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浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密n，在年解密后适用本版权书。 不保密4 口。 学位论文作者签名：徭擘埤 日期纠口年乡月2 支日 指导教师签名：南堤 日期：w 1 7 年j 晰 中国杭州 浙江理工大学硕士学位论文 z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y m a s t e rd i ss e r t a t l 0 n r i b o s w i t c hc d n ai nv i t r oa s s e m b l ya n d d a t a b a s ec o n s t r u c t i o n 舭n h u ah o u d i r e c t e d 砂p r o f e s s o r x i a o l i a ng a o c o l l e g eo f l i f es c i e n c e s ，z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y h a n g z h o u ，c h i n a 浙江理工大学硕士学位论文 分类号： u dc ： 密级： 论文答辩日期2 0 1 0 年3 月1 9 日 爷辩委员会主席垄盔兰丝煎 论文评阅人 塾生塾塾盗 答辩委员会成员 垒益重土缝 纽豇塑丝 签蜃塾蛰煎 课题来源 浙江省生物医学工程重中之重学科人才基金项目 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 r i b o s w i t c h 称为核糖开关，广泛存在于各种生物体内，可以认为是一类对小分子代谢 物敏感的结构r n a ，通过结合小分子代谢物在转录与翻译水平调控基因表达。它们通常位 于m r n a 的5 非翻译区( 5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n su t r ) ，不编码蛋白质，可以不依赖任何 蛋白因子而直接结合小分子代谢物，继而发生构象重排，影响该m r n a 的活动，调控小分 子代谢物相关蛋白的表达。特异性与之结合的小分子代谢物一般为赖氨酸( l y s i n e ) ，黄 素单核苷酸( f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e ，f m n ) ，硫胺素焦磷酸( t h i a m i n ep y r o p h o s p h a t e ，t p p ) ， 甘氨酸( g l y c i n e ) ，维生素b 1 2 氰钴铵( c o b a l a m i n ) 等，其中与小分子结合的区域称为适 配体结构域( a p t a m e rd o m a i n ，a d ) 。 合成生物学的发展使得基因的人工合成变为可能。由于利用传统的碱基按序合成的方 法来合成各种预期目的基因或者基因组序列既浪费时间又浪费资金，并且合成的目标序列 有着很高的出错率，同时在多元平行构建基因的过程中，需要大量合成短的寡核苷酸 ( o l i g o s ) 。随着科技的发展，微流体芯片技术的应用可以使我们平行合成寡核苷酸的过程 变的相对简单与高效。由此可使得人工合成基因的过程简化为连接组装寡核苷酸片段。 本论文以可程序控制的微流体p i c o a r r a y 芯片平行合成的多元r i b o s w i t c h 寡核苷酸( 这 些多元寡核苷酸经过人为设计和改良) 为材料，通过扩增回收纯化，混合成为寡核苷酸混 合物( o l i g o m i x ) ，酶切纯化，连接与组装，p c r 扩增，电泳检测等过程组装全长的r i b o s w i t c h 基因。通过对合成目的基因与载体的连接，转化，克隆，提取质粒，进而对体外组装结果 进行验证。通过质粒抽提，p c r ，目的片段的回收纯化与检测，含量检测，获取r i b o s w i t c h 目的基因的相关数据。将r i b o s w i t c h 文库中d n a 分子所对应的r n a 序列进行m f o l d 二 级结构折叠预测。通过文献查阅，按照配体的不同对r i b o s w i t c h 分类，进而给出与配体结 合的r i b o s w i t c h 分子的保守区域与保守区域的二级结构折叠图像。依据配体的不同，结合 r i b o s w i t c hd n a 相关数据与二级结构折叠预测和适体保守区域分析，构建相应的 r i b o s w i t c h 文库，为后续的r i b o s w i t c h 结构与功能研究奠定基础。 关键词：核糖开关；功能；寡核苷酸混合物；组装；合成；配体；适体 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t r i b o s w i t c h e sa r ec a l l e dn u c l e i cs w i t c h e s ，w h i c ha r ew i d e l yf o u n d e di nv a r i o u so r g a n i s m s t h e yc a nb ec o n s i d e r e da sac l a s so fs t r u c t u r eo fr n as e n s i t i v et os m a l lm e t a b o l i t e sa n dc a n r e g u l a t eg e n e se x p r e s s i o na tt h el e v e lo ft r a n s c r i p t i o na n dt r a n s l a t i o nb yb i n d i n g 、析mt h es m a l l m e t a b o l i t e s u s u a l l yt h e yl o c a t e a t t h e5 e n do fu n t r a n s c r i p t i o nr e g i o n so fm r n a ( 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ，u t r ) t h a td on o tc o d ef o rp r o t e i n sa n dc a nd i r e c t l yb i n ds m a l lm e t a b o l i t e s w i t h o u ta n yp r o t e i nf a c t o r s ，s u b s e q u e n t l y ，t h e ya f f e c tt h ea c t i v i t i e so fm r n aa n dr e g u l a t e p r o t e i nr e l a t e ds m a l lm e t a b o l i t e s e x p r e s s i o nb yc o n f o r m a t i o n sr e a r r a n g e m e n t g e n e r a l l yt h e s m a l lm e t a b o l i t e ss p e c i f i c a l l yb i n d i n g 晰t ht h e ma r el y s i n e ，f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e s ( f m n ) ， t h i a m i n ep y r o p h o s p h a t e ( t p p ) ，g l y c i n e ，c o b a l a m i na n ds oo n t h ea r e ao fs m a l lm o l e c u l e s b i n d i n g 诵t l li sc a l l e da sa p t a m e rd o m a i n ( a d ) t h ed e v e l o p m e n to fs y n t h e t i cb i o l o g ym a k e ss y n t h e t i cg e n e sp o s s i b l e i ti st i m e c o n s u m i n g a n dm o n e y - s p e n d i n gu s i n gt h et r a d i t i o n a lm e t h o do fo r d e r i n gb a s es e q u e n c e st os y n t h e s i z e p r o s p e c tg e n e so rg e n o m e ，b e s i d e st h et r a d i t i o n a lm e t h o dh a sh i g he r r o rf r e q u e n c ya n d i ti sn e e d a m o u n to fs h o r to l i g o n u c l e o t i d e sf o rp a r a l l e lg e n ec o n s t r u c t i o n b u t 、析t ht h ea p p l i c a t i o no f m i c r o f l u i d i cp i c o a r r a yt e c h n o l o g yi tb e c o m e sr e l a t i v e l ys i m p l ea n de f f e c t i v ef o rp a r a l l e lo l i g o s s y n t h e s e s s o i t s i m p l i f i e s t h ep r o c e s so fg e n es y n t h e s i s p r o v i d i n gf r a g m e n t sf o ro l i g o s a s s e m b l i n g w ei n t r o d u c e dt h ec o m p l e t ep r o c e s sf r o mo l i g o st of u l l l e n g t hr i b o s w i t c hg e n e f i r s t l y , t o o kt h ec o n t r o l l a b l em i c r o f l u i d i cp i c o a r r a yp a r a l l e ls y n t h e s i sr i b o s w i t c ho l i g o s ( t h e s eo l i g o s h a v ea l r e a d yb e e na r t i f i c i a l l yd e s i g n e da n dm o d i f i e d ) a sm a t e r i a la n dt h e nr e c y c l e dt h e ma f t e r a m p l i f i c a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，m i x e dt h eo l i g o sa n dd i g e s t e d 谢me n z y m e s ，a n dt h e nl i g a t e da n d a s s e m b l e dt h e ma f t e rp u r i f i c a t i o n ，l a s t l y , a m p l i f i e dt h e mb yp o l yc h a i nr e a c t i o na n dd e t e c t e db y e l e c t r o p h o r e s i s w et e s t i f i e dt h ea s s e m b l i n gr e s u l t nv i t r ab yl i g a t i o no ft a r g e t e dg e n e sw i t h v e c t o r , t r a n s f o r m a t i o n ，a n dc l o n ea n dp l a s m i de x t r a c t i o na n do b t a i n e dt h er e l a t e dd a t at h r o u g h t h ep r o c e s so fp l a s m i de x t r a c t i o n , p o l yc h a i nr e a c t i o n , t a r g e tg e n e s r e c o v e r ya n dd e t e c t i o n , q u a n t i t y sm e a s u r e m e n t p r e d i c tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fr n as e q u e n c e sc o r r e s p o n d i n gt o d n ab ym f o l dm e t h o d ，a n dt h e nf i n dt h es e c o n d a r yf o l d i n gs t r u c t u r eo ft h ec o n s e r v a t i v e r e g i o n sa n dd o m a i n so fr i b o s w i t c hb i n d i n g 晰ml i g a n d s l a s t l y ，c o n s t r u c tc o r r e s p o n d i n g r i b o s w i t c hl i b r a r ya c c o r d i n gt od i f f e r e n tl i g a n d sa n dc o m b i n a t i o nw i t ht h ep r e d i c t i o no ft h e r e l a t i v ed a t a , t h es e c o n d a r yf o l d i n gs t r u c t u r eo fr i b o s w i t c h d n aa n da n a l y s i so fa p t a m e r c o n s e r v a t i v er e g i o n s ，a l lo ft h i sc a nl a yb a s i sf o rs u b s e q u e n ts t u d yo nr i b o s w i t c h s t r u c t u r ea n d f u n c t i o n u 浙江理工大学硕士学位论文 k e yw o r d sr i b o s w i t c h ；f u n c t i o n ；o l i g o m i x ；a s s e m b l e ；s y n t h e s i s ；l i g a n d ；a p t a m e r h l 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t 目录 第一章合成生物学与r i b o s w i t c h 相关研究 1 合成生物学1 1 1 合成生物学概念l 1 2 合成生物学的研究进展1 1 3 合成生物学的研究意义。2 1 4 合成生物学面临的发展机遇与现实困难2 1 4 1 合成生物学在基因合成方面的优势。2 1 4 2 合成生物学发展中的现实困难。3 2 核糖开关3 2 1 核糖开关的研究历史3 2 2 核糖开关结构特点4 2 2 1 核糖开关结构4 2 2 2 核糖开关与配体的结合特点5 2 3 核糖开关的适体与配体一7 2 4 核糖开关基因调控7 2 4 1 转录阶段表达调控机制一8 2 4 2 翻译阶段表达调控机制一9 2 5 核糖开关分类9 2 5 1 核苷酸类核糖开关一9 2 5 1 1p u r i n e r i b o s w i t c h 9 2 5 1 2a d e n i n e r i b o s w i t c h 9 2 5 2 氨基酸类核糖开关1 0 2 5 2 1s j m r i b o s w i t c h 1 0 2 5 2 2l y s i n e r i b o s w i t c h 1 0 2 5 3 维生素类核糖开关1 0 2 5 3 1t p p r i b o s w i t c h 1 0 2 5 3 2f m 寸一r i b o s w i t c h 1 0 2 5 3 3a d o c b l r i b o s w i t c h 1 0 3 前景1l 第二章实验方案设计 l 实验目的和意义1 2 2 研究内容1 2 3 实验流程图1 3 第三章由寡核苷酸到全长r i b o s w i t c h 序列的合成 1 4 l 材料与试剂15 1 1 材料l5 1 2 试剂1 5 1 3 试剂的配制l5 1 3 1a m ps t o c k ( 10 0m g m 1 ) 15 1 3 2i p t g s t o c k ( 2 4m g m 1 ) 15 1 3 3x g a l ( 2 0m g m 1 ) 1 5 1 3 4l b a m p 液体培养基( 5 0 0m 1 ) 一15 1 3 5 质粒提取试剂1 6 2 方法1 6 2 1r i b o s w i t c ho l i g o m i xp c r 1 6 2 1 1r i b o s w i t c ho l i g o m i x 扩增条件的优化1 6 i v 浙江理工大学硕士学位论文 2 1 2p c r 产物纯化17 2 2o l i g o m i x 酶切1 7 2 3m yi 酶切后o l i g o m i x 组装18 2 3 1m yi 酶切后o l i g o m i x 纯化18 2 3 2o l i g o m i x 同源杂合退火18 2 3 3 同源杂合片段连接l8 2 4 组装后片段p c r 扩增。1 8 2 5 连接与转化1 9 2 5 1 连接反应1 9 2 5 2 连接产物转化步骤2 0 2 5 3 质粒提取2 0 3 结果2 l 3 1o l i g o m i x 丰度富集及纯化。2 l 3 2 纯化产物m l yi 限制性酶切鉴定2 2 3 3m yi 酶切后o l i g o m i x 组装2 3 3 4 组装后片段p c r 扩增2 3 3 5 质粒提取检测。2 4 4 讨论2 5 第四章r i b o s w i t e h 相关文库构建 2 7 l 材料与试剂2 7 1 1 材料2 7 1 2 试剂2 7 1 3 试剂的配制2 7 2 方法2 8 2 1 质粒稀释，p c r 2 8 2 2p c r 产物纯化2 9 2 3 纯化产物p c r 扩增，电泳检测3 0 2 4d n a 模板体外转录r i b o s w i t e h 3 2 2 4 1b b si 限制性酶切3 末端引物序列3 2 2 4 2 体外转录3 3 3 结果3 3 3 1 质粒p c r 3 3 3 2 目的片段回收3 4 3 3 目的片段回收后p c r ，纯化，含量检测及测定3 5 3 4b b si 限制性酶切3 末端侧翼引物，纯化产物3 7 3 5 体外转录r i b o s w i t c h 及浓度测定3 7 3 6 二级结构折叠预测与适体保守性分析。3 7 4 讨论3 9 参考文献 致谢 v 4 l 4 5 浙江理工大学硕士学位论文 缩略语 a d o c b l 腺苷钴胺素a d e n o s y lc o b a l a m i n a m p氨苄青霉素( 钠)a m p i c i l l i n ( s o d i u ms a l o a p s过硫酸铵a m m o n i u mp e r s u l f a t e s a t p腺嘌呤核苷三磷酸a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b p k b 碱基对千碱基对 b a s ep a i r k i l o b a s ep a i r s b s a牛血清白蛋白b o v i n es e r u ma l b u m i n ( f r a c t i o nv ) c d n a 互补d n ac o m p l e m e n t a r yd n a d a t p 脱氧三磷酸腺苷d e o x y a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e d d h 2 0双蒸水double d i s t i l l e dw a t e r d n t p 脱氧核糖三磷酸d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e p c 焦碳酸乙二脂d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d m t 对苯二甲酸二甲酯d i m e t h y lt e r e p h t h a l a t e e b 溴化乙啶 e t h i d i u mb r o m i d e e d t a 乙二胺四乙酸e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d f m n 黄素单核苷酸 f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e i p t g 异丙基一p d - 硫代半乳糖苷 i s o p r o p y l p - d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e n t 核苷 n u c l e i o t i d e p a g e 聚丙烯酰胺凝胶电泳p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r 聚合酶链式反应p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r f d n a s e r n a d n a 酶r i b o n u c l e a s e d e o x y r i b o n u c l e a s e s a m s 甲腺甲硫氨酸s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e s s d s 十二烷基硫酸钠 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e m e d n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s 三( 羟甲基) 氨基甲烷t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e t p p 硫胺素焦磷酸t h i a m i np y r o p h o s p h a t e x - g a l 5 一溴4 一氯一3 - 吲哚- p d - 半乳糖苷5 - b i o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e v i 浙江理工大学硕士学位论文 第一章合成生物学与r i b o s w i t c h 相关研究 1 合成生物学( s y n t h e t i cb i o l o g y ) 1 1 合成生物学概念 合成生物学( s y n t h e t i cb i o l o g y ) 是基因工程中的一个分支学科，它借鉴工程化的思想， 结合分子生物学，生物化学，微生物学，物理学，数学等各门学科【1 1 ，通过人工方法来设 计与合成生物界存在或不存在的生物元件或者生物系统，来满足科研需求，解决环境，资 源等诸多领域内的现实问题。合成生物学与以往的通过解剖生命体研究结构与功能不同， 它是从最基本的原料开始逐步建立起生物体零部件，甚至生命体的过程，是一个与传统研 究方法相反的过程。其具体研究内容主要包括以下几个方面：一是从病毒等微小生命体入 手，通过模拟，复制以致改造这些生命体进行相关的理论研究；二是通过人工合成基因组 等生命元件，来进行生物功能的研究；三是以天然存在或人工合成的功能元件为基础，构 建具有新功能的更加复杂的生物系统，甚至新的人工生命。 1 2 合成生物学的研究进展 追溯合成生物学的起源，最早应该是在18 2 8 年的w o h l e r 等人，他们利用化学方法人工 合成了尿素，这表明合成生物学最早起源于合成化学【2 】。此后，中国科学家于1 9 6 5 年成功 合成具有生物活性的结晶牛胰岛素。1 9 7 9 年，k h o r a n a 等也首次合成了2 0 7b p 酪氨酸阻遏 t r n a 基因。随后，中国科学家又在1 9 8 1 年合成酵母丙氨酸转运核糖核酸。以上这些成就在 合成生物学的历史上都具有重要意义。进入新世纪后，美国w i m m e r 实验室于2 0 0 2 年报道 了不依赖天然模板，仅利用已知基因组序列，以化合物单体从头合成脊髓灰质炎病毒 e d n a ，并用r n a 聚合酶将它转录成具有感染活力的病毒r n a 3 1 。w i m m e r 研究小组从平均 长度为6 9b p 的寡核苷酸入手，通过化学合成和无细胞体系从头合成两种方法，将其装配成 全长病毒基因组并验证了其生物学活性，从而开辟了利用已知基因组序列，不需要天然模 板，从化合物单体合成感染性病毒的先河。这在合成生物学历史上也成为一个新的里程碑。 随后在2 0 0 3 年，美国v e n t e r 实验室只用了两周就合成- o x l 7 4 噬菌体基因( 5 ，3 8 6b p ) 【4 5 】。 o x l 7 4 噬菌体基因是单链环状d n a ，它也是是历史上第一个被纯化的d n a 分子。 合成生物学除了体外模拟合成生物界原有的生命元件( 如d n a ，r n a 等) 之外，还可 以人工定向改变生物界合成的物质，进行新的合成。在2 0 0 0 年，b r e n n e r 等就从理论上提出 通过向细胞d n a 中加入自然情况下不存在的碱基的方法来发展人工遗传系统【6 】，一个实践 上的例子是s c h u l t z 实验室通过向大肠杆菌蛋白质生物合成装置中添加天然外新的底物成 分，通过基因合成来生成非天然的氨基酸并取得了成功【7 1 。此后在2 0 0 3 年，s c h u l t z 实验室 浙江理工大学硕士学位论文 利用酵母中加入非天然氨基酸密码子的手段，成功地将5 种氨基酸导入了蛋白质中【8 】。同在 2 0 0 3 年，m a r t i n 等将青蒿和酵母基因转入ec o l i 中，使青蒿素可以在ec o l i 中合成，这就有 可能使得不久的将来疟疾的治疗变得更加经济9 1 。在未来，通过合成基因的方法获得目标 序列将有可能成为普通实验室的常规实验手段，合成技术将会逐步取代现有的重组手段 0 0 0 我国的合成生物学曾经一直走在世界的前列，进入新世纪后，在2 0 0 9 年2 月，中国科学 院合成生物学重点实验室在上海正式成立，这将对生物合成的分子设计，能源植物改造， 医药化工产品的高效合成提供更多科技支撑与技术指导，同时也必将对我国合成生物学的 进一步发展产生重大的推动作用。 1 3 合成生物学的研究意义 合成生物学在生物科学发展中具有重要的理论与现实意义。首先，利用合成生物学， 从生物组件的合成开始，通过生物组件的的组装与重建，可以使人们对生命体的组成系统， 起源等根本性问题有理论上的全新认识。除去理论层面，在技术应用上一旦成熟，将会有 巨大的发展潜力与发展空间。由于从学科发展角度看，合成生物学是在人类基因组计划所 带动的诸多学科如基因组学，蛋白质组学，系统生物学，生物信息学等发展成熟基础上发 展而来的，这就使得合成生物学涵盖了基因的合成与调控，蛋白的合成与功能等领域。在 此基础上与相关学科的交叉融合，会使其在药物合成，疾病的早期预警【l l 】等方面发挥无可 比拟的优势。 除了在生物学中具有的重要作用，合成生物学在其他领域亦有广阔的发展空间。利用 合成生物学，可以人工构建污水分解，垃圾处理，核废料处理的细菌基因，来应对环境问 题。同时利用合成生物学可以发展生物感受器，例如美国杜克大学的h e l l i n g a 重新设计并安 装在大肠杆菌体内的生物蛋白感受器，使得该大肠杆菌够感知2 ，4 ，6 三硝基甲苯 ( t r i n i t r o t o l u e n e ，t n t ) 或其他感兴趣的化合物【1 2 】。 1 4 合成生物学面临的发展机遇与现实困难 1 4 1 合成生物学在基因合成方面的优势 人工设计为基础结合化学方法的基因合成与以往的传统方法克隆测序合成基因相比， 具有以下几点优势：1 ) 可以通过人工设计序列合成基因，减少重组筛选环节；2 ) 合成基 因相比传统克隆在时效性与环境限制方面具有优势；3 ) 可以根据已知的分子片段人工构 建由于种种原因无法得到的天然基因或古生物基因；4 ) 可以与克隆测序技术相结合来验 证彼此的正确性； 2 浙江理工大学硕士学位论文 合成生物学研究有助于明确病毒基因组序列在病毒感染、免疫调控作用机制及新型药 物筛选等一系列传统实验研究方法不易触及的方面，体现了由解构生命向重构生命的发展 趋势。 1 4 2 合成生物学发展中的现实困难 在看到合成生物学领域美好发展前景的同时，我们也应重视合成生物学发展中的现实 困难。当前合成生物学面临的最大困难是在合成序列准确性上有待于进一步提高，而这也 是制约其发展的瓶颈之一。只有保证合成序列的准确性，下一步的操作与应用才有正确的 基础，这在技术层面上迫切要求其有较大的改进。在d n a 合成与错误校正技术取得快速 进步的大背景下，我们有理由相信经济高效的合成方法能够合成长而复杂的全基因组序 列。同时，蛋白介导【1 3 1 与特殊设计的杂交技术等碱基错配修正方法也使基因合成中不易 解决的出错问题有了借鉴意义。 与所有新兴学科发展所遇到的问题类似，合成生物学在表现出巨大生命力和广阔应用 前景的同时，也成为一把“双刃剑，随之而来的生物伦理和生物安全等问题备受关注。 人们对其可能导致的生物伦理，反恐问题以及其它可能潜在的威胁感到担忧。鉴于此，2 0 0 4 年6 月在美国麻省理工学院举行了第一届合成生物学国际会议。2 0 0 5 年8 月在美国旧金山 举行的合成生物学会议讨论了生物合成领域对药物发展、细胞重新编程、生物机器人等方 面的潜在与现实意义。正如其它学科的发展一样，我们有理由相信，在人们认识到问题的 同时，也一定有能力来解决它们，从而使得该学科能够朝着人们期望的方向去发展。尽管 合成生物学的发展还面临着技术，生物伦理等诸多问题，但其可行性与重要性已有目共睹， 合成生物学研究趋势势在必行。 2 核糖开关( r i b o s w i t c h ) 2 1 核糖开关的研究历史 在以往所发现的基因表达调控过程中，发现的大多数反式调控作用元件均是一些蛋白 因子。在1 9 9 1 年，l u n d r i g a n 等发现了在ec o l i 中的b t u b 基因( b t u b 基因编码维生素b 1 2 的胞外转运蛋白) 转录产物的5 - u t r 高度保守，这段保守序列区域被称作“b 1 2 b o x ，与 此同时，发现a d o c b l 同维生素b 1 2 都可使得b t u b 基因表达量降低，类似的情况在细菌维 生素b 1 和b 2 操纵子中也有存在 1 5 - 1 7 1 。基于以前研究中所认为的在基因的转录、翻译调控 中蛋白因子所参与的重要作用，人们也认为5 脱氧腺苷基钴胺素( 5 - d e o x y a d e n o - s y l c o b a l a m i n , a d o - c b l ) 极有可能结合特异的蛋白因子，然后此蛋白因子再通过与m r n a 结合来进行基 因表达的调控。所以人们一直致力于寻找到可以对a d o c b l 敏感的r n a 结合蛋白，可惜 浙江理工大学硕士学位论文 的是此种蛋白因子自始至终都没有被发现。同时，也有学者如s t o r m o 等提出m r n a 或许 可以与小分子代谢物直接结合，不基于蛋白因子来调节基因表达的设想，只是其假设未得 到实验证据的有力支持【l 引。 a n d r e w 等于1 9 9 0 年在合成的大量随机序列r n a 分子中，按照能够特异结合有机染 料配体的原则，对r n a 分子进行筛选。他们将这些筛选出的r n a 分子命名为“a p t a m e r ( 适体) 1 1 9 1 。“a p t a m e r ”一词实际来源于拉丁文“a p t u s ”，他们指的是一种人工制造的生 物传感器，可在体外折叠形成稳定的三维结构，同时还可以特异结合小分子配体的单链或 双链d n a ，或者是单链r n a t 2 0 1 。受到此研究的启发，在2 0 0 2 年，耶鲁大学的b r e a k e r i 等 认为在自然界中，也存在天然的r n a 适体分子，并通过设计一系列实验证明了这种天然 适体是存在的。于是，这类参与调节基因活动的m r n a 元件( 序列) 被称为“r i b o s w i t c h ” 2 1 】。考虑到生化本质同为r n a ，且具有酶活性的“r i b o z y m e 被译为核酶，故将“r i b o s w i t c h 译为“核糖开关 。 由以上的研究历史可知，核糖开关实际上是一类结构r n a ，它们作为一种m r n a 元件， 对小分子代谢物敏感，其特点是通过结合对应的小分子代谢物进而调控基因表达。一般核 开关位于原核生物的m r n a5 - u t r ，不编码任何蛋白，不依赖任何蛋白因子，通过直接结 合小分子代谢物引发构象重排，通过空间结构的变化来影响m r n a 的活动，进而调控与小 分子代谢物相关蛋白的表达。随着研究的进一步深入，在真核生物的前体m r n a3 - u t r 中， 内含子区域中也发现了与上述结构相类似的结构基因元件【2 2 1 。 2 2 核糖开关结构特点 2 2 1 核糖开关结构 由现已发现的核糖开关知它由两个结构域组成，分别是：适体结构域( a p t a m e rd o m a i n ， a d ) ，表达结构域( e x p r e s s i o n d o m a i n ，e p d ) 【2 3 】。a d 直接结合小分子代谢物，是r n a 的 传感器。通过序列分析表明，同类核糖开关在不同细菌中，a d 序列相对保守，位于m r n a 5 - u t r 区域，该区域编码小分子化合物( 嘌呤、嘧啶、氨基酸、维生素等) 相关合成酶类 与转运酶类。核糖开关含有丰富的碱基互补配对区域，在这些区域内可以形成颈环结构( 图 1 1 ) 1 2 4 ，而这些二级结构都是高度相似的。当配体( 1 i g a n d s ) 小分子代谢物与之结合后， a d 首先发生构象重排的变化，信息进而传递至e p d ，后者