（果树学专业论文）柑橘citserk基因克隆、序列分析及其遗传转化.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用二一 学位论文 墨 如需保密，解密时间 如岁年以月偿日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地3 - 外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：i 移讫s 时间： 炒7 年。莎月，驴日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：移他鼽导师签名：各衫父又p 签名日期：夕一7 年6 6 月f g 日 签名日期： 汐夕年月，步日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 摘；要3 a b s t r a c t 4 缩略词表5 j 一 1 只u 舌6 1 1 课题的提出6 1 2 前人研究进展6 1 2 1 体细胞胚胎发生的概念及影响体细胞胚胎发生的相关因子6 1 2 1 1 体细胞胚胎发生的概念6 1 2 1 2 影响体细胞胚胎发生的相关因子7 1 2 1 3 植物体细胞胚胎发生相关基因的分离与克隆7 1 2 1 4 植物体细胞胚胎发生相关特异蛋白。9 1 2 2 植物基因分离克隆方法研究进展9 1 2 2 1 同源序列法1 0 1 2 2 2 表达序列标签1 0 1 2 3s e r k 基因的研究进展l l 1 2 3 1s e r k 基因及s e r k 基因家族1 l 1 2 3 2s e r k 编码的蛋白一1 1 1 2 3 - 3s e r k 基因的表达一1 2 1 3 本研究的目的和内容1 2 2 材料和方法1 4 2 1 材料14 2 2 方法1 4 2 2 1r n a 的提取1 4 2 2 1 1r n a 提取试剂1 4 2 2 1 2r n a 提取步骤1 4 2 2 2 大肠杆菌感受态细胞的制备15 2 2 3c d n a 合成16 2 2 4 引物的合成、p c r 扩增、电泳1 6 2 2 5p c r 扩增产物的克隆和测序1 6 2 2 6 质粒d n a 的提取及酶切l7 2 2 6 1 质粒d n a 的提取( 碱裂解法) 17 2 2 6 2 酶切18 2 2 7 序列分析18 2 2 8s o u t h e r n 杂交。18 2 2 9s e n s e 和a n t i s e n s e 植物表达载体构建1 9 2 2 1 0 柑橘愈伤组织的遗传转化2 0 2 2 1 1 柑橘愈伤组织的准备2 0 2 2 1 2 农杆菌侵染液的制备2 0 2 2 1 3 侵染与共培养2 0 2 2 1 4 筛选培养。2 0 3 结果与分析2 l 3 1 总r n a 的提取2 1 3 2 暗柳橙体细胞胚胎发生过程中c i t s e r k 的克隆与分析2 1 3 2 1 暗柳橙c i t s e r k 的分离与克隆2 l 3 2 2 暗柳橙c i t s e r k 的序列分析2 3 3 2 3 暗柳橙c i t s e r k 的系统进化分析2 5 3 2 4 暗柳橙c i t s e r k 的拷贝数分析2 6 3 3 植物遗传转化载体的构建2 7 3 3 1 超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建2 7 3 3 2c i t s e r k 基因超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建2 7 3 3 3 植物遗传转化载体构建体系的优化2 8 3 3 4 转基因抗性愈伤组织的获得2 9 4 讨论3 0 4 1 体细胞胚胎发生的机制3 0 4 2c i t s e r k 与体细胞胚胎发生的关系3 0 4 3 与体细胞胚胎发生相关的其他因素3 0 4 4 基于本研究的后续工作31 参考文献：3 2 附表l ：c i t s e r k 基因的核甘酸序列3 8 附表2 ：c i t s e r k 基因编码的氨基酸序列3 9 致谢4 0 2 柑橘c i t s e r k 基因克隆、序列分析及其遗传转化 摘要 植物组织培养中，胚性愈伤组织经长期继代后分化能力能否保持，一直是细胞 工程研究中的重要课题。柑橘部分品种的愈伤组织经长期继代后，仍具有很强的体 胚发生能力，但也有一些品种的愈伤组织经长期继代后体胚发生能力下降，甚至完 全丧失体胚发生能力。从柑橘愈伤组织中克隆控制体胚发生的基因，对于通过基因 工程改良品种、提高转化子的再生具有重要意义。对柑橘体细胞胚胎发生的研究， 有助于进一步揭示柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生的分子调控机理，同时，也有助于 进一步提高柑橘愈伤组织离体种质库用于生物技术遗传改良的效率。 本研究以暗柳橙的愈伤组织为实验材料，利用r t - p c r 方法克隆了c i t s e r k 的 e d n a 全序列，并对其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。同 时，还构建了c i t s e r k 的正义表达载体和反义表达载体，并进行了遗传转化。主要研 究结果如下： 1 提取了暗柳橙愈伤组织的总r n a ，所提取的r n a 的a 2 6 d a 2 8 0 在1 6 5 1 9 0 之间， & 6 0 a 2 3 0 大于2 0 ；其质量和浓度能够直接用于其它分子生物学研究，如r t - p c r 及 n o r t h e r n 杂交等实验。 2 利用r t - p c r 方法从暗柳橙愈伤组织中克隆得到c i t s e r k 基因的c d n a 全序 列，全长1 8 8 6b p ，并对重组质粒d n a 进行了p c r 检测和酶切检测。 ， 3 利用美国国立生物技术信息中，t , b l a s t 程序、e x p a s y 和c l u s t a lw 软件进行 分析发现，c i t s e r k 基因与已克隆的其它s e r k 基因具有很高的同源性，编码6 2 1 个 氨基酸，等电点是5 5 7 ，分子量为6 8 3k d ，是一种疏水性蛋白，并对其氨基酸序列 结构进行了分析。 4 构建了c i t s e r k 基因的正义表达载体与反义表达载体，同时，对构建的正义 表达载体与反义表达载体的重组质粒d n a 进行了p c r 检测和酶切检测。 5 反义表达载体的遗传转化，并获得了一定数量的抗性愈伤组织。 关键词：柑橘；体细胞胚胎发生；c i t s e r k ；基因克隆；遗传转化 3 c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no f c i t s e r kg e n ei nc i t r u s a b s t r a c t t h ec o m p e t e n c ef o rs o m a t i ce m b r y o g e n e s i so fc a l l u sw i t hl o n g t e r mc o n s e r v a t i o ni s a l w a y st h eh o tp r o b l e mi np l a n tc e l le n g i n e e r i n g s o m ec a l l is t i l lh a v es t r o n gc o m p e t e n c e f o rs o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa f t e ral o n gt i m e w h i l et h a to fs o m eo t h e r sd e c r e a s e dr a p i d l y o ra l m o s tc o m p l e t e l yl o s tt h i sc a p a c i t y c l o n i n gt h eg e n e sa s s o c i a t e dw i t ht h es o m a t i c e m b r y o g e n e s i so fc i t r u sc a l l u s i s i m p o r t a n tf o rp l a n tr e g e n e r a t i o nf o l l o w i n gc a l l u s t r a n s f o r m a t i o n s t u d i e so ns o m a t i ce m b r y o g e n e s i so fc i t r u sc a l l u sw i l lh e l pu n d e r s t a n d t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n di m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fc i t r u s c a l l u su t i l i t y i nt h i ss t u d y , a n l i u s w e e to r a n g ew a su s e dt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fs o m a t i c e m b r y o g e n e s i s f u l le d n ao fc i t s e r kf r o ma n l i u c h e n gc a l l u sw a sa m p l i f i e db y r t - p c r i t sn u c l e o t i d ea n dp u t a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c ew e r ea n a l y z e d m e a n w h i l e ，t h e s e n s ea n da n t i s e n s ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e d a tp r e s e n t ，t h eg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o nh a sb e i n gd o n e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t o t a lr n af r o ma n l i uc a l l u sw a se x t r a c t e d t h er a t eo fa 2 耐k 2 3 0o fr n aw a so v e r 2 0 ，a n dt h ea 2 6 0 a 2 8 0r a n g e df r o m1 6 5 1 9 0 ，i n d i c a t i n gl o wl e v e l so fp o l y s a c c h a r i d e a n dg o o dp u r i t yo ft h er n a i t sq u a l i t yw a sf i n ef o rs u b s e q u e n tm o l e c u l a rb i o l o g y e x p e r i m e n t 2 t h ef u l lc d n ao fc i t s e r kw a sa m p l i f i e db yr t - p c r ，a n di th a s18 8 6n u c l e o t i d e a t t h es a m et i m e ，t h er e c o m b i n a t e dp l a s m i dd n aw a st e s t e db yp c ra n de n z y m ed i g e s t 3 c i t s e r kw a sa n a l y z e db yb l a s t , e x p a s ya n dc l u s t a lwo ni n t e r a c t ，i th a sh i g h h o m o l o g ys c o r ea ta m i n oa c i dl e v e lw i t ho t h e rs e r k s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e n u m b e ro f p u t a t i v ea m i n oa c i di s6 2 1 ，i s o e l e c t r i cp o i n ti s5 5 7a n dm o l e c u l a rw e i g h ti s 6 8 3 k d i ti sa h y d r o p h i l i ca m i n oa c i d 4 s e n s ea n da n t i s e n s ee x p r e s s i o nv e c t o r so fc i t s e r kw e r ec o n s t r u c t e d t h es e n s ea n d a n t i s e n s er e c o m b i n a t e dp l a s m i dd n aw a st e s t e db yp c ra n de n z y m e d i g e s t 5 t r a n s g e n i ca n l i uc a l l u sw e r eo b t a i n e db yt h em e t h o do fa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n k e yw o r d s ：c i t r u s ，s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ，c i t s e r k , g e n ec l o n i n g ，g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n 4 缩略词表 5 1 刖吾 1 1 课题的提出 柑橘是世界和我国南方第一大水果，是一种重要的经济作物。我国是柑橘原产 地和生产大国，产量在2 0 0 5 年居世界第二( 邓秀新，2 0 0 5 ) 。柑橘部分品种愈伤组 织体细胞胚胎发生能力弱是利用愈伤组织进行遗传改良获得再生植株的瓶颈，虽然 很多其它因素如激素种类和浓度的不同、光照时间的长短、温度的高低等也都与柑 橘转基因愈伤组织植株的再生直接相关，但柑橘愈伤组织自身基因型的不同是其愈 伤组织难以形成再生植株的主要原因。 多年的研究表明，改变体细胞胚胎发生能力弱的愈伤组织的基因型是克服转基 因愈伤组织难以形成再生植株的最有效途径。提高转基因愈伤组织再生植株的能力 是转基因研究的重要目标之一，传统的研究方法仅局限于外界条件对体细胞胚胎发 生的影响。而寻找丰富的体胚发生基因资源和全面阐述对体胚发生影响的机制可能 是最终克服部分柑橘愈伤组织体胚发生能力弱的必经之路。因此，本研究将从克隆 和分析与体细胞胚胎发生相关的基因入手，寻找控制柑橘愈伤组织体细胞胚胎发生 的分子证据，并在此基础上进行遗传转化，验证基因功能。 1 2 前人研究进展 1 2 1 体细胞胚胎发生的概念及影响体细胞胚胎发生的相关因子 1 2 1 1 体细胞胚胎发生的概念 体细胞胚胎发生是指在离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途 径发育成新个体的过程( h a c c i s ，1 9 7 8 ) 。体胚发生现象最早由s t e w a r d 等( 1 9 5 8 ) 在胡萝卜根细胞离体培养时发现，后来又陆续在单细胞悬浮培养、原生质体培养和 花粉培养中观察到( 黄素华等，2 0 0 3 ) 。体胚发生具有单细胞的特点( p o l i t oe t a 1 ，1 9 8 9 ) ，为基因工程、细胞工程等生物技术改良品种提供了良好的实验体系。 因此，2 0 世纪7 0 年代以来，这方面的研究与日俱增，已在4 3 科7 9 属1 1 4 种植物 中有体胚发生的报道，然而这些研究大部分局限于器官水平，即发生的形态学、生 理学( 酶代谢，蛋白代谢，核酸代谢以及激素，糖，多胺，金属离子，微量元素， 活性氧与体配发生关系) 的研究( 王风华，等；2 0 0 5 ；朱长甫等，1 9 9 7 ) 。随着分子 生物学研究技术的发展，植物体细胞胚胎发生的研究逐步深入到分子水平，如体胚 发生相关基因的分离，基因的表达调控，细胞的信号传导等。 6 1 2 1 2 影响体细胞胚胎发生的相关因子 体细胞胚胎发生对于利用柑橘愈伤组织进行遗传转化和理化诱变具有重要意 义。影响体细胞胚胎发生的因子有很多，国内外对这些相关因子的研究中以激素的 报道为最多。研究发现，添加2 , 4 一d ，柑橘体胚发生率0 ；添加4 - c p p u ，体胚发 生率为1 6 ( f i o r e 等2 0 0 2 ) ；而2 ，4 d 和a b a 结合使用，能促进体胚高频发生、 成熟甚至进一步发育( m o h a m e d ，2 0 0 4 ) ；k a u r 等( 2 0 0 4 ) 认为，2 ，4 d 和k t 结合 使用也能促进体胚发生。p a n a i a 等( 2 0 0 4 ) 发现细胞分裂素和t d z 可以促进体胚发 生。g i r i d h a r 等( 2 0 0 4 ) 认为适当浓度的t d z ，可以促进体胚快速发生。l a n g h a n s o v a 等( 2 0 0 4 ) 认为，聚乙二醇( p e g ) 和a b a 可促进体胚成熟和植株再生，用其处理 人参成熟的合子胚，再生率为7 0 ，而未处理的再生率为3l ，同时，处理的有7 5 形成根，而未处理的全部未生根。w u 等( 2 0 0 4 ) 在研究棉花体胚发生时发现，激 素的有无与不同激素的搭配使用，形成球形胚的比率不同。无激素，3 8 3 胚性愈伤 分化成球形胚；适当浓度的i b a 和k t 搭配使用，8 6 7 胚性愈伤分化成球形胚。另 外，糖代谢、d n a 甲基化和秋水仙素等其它相关因子也都在体细胞胚胎发生中起着 重要的作用( 赖钟雄，2 0 0 2 ；张进仁，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 3 植物体细胞胚胎发生相关基因的分离与克隆 绝大多数与体细胞胚胎发生相关的基因都是从胡萝卜上分离得到的，迄今为止， 从胡萝卜体细胞胚胎发生中克隆的基因就有2 0 多种。目前又从拟南芥、烟草、白云 杉等植物的体细胞胚胎中克隆到大批的基因( e d n a ) 片段( 表1 ) 。 表l 已克隆到的与体细胞胚胎发生相关的基因 t a b l e1c l o n e dg e n e sr e l a t e dt os o m a t i ce m b r y o g e n e s i s 7 8 1 2 1 4 植物体细胞胚胎发生相关特异蛋白 第一个完整的蛋白质数据库一酵母蛋白质数据库己于1 9 9 7 年由g a r r e l s 为首的 美国麻省蛋白质组公司创建。伴随着双向电泳技术日趋成熟，近年来，双向电泳技 术被广泛应用于植物特异蛋白的研究。s u n g 等( 1 9 8 1 ；1 9 8 3 ) 报道体胚与增殖期愈 伤组织相比，存在两种胚胎发生特异蛋白e l 和e 2 ，且体胚与增殖期愈伤组织之间 蛋白质双向电泳图谱差异不超过2 。r e i n b o t h e 等利用双向电泳技术对洋地黄、烟 草的离体培养物进行研究，将双向电泳获得的蛋白点分为三类：一是消失的蛋白点， 二是增加的蛋白点，三是不变的蛋白点。h i b e n 等( 1 9 9 2 ) 利用双向电泳技术获得2 个枸杞胚胎发生特异蛋白( 3 7 5k dp 1 4 ；3 7 5k dp 1 4 ) 。s t i m 等( 1 9 9 5 ) 对大麦具备 再生植株能力和不具备再生能力的胚性培养物进行比较研究时鉴定出3 个特异蛋白 ( 8 5k dp 1 5 8 ；4 6k dp 1 6 1 ；1 7 4k dp 1 6 1 ) ，其中前一个特异蛋白只存在于没有再 生能力的培养物中，后两个特异蛋白只存在于具备再生能力的培养物中。催凯荣等 ( 2 0 0 0 ) 利用双向电泳技术，对枸杞体胚发生中的特异蛋白分析发现在胚性愈伤组 织中有7 0k d ( p 1 7 4 ，7 5 ) ，5 6k d ( p 1 6 0 ) 、3 2k d ( p 1 6 8 ) 和一系列较小分子量( 2 0 2 6 k d ，p 1 5 0 5 5 ) 的特异蛋白表达。另外，g i r o u x ( 1 9 9 6 ) 等利用i e f s d s p a g e 双 向电泳技术，也鉴定出一种5 0k d 的体胚发生特异蛋白，在胡萝卜的体胚中也利用 蛋白质双向电泳技术得到了伴随2 ，4 d 加入而产生的蛋白。 在人参、小苍兰、西洋参、香雪兰、光棘豆、草木烯、罂栗、豌豆、拟南芥等 胚性培养物中也发现有特异蛋白存在( z h e n ge ta 1 1 9 9 4 ；杨和平等1 9 9 1 ) ，其中有 一种5 4k d 的多肽只特异性的存在于水稻胚性愈伤组织和胚状体中( c h e ne ta 1 1 9 8 7 ) ，而大麦体胚中则有一种2 9k d 的特异蛋白( n a t oe ta 1 1 9 9 7 ) 。 可见，无论双子叶植物还是单子叶植物在体细胞胚胎发生的过程中，处于特定 状态下的培养细胞中确实存在某些特异蛋白，它们似乎与组织或细胞在该状态下的 特定功能和性质有关。特异蛋白可以作为分子标记来鉴别潜在的胚性培养物，跟踪 胚胎发育，并为进一步探讨体细胞胚胎发生的基因调控和分子机制提供依据。 1 2 2 植物基因分离克隆方法研究进展 随着生物技术、基因组学和生物信息学的飞速发展，目前已发展出一系列适合 各种不同起始条件的基因克隆方法。如图位克隆法、转座子标签法、同源序列法、 r a c e 、表达序列标签( e s t ) 、基因表达系列分析( s a g e ) 、交互式差减差异r n a 显示( r s d d ) 、转录活动的差减杂交技术( a d s h ) 、c d n a 捕捉法、顺次差示显示 法、标签接头p c r 技术( a t a t - p c r ) 、c d n a 微列阵( c d n am i c r o a r r a y ) 、差别筛选 ( d s ) 、r n a 指纹技术( r a p p c r ) 、消减杂交法( s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) 、 9 c d n a a f l p 技术、差异显示( d d i m p c r ) 和抑制性差减杂交( s s h ) 等( 李斐雪 和王雁玲，2 0 0 4 ；谢伟伟等，2 0 0 5 ；安心民，2 0 0 1 ) 。但对于体细胞胚胎发生相关基 因的克隆而言，其方法主要集中在同源序列法和表达序列标签。 1 2 2 1 同源序列法 生物的种、属之间编码基因的某些区域高度同源，可以根据它们序列的保守性 设计引物来扩增目的基因。绝大多数抗病基因都是通过同源序列法获得的( 易图永 等，2 0 0 2 ) ，果树上的许多基因也是通过同源序列法克隆到的( 徐昌杰和张上隆，2 0 0 2 ； k a t o 等，2 0 0 4 ；a s i f 和n a t h ，2 0 0 5 ) 。虽然在克隆新基因方面受到限制，同源序列 法仍然是目前基因克隆最常用的方法。 1 2 2 2 表达序列标签 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 是指从不同组织来源的c d n a 文 库中随机挑选克隆进行单向测序所获得的一段核苷酸序列，平均长度为3 0 0 5 0 0 b p ( a d a m s 等，1 9 9 1 ；a r p a t 等，2 0 0 4 ) 。其技术的核心是以c d n a 文库为基础进行大 规模随机测序，因此能快速获得基因的全长，已被广泛应用于新基因的克隆、组织 特异性基因表达谱分析以及基因组序列的功能注释等研究领域，成为大规模获取功 能基因的一种最为快捷和有效的研究手段( f o r m e n t 等，2 0 0 5 ；d e v i t t 等，2 0 0 6 ) 。 植物中最早开展e s t 的是拟南芥( h o f t e 等，1 9 9 3 ) 。水稻是第二个被选中的进 行基因组研究的单子叶植物( s a s a k i 等，1 9 9 4 ；y a m a m o t o ，1 9 9 7 ；j a n t a s u r i y a r a t 等， 2 0 0 5 ) 。随之高粱、番茄、棉花、大豆、小麦、玉米等作物的e s t 研究相继展开( k w a k 等，1 9 9 6 ；e m m a n u e l 和l e v y ，2 0 0 2 ；f e r n a n d e s 等，2 0 0 2 ) 。近年来也开展了一些 木本植物的e s t 研究，如板栗( c o n n o r s 等，2 0 0 1 ) ；松树( w h e t t e n 等，2 0 0 1 ) ；杏 ( j i a n g 和m a ，2 0 0 3 ) ，葡萄( m o s e r 等，2 0 0 5 ) 和柑橘( h i s a d a 等，1 9 9 6 ；h i s a d a 等，1 9 9 7 ；m o f i g u c h 等，1 9 9 8 ；h i s a d a 等，1 9 9 9 ；k i t a 等，2 0 0 0 ；b a u s h e r 等，2 0 0 3 ； s h i m a d a 等，2 0 0 3 ；s h a t t e r s 等，2 0 0 4 ；f o r m e n t 等，2 0 0 5 ) 等。 随着各种生物e s t 计划的不断开展，公共数据库中的e s t 数目由1 9 9 1 年的不 足2 0 0 0 条，增加至2 0 0 7 年1 月的3 2 8 8 9 2 2 5 条，e s t 数量在各核苷酸数据库中达到 最大。植物中排名前十位的分别是玉米( 1 0 1 5 4 2 2 条) ，小麦( 1 2 1 1 4 3 条) ，拟南芥 ( 2 8 0 0 8 6 0 条) ；水稻( 1 2 7 0 9 2 7 条) ，大麦( 4 7 5 4 0 7 条) ，大豆( 4 3 8 0 1 3 条) ，松树 ( 4 7 9 3 2 7 条) ，马铃薯( 2 9 2 1 5 5 条) ，高梁( 2 0 8 4 6 6 条) 和番茄( 3 4 9 5 9 0 条) 。紧随 其后的是苹果( 2 6 0 6 0 5 条) 和葡萄( 9 8 9 5 6 条) 。柑橘中的e s t 也达到2 3 5 1 1 6 条， 分布于不同的种属中：脐橙( c i t r u ss i n e n s i s ，1 0 0 2 3 0 条) ，枳( p o n c i r u st r i f o l i a t a ， 3 7 7 8 5 条) ，克里曼丁橘( c i t r u sc l e m e n t i n a ，6 4 0 9 0 条) ，枳柚( c i t r u s xp a r a d i s i 1 0 p o n c i r u st r i f o l i a t a ，8 0 4 8 条) ，酸橙( c i t r u sa u r a n t i u m ，5 0 6 0 条) ，杂柑类( c i t r u s r e f i c u l a t asc i t r u st e m p l e ，1 8 2 3 条；c i t r u sc l e m e n t i n a c i t r u st a n g e r i n a ，1 7 6 6 条； c i t r u ss i n e n s i sxp o n c i r u st r i f o l i a t a ，1 0 5 2 条；c i t r u sc l e m e n t i n a c i t r u sr e t i c u l a t a ， 7 4 条) ，宽皮柑橘( o t r u sr e t i c u l a t a ，5 5 3 7 条) ，温州蜜柑( 甜t r u su n s h i u ，4 5 9 2 条) ，酸橘( c i t r u sr e s h n i ，2 8 6 7 条) ，来檬( c i t r u sm a c r o p h y l l a ，1 0 7 6 条) ，柠檬 ( c i t r u sj a m b h i r i ，1 0 2 0 条) ，枸橼( c i t r u sm e d i c a ，6 5 0 条) 。从以上的文献和数据 还可以看出，柑橘e s t 的研究主要集中在日本、美国、西班牙和巴西等国家，我国 的柑橘e s t 在相关的数据库和文献中还没有报道。 1 2 3s e r k 基因的研究进展 1 2 3 1s e r k 基因及s e r k 基因家族 胡萝卜s e r k ( d c s e r k ) 基因是在寻找能够监测悬浮细胞培养体细胞向胚性细胞 转变的标记基因时发现的一段c d n a 克隆，氨基酸序列以及激酶体外分析表明，该基 因编码一种l r r r l k 。随后又在拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ( h e c h t 等，2 0 0 1 ) 、玉米 ( z e am a y ) ( b a u d i n o 等，2 0 0 1 ) 、苜蓿( m e d i c a g ot r u n c a t u l a ) ( k i m 等，2 0 0 3 ) 、向 日葵( h e l i a n t h u s a n n u u s ) ( c 1 6 m e n t 等，2 0 0 4 ) 等植物中克隆和鉴定了s e r k 基因，分 别命名为彳f s e 尺k 、z ms e r k 、m t s e r k 和h a s e r k 。目前，拟南芥基因 组也发现有5 + a t s e r k ( a t s e r k l 、a t s e r k 2 、a t s e r k 3 、a t s e r k 4 和a t s e r k 5 ) ， 其中，a t s e r k 2 5 是在细菌人工染色体( b a c t e r i aa r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s ，b a c s ) 上找 到的4 段序列，由于它具有4 t s e r k l 的结构特征，也命名为彳觥。玉米基因组至 少有3 个距蜮员，即锄觥1 、z m s e r k 2 和z m s e r k 3 ，其中，z m s e r k l 、z m s e r k 2 是用胡萝卜和拟南芥s e r k 的简并引物( d e g e n e r a t ep r i m e r s ) 进行基因组和c d n a 筛 选过程中发现的，z m s e r k 3 则是在上述两者表达分析过程中获得的一段c d n a 克 隆( b a u d i n o 等，2 0 0 1 ) 。m t s e r k l 是在苜蓿高胚性种系2 h a 培养了2 周的培养物中 克隆出的，目前苜蓿中只克隆出m t s e r k l ( k i m 等，2 0 0 3 ) 。至今，美国国立生物 技术信息中心( n c b i ) 已接受5 2 个有关s e r k 基因的序列注册 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v 0 。所有这些基因组成了一个s e r k 基因家族。 1 2 3 2 胚尼脯码的蛋白 s e r k 蛋白既有l r r r l k 的经典结构，又有其独特的部分，即包括1 个s p 、i + z i p 、 5 1 l r r 基序和1 个s p p 。l r r 是由串联排列的具有l e u - x - x - l e u x l e u - x - x a s n x l e u 的 保守序列组成，l r r 结构不完全相同，根据胞外的l r r 结构可将l r r - r l k 分为1 3 个亚类( b a u d i n 等，2 0 0 1 ) 。在保守区内的保守残基认为可为蛋白与蛋白相互作用提 供结构支架，而保守区内的可变氨基酸决定了它与其相互作用蛋白的特异性。位于 保守区以外的氨基酸具有极低的序列同源性。l r r r l k s 广泛存在于多种植物中， 在这些植物中，l r r 重复单元的数目是可变的，从3 - 2 7 个不等( s h i u 等，2 0 0 3 ；z h a n g ， 1 9 9 8 ) ，如拟南芥c l v l 有2 1 个l r r 单元，油菜b r l l 有2 5 个l r r 单元，水稻x a 2 1 有 2 3 个l r r 单元等，l r r 单元的数目不同可能也与决定蛋白质相互作用的特异性有关。 s e r k 基因编码l r r - t m p k 类蛋白，其l r r 为胞外结构域，它能与胞内的p k 跨 膜区域相结合。s e r k t 卜导的抗性需l r r 和p k 的共同作用才能完成( h o n g 等，2 0 0 5 ) 。 胞外l i 汛结构域可与来自病源物的基因相结合，从而感知病源物侵染的信号，这一 信号的传导活化其胞内蛋白激酶( p k ) 的表达，从而激活细胞内一系列的反应，最 终介导s e r k 的表达。 1 2 3 3s e r k 基因的表达 艇雠拟南芥和苜蓿中表达与在胡萝卜和鸭茅中的表达相似( 陈小飞，萧浪涛， 2 0 0 5 ) 。但不同物种s ! e r 朦达存在较大差异。无论直接体胚发生还是间接体胚发生， 鸭茅中胚胎发育早期艇脚有表达，而且晚期胚胎也有表达，表达集中在分生区域， 如茎顶端分生组织、胚芽鞘、胚根鞘以及盾片等，在成熟的组织中未检测到表达 ( s o m l e v a 等，2 0 0 0 ) 。a t s e r k l 也在胚胎发生能力获取、胚性细胞、早期体胚以及 合子胚早期发育中高水平表达。合子胚发育时，胚珠未完全发育时的胞核、功能性 孢子以及受精前的胚囊细胞，受精后到心形胚的所有胚细胞都有低水平表达。对 彳心e r k 启动子融合的g u s 基因表达分析显示，在莲座叶、根等成熟维管组织中都有 低水平的表达( h e c h te ta 1 2 0 0 1 ) ，比在胡萝卜、鸭茅表达时间和范围上广泛得多， 这可能是拟南芥与胡萝b 、鸭茅间物种差异所致。比较特殊的是z m s e r k 。z m s e r k l 、 z m s e r k 2 在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织培养物中都存在表达差异：z m s e r i e 2 在非胚性培养物、成熟胚珠、叶、单核小孢子等材料中都表达；而z m s e r k l 在小 孢子中强烈表达，在根尖、成熟叶等组织中都无表达( b a u d i n o 等，2 0 0 1 ) 。与其它 s e r k 的一个最重要区别则在于z m s e r k l 在体胚中缺乏表达。在柑橘未分化的愈伤组 织中未检测到s e r k 基因的表达，随后从心型胚到子叶胚中，s e r k 基因的表达依次 升高。同时，艇越因在柑橘的花、叶、茎、3 0 天和6 0 天的果实组织中均有表达， 且依次升高，在6 0 天的汁囊中表达最高，但当果实到1 8 0 天时，s e r k 基因的表达突 然消失( s h i m a d a 等，2 0 0 5 ) 。这些均表明，s e e g 体胚发生所必须的基因，同时， 艇嗽达并不局限于那些完成了转变成为胚性状态的细胞。 1 3 本研究的目的和内容 在柑橘中，有些品种的愈伤组织继代多年后，仍具有很强的体细胞胚胎发生能 力，在基本培养基上就能形成胚状体，而有些品种的愈伤组织一直维持在愈伤未分 化状态，即使在甘油培养基上也很难形成胚状体。这给转基因愈伤组织的转化子再 生带来了很大的困难。为此，本研究的目的在于：分离与体细胞胚胎发生相关的基 1 2 因，为人为控制愈伤组织的体细胞胚胎发生提供理论指导和技术支持，同时也为进 一步揭示体细胞胚胎发生的机理奠定一定的基础。具体研究内容： 1 利用r t - p c r 从a l c ( 暗柳橙) 中分离柑橘c i t s e r k 基因c d n a 全序列。 2 进行序列比对，分析与其它物种s e r k 基因的差异。 3 s o u t h e r n 杂交，验证其拷贝数。 4 构建c i t s e r k 正义( 超量) 表达载体和反义表达载体。 5 遗传转化。 1 3 2 材料和方法 2 1 材料 供试的愈伤组织来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，品种为暗柳 橙，英文名为a n l i u c h e n g s 、e e to r a n g e ，学名为c i t r u sj 加傩西。 2 2 方法 2 2 1r n a 的提取 愈伤组织r n a 的提取参照刘永忠等( 2 0 0 6 ) 。具体步骤如下： 2 2 1 1r n a 提取试剂 抽提b u f f e r ：o 1m o l lt r i s h c l ，o 1 m o l ll i c i ，o 0 1m o l le d t a ，1 ( w v ) 十二烷基硫酸钠( s d s ) ，0 5 ( w v ) 十二烷基肌氨酸钠( s a r c o s y l ) ，p h 8 0 水饱和酚( p h 4 2 - 5 0 ) 和氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 8m o l l l i c l 预冷的7 5 乙醇和无水乙醇( 贮藏在- 2 0 低温中) t e s a r ：10m m o l lt r i s h c l ( p h8 0 ) ，1m m o l le d t a ，1 ( w v ) s a r