（海洋化学专业论文）五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位素组成研究.pdf

五种徽藻中倥腊与脂肪酸组成及同位素组成研究 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位素组成研究 摘要 脂类化合物作为海洋生物标记物，被广泛应用于地球化学研究。从浮游植物 合成到埋藏于沉积物中，脂类化合物的存在形态和含量等都受到很多因素影响。 本研究通过对五种海洋微藻的实验室培养，测定了这几种藻在不同生长期的主要 的脂类化合物组成；比较了指数生长期和稳定期，细胞膜与细胞内脂类化合物组 成的异同；分析不同时期的碳同位素组成，讨论不同生长裳碳同位素的分布变化。 主要结论如下： l 。五种微藻不同生长期的脂肪酸与中性脂组成 五种微藻主要含有的脂肪酸是：1 4 ：0 、1 6 ：3 、1 6 ：2 、1 6 ：l 、1 6 ：0 、1 8 ： 3 、1 8 ：2 、1 8 ：l 、1 8 ：0 、2 0 ：5 、2 2 ：6 。 青岛大扁藻，盐藻，塔玛亚历山大藻指数生长期的脂肪酸含量都多子稳定期， 其中1 6 ：0 ，1 8 ：0 ，2 2 ：6 变化范围最为显著，从几倍到几十倍；三角褐指藻和 聚球藻的1 6 ：0 ，1 6 ：l ，2 0 ：5 在稳定期的含量则是指数生长期的两倍左右。 植醇主要存在于细胞膜物质中；聚球藻的烷烃只是作为麓量储存物质存在。 2 。细胞膜与细胞内脂类他合物组成的异同 无论是指数生长麓还是稳定期后期，胞内物质的脂肪酸含量赐显要低予细胞 膜组分，1 6 ：0 、1 8 ：0 脂肪酸是二者的主要组成脂类；1 4 ：0 在二者中也可以测 出，但含量相对较低。 指数生长期，细胞膜组分的脂肪酸种类要多于胞内物质；二者在指数生长期 以饱和脂肪酸为主，不饱和脂肪酸种类及含量都相对较少。 进入稳定期后期，五种微藻体内脂肪酸种类明显增多，藻体内可以发现很多 不饱和嚣肪酸。藻体细胞膜脂类的脂肪酸以1 6 ：0 及c 1 8 系为主，其中，以1 6 ： 0 ，1 8 ：l 含量较高。胞内物质豹脂肪酸种类增多，不饱和脂肪酸浓度要高于饱 和脂肪酸，但胞内物质的脂肪酸整体浓度分布仍要低于细胞膜脂类。 3 同位素组成变化 青岛大扁藻、盐藻的胞内物质上，同种脂肪酸的6 b c 值在指数生长期要高 于稳定期后期；塔玛亚历山大藻、三角褐指藻和聚球藻中，同种脂肪酸的6 b c 值在指数生长期要低于稳定期后兢。从整体分布上看，该部分脂肪酸的5 璩c 值 中国海洋大学硕士学位论文 在稳定期相对较高。 细胞膜上的多不饱和脂肪酸，2 0 ：5 、1 8 ：2 、1 6 ：2 等在指数生长期富集1 3 c ， 6 1 3 c 值相对稳定期略高。盐藻和青岛大扁藻的主要饱和脂肪酸是在指数生长期富 集1 3 c ；塔玛亚历山大藻、三角褐指藻和聚球藻的单不饱和及饱和脂肪酸在稳定 期后期富集1 3 c 。中间产物在塔玛亚力山大藻、三角褐指藻及聚球藻的脂肪酸中 主要是在稳定期后期富集b c 。 指数生长期的青岛大扁藻、盐藻，胞内物质的脂肪酸相对于磷脂来源的要富 集1 3 c ；稳定期磷脂来源的饱和脂肪酸比能量物质的富集1 3 c ；不同来源脂肪酸 的6 1 3 c 值相差0 。1 。稳定期的塔玛亚历山大藻在胞内物质中以c 1 8 、c 2 0 等 长链脂肪酸中富集1 3 c 。 指数生长期的三角褐指藻和聚球藻，细胞膜脂肪酸相对于胞内物质要富集 1 3 c ，二者6 1 3 c 值相差0 5 o 左右；稳定期后期，三角褐指藻膜上的1 8 ：l ，聚球 藻的1 8 ：o 较胞内物质要亏损1 3 c ；同类物质在不同来源中的6 1 3 c 值相差0 4 o 。 关键词：微藻；脂肪酸；中性脂；同位素组成 五种微藻孛性滕与脂肪酸终成及弱位素组成研究 a s t u d yo nt h ec o m p o s i t i o n so ff a t t ya c i d ，n e u t r a ll i p i d s a n dl s o t o p et r a c t i o n a t i o ni nt i v em i c r o a l g a e - 一 一 _ a b s t r a c t l i p i d sw h i c ha r ec a l l e da so c e a nb i o m a r k e r sa l ew i d e l yu s e di nt h eg e o c h e m i c a l r e s e a r c h e s m a n yf a c t o r si m p a c tt h ep r e r v a t i o no ft h el 城d si nt h es e d i m e n t i nt h i s r e s e a r c h , w ei n c u b a t ef i v em a 血em i 啪a l g 躐，a n df i r s te x a m i n et h ec o m p o s i t i o no f l i p i d sd u r i n gd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e s t h e nw es t u d yt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e n m e m b r a n el i p i d sa n dm e t a b o l i cs t o r a g el i p i d s 豫鑫1 3 cc o m p o s i t i o no ft h e f i v e 矗e 内砖g 勰a r ea l s od e t e r m i n e dd u r i n gd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e si no r d e rt oa n a l y s et h e a l t e r a t i o no fc a r b o ni s o t o p e d u r i n g d i f f e r e n tr 崩o d s 明蛇m a i nr e s u l t sa n d c o n c l u s i o n sa r el i s t e a 鹪f o l l o w s ：。 1 t h ec o m p o s i t i o n so ff a t t ya c i d sa n dn e u t r a li nf r e em i e r o a l g a ed u r i n gd i f f e r e n t g r o w t hp h a s e s 1 4 ：o ，1 6 ：3 ，1 6 ：2 ，1 6 ：l ，1 6 ：o ，1 8 ：3 ，1 8 ：2 ，1 8 ：l ，1 s ：o ，2 0 ：5 ，2 2 ：6a r et h e p r i m a r yf a t t ya c i d si nt h ef i v em i c r o a l g a e p l a t y m o n a sh e l g o l a n i d i c a ，d u n a l l e l i as a l i n a , a l e x a n d r i u m 阳孵嬲r 窖，舔8h a v em o r e f a t t y 氇c i 丞i nl o g a r i t h m i cp h a s et h a ni ns t a t i o n a r yp h a s e ，e s p e c i a l l y1 6 ：o ，1 8 ：0a n d 2 2 ：6c h a n g es i g n i f i c a n t l yd u r i n gt h eg r o w t hp h a s e c o n c e n t r a t i o n so f1 6 ：o ，1 6 ：l a n d2 0 ：5i np h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ，s y n e c h o c o o c u ss p d u r i n gt h el o g a r i t h m i c p h a s e a r ea st w i c ea ss t a t i o n a r yp h a s e 2 t h ec o m p o s i t i o n so fm e m b r a n el i p i d sa n di n t r a c e h u l a ri i p i d s 羽豫c o n c e n t r a t i o n so ff a t t ya c i 豳a r el e s si nt h ei n t r a c e l l t d a rl i p i d s 羽穗s a m s a t e d f a t t ya c i d s1 6 ：0a n d1 8 ：0a r et h ep r i m a r yf a t t ya c i d s w ec a na l s of i n d1 4 ：oi nt h e t w op a r t so fa l g a e ，b u ti t sc o n c e n t r a t i o ni sl o w w i t ht h eo n s e to fl o g a r i t h m i cp h a s e ，t h ec o m p o s i t i o no f m e m b r a n el i p i d si sm o r e c o m p l e xt h a nt h ei n t m c e l l u l a rn p i d s s a t u r a t e df a t t ya c i d s 鞠瞎t h em a i nf a t t ya c i d s d u r i n gt h ew h o l eg r o w t hp h a s e ，t h ec o n c e n t r a t i o n sa n ds p e c i e so fu n s a u n a t e df a t t y a c i d sa r el e s st h a no fs a t u r a t e df a t t ya c i d s i nt h es t a t i o n a r yp h a s e ，t h es p e c i e so f f a t t ya c i d si nt h ef i v ea l g a ei n c r e a s e ，a n dw e c a l lf i n dm o l eu n s a t u r a t e df a t t ya c i d s t h em a i nm e m b r a n ef a t t ya c i d sa r e16 ：o ， l8 ：2 ，l8 ：la n d18 ：0 。d u r i n gt h i sp h a s e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fu n s a t u r a t e df a t t y a c i d si sm o r et h a ns a t u r a t e df a t t ya c i d s t h ec o n c e n t r a t i o no fm e m b r a n el i p i d si s i i i 中国海洋大学硕士学位论文 l o w e rt h a nt h ei n t r a e c l l u l a rl i p i d s 。， 3 s t a b l ei s o t o p i cc o m p o s i t i o n f a t t ya c i d se x t r a c t e df r o mp l a t y m o n a sh e l g o l a n i d i c aa n dd u n a l l e l i as a l i n ad u r i n g s t a t i o n a r yp h a s ea r ed e p l e t e di nb cr e l a t i v et oi ti nt h el o g a r i t h m i cp h a s e t h er a n g ei s o p p o s i t e di na l e x a n d r i u mt a m a r e n s e , p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u ma n ds y n e c h o c o o c u s s p 1# m e m b r a n ep o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ；2 0 ：5 ，l8 ：2a n d16 ：2 ，a 地s l i g h t l y e n r i c h e di n 糙ci nt h el o g a r i t h m i cp h a s e m e m b r a n es a t u r a t e d f a t t ya c i d so f p l a t y m o n a sh e l g o l a n i d i c a a n dd u n a l l e l i as a l i n aa r ee n r i c h e di n1 3 c d u r i n g l o g a r i t h m i cp h a s e ，o p p o s i t e l yt h e s el i p i d so f a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e , p h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u ma n ds y n e c h o c o o c u ss pa r ee n r i c h e di nd ci ns t a t i o n a r yp h a s e i n t m c e l l u l a rl i p i & i np l a t y m o n a sh e l g o l a n i d i c aa n dd u n a l l e l i as a l i n aa r ee n r i c h e d i n 乃cr e l a t e dt om e m b r a n et i p i d sd u r i n gl o g a r i t h m i cp h a s e 硼1 i sr a n g ei sr e v e r s e di n s t a t i o n a r yp h a s e 8 1 3 co fi n d i v i d u a lc o m p o u n d so fd i f f e r e n tl e s o u r c e $ v a r i e sf r o m0 t o 1 o m e m b r a n el i p i d si np l a t y m o n a sh e l g o l a n i d i c aa n dd u n a l l e l i as a l i n aa r ee n r i c h e d 诫抬cr e l a t e dt oi n t r a c e l l u l a xl i p i d sd u r i n gl o g a r i t h m i cp h a s e ，v a r yb yu pt o0 5 9 6 0 i n s t a t i o n a r yp h a s e ，18 ：lo fp h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u ma n d18 ：0o fs y n e c h o c o o c u s s pa l ed 哪e t e di n1 3 cr e l a t i v et oi ti ni n t r a c e l l u l a rl i p i d s 6 1 3 co fi n d i v i d u a l c o m p o u n d so fd i f f e r e n tr e s o u r c e sv a r i e sf r o m0t 04 9 | 6 0 k e yw o r d s ：m i c r o a l g a e ；f a t t ya c i d ；n e u t r a ln p i d s ；i s o t o p i cc o m p o s i t i o n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方镣，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 注；垫浚套墓整震蓬蓬型童圜鲢乙奎拦互窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 皂 导师签字： 沙嗡 签字日期：m 扩年月，7 豳 签字日期：五彬年石胃f 7 尽 学位论文作者毕业厝去向： 工作单位：黼 遭讯地址： 而 碍密 电话： 邮编 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位素组成研究 0 前言 海洋中分子生物标记物的研究是现代海洋科学中的一个热门方向，它结合了 海洋化学、生物学、有机化学和地质学的知识，是通过对这些知识的综合运用来 探讨海洋中有机物质的生物地球化学行为。 浮游植物是海洋系统中有机物的主要生产者，为浮游生物和底栖群落提供食 物和能量；一部分浮游植物产生的有机物( 包括脂类化合物) 被保存在海洋沉积 物中，既是全球碳收支中有机碳的主要组分，又作为生命活动和环境交迁的记录， 提供地球历史演变的重要信息。浮游植物通过光合作用合成多种脂类化合物，可 以占到生物量总碳的5 2 0 。由于其结构具有指纹特征，并较之蛋白质和糖 类化合物结构稳定，脂类化合物已被广泛地用于研究有机物的生物地球化学循 环，和沉积物历史记录的反演。近年来，脂类生物标志物分子组成研究的发展， 有机分子碳稳定同位素技术的进步，进一步扩展了生物地球化学应用领域。但是 由于复杂的海洋沉积物成岩过程( 例如，脂类化合物的合成路径、生物体中存在 形态、环境因子、氧化还原条件等) 以及对分子同位素信号的行为规律理解不够 全面，较大程度地限制了上述应用。 在本论文中，通过对五种海洋微藻的实验室培养，测定了这几种藻主要的脂 类化合物组成，并就指数生长期和稳定期后期脂类组成进行比较；比较了指数生 长期和稳定期后期，细胞膜与细胞内脂类化合物组成的异同分析了不同生长期 的碳同位素组成，讨论不同生长期碳同位素的分布变化。期望能够为分析早期成 岩作用对生物地球化学过程和分子同位素信号变化规律的影响，及在评价这些变 化对其在生物地球化学应用方面的效应时提供可以借鉴的资料。 三年来，在导师的悉心指导下论文工作取得了一定的进展，但由于本人水平 有限，时阗仓促，因此对该领域的探讨分析存在很多不足之处。在此，真诚的希 望各位专家、老师及同学对本文提出宝贵的意见。 中国海洋大学硕士学位论文 1 文献综述 重。董生物标记物 生物标记物作为示踪物质最早应用于矿物燃料的地球化学研究中，t r e i b s ( 1 9 3 6 ) 首次研究了光合作用生物体中时绿素a 与石油和页岩中鏊卜啭之闻的关 系，以此第一次提出了石油来源的有力证据。之后许多石油烃类生物标记物( 正 构烷烃、异戊二烯、藿烷、菇烷、甾烷等) 被相继发现，为我能研究有机物的来 源、有机物在沉积和掩埋过程中( 成岩过程) 的环境状况、生物降解率和年龄等 提供了有秘蓣助。例如，齐墩果烷测年法，郄利用被子植物( 开花植物) 的三萜 烷生物标记物的特征进行年代测定，因为这种化合物只能在第三纪( 2 0 7 0 百万 年前) 和盘奎纪( 7 0 1 4 0 百万年前) 的岩石和原油中找到。再如，军藻溪烷，一 种主要由海洋腰鞭毛虫产生的甾烷类生物标记物，可以用来区分中生代( 7 0 2 5 0 百万年前) 和吉生代( 2 5 0 - 6 0 0 百万年前) 的物质来源。 生物标记物示踪分析广泛应用于古气候研究的各个方面。例如， p r y m n e s i o p h y t e 藻分泌的长链c 3 7 ，c 3 9 烯酮，其不饱和度的变化与其生长的海 洋表层温度的变化有很好的相关性f 1 洌。东太平洋的气候波动可以由沉积物中高 级植物正态烷烃的分布和丰度的变化所反映，这些烷烃是在冰川时期强季风带控 制下被掩埋入沉积物中的。生物标记物在土壤层和沉积物中的热变产物可以用来 反映过去的生物量情况和气候的干温情况。例如，脱水糖类，1 ，6 脱水。p d 毗喃 ( 型) 葡萄糖( 左旋葡聚糖) 在树木燃烧过程中产生；惹烯，纤维素和去氢松香 酸在松树树脂燃烧中产生，可以从经受过火灾的森林和草原土壤中找到。 生物标记物可以存在于岩石、沉积物、土壤、水、矿物燃料和大气排放物中。 排放到自然环境中的天然有机物( 例如，表层土壤中植物的残体、大气中天然火 灾的释放产物、流入江河中土壤的有机物) 包含着其植被来源的化学指纹。这些 化学指纹由有机物的丰度和分布来构成，它们与植被来源、微生物降解和热解之 间有着紧密的联系。因此，能作为生物标记物示踪物质的有机物主要是天然产物 及其衍生物。 通过使用气相色谱和气质联用分析天然有机物( 高等植物脂、海洋脂等) 和 人类产生的石油烃及其氧化产物衍生物( 如润滑油、汽油燃烧排放物) ，可以准 确判定物质来源。生物标记物在排放到自然环境或者埋藏到地层后，仍然能够( 部 2 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位素组成研究 分的) 保留其结构特征。因此它们可以用来示踪其生物来源。 应用生物标记物作为示踪物质，对于了解地球上的循环系统( 如生物降解、 成岩过程、碳循环过程) 及自然界的生物地球化学过程( 空气、水、沉积物及其 相互界面) 非常重要。生物标记物在排放到自然界后，与其它的有机物相比，如 蛋白质、核酸生物聚合体、多糖、脂类( 如脂肪烃) 、结构生物聚合体( 如纤维 素、半纤维素和木质素) 为相对惰性，只是有限的为微生物所降解。因此，它们 可以在土壤或沉积物中被检测出来，用于研究各种循环。 1 2 海洋生物标记物 海洋生物标记物是海洋自生或陆源输入的天然有机化合物，如甾醇、脂肪酸、 非芳香烃和多环芳烃等。这些标记物分子由于其化学性质的稳定性和分子结构的 多样性，常被用作研究海洋生物地球化学过程的指示物，因而称之为海洋生物标 记物。早在7 0 年代，生物标记物就开始在海洋沉积物环境中获得应用【3 4 】。 海洋沉积物中的生物标记物可以获取丰富的信息，包括有机物质来源、早期 成岩过程中沉积物的条件和沉积过程中的古环境条件。用某种特定的生物标记物 来记录古环境或古生产力的变化，存在一定的局限性，如：藻的生物量及分泌的 特定脂类在深海沉积物中的保存效率之间定量关系的不确定性；埋藏效率受到成 岩过程控制，且随水柱和沉积物氧化条件及沉积物的组分的改变而改变。然而， 如果在一个沉积环境中，在一段时间内，这种定量的关系稳定的存在，那么脂类 生物标记物的变化就可以用于反映古海洋环境或古生产力变化【5 一。 1 3 脂类化合物 1 3 1 脂类化合物的研究意义 脂类是生物体内的一大类物质，具有酯的结构或可能成为酯，不溶于水而溶 于乙醚、石油醚、氯仿等有机溶剂，包括脂肪、蜡、磷脂、糖脂、固醇等。脂类 化合物是重要的海洋生物标记物。 脂类化合物可以提供丰富的信息，包括有机物质的来源，早期成岩过程中沉 积物的特征和沉积过程中的古环境条件，对于研究海洋历史变迁和海洋地球化学 过程有重要意义。但是由于海洋沉积物成岩过程复杂，脂类化合物的合成路径、 3 中国海洋大学硕士学位论文 环境因子、氧化还原条件等均会影响脂类化合物形态和浓度，从而影响其在示踪 分析、环境重建等方面的应用。 1 3 2 影晌因素 1 3 2 1 生物体中存在方式的影响 壁 物质 图l - l 植物细胞组成图 如图所示，藻类作为真核细胞，细胞体系主要分成三大结构g1 ) 以脂蛋白 为基础的细胞膜；2 ) 以核酸蛋白质为主的胞内物质；3 ) 特殊蛋白构成的骨架 系统 7 1 。脂类化合物广泛存在于细胞膜并作为能量储存物质存在于细胞内，当研 究具体的脂类化合物时，它在生物体内的作用方式，会影响到我们对一些问题的 解释。 p r y m n e s i o p h y t e 藻分泌的长链c 3 7 、c 3 9 烯酮，其不饱和度的变化与海洋表 层温度的变化有很好的相关性【旧，可以反映它生长的古海洋温度。而营养盐浓 度、细胞生长速率等对沉积物中两种物质的存在，没有明显影响【8 1 0 】。 两种物质在生物体中不同的存在方式让我们解释嘭的变化原因时要考虑更 多的因素。如果他们存在于细胞膜中，就可以很好的解释嵋与温度的相关性， 因为低温条件下，不饱和度的增加可以降低脂类的溶点，从而提高细胞膜的流动 性【1 1 1 ，我们称之为生物适应性。 如果他们作为新陈代谢的储存脂类存在，那么二者与温度的关系就不能用生 4 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及圈位素组成研究 物适应性来解释。而只与脂类的溶点及生物体密度有关。这是因为生物体内流动 状态脂类更容易被分解代谢，丽高不饱和度的脂熔点低，满足生物体要求。其次 浮游植物在永体生长要有一定的浮力，这需要储存的脂类他合物来改变密度调整 浮力。 脂类化合物在生物体内的不同作用方式，对其含量也造成直接影响。已有的 实验证明c 3 7 烯酮是以能量储存物质的形式存在于p r y m n e s i o p h y t e 藻中【1 0 1 ，在 没有外界能量供应时，生物体要消耗这部分能量，而影响最终埋藏在沉积物中的 量。然而，陆续的实验表明，藻体中的烯酮不饱和度变化很小【翻，或许不会影响 对古环境温度的评价。大家在这个领域酶争论使得研究不同藻体内各物质的作用 形式成药现代研究的重点。 1 3 2 2 生物合成方式的影响 阕位素示踪的方法广泛用予研究地球化学中生物标记物的起源【1 3 , 1 4 。不同生 物合成途径对同位素分馏会产生不同影响，从藤影响到对同位素示踪分梃的应 用。 生物合成途径存在两种假设，一种是经典的甲羟戊酸( m e v a l o n a t e ) 途径【1 5 1 ， 一种是新兴的丙酮酸磷酸甘油醛( p ”u v a t e g i y c 删d e h y d e s 3 p h 0 印h a 俯) 途径f 1 6 ，1 7 】 ( 如图1 - 2 ，图1 3 ) 。 +them e v a l o n a t ep a t h w a y 妒嚣0 喇_ c o a 妒s h 旷屹争蠢吣泓_ 眦m 掣c = is 。+ 【8 】 6 k l 、c o a s h 士 勉e 文i i 爰。i i 哪蘸b o 峄p r e n o l d s 嘲， 搬蹦o 、 可鹰。+ 曲3 ， 一密o ho 一。么脶hh 2 f - - c - - o h 旷厶c 0 2 瞄等o h h 3 c h 2 c - c s c o a 3 c h 2 c - i c i s c o a o h 吨r 一辛一山h fq 珏3 e 午嘎e o 糟 o 图l - 2 甲羟戊酸途径 5 中国海洋大学硕士学位论文 卜卜6 _ o hi c - - c 叭- - t p p 一嘲= p 。 i 蠡：毒： g a p t p p l c 式c h c 3 _ c ：= - # 0 , h 士_ 气蔫o h v 8 b h 。 h 。一么 h 呲眦鼍y 1 p s p h 托( p 矗2 6 一o p 图1 - 3 丙酮酸磷酸甘油醛途径 h a y s 等人认为甲羟戊酸途径起作用，认为类异戊二烯经过此途径生成【1 5 】( 图 i - 2 b ) ，因此，比起经过长链醋酸辅酶a ( 图1 - 2 a ) 合成的脂肪酸就多富集1 5 1 3 c 。 这是由丙酮醛去羰基形成醋酸辅酶a 引起的【l s , 1 9 。在这里，醋酸辅酶a 相比甲 基要亏损1 3 c 。羰基去碳数与甲基去碳数在脂肪酸中是1 ：1 ，而在类异戊二烯中 是2 ：3 ，并最终生成异戊烯焦磷酸( i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e ) ，结果使得生物体 中及沉积物中经由此途径生成的类异戊二烯组分比脂肪酸富集”c 。 实验发现不仅在原核生物【1 6 1 7 1 ，而且在真核生物及高等植物【2 0 】中，都是丙酮 酸磷酸甘油醛途径在起作用。但经过此途径推断的结果与经典途径存在差异。 经此途径生成的类异戊二烯富集1 3 c 的原因是异戊烯焦磷酸中5 个碳原子只有1 个是从羧基得到的，因此造成1 3 c 的亏损。但生物体中各部分如何影响异戊烯焦 磷酸的同位素组成，异戊烯焦磷酸在生物体中储库不同会产生什么影响，目前还 无法确定，仍需要进一步研究。 针对上述两条合成途径，s t c f a n 等人对十三种藻的脂类进行分析，发现以上 两个合成途径可能是同时存在的【2 1 1 。这也意味着在用示踪方法解释生物标记物的 来源时要考虑更多因素，解释起来更加复杂。 6 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位索组成研究 1 3 2 3 氧化还原环境的影晌 有机物的降解过程在全球碳循环中起到非常重要的作用。根据碳循环我们可 以研究有机物来源、模拟古生产环境，但不同的降解过程，使我们对循环过程的 认识是不同的。有机物降解都是在富氧或缺氟环境下，依靠不同的氧化还原条件 进行的。目前就氧气在有机物降解过程中的作用仍然存在争议 2 2 - 2 0 3 。 目髓一个主要的争论就是耗氧降解是不是比厌氧降解快。早期的实验结果 表明二者不存在差异 2 7 , 2 8 1 。户外培养及实验室培养的数据显示二者的速率是基本 致的 2 9 , 3 0 。但仍有一些研究表明有机物的氧化降解要快于厌氧降解，并且有机 物在氧化环境的暴露时间决定了有机物的保存程度译1 矧。 脂类化合物在不同的氧化还原环境下表现出不同的降解行为 3 4 , 3 5 1 。k r i s t e m e n 等人发现，不论富氧还是厌氧环境，从生物体渗出的及开始水解的溶解有机物， 它们的降解速率是相似的阁。生物体的结构物质发生降解时，则是氧化环境下豹 速率更快，这部分主要是脂类化合物。早期的实验室研究表明细胞内起联结作用 的脂类化合物在氧化环境下降解更快 3 7 , 3 8 1 ，嚣露其他的研究显示游离的脂类化合物 在两种环境下降解速率是相似的【3 3 】。s u n 等的实验表明，藻类的脂肪酸在氧化环 境下降解比厌氧环境要快。并且，氧化环境下，细胞膜上的脂肪酸比胞内的降解 要快。但膜上与胞内的脂肪酸在厌氟环境下降解速率相同，这也证明了氧气对胞 内脂肪酸降解起到重要终用。 1 3 。2 。4 环境扰动豹影响 环境中的扰动过程对有机物的成岩作用有很大影响。环境中的扰动过程主要 包括生物扰动与物理扰动。生物扰动过程主要是底栖生物的灌溉、捕食、打洞等， 是持续的生物扩散过程，扰动过程的频率和周期影响到有机物的降解【3 踟。物理扰 动主要是飓风、风暴等，是偶然性发生的，此时，颗粒有机物及氧气都被深埋入 沉积物中，从丽改交了环境的氧化还原状态。物理混合会导致沉积物的侵蚀、转 移及新生成的有机物在深层厌氧沉积物中的埋藏。从而使得新生成的有机物在厌 氧环境下降解。 已有的研究表明，脂类化合物的降解速率在富氧及存在很好的生物扰动条件 下比缺氧环境快【3 9 】。虽然氧气只渗透进沉积物几毫米【柏】，但生物混合使降解过 7 中国海洋大学硕士学位论文 程完全暴露在氧气环境下，成为典型的氧化降解。 h a r m e t t 等人假设有机物在沉积物中的保存是受氧气暴露时间控制的。氧气 暴露时间可以定义为氧气在沉积过程中的渗透深度。较高的氧气暴露时间会导致 较低的有机物保留度【4 1 1 。s u n 等人的研究证明了这个假设，突然的物理扰动可 以使有机物通过富氧环境快速进入底层的厌氧环境，从而降解速率减少，而在厌 氧层大量保存【4 2 】。生物扰动则使有机物在富氧和缺氧界面连续循环，延长了有机 物质的氧气暴露时间，造成与氧反应的有机物快速降解。 除以上几种主要影响因素外，光照强度和光照周期m 州，温度【4 5 1 ，盐度m ，c 0 2 浓度 4 7 1 对脂类化合物成岩过程都有很大影响，使其在生物地球化学中的应用，受 到各方面的限制。但作为生物标记物，它具有重要的理论和实践意义。随着研究 的深入，分析手段的完善，应该尽可能排除各种影响，使其更好的服务于生物地 球化学研究。 1 4 海洋生物标记物中脂类化合物的测定方法提取、分离纯化和定 性、定量 1 4 1 海洋沉积物中脂类化合物的提取 1 索氏提取法( s o x h l e te x t r a c t i o n ) 海洋沉积物中脂类生物标记物的提取最早是采用索氏提取法【鸽】，溶剂是 c h 2 c h ：c h 3 0 h ( 2 ：1 ，v ：v ) 。该方法时间较长( 2 4 h ) ，在萃取溶剂固 体比例为l( v ：m ) 的前提下，要求回流次数超过6 次，但是萃取效率较高， 对于芳香烃( a h ) 、多氯联苯( p c b ) 和烃类总萃取效率分别是9 2 、9 6 和9 6 ， 是萃取生物标记物的常用方法。 2 超声波萃取法( s o n i c a t i o ne x t r a c t i o n ) 超声波萃取法也具有较高的萃取效率，对于沉积物中的脂肪烃类化合物，在 液固比与索氏提取法相同的条件下，重复6 次后，总回收率为9 5 ，该方法操作 简单，萃取时间短，方便快捷【4 8 】。 3 微波加速提取法 。 已经商品化的微波加速提取法，提取样品仅仅需要1 0 m l 溶剂，5 分钟一次 8 五种微漂中性腊与脂肪酸组成及同位素组成研冤 性提取，而且萃取效率较前两种方法要高( 9 5 ) ，但是仪器的造价较高1 4 9 - 5 2 。 以上提及的都是对于自由态脂类化合物的提取过程，通过辅助以酸、碱、加 热以及相转移催化剂( p h a s et r a n s f e rc a t a l y s t ) 等，也可以对以不同结合方式存 在于沉积物中的脂类化合物进行进一步的分级提取【5 3 】( s e q u e n t i a le x t r a c t i o n ) 。 1 4 2 海洋沉积物中脂类化合物的分离、纯化、定性和定量 脂类生物标记物的分离过程原则上是根据待分析化合物的结构、极性、溶沸 点等物理化学性质，通过浓缩提取液皂化( o 5 m o v lk o h c h 3 0 h ) 后过柱，用 不同极性的混合溶剂( 混合比例不相同) 洗脱，得到各种类型化合物的混合物。 通常情况下，用正己烷从皂化产物中萃取出中性脂后，在硅胶柱上用正已烷洗脱 脂肪烃；甲苯和苯洗脱多环芳烃，用c h 2 c 1 2 洗脱醛酮，用c h 2 c 1 2 和c h 3 0 h 混 合洗脱脂肪醇和甾醇。对予脂肪醇和甾醇组分用c s h l s f 3 n o s i 2 ( b s t f a ) 处理( 甲 基硅烷化试剂) ，然后气相分析。对于皂化萃取后的残余溶液，加入6 m o l lh c i 使其p h 值 、7 ) 8 ) 分别洗入阕一只梨形瓶中，焉后参照论文第三 部分的提取方法，旋蒸后继续皂化以后的步骤。 仪器检测方法参照论文第三部分。 4 3 结果与讨论 4 3 1 同一生长时期脂肪酸分布 5 种海洋微藻经硅胶层析后，不同组分：三油酸甘油酯，中间产物，磷脂的 脂肪酸在不同生长周期( 指数生长前期及稳定期后期) 在总脂肪酸中的百分含量 如图4 - 1 所示。 1 4 ：0 1 盘 i m2 z 嵋 1 4 0 他2l e ：1l q k o1 盘1 采11 m2 七5 丝暗 1 4 01 盘1 鲥 舶 蠢31 0 盘1 8 ：11 蠢o2 m 52 2 喀 1 4 01 8 ：1 l e ：o 1 8 ：21 8 ：1t 8 02 0 ：5 置：e 五种微藻中性滕与曼旨肪酸组成及网位素组成研究 锄i 饿1 6 01 豫1 8 0嬲 霪 嚣 基 鼍 确 毽 t 4 01 纛瑶1 8 11 6 ：01 8 21 8 11 8 ：02 0 ：6 粥 1 4 ：01 6 ：11 6 ：01 8 21 8 0嬲 1 4 01 6 ：31 6 ：11 6 01 8 ：21 8 ：11 8 ：02 龟5 黧敬6 图垂l 聂稃海洋微藻不同生长时期细胞膜和胞内的莠旨肪酸组成 4 3 1 1 指数生长期脂肪酸分布 。由图舡l 可知，五种海洋微藻在指数生长前期脂类组成主要是以细胞内脂类 为主，其中尤以1 6 ：0 和1 8 ：o 两种饱和脂肪酸为主。而1 4 ：o 也是在几种微藻 中都检测到的饱和脂肪酸，并且在磷嚣旨和三油酸甘油酪中多可以测出，但含量摆 对较低，都只有1 左右。量i 杰酸甘油酯的脂含量较低，主要也是以1 6 ：0 和l s ： 0 两种饱和脂肪酸为主，含量在1 o1 0 之间。三油酸甘油脂的脂肪酸组成明 显要低于磷脂组分。 青岛大扁藻在指数生长前期，1 6 ：0 、1 8 ：0 含量较高，总脂中含量在2 5 4 0 ；在磷脂和三油酸甘油酯中都发现少量的多不饱和脂肪酸2 2 ：6 。三油酸甘 油脂的脂肪酸组分含量在5 1 0 乏阉，主要是三种饱和脂肪酸1 4 ：0 、1 6 ：0 、 3 1 中国海洋大学硕士学位论文 1 8 ：0 0 盐藻的1 6 ：0 、1 8 ：0 含量相对青岛大扁藻略低，只有1 5 一3 0 ；在磷脂 中我们还发现了部分不饱和脂肪酸：1 6 ：2 、1 8 ：2 、1 8 ：l ，其中1 8 ：1 含量相 对较高，接近1 1 ，而其他两种不饱和脂肪酸只有2 左右。饱和脂肪酸分布情 况与青岛大扁藻相似。 塔玛亚历山大藻的1 6 ：0 、1 8 ：0 含量在2 5 一4 0 ；在磷脂中也发现了不 饱和脂肪酸1 8 ：2 、1 8 ：l ，同时三油酸甘油酯中也有类似分布，不过含量相对 就磷脂较低； 三角褐指藻与聚球藻相似，除了饱和脂肪酸，在磷脂中我们检测到不饱和脂 肪酸1 8 ：2 、1 6 ：l ，但含量较低，只有3 左右；二者的磷脂中都发现了5 左 右的2 2 ：5 多不饱和脂肪酸。 4 3 1 2 稳定期后期脂肪酸分布 进入稳定期后期，五种微藻体内脂肪酸种类明显增多，如论文第三部分所述， 藻体内可以发现很多不饱和脂肪酸。经过硅胶层析后，我们发现，稳定期藻体磷 脂类的脂肪酸以1 6 ：o 及c 1 8 系为主，其中，以1 6 ：o ，1 8 ：1 含量较高。三油 酸甘油脂的脂肪酸整体分布要低于磷脂。 稳定期后期的青岛大扁藻和盐藻的脂肪酸组成具有一定的相似性。青岛大 扁藻磷脂部分的1 6 ：0 、1 8 ：1 含量分布在2 0 4 5 ，盐藻的同种脂肪酸含量 分布在3 0 左右。其次，1 6 ：1 的含量也达到1 0 ；而多不饱和脂肪酸，如2 0 ： 5 j2 2 ：6 等含量在1 5 。三油酸甘油酯以1 6 ：0 、1 8 ：l 含量最高，大约5 左右，同时可以发现1 8 ：3 、1 6 ：1 等不饱和脂肪酸；青岛大扁藻中我们检测到 2 2 ：6 ，2 0 ：5 ，盐藻中只测出2 2 ：5 ，含量都只有3 左右。 塔玛亚历山大藻中我们测出较多的1 4 ：0 ，磷脂部分大约5 ，三油酸甘油 酯中3 左右；在磷脂中，1 6 ：0 、1 8 ：2 、1 8 ：1 含量都在1 0 以上，从图8 可 以看出，随不饱和度降低，磷脂中c 1 8 系列的脂肪酸浓度依次降低；该藻磷脂 中也测得较多的2 0 ：5 、2 2 ：6 ，含量在5 1 0 之间。三油酸甘油酯中的1 6 ： 0 、1 8 ：1 含量在5 。1 0 之间，同时含有2 左右的2 0 ：5 和2 2 ：6 。 三角褐指藻和盐藻在稳定期的磷脂主要是以1 6 ：0 为主，含量在2 0 4 0 。 五种微藻中性脂与脂肪酸组成及同位素组成研究 其他的脂肪酸含量都在1 0 以下；两种藻的磷脂部分都检测到2 左右的2 0 ：5 、 2 2 ：6 多不饱和脂肪酸；三油酸甘油酯中则只发现了2 0 - 5 ；三角褐指藻的1 6 ： 1 、1 6 ：0 在三油酸甘油脂中的含量都在1 0 左右，并远远多于磷脂部分同类脂 肪酸的含量。 4 3 2 不同生长时期脂肪酸分布 我们把不同生长周期下的同类来源的脂肪酸放到一起进行比较，得图4 2 所 示，分析不同生长周期下、不同来源脂肪酸的分布规律。 青岛大扁藻 蛰1 矿 囊1 矿 o 1 旷 青岛大扁藻 二 i。蔫鬻。臻攀j，馐馐灌馐罩伽銎霾殛爨鍪瑟缓疆盏鲥罐鬈霾霎啦!曩1壤1伽j，。簟。耋1灌馐谨鎏俐瑟器翌啦再 r t 罄鬈量一，鬻兹。j。；。；二一溜童 1_11_jl_l，1ld3_j1j1jj41t 伯 竹 【_蓦f石笋”、c f f i 苎一 1 0 4 ， 霉 = # 1 0 4 彗 、； 甚 喜 - ：1 0 + 7 星1 0 1 0 1 0 ，1 0 7 l 詈 1 0 4 磐 。 警 。1 0 4 = 墼 1 0 。 中国海洋大学硕士学位论文 塔玛亚历山大藻 。m 宿丽 嘲稳定 i l鏊 i 萋 i 荔荔 h一溺 1 4 ：01 6 ：11 6 ：01 8 ：21 8 ：11 8 ：02 0 ：52