（生物化学与分子生物学专业论文）乙型肝炎病毒x蛋白与肝癌关系的研究.pdf

南开大学 博士研究生毕业( 学位) 论文 乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌关系的研究 a s s e s s m e n to fr e l a t i o n s h i pb e t w e e nh e p a t i t i sb v i r u sxp r o t e i na n d h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a 姓名：东楠 年 级：二零零二级 专 业：生物化学与分子生物学 研究方向：肿瘤分子生物学 完成日期：二零零五年四月 指导教师：旰丽虹教授 张晓东教授 南开大学生命科学学院 i _ l 南开大学学位论文版权使用授权书 卜 、 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：。本、桶 z s 年s 只f a 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在j 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： _ m 学位论文作者签名： 乐桶 解密时间： 2 。i 。 年i 二月 弓f 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：。辱、桶 ：西5 年岁月，口日 iil rr 乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌关系的研究 目录 目录 中文摘要i b s t l 蝴i v 缩写词表v i i 前言1 1 h b x 基因及其表达产物h b x 1 2 h b x 与肝癌发生的关系l 研究目的和意义6 第一部分稳定表达h b x 蛋白细胞系的建立及其应用研究7 1 1 弓i 言7 1 2 材料7 1 3 方法l1 1 4 结果2 7 1 5 讨论4 7 第二部分l i b ( 蛋白对h t e r t 表达及活性的影响5 0 2 1 弓i 言5 0 2 2 ) l 才料5 0 2 3 方法51 2 4 结果5 5 2 5 讨论6l 第三部分t b x 在肝癌细胞中对细胞凋亡信号传导途径的影响6 3 3 1 弓f 言6 3 3 2 材料6 4 3 3 方法6 5 3 4 结裂6 7 3 5 讨论8 0 小结与展望8 4 参考文献8 6 综述：乙肝病毒x 基因与肝癌发病关系的研究进展9 2 一、h b x 基因分子生物学9 2 二、h b x 与肝癌9 4 三、基因芯片及蛋白质组学技术在肝癌研究中的应用研究进展1 0 5 附录l 常规溶液配制1 1 5 l 免疫组化实验试剂配制1 15 2w e s t e r n 免疫印迹实验试剂配制1 1 5 附录2 论文发表情况1 1 8 1 致谢1 2 0 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌关系的研究中文摘要 中文摘要 乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 的持续感染与肝癌的发生密切相关，由乙肝 病毒x 开放读码框编码的x 蛋白( h b x ) 在肝癌的发生中起重要作用，但是h b x 蛋白的 致癌机理目前尚不清楚。为了进一步阐明h b x 与肝癌发病的关系，我们在组织、细胞和 分子水平上对h b x 的致癌机理进行了深入细致的研究，主要研究内容如下： 第一部分，稳定表达h b x 细胞系的建立及其应用研究 为了探讨乙肝病毒h b x 基因在肝癌细胞中整合后的作用，建立稳定转染h b x 基因的 细胞系具有十分重要的意义。该研究的主要内容有：第一，建立了稳定转染h b x 基因的 肝癌细胞系，并进行了生物学鉴定。通过基因转染技术将克隆有乙肝病毒x 基因( h b x ) 的p c m v - x 质粒导入培养的人肝癌细胞系h 7 4 0 2 中，经g 4 1 8 筛选，建立了稳定表达h b x 的肝癌细胞系，命名为h 7 4 0 2 x 。以h 7 4 0 2 x 细胞基因组d n a 为模板进行p c r ，并进 行r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 及免疫荧光检测，显示h 7 4 0 2 x 细胞中存在x 基因的整合及x 蛋白的表达。第二，应用基因芯片技术和蛋白质组学技术比较了h 7 4 0 2 一x 和h 7 4 0 2 一p ( 对 照组) 细胞，检测了h 7 4 0 2 - x 细胞中基因表达谱和蛋白表达谱的变化。基因芯片检测发现 1 0 2 个有明显差异的基因，其中在h 7 4 0 2 一x 细胞中呈上调表达( 比值 2 0 ) 的基因有8 2 个，呈下调表达( 比值0 5 ) 的基因有2 0 个；我们从基因芯片检测结果中选出两个基因 ( i l 6 和n r 4 a 3 ) 进行了r e a l t i m ep c r 检测进行验证，显示与芯片获得的结果一致。蛋 白质组学检测发现差异表达的蛋白质有2 2 个。差异表达的基因和蛋白质的功能广泛涉及 到细胞凋亡、转录调控、细胞黏附与转移和代谢等多方面。第三，对h 7 4 0 2 一x 细胞的生物 学特征进行了研究。检测了h 7 4 0 2 一x 细胞增殖和细胞周期分布。通过细胞动力学和流式 细胞仪检测发现h 7 4 0 2 - x 细胞的增殖速度加快，处于g o g i 期的细胞减少，而处于s 期 的细胞显著增加。应用w e s t e r nb l o t 方法检测了增殖细胞核抗原( p c n a ，p r o l i f e r a t i n gc e l l n u c l e a ra n t i g e n ) ，细胞周期相关蛋白c y c l i nd ，e y c l i ne 和p 2 7 的表达。结果发现，h 7 4 0 2 - x 细胞中p c n a ，c y c l i nd ，e y c l i ne 的表达水平明显增加，而细胞周期抑制蛋白p 2 7 表达水 平下调。应用报告基因方法检测了h b x 蛋白对转录调控因子n f k a p p ab 和a p 1 启动 子的作用。结果显示，h b x 蛋白对n f k a p p ab 和a p l 启动子具有明显的激活作用。 探讨了h b x 蛋白的表达水平与细胞凋亡的关系。应用抗癌药阿霉素诱导h 7 4 0 2 肝癌细胞 建立细胞凋亡模型，流式细胞仪检测发现h 7 4 0 2 一x 细胞具有明显的抗细胞凋亡作用， w e s t e r nb l o t 检测显示h 7 4 0 2 一x 细胞中凋亡抑制蛋白b c l - 2 和s u r v i v i n 蛋白表达明显上调。 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 i 乙裂肝炎病毒x 蛋白与肝癌关系的研究中文摘要 构建了h b x 基因的r n a 干扰真核表达载体p s i l e n c e r3 o x ，将其导入h 7 4 0 2 x 细 胞后发现h b x 基因m r n a 的表达水平明显下调，h b x 的表达受到显著抑制；4 8 h 后，显 示转染了p s i l e n c e r3 0 - x 的细胞与未转染的细胞相比增殖速度明显减慢，流式细胞仪分 析显示处于s 期的细胞显著减少，细胞凋亡实验显示抗凋亡能力减弱。同时，w e s t e r nb l o t 结果显示b c l 2 、s u r v i v i n 和p c n a 的表达水平明显下调。 第二部分，h b x 对肝癌细胞h t e r t 表达及活性的影响 由于端粒酶( t e l o m e r a s e ) 在癌变过程中发挥重要作用，为了阐明h b x 蛋白对端粒酶 反转录酶( h u m a nt e l o m e r a s er e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，h t e r t ) 的表达及活性的影响，应用免 疫组织化学的方法，检测了乙型肝炎病毒三种抗原( h b s a g ，h b c a g ，h b x a g ) 和h t e r t 在3 4 例肝癌，癌旁及3 0 例肝硬化组织中的表达及分布，旨在探讨这三种抗原与h t e r t 在肝癌组织中的关系及意义。结果显示，在肝癌组织及肝硬化组织中均有h b x a g 高水平 的表达，在肝癌、癌旁和肝硬变组织中，h b x a g 阳性检出率分别为7 6 5 、8 5 3 和1 0 0 o ； h t e r t 在这三种组织中的阳性率分别为6 7 6 ，7 3 5 和1 0 0 ( 均为p 0 0 5 ) 。将克隆有 h b x 基因的p c m v - x 质粒瞬时转染至h 7 4 0 2 细胞中，发现h b x 过表达不仅具有上调 h t e r t 和c m y c 蛋白表达的作用，而且还具有增强h t e r t 活性的作用；在h 7 4 0 2 x 细 胞中h t e r t 的活性显著提高。因此，h b x 可促进h t e r t 的表达和增强其活性，可能在 乙型肝炎病毒致癌过程中发挥重要的作用。 第三部分，h b x 对肝癌细胞细胞凋亡信号传导途径的影响 h b x 过表达时可导致细胞凋亡，文献报道h b x 对细胞凋亡信号传导途径中的许多因子 产生影响。线粒体及内质网应激途径是介导细胞凋亡信号传导的两条重要通路。为了进一 步阐明h b x 与细胞凋亡信号传导途径的关系，本研究从几个方面对h b x 与细胞凋亡信号传 导途径的关系进行了探讨。第一，应用免疫组化方法检测了3 4 例肝癌组织中b c l 一2 家族 7 个成员( b a k 、b a d 、b i d 、b a x 、b c l x s 、b c l w 和b c l 2 ) 的表达。结果表明，b c l - 2 家 族参与了肝癌细胞细胞凋亡的调控；第二，探讨了h b x 与线粒体凋亡途径的关系。瞬时转 染3 p c m v - x 质粒后，发现h 7 4 0 2 细胞发生凋亡，细胞凋亡率达4 2 7 ：w e s t e r nb l o t ，检测显示，b c l - 2 表达水平减少而b a x 表达水平增加；罗丹明染色结果显示线粒体膜电位 下降，可能导致细胞色素c 释放增加；w e s t e r nb l o t 检测显示线粒体凋亡途径中的相关 因子细胞色素c 、a p a f l 、p r o c a s p a s e 9 和p r o c a s p a s e 3 的表达水平有不同程度的增加； 第三，探讨了h b x 与内质网应激途径的关系。瞬时转染3 腿p c m v - x 质粒后，发现h 7 4 0 2 细胞中钙离子浓度增加，w e s t e r nb l o t 检测到c a s p a s e l 2 的表达，表明了h b x 可导致内 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 h 乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌关系的研究 中文摘要 质网应激，进而介导细胞凋亡；第四，探讨了h b x 与i a p ( i n h i b i t o ro fa p o p t o s i s ) 家 族的关系。本实验室前期研究发现h b x a g 与s u r v i v i n 有密切的关系，两者的表达具有协 同性，而且s u r v i v i n 具有抑制h b x 诱导细胞凋亡的作用。为了进一步研究h b x 与s u r v i v i n 的关系，在此基础上，我们继续进行研究，发现转染的h b x 可剂量依赖性地促进内源性 s u r v i v i n 表达。在h 7 4 0 2 x 细胞中也出现s u r v i v i n 表达水平提高。当应用r n a 干扰真核 表达载体p s i l e n c e r3 0 - x 后，发现s u r v i v i n 的表达明显降低。为了直接观察h b x 蛋白 在肝癌发生中的作用，我们还构建了t a t x 蛋白转导载体，可实现h b x 蛋白转导。 综上所述，我们发现h b x 可能通过整合入宿主细胞基因组影响细胞增殖、细胞周期 和抗凋亡活性对肝癌细胞产生影响：同时，h b x 蛋白还通过增强肝癌细胞h t e r t 表达和 活性在细胞永生化中起重要作用。h b x 蛋白通过影响细胞凋亡线粒体途径和内质网应激 途径并与凋亡家族蛋白( b c l 2 和i a p 家族) 直接或间接作用参与对细胞凋亡的调控，凋 亡异常也是导致肝癌发生的主要原因。上述研究将为深入揭示h b x 的致癌机理提供新的 实验依据，可进一步丰富h b x 致癌的分子机理，对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论 价值。 关键词：肝癌；乙型肝炎病毒x 蛋白；基因芯片；蛋白质组学；细胞周期；细胞凋亡： h t e r t ：b c l - 2 ；s u r v i v i mr n a 干扰 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 i i i 下 a b s t r a c t i n f e c t i o no fh e p a t i t i sbv i r u s ( h b v ) i sc l o s e l yr e l a t e dt ot h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n t o fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) p r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w nt h a th b v x p r o t e i n ( h b x ) ， e n c o d e db yh b vxo p e nr e a d i n gf r a m e ( o i 心) ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to f h c c i no r d e rt oi l l u s t r a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh b xa n dh c c ，i nt h i st e x tw ee m p h a s i z e d t h es t u d yo fc a r c i n o g e n e s i so fh b xp r o t e i na tt h el e v e l so ft i s s u e ，c e l la n dm o l e c u l e t h i ss t u d y i n c l u d e st h r e ep a r t sa sf o l l o w s ： e s t a b l i s h m e n to fas t a b l eh b x e x p r e s s i n gc e l ll i n e t od e m o n s t r a t et h ef u n c t i o n so fi n t e g r a t i o no fh b xi nh e p a t o m ac e l l s ，i ti ss i g n i f i c a n tt o e s t a b l i s ham o d e lw i t hs t a b l ee x p r e s s i o no fh b x t h i sp a r ti n c l u d e st h r e em a j o rc o n t e n t s f i r s t ， e s t a b l i s h m e n ta i l di d e n t i f i c a t i o no fac e l ll i n ew i t hs t a b l ee x p r e s s i n gh b x p c m v - x ，e n c o d e d h b xg e n e ，w a st r a n s f e c t e di n t oh u m a nh e p a t o m ah 7 4 0 2c e l l sb yl i p o f e c t e m i n ，a n dg 一418w a s e m p l o y e dt os e l e c tt h et r a n s f e c t a n t s a f t e rt h a t ，ac e l l l i n ew a se s t a b l i s h e d ，w h i c hw a sa b l et o s t a b l ee x p r e s sh b x ，t e r m e dh 7 4 0 2 x t h em e t h o d s o fp c r ，r t - p c r ，w e s t e r nb l o t a n d i l r n u n o f l o u r e s c e n c ew e r eu s e dt oa p p r o v et h ei n t e g r a t i o na n de x p r e s s i o no fh b xg e n e s e c o n d ， t h et w oc e l ll i n e s h 7 4 0 2 xa n dh 7 4 0 2 p ，w e r ec o m p a r e dt os c r e e nh b x a s s o c i a t e dg e n e sa n d p r o t e i n sb ye d n am i c r o a r r a y , 2 - de l e c t r o p h o r e s i sa n dm a s ss p e c t r u m ，d i s p l a y i n g d i f f e r e n t g e n ea n dp r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l e t h er e s u l t so fg e n ec h i ps h o w e dt h a t10 2k i n d so fg e n e s w e r em a r k e d l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h et w oc e l ll i n e s ，i nw h i c h8 2w e r eu p r e g u l a t e da n d2 0 d o w n - r e g u l a t e di nh 7 4 0 2 xc e l l s t w oo ft h e m ( i l 一6 ，a n dn r 4 a 3 ) w e r er e c o n f i r m e db y r e a l t i m ep c r m o r e o v e r , t h e r ew e r e2 2d i f f e r e n tk i n d so fp r o t e i n sb e t w e e nt h et w oc e l ll i n e s b yp r o t e o m e t h ea b o v eg e n e sa n dp r o t e i n sa r ea s s o c i a t e dw i t ht h e s ef u n c t i o n s ，s u c ha ss i g n a l t r a n s d u c t i o n ，t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ，c e l l a d h e s i o na n dm o v e m e n t ，a p o p t o s i s ，c e l lc y c l e ， m e t a b o l i s m a n ds oo n t h i r d ，t h eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fh 7 4 0 2 - xw e r ei n v e s t i g a t e d c e l l d r o l i f e r a t i o na n dc e l lc y c l ew e r ea n a l y z e db yc e l ld y n a m i c sa n df l o wc y t o m e t r y , a n dc e l lc y c l e a s s o c i a t e dp r o t e i n s ，s u c ha sc y c l i nd ，e y c l i ne ，p 2 7a n dp r o l i f e r a t i n gc e l l n u c l e a ra n t i g e n 7 ( p c n a ) w a se x a m i n e db yw e s t e r nb l o ta n a l y s i s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f p c n a c y c l i nd a n de y c l i new e r eu p r e g u l m e db u tp 2 7 ，a ni n h i b i t o ro fc e l lc y c l e ，w a s d o w n - r e g u l a t e di nh 7 4 0 2 xc e l l s n e x t ，t h er e p o r t e rg e n e sw e r ee m p l o y e d t od e t e c tt h ee f f e c t o fh b x 雏at r a n s a c t i v a t o r , o np r o m o t e ro fn f k a p p ab a n da p 1 t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t h b xc o u l da c t i v a t et h et w op r o m o t e r sr e m a r k a b l y m o r e o v e r , w ee x a m i n e dt h er e l a t i o n s h i p 南开大学博士研究生毕q v ( 学位) 论文 b e t w e e nh b xa n da p o p t o s i s f l o wc y t o m e t r ya n a l y s i si n d i c a t e dt h a th 7 4 0 2 一xc e l l sr e s i s t e d a p o p t o s i si n d u c e db ya d r i n m y c i n ，a n dm e a n t i m ew e s t e r nb l o ta n a l y s i s r e v e a l e dt h a tt h e e x p r e s s i o no fb c l 2a n ds u r v i v i n g ，a n t i a p o p t o t i cp r o t e i n s ，w a si n c r e a s e di n h 7 4 0 2 一x i no r d e r t ol u c u b r a t et h ef u n c t i o no fh b x ，t h ev e c t o ro fp s i l e n c e r3 0 - xw a sc o n s t r u c t e df o rr n a i n t e r f e r e n c e a f t e rt r a n s f e c t i o nw i t hp s i l e n c e r3 0 x ，h b xm r n aw a sd e c r e a s e da n dt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fh b x w a si n h i b i t e de v i d e n t l yi nh 7 4 0 2 一xc e l l s w ea l s oo b s e r v e dt h ec e l l g r o w t h ，c e l lc y c l ea n dt h ea b i l i t yo fr e s i s t i n ga p o p t o s i si n4 8 h t r a n s f e c t i o no fp s i l e n c e r3 0 x ， a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec e l lg r o w t hw a sr e p r e s s e da n dt h en u m b e ro fc e l l si nsp h a s e d e c r e a s e d t h ea b i l i t yo fr e s i s t i n ga p o p t o s i si n d u c e db ya d r i n m y c i nd e c l i n e d w e s t e r nb l o t a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i n ，b c l - 2a n dp c n a w a so b v i o u s l yd e c r e a s e da t t h es a m et i m e e f f e c to fh b xo ne x p r e s s i o na n da c t i v i t yo fh t e r t i nh e p a t o m ac e l l s t e l o m e r a s ep l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nc a r c i n o g e n e s i s i no r d e rt oe l u c i d a t et h er e l a t i o n s h i p b e t 、v e e nh b xa n dh u m a nt e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e( h t e r t ) ， w eu s e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o dt os t u d yt h ee x p r e s s i o no fh t e r ta n dh b va n t i g e n s ( h b s a g ， h b c a g a n dh b x a g ) i n3 4c a s e so fh c ca n dc o r r e s p o n d i n gp a r a t u m o rt i s s u e sa n d3 0c a s e so f l i v e rc i r r h o s i s w ef o u n dt h a th b x a gw a se x p r e s s e db y7 6 5 i nt u m o rt i s s u e s ，8 5 3 i n p a r a t u m o rt i s s u e s a n d 10 0 i nc i r r h o t i ct i s s u e s h t e r tp o s i t i v er a t ew a s6 7 6 ，7 3 5 ，a n d 10 0 i nt u m o r ，p a r a t u m o r ，a n dc i r r h o s i ss a m p l e sr e s p e c t i v e l y t oe x a m i n et h ee f f e c to fh b x o n h t e r te x p r e s s i o na n da c t i v i t yi nh e p a t o m ac e l l s ，w et r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e dt h ep c m v _ x p l a s m i di n t oh 7 4 0 2h e p a t o m ac e i l s ，t h e nm e a s u r e dt h ee x p r e s s i o no fc - 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2f a m i l y ，i n c l u d i n g p r o a p o p t o t i c m e m b e r so fb c l 2f a m i l ys u c ha sb a k ，b a d ，b i d ，b c l - x s a n db a x ，a n d a n t i a p o p t o t i co n e ss u c ha sb c l wa n db c l 2 ， w a sd e t e c t e di n3 4c a s e so ft i s s u e st oe x p l o r et h e s i g n i f i c a n c eo ft h e i re x p r e s s i o n i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt 1 1 eb c l - 2f a m i l yp r o t e i n sw e r ec l o s e l y r e l a t e dt ot h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fh c c s e c o n d ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh b v a n d m i t o c h o n d r i o nw a si n v e s t i g a t e d a f t e r3 垤p c m v - xp l a s m i dw a st r a n s i t o r i l yt r a n s f e c t e di n t o h 7 4 0 2c e l l s ，i tw a sf o u n dh b xw a sa b l et oi n d u c ea p o p t o s i sa n dt h ea p o p t o t i cc e l l sr e a c h e dt o 4 2 7 t h ee x p r e s s i o no fb c l 2d e c r e a s e db u tt h a to fb a xi n c r e a s e d r h o d a m i n e12 3s t a i n i n g w a se m p l o y e dt oe x a m i n et h em e m b r a n ep o t e n t i a lc h a n g eo fm i t o c h o n d r i aa f t e rt r a n s f e c t i o nb y f l o wc y t o m e t r ya n a l y s i s i tw a ss h o w e dt h a tt h em e m b r a n ep o t e n t i a lo fm i t o c h o n d r i ad e c r e a s e d a f t e rt r a n s f e c t i o n ，s u g g e s t i n gt h a th b xp r o t e i np r o m o t e dt h er e l e a s eo fc y t o c h r o m ecf r o m m i t o c h o n d r i ai nt h eh e p a t o m ac e l l s t h ee x p r e s s i o nl e v e l s o ft h ef a c t o r si n v o l v e di n m i t o c h o n d r i a ，i n c l u d i n gc y t o c h r o m ec ，a p a f - 1 ，p r o c a s p a s e 9a n d p r o c a s p a s e3 ，w e r e u p r e g u l a t e di n d i f f e r e n td e g r e ei nt h ea p o p t o t i cc e l l s t h i r d ，w ee x a m i n e dt h ec o n n e c t i o n b e t w e e ns t r e s s e de ra n dh b x a f t e r3 岭p c m v - xp l a s m i dw e r et r a n s i t o r i l yt r a n s f e c t e di n t o h 7 4 0 2c e l l s c a 2 + c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e da n dt h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e l2w a sd e t e c t a b l e ， s u g g e s t i n gt h a th b x c a nl e a dt oe rs t r e s sa n dt h e ni n d u c ea p o p t o s i s f o u r t h ，t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nh b xa n ds u r v i v i ni nh e p a t o m aw a sd e m o n s t r a t e d i tw a sf o u n dt