分析1 5 种黄酮类化合物0 4 , 3 5 1 。 分光光度法最早应用于茶叶中黄酮含量的测定，但是因为其受多种因素影 响，随机性强，定量不准。之后津志田腾二郎等用h p l c 法分析分析茶叶中的黄 酮醇，获得4 种主要峰，并用各种色层析法作单一成分制取，查明它们是槲皮素 作分配糖体的黄酮醇和以山奈素作配糖体的黄酮醇。h u a f u w a n g 等刚以3 0 乙 腈：0 0 2 5m o f l 磷酸二氢钾为流动相，反相高效液相色谱法分析测定茶叶水解 后的黄酮苷元，获得三个主要峰。同样卢邦俊【3 7 】以：甲醇甲酸t h f - 水，一定梯 度洗脱、u v3 7 0n 1 l 检测，在柱温2 5 下研究了其对茶叶样品水解后黄酮苷元 的分离，得到四个主要峰。 采上述方法分析时各主要峰之间未能获得理想的基线分离，影响对黄酮的准 确定量。同时流动相加入磷酸二氢钾容易结晶堵塞柱子，影响其使用寿命；四元 流动相梯洗脱，操作烦琐，不利于样品快速分析。 高效薄层色谱法，因为操作简便，不需要昂贵色谱纯级试剂，并能同时分析测 定多种样品，受到越来越多色谱分析者的青睐 3 s - 4 2 。但是还没有用于分析测定茶 叶中黄酮的报道。 1 3 黄酮类化合物的提取工艺 天然药用植物中黄酮类化合物种类较多，普遍存在于食品中的黄酮类化合物 就超过5 0 多种，而且在植物体内存在的部位不同，其结合状态也不同，如在花、 叶、果等组织中一般多以苷的形式存在，在木部坚硬组织中，则多为游离苷元形 式存在。黄酮类化合物因其结构和来源的不同，溶解特性差异也很大，因此应根 据其极性和水溶性的大小选择合适的溶剂进行提取。黄酮苷类一般可用丙酮、乙 醇、甲醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取，而苷元元宜用极性较小的溶 剂，如氯仿、苯、乙醚、乙酸乙脂等有机溶剂来提取。 1 3 1 有机溶剂提取 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同进用不同的溶剂萃取可达到精制 纯化目的。甲醇和乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇( 如9 0 左右) 适宜于提取普元，6 0 左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜于提取苷类。如 李秀信【4 3 1 等在提取香椿叶中黄酮类化合物时，同时用热水浸提、7 0 乙醇提取、 碱液提取和6 0 丙酮水溶液提取，发现以6 0 丙酮作溶剂，提取率最高，且工 艺流程简单，易工业化生产。唐津忠等采用正交实验法确定了金莲花中总黄酮提 取的最佳方案，通过对提取溶剂、提取固液比、提取时问和提取温度四因素三水 3 平的选择实验，得出最佳提取条件：6 0 的乙醇作提取剂，按l ：1 5 的固液比，温度 为6 0 ，提取时间为2h 。周才琼f 4 叼采用由低极性到高极性的系统溶剂提取法浸 提金银花花叶通过纸斑反应，紫外灯观察颜色并用荧光检测。试验表明：金银花及 叶中的黄酮类种类相似，但叶中黄酮类含量大大高于花中的含量，金银叶中的黄酮 类化合物最佳提取工艺为9 0 乙醇，物料比1 ：1 2 ，7 0 下温浸6 0m i n 。陈乃富【4 5 】 用7 0 乙醇浸提可得到约为蕨菜干重1 4 的粗黄酮粉，其含量为2 7 1 0 。 1 3 2 水提取 水提法仅限于提取黄酮苷类物质，在提取过程中需考虑物料比、浸提时间、 浸提温度等因素如刘世民m 研究认为洋葱中黄酮类物质的最佳提取条件为水浸 提，物料比l ：3 ，浸提温度9 0 ，浸提时间4 0m i n 。此工艺成本低、设备简单、 安全，适合工业化生产，但是用水提取，提取液中杂质较多( 如无机盐、蛋白质、 糖等) 给进一步分离带来许多不便，且收率较低，故不常使用。 1 3 3 碱性水或碱性稀醇提取 由于黄酎类化合物大多具有酚羟基，溶于水，易溶于碱性水，难溶于酸性水， 故可用碱性水进行提取，黄酮苷类即可沉淀析出。因此可用碱性水或碱性稀醇浸 出，再将碱性提取液调成酸性可析出黄酮类化合物。但碱性提取时，所用碱的浓 度不宜过高，否则会破坏黄酮类化合物的母核。主要应用的碱性溶液多为稀氢氧 化钠和氢氧化钙水溶液，稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出杂质较多。氢 氧化钙水溶液的缺点是浸出效果可能不如稀氢氧化钠水溶液，且有些黄酮类化合 物能与钙结合成不溶性物质。不被溶出。王永宁等f 4 刀采用了碱性水提取和乙醇 提取两种不同的方法，对槐花中的黄酮类化合物进行提取研究后发现，碱性水提 取法的提取率比乙醇提取法的提取率高，在提取时应注意所用的碱浓度不宜过 高，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物的母核，当有邻二酚羟基时可加硼酸 保护。 1 3 4 超声提取法 用超声波法提取黄酮类物质，它的原理是超声的空化作用对细胞膜的破坏有 助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散 超声波法大大缩短了提取时间，提高了有效成分的提取率，原料的利用率。如陈 辉强等【4 s 1 测定了苦丁茶中芦丁的含量时对比了索氏回流、热浸、超声振荡和醇 4 溶液浸提，结果表明甲醇提取超声振荡效果最好。钱秋霞等 4 9 1 贯叶连翘中黄酮 类化合物的含量的提取条件时采用加热回流、冷浸和超声波振荡等提取方法，结 果超声波提取方法方便、迅速、提取完全。武正才掣5 0 】采用超声波提取法和回 流提取法及水提醇沉法提取灯盏花中总黄酮成分，比较3 种方法的提取率及提取 时间。结果：超声波提取法比其它方法大大缩短提取时间。黄锁义等 5 1 1 采用超声 波乙醇浸提法从榕叶中提取黄酮类物质结果表明采用该方法其所得产品纯度和 产率均较高。并且该方法全物理过程，无任何污染，是提取榕树叶黄酮类物质的 有效途径。 1 3 5 微波提取法 微波加热是透入物料内部的能量被物料吸收置换成热能对物料加热，形成独 特的物料受热方式，具有均匀性的优点，同时具有反应高效性和强选择性等特点， 而且操作简单，副产物少，提取率高及产物易提纯等优点。如陈代武等【5 2 】利用 改进后的家用微波炉提取洋葱中棚皮素，并对微波辅助提取条件进行了优化研 究。与普通加热回流和室温浸渍法提取洋葱中棚皮素的提取产率，龚盛昭等 5 3 l 以石灰水为介质。进行了微波场协同提取芦丁的研究，得到了微波场协同提取芦 丁的最佳工艺条件：固液比为= 1 6 ，时间1 0m i n ，微波功率2 9 6w ，提取2 次， 产率约为1 7 1 ，w ( 芦丁) = 9 4 1 结果表明，微波辅助萃取大大缩短了提取时 间，节省能源，是一种很有发展潜力的提取技术。王军等1 5 4 对苦荞麦麸皮总黄 酮微波提取工艺进行了研究。试验结果表明：微波提取的最佳工艺条件为微波功 率中档，微波加热1 2 0s ，乙醇浓度8 0 ，料液比1 ：5 0 ，该工艺条件下总黄酮得率达 5 5 l ：与传统提取方法相比，微波提取法具有节省时间、节约能量、提取效率高、 控制方便等优点。吴雪辉等【5 5 l 探讨了微波萃取、超声波提取、常规加热回流等 方法提取板栗花中黄酮类化合物的工艺，并对其提取效果进行对比。结果表明，微 波萃取法具有高效、短时的优势，对板栗花中黄酮类化合物提取的最佳条件为：板 栗花粉碎度1 0 0 1 2 0 目，固液重量比l ：1 4 0 ，微波功率8 0 0w ，处理时间3r a i n , 在 此条件下，板栗花中黄酮类化合物的提取率为7 1 9 。杨自蝾等【5 6 1 将融冻微波破 壁法和微波破壁法相结合技术用于枣核总黄酮类化合物的提取结果表明：融冻微 波破壁法是提取枣核黄酮类化合物的优选方法，游离黄酮类化合物最佳提取工艺 为：以料液比为lg ：2 0m l ，体积分数4 0 的乙醇为浸提剂，在低火、微波提取2m i n a 1 3 6 半仿生提取 半仿生提取法( s b e 法) 是针对中药药效物质提取中存在的“唯成分论”和“通 则论”，采用“灰思维方式”将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，从生物药 剂学的角度为经消化道给药的中药制剂创立的一种提取新技术。利用“s b e 法”药 效物质的提取率高，不改变中药、方剂原有的功能与主治，生产周期缩短，成本降 低。至今为止，已对很多中药及中药复方5 7 啦! 进行了研究，结果皆提示：s b e 法有 可能替代水提法( w e 法) ；半仿生提取醇沉法( s b a e 法) 有可能替代水提醇沉法 ( w a e 法) 。陈晓娟i 叫为优选杜仲叶中绿原酸和黄酮提取最佳工艺，以绿原酸和黄 酮含量为考察指标，通过正交实验对半仿生法和酶法两种提取方法进行了优化。 半仿生法的工艺条件为：杜仲叶为原料，以磷酸氢二钠柠檬酸的缓冲溶液作为提 取液，i i l ( 杜仲叶) ：m ( 提取液产i ：2 0 ，提取液p h 分别为2 0 ，7 5 ，8 3 ，在7 0 ，每次 提取1h ，提取3 次；在此条件下，绿原酸的得率达1 4 4 ，黄酮得率达0 0 4 4 。 1 3 7 超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近2 0 年来国际上迅速发展的新一代化工分离技术。已广 泛用于食品、香料、医药等行业c 0 2 是最常用的超临界流体。超临界c 0 2 萃取( s f e c 0 2 ) 应用于植物提取，与传统方法比较，具有许多独特的特点陈从贵等1 6 4 1 研 究探讨超临界c 0 2 提取分离银杏叶药用成分的适用性和可操作性，提出溶剂浸提 与超临界流体萃取相结合的生产工艺，既可降低生产成本、保证产品质量，又可大 幅度削减设备造价，为超临界流体萃取技术的实际应用创造条件。武正才等1 6 5 1 比 较超临界c o ：萃取法和水提醇沉法从灯盏花中提取总黄酮成分的工艺。结果表明 超临界c 0 2 萃取的最佳工艺为：压力为2 5m p a ，夹带剂为8 5 乙醇，萃耿温度为 40 ，萃取时间3h ，夹带剂加入量8 0 0m l ，c 0 2 流量为1 5l h 。谷玉洪等脚l 采用 s f e c 0 2 并用乙醇作夹带剂萃取蜂胶中的黄酮类有效成分。萃取物处理方法简 单方便，萃取物中黄酮类成分的量高。s f e c o z 萃取的最佳条件为：粉碎粒度为 2 0 目，萃取压力3 5m p a , 萃取温度4 0 ，蜂胶与夹带剂用量比例为1 ：2 ，方法 可行，适合工业化生产。 1 3 8 酶法提取 植物酶法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物药材细胞壁的构 6 成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成 分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶 于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的，因而酶法提取有利于提高有效 成分的提取率，成为近年来现代提取方法的研究热点。 孟志芬等 6 7 1 采用酶法工艺提取香椿叶中总黄酮，与传统水提工艺相比提取率明显 提高，提取条件温和，且不使用有机溶剂。孙艳华，苗靖等1 6 8 利用纤维素酶法结合 乙醇提取法进行提取养麦茎叶中黄酮的研究，实验结果表明，应用纤维素酶法后， 茎、叶及茎叶混合物的黄酮的提取率比单纯的乙醇提取法分别提高了1 9 6 、 1 6 7 、1 7 3 。王邕等【明研究酶法与溶剂提取相结合提取罗汉果中黄酮类化合 物的工艺条件，通过正交试验找出纤维素酶法及溶剂提取的最佳工艺条件。表明 酶解溶剂法提取罗汉果黄酮具有较高的提取率，是种安全可靠的提取方法。吴 超等t 7 0 l 研究了p 葡萄糖苷酶在银杏叶提取物制取黄酮苷元过程的酶解工艺：p h 为 银杏叶提取物的自然p _ h 值，酶解温度为5 0 x 2 ，酶与底物比( e s ) 为u 2 0 0 0 ( e d g ) ，底物 浓度为5 m e , m l ，酶解时间6 h , 还原糖相对提高量达到9 2 3 1 。银杏叶总黄酮在植物 细胞中以苷元和苷的形式存在，在低浓度的醇水体系中苷元不易被提取。许明淑 等利用转苷酶和糖等糖基供体将极性低的黄酮苷元转为黄酮苷以提高总黄酮在 醇水中的溶解率。利用s u h o n 9 4 7 5 转苷酶强化银杏叶总黄酮提取的研究结果表明， 总黄酮的提取率比未加酶对照组增加了4 4 ，温度5 5 6 0 x 2 、p h 6 o 6 5 ，反应时间 1 0 h 的提取条件有利于总黄酮的提取。结果表明利用转菅反应可以在低乙醇浓度 的乙醇溶液中达到较高的总黄酮提取率。许明淑等【7 1 】利用s t i l l o n 酣7 5 转苷酶强化 银杏叶总黄酮提取的研究结果表明，总黄酮的提取率比未加酶对照组增加了4 4 * 0 ， 温度5 5 6 0 、p h 6 0 6 5 ，反应时间1 0 h 的提取条件有利于总黄酮的提取，同时 也表明利用转苷反应可以在低乙醇浓度的乙醇溶液中达到较高的总黄酮提取率。 总而言之，黄酮类化合物提取的方法很多，随着科技进步，将会有更多的新 型技术被采用提取植物中的黄酮类化合物，但是各种方法都有其自身的优缺点。 本实验根据实验室现有的研究条件，采用超声波法结合水浴浸润来提取茶叶中的 黄酮类物质，同时探讨了不同固液比、超声时间、乙醇浓度、浸提温度对黄酮得 率的影响。 2 花青素研究进展 7 2 1 花青素的结构、提取、分离与纯化 花青素属于酚类化合物中的类黄酮类，基本结构包含二个苯环。并由3 碳的 单位连结( c 6 c 3 c 6 ) 。花青素经由苯基丙酸路径和类黄酮生合成途径生成，由许 多酵素调控催化。花青苷是花青素与糖类物质通过糖苷键结合形成的。花青素是 花色苷的配基。通常不稳定，因此在植物中主要以稳定的花青苷的形式存在。花 青素的基本结构是3 ，5 ，7 一三羟基2 一苯基苯并吡喃，a 环3 ，5 ，7 位上的羟基以糖 苷键与糖结合时便形成花色苷。由于b 环各碳位上的取代基不同，形成各种各 样的花青素。根据文献报道，自然界中常见的花青素有2 0 多种，但是以如图2 所示的六种含量最高7 2 】：天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵 牛色素和锦葵色素。与花青素结合的糖、有机酸的种类及数量不同，花青苷的种 类不相同，结合的糖类主要有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖等单糖，鼠李葡萄 糖、龙胆二糖、等二糖。花青苷与有机酸通常是通过糖的酯酰形式结合。目前发 现的花青苷种类已经超过4 0 0 7 3 - 7 5 1 种。 图l 六种主要的花色苷的结构 f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r e sa n dm o l e c u l a rw e i g h t s ( m 聊o f s i xc o m l i l o n a n t h o c y a n i d i n s 8 花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，果皮呈色受内在、外在因子 和栽培技术的影响。光可增加花青素含量；高温会使花青素降解。花青素为植物 二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授 粉和种子传播。常见於花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。 近年来，随着医学毒理学和生物学研究工作的深入开展，化学合成色素由于其 大多数种类对人体有毒害作用，从而逐渐被天然色素所替代。天然色素不仅可以 应用于饮料、糖果、糕点、酒类等食品工业，而且也可应用于化妆品及医疗保健 品的生产，花青素也是世界上使用最为广泛的天然食用色素之一，因其安全性高， 允许其用于食品的着色，美国f d a 将其列入无须许可证的着色剂 花青素的一般用甲醇或者乙醇并加一定浓度的酸，在低温条件下提取，但是 如果酸度太高会使花青素产生一定程度的降解，所以很多人采用酒石酸，柠檬酸 等【7 6 】。近年来一些新的技术如加压液相萃取法m 、超临界流体萃取 7 8 - 8 3 、微固 相萃取被广泛用来提取植物中的花青素，同是伴随一系列的层析、色谱技术来实 现花青素的分离和纯化如纸层析、薄层层析、柱色谱1 8 4 4 7 1 。高效液相色谱、高速 逆流色谱、高效离心分配逆流色谱s g 、毛细管电泳、毛细管区带电泳1 9 0 l 、胶 束电动毛细管色谱等等1 9 1 。对花青素的定性分析一般采用紫外分光光度法、红 外吸收光谱法、质谱法 9 2 - 9 7 1 、核磁共振波谱法 9 s l 等等，同是对花青素的水解分 析也可以作为结构探讨的有益补充嗍。 2 2 花青素的生物活性 自由基具有高度的化学活性，一方面它是机体有效防御系统的一部分，另 一方面它又是造成许多疾病和衰老的根源【1 吣1 0 1 1 ，花色苷都具有明显的清除自由 基的作用t 1 0 2 l 和抗氧化活性【1 0 3 - 0 】。i g a r a s h i 等人发现山葡萄中的花青苷具有很强 的抗氧化作用，t s u d a 等人用亚油酸自动氧化系统、脂质体系统、兔血红细胞膜 系统对矢车菊色素一3 葡萄糖苷和矢车菊色素的抗氧化活性进行了实验，发现它 们具有很强的抗氧化活性。w a n g 等用自由基吸附系统评价了天竺葵色素等1 4 种 花青营的清除过氧化自由基的能力，结果表明以上花青苷对自由基都有不同程度 的清除作用，其中从红葡萄中提取的花青苷清除超氧自由基的能力最强。l i v i e r 0 等的实验结果表明，o 5 m g m l 的葡萄原花青苷可使啤酒酵母$ 2 8 8 c 菌株线粒体 的自发性基因突变比对照组减少6 5 。此外，s 蟾i n l o t o 证实葡萄籽花青苷对自由 9 基的抑制率达9 4 。凌智群发现适量的莲房花青萤具有抗活性氧的作用。余莹等 人从葡萄中提取高纯度的花青苷，测得其对稳定自由基有清除作用，在花青苷浓 度为1 0 9 几时可清除8 0 的自由基。c h o is a n g - w o n i 川l 利用亚麻酸自氧化和鼠肝 微粒体系，考察了从葡萄、甘薯、茄子和红甘蓝中分离出的7 种不同的酰化的花 色苷的抗氧化活性。研究发现，大多数酰化的花色苷都具有同- 生育酚一样强的 抗氧化活性。f u ru t a s h u 2 】考察j 2 1 种甘薯的乙醇提取物对叔丁基过氧自由基 ( t - b u o o ) 的清除活性，发现其中含有花色苷的紫甘薯清除该自由基的活性最强 i g a r a s h i 等研究了由山葡萄、红芜及茄属的抗氧化作用。其中，花翠苷的活性最 高，红蔓箐苷与锦葵色素苷的抗氧化活性差不多。此外，四季豆种皮中含有的矢 车菊素3 葡萄糖苷对兔红血膜及肝脏微粒体也显示出一定的抗氧化能力。花青 素能和蛋白质结合防止过氧化，也能和金属c u 2 + 等鳌创1 1 3 1 ；防止v c 过氧化、再生 v c ，从而再生v e ，也能猝灭单线态氧4 】。同时花青素能减少抗生素对人体造成 的危害。红葡萄酒中的花色苷清除超氧自由基的能力比单宁高，而且一定聚合度 的花色苷比单个花色苷分子的清除效果更好【1 5 l 。韩志萍掣6 1 研究得出桑苷花色 苷可有效地延缓油脂氧化反应：且抗氧化作用随着桑苷提取物用量的增加而增 强，桑堪提取物与v c ，v e 、柠檬酸均具有协同抗氧化作用。陈咸川掣7 1 通过建 立低密度脂蛋白氧化的模型，测得1 5g m l 浓度的桑堪对脂质自由基的抑制作用 达7 1 5 。 自然界中存在着大量致突变物，人类长期接触后可能引起基因突变，从而引 发肿瘤、畸形和遗传缺陷等。目前，人们日益重视从食物及无毒的药食同源的天 然产物中寻找抗突交剂，以防止细胞突交m a r m i r o l i a 在线粒体抗突变试验中，发 现从葡萄中提取的花青苷能有效降低线粒体突变化率【l i i qs u g i n o t o k 发现花青苷 对1 印p - 2 致突变剂的抑制率达9 4 9 】。y o s h i m o t o 1 2 0 1 2 1 l 利用鼠伤寒杆菌t a 9 9 ， 研究发现紫甘薯“n y a m u r a s a k i ”中的花色苷可有效地抑制杂环胺、3 氨基1 ，4 一二 甲基一5 氢吡哆( 4 ，3 - b ) 吲哚、3 一氨基- l - 甲基一5 氢- 吡哆- ( 4 ，3 b ) 吲哚和2 一氨基一3 一 甲基昧唑( 4 ，5 f ) 喹啉引起的突变作用。该实验强调尤其是酰化的花色苷抗突变作 用较强野生浆果含有大量花香苷配糖体，经a m e s 致癌实验，表明具有抑制苯芘、 氨基氟的变异活性，还具有修复人体血液中淋巴球的作用。花色苷还具有抑制人 体内形成并游离出的超氧化自由基的作用。经研究考证，花色苷的抗异原活性是 1 0 通过阻碍变异原前驱体( p r