（微生物学专业论文）海南福山香蕉地土壤细菌和真菌多样性分析.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用手y 1 7 9 8 5 3 1 1 l i i l l l l l l l l l i l l i i i l l l l l l 0 i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名名、哆 日强：e o 年5 窍s 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果， 知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名名钙 日期：矽和年f 月s 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人 的学位论文提交 定享受相关权益 论文作者签 日期：矽d ”中规 参胪 占月 需觏 ：j 名乒 签 ：师期导日 日 存7 摘要 香蕉枯萎病是香蕉生产中具有毁灭性的病害之一，生物防治是控制香蕉枯萎病较为 有效且环保的方法。生物防治多采用定殖外来拮抗菌，作为持续防治土传病害的重要手 段，但是土壤作为一个多种微生物的共生场所，外来拮抗菌的田间防治效果与土壤微生 物环境有着密切的关系。本文选取了海南福山地区正常香蕉地和香蕉病害地，进行土壤 微生物数量多样性分析，并构建1 6 s r d n a 文库和i t s 文库，旨在通过对比两者之间的 差异，探明香蕉枯萎病对土壤微生物多样性的影响，为香蕉枯萎病的生物防治提供参考 依据。通过研究取得以下结果： 1 应用平板计数法研究海南福山地区香蕉地土壤细菌和真菌数量，揭示了在香蕉生长过 程中，细菌数量在苗期达到最高，之后就会减少；真菌在香蕉生长过程中逐渐增长。与 正常香蕉地土壤微生物数量相比较，香蕉枯萎病导致土壤中真菌数量在香蕉孕蕾期明显 增加，而细菌数量降低。 2 从1 6 s r d n a 克隆文库上分析，本实验中正常香蕉地土壤1 6 s r d n a 文库所测得序列涵 盖了6 个门，多样性较高，其中优势菌为变形菌门，此外还有厚壁菌门、放线菌门、酸 杆菌门、蓝藻门、硝化螺旋菌门等。与之比较，香蕉枯萎病病害地土壤中变形菌门的数 量大大减少，以厚壁菌门和放线菌门为主要群落，由此可见在与镰刀菌导致的香蕉枯萎 病的生态竞争中，变形菌门存在一定的劣势而厚壁菌门和放线菌门则能有效繁殖。提交 序列至g e n e b a n k 核酸数据库，得到登录号为h m l 3 1 9 5 4 一i m 1 3 1 9 7 7 。 3 从i t s 文库对比分析可以看出，土壤中真菌的种类明显少于细菌，正常香蕉地土壤以 枝孢属及疣丝孢属居多，均属于半知菌类，占其中的5 0 左右，且菌属较多；此外也含 有少量的半知菌类的镰刀菌属。在正常香蕉地土样的i t s 文库中还存在纤毛动物以及与 未培养的内生菌序列相近的序列。而在病害地土样中所含真核微生物中引发香蕉枯萎病 的镰刀菌属为优势菌，测得少数的阳性克隆子属于枝孢属、疣丝孢属、尾枝虫属、刺皮 属、链格孢属等。比较两者之间的区别，香蕉枯萎病发生地区镰刀菌占很大的优势，但 仍有担子菌门的少量存在，这说明该类真菌进行病害防治和改良土壤更为有效。提交序 列至g e n e b a n k 核酸数据库，得到登录号为h m l 3 1 9 7 9 一h m l 3 2 0 0 4 。 综上所述，本文认为香蕉枯萎病菌对香蕉地土壤微生物环境有一定的影响，香蕉枯 萎病病害地土壤微生物群落多样性明显低于正常香蕉地土壤微生物群落。 关键词：r f l p 分析，1 6 s r d n a 文库，i t s 文库，香蕉地，微生物多样性 a b s t r a c t b a n a n aw i l td i s e a s ei so n eo ft h ee x t r e m e l yd e v a s t a t i n gd i s e a s e si nb a n a n ap r o d u c t i o n b i o l o g i c a lc o n t r o li st h em o s te f f e c t i v ea n de n v i r o n m e n t a lw a yf o rb a n a n aw i l t b i o l o g i c a l c o n t r o lo ff o r e i g nc o l o n i z a t i o no fa n t a g o n i s t i cb a c t e r i aw o r k e da si m p o r t a n tm e a n so ft h e c o n t i n u i n gf i g h ta g a i n s ts o i l - b o m ed i s e a s e s b u tt h es o i la s s u m e dt h es y m b i o s i sp l a c ei n v o l v e d w i t hv a r i e t i e so fm i c r o b e t h e r ew a sc l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef i e l dc o n t r o le f f e c to f f o r e i g na n t a g o n i s t i cb a c t e r i aa n dt h es o i lo fm i c r o b i a le n v i r o n m e n t s o i ls a m p l e sw e r eg o t t e n f r o mt h en o r m a la n dd i s e a s e db a n a n al a n d si nf u s h a nt o w nc h e n g m a ic o u n t yh a i n a n p r o v i n c e t h em i c r o b i a ln u m b e rd i v e r s i t yw a sa n a l y z e d m o r e v e r , t h e16 s r d n al i b r a r ya n d i t sl i b r a r yw e r ec o n s t r u c t e di no r d e rt oc o m p a r et h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ol i b r a r i e sa n d t op r o v et h ei m p a c to fb a n a n aw i l to nt h em i c r o b i a ln u m b e rd i v e r s i t y r e f e r e n c e sc o u l db e p r o v i d e dt ot h eb i o l o g i c a lc o n t r o lo fb a n a n aw i l te v e n t u a l l y t h er e s e a r c hr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： t h en u m b e r so fs o i lb a c t e r i aa n df u n g ii nf u s h a n gb a n a n al a n d sw a sa s s a y e db yt h ew a y o fp l a t ec o u n t i n gm e t h o d i tr e v e a l e dt h a tt h en u m b e ro fb a c t e r i aa d d e du pt ot h ep e a ki nt h e s e e d l i n gs t a g ea n dt h e nd e c r e a s e d m i l et h o s ev a r i e t i e so ff u n g ii n c r e a s e dg r a d u a l l yd u r i n g t h eb a n a n ag r o w i n gp r o c e s s c o m p a r e d 、i t ht h en o r m a lb a n a n al a n d s ，t h eq u a n t i t i e so ff u n g i i nt h eb a n a n aw i l tl a n d si n c r e a s e do b v i o u s l y , w h i l e ，b a c t e r i ad e c r e a s e di nt h eb u ds t a g e a n a l y s i so ft h e16 s r d n ac l o n i n gl i b r a r i e ss h o w e dt h a t ：t h e16 s r d n al i b r a r yo ft h e n o r m a lb a n a n al a n d se x h i b i t e db e t t e rd i v e r s i t ya n dc o v e r i n gs i xp h y l u m s t h ed o m i n a n t b a c t e r i aw e r ep r o t e o b a c t e r i a o t h e r sw e r ef i r m i c u t e s , a c t i n o b a c t e r n a c i d o b a c t e r i a , c y a n o p h y 舰n i t r o s p i r ae t c i nc o n t r a s t ，t h en u m b e ro fp r o t e o b a c t e r i ai nt h ew i l t d i s e a s e b a n a n al a n d sw a sm u c hs m a l l e ra n dt h em a i nb a c t e r i u mc o m m u n i t i e sw e r ef i r m i c u t e sa n d a c t i n o b a c t e r i a i ts h o w e dt h a tp r o t e o b a c t e r i aw a si ni n f e r i o rp o s i t i o nb u tf i r m i c u t e sa n d a c t i n o b a c t e r i ar e p r o d u c e de f f e c t i v e l yi nt h ee c o l o g i c a lc o m p e t i t i o nw i t ht h ef u s a r i u mw h i c h c a u s e dt h eb a n a n aw i l td i s e a s e s s u b m i t e ds e q u e n c ed a t at og e n b a n k ，t h e yh a v ep r o v i d e dg e n e b a n k a c c e s s i o nn u m b e r sf o rn u c l e o t i d es e q u e n c e s ：h m l 3 1 9 5 4 一h m l 3 1 9 7 7 c o m p a r a t i v ea n a l y s i so ft h ei t sg e n el i b r a r i e si n d i c a t e dt h a tt h et y p e so fs o i lf u n g iw e r e l e s st h a nt h a to ft h es o i lb a c t e r i a c l a d o s p o r i u ms p a n ds t c n e l l as p b e l o n gt oa d e l o m y c e t es p w e r e5 0 i nt h en o r m a lb a n a n al a n d sw i t hs o m eo t h e rf u n g ig e n e r a 形西a fi sm o r e 。as m a l l q u a n t i t i e so ff u s a r i u ms p b e l o n gt o a d e l o m y c e t esw a sf o u n d s e q u e n c e ss i m i l a rt ot h a to f c i l i aa n i m a la n du n c u l t u r e de n d o p h y t e sw e r ef o u n di ni t sg e n el i b r a r i e so ft h en o r m a ll a n d s a d d i t i o n a l l y i nt h ed i s e a s e dl a n d s ，t h em a i nf u n g iw e r et h ef u s a r i u ms p w h i c hl e dt ot h ew i l t i i d i s e a s e f e wo ft h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ec l a d o s p o r i u ms p ，s t c n e l l as p ，u r o s t y l ag r a n d i s , h e t e r o c h a e t e s p ，a l t e r n a r i ae c t f u s a r i u ms p w a si nd o m i n a n tp o s i t i o ni nd i s e a s e dl a n d s t h o u g ht h e r ew a sf e wb a s i d i o m y c o t a i ti n d i c a t e dt h a tt h eb a s i d i o m y c o t af u n g im a y b em o r e e f f e c t i v et ot h ed i s e a s ec o n t r o la n ds o i li m p r o v e m e n t s u b m i t e ds e q u e n c ed a t at og e n b a n k ，t h e y h a v ep r o v i d e dg e n e b a n ka c c e s s i o nn u m b e r sf o rn u c l e o t i d es e q u e n c e s ：删1 3 1 9 7 8 一i - i m l 3 2 0 0 4 i ns u m m a r y , b a n a n aw i l td i s e a s ea f f e c t st h em i c r o b i a le n v i r o n m e n ti nt h es o i lt oac e r t a i n e x t e n t i ta l s od e c r e a s e st h em i c r o b i a lc o m m u n i t yd i v e r s i t yi nt h eb a n a n aw i l td i s e a s es o i l s i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t hn o r m a ll a n d s k e yw o r d s ：r f l pa n a l y s i s ，16 s r d n al i b r a r y , i t sg e n el i b r a r y , b a n a n as o i l ，m i r o b i a l d i v e r s i t y i i i 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i 目录i v 第一章前言1 l 土壤微生物多样性的概念1 1 1 土壤微生物物种多样性1 1 2 土壤微生物遗传多样性2 1 3 土壤微生物生态系统多样性2 1 4 土壤微生物功能多样性一2 2 土壤微生物多样性的研究方法3 2 1 传统平板培养法3 2 2b i o l o g 微平板分析法4 2 3 磷脂脂肪酸分析法5 2 4 分子生物学方法6 3 本研究的目的及意义1 0 第二章香蕉地土壤微生物数量多样性分析1 1 1 实验材料1 1 1 1 样品采集地描述1 1 1 2 药品及仪器1 1 1 3 培养基1 1 1 4 分析软件1 2 2 实验方法1 2 2 1 样品采集和保存1 2 2 2 土壤含水量及p h 值测定1 2 2 3 土壤微生物菌落计数1 2 2 4 数据分析13 3 结果与分析1 3 3 1 土壤含水量及p h 值1 3 3 2 土壤中真菌、细菌计数1 3 z i 讨论16 第三章香蕉地土壤d n a 提取1 8 1实验材料18 1 1 材料18 1 2 主要药品及试剂盒1 8 1 3 仪器设备19 1 4 试剂1 9 2 土壤微生物总d n a 提取2 0 2 1 土壤微生物总d n a 直接提取法2 0 2 2 土壤微生物总d n a 间接提取法2 1 2 3 提取d n a 的纯度检测和定量2 1 3 结果分析一2 2 3 1 土壤总d n a 提取电泳检测2 2 3 2 土壤总d n a 的提取量和纯度2 3 4 讨论2 4 第四章香蕉地土壤细菌多样性分析2 5 1 实验材料2 5 1 1 材料2 5 1 2 药品和仪器2 5 1 3 主要试剂2 5 1 4 引物2 6 2 试验方法2 6 2 1 土壤总d n a 的1 6 s r d n a 片段的扩增2 6 2 2p c r 产物的检测及回收2 7 2 3 感受态细胞( e c o l id h 5q ) 的制备2 7 2 4p c r 回收产物与载体的连接2 7 2 5 连接产物转化d h 5q 感受态细胞2 7 2 6 质粒双酶切电泳检测筛选阳性克隆2 8 2 7 文库的保存3 0 2 8 r f l p 分析3 0 2 9d n a 序列测定和16 s r d n a 系统发育分析3 2 3 结果分析3 2 3 1 土壤总d n a 的1 6 s r d n a 扩增3 2 v 3 2 阳性克隆子检测3 3 3 3 菌落p c r 3 4 4 讨论4 1 第五章it s 文库构建4 2 1 实验材料4 2 1 1 材料4 2 1 2 药品和仪器4 2 1 3 主要试剂4 2 1 4 引物4 2 2 试验方法4 2 2 1 土壤总d n a 的i t s 片段的扩增4 2 2 2p c r 产物的检测及回收4 3 2 3 连接转化4 3 2 4 筛选阳性克隆子4 4 2 5 文库的保存4 4 3 结果分析4 4 3 1 土壤总d n a 的i t s 扩增4 4 3 2 i t s 文库4 5 4 讨论4 8 第六章主要结论4 9 参考文献5 0 附录5 3 致谢5 4 第一章前言 土壤微生物是土壤中比较活跃的组成部分，它参与土壤中物质转换和能量流动，土 壤中微生物的种类、数量和分布影响着土壤肥力，植物营养及土壤中有毒物质降解等方 面。随着人们对环境资源的掠夺性开发，使得土壤渐渐失去了自我恢复的功能，土壤生 态系统遭受到前所未有的破坏。国内外的科学家们越来越多的将目光投向了土壤微生 物，土壤微生物在土壤保健中起着重要的作用，同时可以成为稳定土壤生态系统，监测 土壤变化的一项指标，而其多样性研究在维持生态系统平衡中也发挥着重要的作用【1 3 】。 1 土壤微生物多样性的概念 微生物的物种资源非常丰富，土壤微生物多样性主要是指在栖息地中微生物类群的 物种多样性，在微生物类群内的遗传多样性，以及包括群落结构的变异性、相互作用的 复杂性、营养水平和共位群数量( 功能多样性) 在内的生态系统多样性【4 1 。其中遗传多 样性可认为是土壤微生物多样性的本源【5 1 。 1 1 土壤微生物物种多样性 土壤是微生物的主要生活场所，土壤的通气性、水分状况、养分状况以及有机质含 量直接影响着土壤微生物的种类及数量。土壤微生物主要包括真核微生物、原核微生物 和超显微结构微生物。原核微生物有细菌、蓝藻、放线菌等，真核微生物主要有真菌、 藻类、地衣和原生动物等。研究证实，土壤中原核生物的数量最多，约为2 6 1 0 2 6 个 细胞。真菌、藻类和原生动物的数量比原核生物少。对甘肃环县草地可培养细菌分离后 发现，平均每克土壤有6 5 个不同的细菌种群，细菌总量为每克土壤中含有4 5 1 1 0 9 1 7 4 1 0 1 0 个菌落。对美国威斯康星农田土壤微生物多样性分析表明，约9 8 的物种属于细 菌，其中1 6 1 属于古细菌，2 1 8 属于噬纤维菌黄杆菌类群，另有2 1 8 属于低g + c 含量的革兰氏阳性菌【6 7 1 。微生物的种类虽然非常的多，但是由于研究技术的相对落后， 目前对于微生物的研究及分类仍有相当大的比重未被认识，随着科技的发展，将来会有 越来越多微生物被人们研究并利用。在微生物中较易培养和观察的大型微生物真 菌，至今每年还可以发现1 5 0 0 个新种。与此同时，随着分子生物学研究技术在土壤微 生态研究上渗透，使得许多土壤中未培养的微生物也渐渐得到认识并对其功能进行了鉴 定，大大丰富了土壤微生物物种的多样性。 1 2 土壤微生物遗传多样性 微生物遗传多样性本质上讲是组成生物遗传物质的d n a 或r n a 中碱基的排列顺序 的多样性及碱基的庞大数量所决定的。由于微生物的遗传物质在复制过程中出现的单链 d n a 、单链r n a 等的稳定性不高，因此在碱基配对过程中容易出现错误及微生物特有 的基因重组方式如转化、转导等现象使微生物遗传多样性更为复杂。遗传物质不同带来 的不同的蛋白质的合成，使得微生物的形态，结构等方面表现不同性状。微生物也就是 通过不断的改变自己的遗传物质来提高其适应性，以适应环境的变化。 1 3 土壤微生物生态系统多样性、 土壤微生物对整个生态系统产生重要的影响，它们不仅是土壤中有机物的分解者， 而且是食物链中的初级生产者，对自然界的碳、氮、硫、磷等元素循环发挥重要作用瞵j 。 土壤的通气性、水分状况、养分状况以及有机质含量直接影响着土壤微生物的种类及数 量。全球土壤类型多种多样，构成复杂，其有机质及矿物质含量、p h 值、机械组成、 团聚体组成等理化特征各不相同。其中土壤有机质的类型和含量对提供维持土壤各种功 能所必需的能量、底物和生物多样性至关重要，土壤有机质含量和组成是影响微生物生 物量、群落组成、生物活性的关键因素【9 。1 1 】。不同的土壤环境能够提供微生物不同的营 养成分，从而形成不同的土壤微生物群落结构。王英【1 2 】等通过对免耕水稻土壤的研究发 现不同土层细菌群落结构相似性极低。刘恩科【1 2 】等对不同施肥制度下的土壤进行了 d g g e 分析，得出了通过改变土壤微环境条件可以引起土壤微生物群落结构的变化。地 球上存在着众多的土壤环境生态系统，微生物作为各个生态系统中重要的组成成分，在 适应环境的同时形成了各自不同的土壤微生物群落结构组成。 1 4 土壤微生物功能多样性 土壤微生物影响着土壤中各种物质的转化，包括有机物质的分解、营养元素的转化、 土壤中新的有机质的合成以及土壤理化性质的改变；土壤微生物的活动对植物营养、生 长以及抗病性都有一定的影响；土壤微生物所分泌的各种外酶及死亡自溶后释放的内 酶，对土壤中各种物质转化的活性以及对土壤性质的影响；此外，土壤微生物对污物、 污水的净化，对有机农药残毒的降解以及土壤保健起着重要作用。 近年来，各国科学家越来越重视土壤微生物功能的研究，并将其应用于实践中。现 今至少有7 0 个国家在研究、生产和应用微生物肥料【1 3 1 。微生物肥料是以特定微生物的 生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品，我国现行的微生物肥料根据其对改善 植物营养元素的不同，可分成根瘤菌肥料、固氮菌肥料、磷细菌肥料、硅酸盐细菌肥料、 2 复合微生物肥料等五类。与其他类型肥料相比，微生物肥料还可以提高化肥的利用率； 通过降解废弃物减少土壤中有害物质的积累；通过改善土壤团粒结构，参与腐殖质的形 成，改良土壤；减少污染，保护环境，有益于人类的生存和健康。 土壤中还存在大量的有益微生物资源，如各国科学家通过在土壤中寻找拮抗性微生 物发现了青霉素、土霉素、链霉素等一系列的抗生素；从土壤中获得农用抗菌素和杀虫 剂，实行以菌治虫，以菌治草，以菌治病；通过土壤微生物发酵产生沼气作为燃料等， 极大地方便了人们的生活。土壤微生物功能多样性为人类的生产，生活各个方面提供了 解决问题的新思路。 2 土壤微生物多样性的研究方法 研究土壤微生物多样性的方法有很多，主要是通过分析土壤中可培养微生物群落， 或者是分析土壤中整个微生物群落来研究土壤微生物的【4 】。常用的方法大致可以分为四 类：( 1 ) 传统平板培养法；( 2 ) b i o l o g 微平板分析法；( 3 ) 脂肪酸分析法；( 4 ) 分子生 物学方法【l4 1 。其中传统平板培养是基于分析土壤中可培养微生物群落，而b i o l o g 微平 板分析，脂肪酸分析及分子生物学方法既可以用于分析可培养微生物群落又可用于分析 土壤中整个微生物群落。 2 1 传统平板培养法 传统的微生物平板培养法是利用一定的培养基和方法选择所需要的土壤微生物，通 过尽可能的复制与微生物小生境一样的资源和条件，达到探测该小生境里可能栖居的微 生物类群的目的【1 5 - 1 6 ，至今仍是认识土壤微生物区系组成、数量和主要生理类群结构状 况的一种重要而不可替代的经典方法。平板稀释培养法是进行土壤微生物分离培养的常 用方法，一般分为稀释一接种一培养一计数等几个步骤。主要包括细菌、放线菌及真菌 平板培养计数1 1 7 j 。 各国研究者们结合土壤环境对微生物数量和类型进行分析，为土壤微生态环境的保 护提供依据。武丽花【ls 】等用平板计数法发现在锰矿废弃地的不同植被恢复方式下同一月 份同一土层的细菌数量的差异极显著，人工植被恢复地 对照地 自然植被恢复地；真菌 在不同月份数量变化趋势不同，7 月份，o 2 0c m 土层中真菌数量达到最高值，人工植 被恢复地 自然植被恢复地 对照地，5 月份，对照地 人工植被恢复地 自然植被恢复地， 而1 1 月份却表现为人工植被恢复地 对照地 自然植被恢复地；不同土层放线菌数量的 季节变化规律不一致，不同植被恢复下放线菌数量排序也不同。熊鸿焰【l9 】等通过对真菌、 细菌、放线菌的平板培养计数认为免耕水稻田应在免耕5 6 年后适当翻耕，可以保持土 壤微生物的多样性。在自然土壤环境下，许多土壤微生物处于贫营养状态，而培养基中 含有充分的营养使得大量的贫营养微生物并不适宜生长其中，而且实验室的培养条件不 可能同时满足不同类型的微生物对温度、通气状况以及p h 等条件的要求，采用特定的 培养条件很难将一些不适应该条件的微生物培养出来，所以用传统的方法得到的多样性 结果所代表的自然环境中微生物多样性是非常片面的。除了培养基类型和培养条件等方 面的限制外，许多微生物在环境变化过程中表现为- 7 中“存活但不能培养 ( v i a b l eb u t n o n c u l t u r a b l e ，v b n c ) 的状态。可见利用传统平板培养法不可能全面地反映土壤微生物 的全部信息【2 0 乏2 1 。根据a m a i l n 【2 3 】等的评估，认为8 0 0 0 - 9 9 的微生物不可培养或未能得 到培养，说明大部分微生物的特征不能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述， 因 此，随着人们对土壤微生物认识的不断深入，传统的平板培养法，不能满足人们对土壤 微生物多样性的研究，需要结合一些现代生物技术来更详细准确的了解土壤微生态状 溯。 2 2b i o l o g 微平板分析法 b i o l o g 微平板分析法是测定土壤微生物对9 5 种不同碳源的利用能力以及代谢差异， 从而表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的一种方法【1 4 j 。在b i o l o g 微平板反 应中，将土壤溶液接种到每一个微平板孔中，在一定的温育时间内，利用土壤微生物其 新陈代谢过程中产生的脱氢酶能降解四氮叠茂，使四氮叠茂变成紫色，微平板中每- - 的颜色变化可以通过酶标仪测定和记录下来，这样便可得到土壤微生物特有的“代谢指 纹”( m e t a b o l i cf i n g e r p r i n t ) ，根据每孔颜色变化程度可以反映土壤微生物对不同单一碳 源的代谢能力高低，微生物对碳源的利用能力则是表征土壤微生物生长情况的主要指 标。由于土壤中微生物其生长主要受碳源的限制，所以通过土壤微生物对单一碳源的利 用情况可以了解土壤微生物的动态变化，这种方法能比传统平板培养法通过计数来了解 微生物动态变化更为有效皿4 1 。高军【2 5 】等利用b i o l o g 微平板分析技术，对多氯联苯自然 污染的农田土壤中的微生物进行研究，发现多氯联苯自然污染引起了土壤微生物群落功 能多样性下降，降低了微生物对不同单一碳源底物的利用能力，从而得出多氯联苯自然 污染的农田土壤的微生物群落功能多样性产生了一定程度的影响，体现在微生物的种群 丰富度和常见物种数等方面的改变的结论。此外，谭兆赞【2 6 】等研究生化腐植酸对土壤微 生物多样性，孔滨【2 7 】等研究水热条件和施肥对黑土中微生物群落代谢特征的影响时都通 过b i o l o g 微平板测定，反映出土壤的群落多样性和均匀度，而这两种指数可以反映群落 的稳定性和群落的组成结构，从而更好地反映在不同的土壤环境中土壤微生态的状况。 b i o l o g 微平板分析法是现今研究土壤微生物群落功能多样性和结果多样性的一种 相对简单、快速的分析方法，但是也存在一些不足之处。首先土壤微生物在b i o l o g 微平 板系统中生长时，由于温育条件的变化引起微生物对单一碳底物实际利用能力的改变及 其代谢补偿、代谢适应等微生物环境适应性问题；其次b i o l o g 板内是近中性的缓冲体 4 系，高浓度的碳源，同时生物毒性的指示剂都可能影响对土壤微生物测试的效果【2 8 】；最 后该方法仅能鉴定快速生长或富营养微生物类群的活性，而不能反映土壤中生长缓慢的 微生物信息，所以b i o l o g 方法等微生物培养方法测定的土壤微生物种类数量不到1 6 s r r n a 方法测定的微生物数量的1 ，因而在很大程度上低估了土壤中微生物的实际情 况，不能全面反映土壤微生物的多样性。 2 3 磷脂脂肪酸分析法 磷脂脂肪酸( p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d 简称p l f a ) 是磷脂的构成成分，而磷脂是构成活 体生物膜的重要部分【2 9 1 。不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同的p l f a ，一 些研究表明细胞死亡后数分钟到数小时内细胞酶水解和释放磷脂，p l f a 被降解，所以 p l f a 能很好的测定有繁殖能力的微生物生物量【3 0 1 。总p l f a 谱中某些特征脂肪酸分别 对细菌、真菌和放线菌是特异的，且在大多数情况下p l f a 的某专一类型在某一土壤微 生物分类中占优势，以p l f a 谱图中不同磷脂脂肪酸的种类和含量用来分析微生物的种 类和生物量，p l f a 丰富则显示了生化功能多样性和微生物物种多样性，所以p l f a 作 为微生物多样性的指示性标记【3 1 1 。该方法是以氯仿甲醇柠檬酸缓冲液来提取土壤鲜样 或冷冻干燥样品中的脂类，然后用柱层析法分离得到磷酯脂肪酸，最后经甲酯化后以气 相色谱来分析各种脂肪酸( c 5 c 2 0 ) 的含量【1 6 】。 f r o s t e g a r d l 3 3 1 等将磷脂提取方法改进后，成功地应用到土壤微生物多样性分析中， 发现施用石灰、灰分等碱性物质后，森林土壤p l f a 有明显的变化，农药、重金属污染 土壤的p l f a 也存在差异【3 2 - 3 4 。文倩【3 5 】等希望通过对北方农牧交错带林地、耕地和草地 土壤微生物群落结构特征的p l f a 分析，得出耕地和草地土壤肥力和有机物输入高于林 地土壤。探索出土壤利用方式与微生物群落结构变化之间的关系，为合理地利用土壤资 源提供依据。 磷脂脂肪酸分析技术( p l f a ) 是一种不需要通过分离和培养的技术，通过有效提 取土壤中大部分微生物脂肪酸成分，能更全面揭示土壤中微生物的生物量和生态结构， 表征土壤微生物群落结构的动态变化，包括不可培养微生物，并且可以减少分离和培养 过程中的人为误差1 3 。但是也存在多方面的不足之处：首先，土壤是一个复杂的且易变 的生态系统，对土壤脂肪酸含量、组成及其意义还缺乏充分的了解，使得磷脂脂肪酸分 析技术的分析依据存在缺陷；其次，该分析方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定 壤微生物群落结构，而当土壤中p l f a 标记物的组成及其稳定性还受提取方法、提取 条件等因素直接影响，即使是同一土壤样品采用不同的提取方法和条件也可能会出现偏 差，将导致群落估算上的偏差；然后，它很难从种的水平上鉴定微生物类群，只能鉴定 到属；最后，细菌和真菌能够产生大量不同类型的磷脂脂肪酸，因而生长条件的改变或 环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变，这些因素都有可能导致在进行磷脂脂肪酸分析 时，出现群落多样性的偏差。 2 4 分子生物学方法 土壤是微生物的主要栖息地，是自然环境中最复杂的异质体系，这决定了土壤微环 境的多样化和土壤微生物的高度多样性。据估计，每克土壤含有大约4 0 0 0 7 0 0 0 种近1 0 亿的细菌【3 6 】，按平均每个基因组大小为6 1 l o p ，每个基因长度为1 0 3 b p 计算，则每 克土壤就包含6 1 1 0 7 个基因【了7 1 。这表明土壤微生物是一个巨大的基因文库，以往对 土壤微生物多样性的研究建立在传统的微生物培养和分离技术上，虽然被证明是有效 的，也获得了很多有应用价值的活性生物，然而土壤中可培养微生物仅占约3 ，传统 的培养方法大大地限制了土壤中微生物基因资源的开发利用。为了摆脱对培养技术的依 赖，分子生物技术被广泛应用于土壤微生物中，把分子生物学技术运用于土壤微生物生 态学的研究，使人们可以避开传统的分离培养过程，通过d n a 水平上的研究，直接探 讨土壤微生物的种群结构和环境的关系。1 9 8 6 年，p a c e t 3 s j 等第一次以1 6 sr d n a 确定环 境样品中的微生物后，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识，此后，通过 p c r 技术将土壤中提取的d n a 扩增和检测出来的分子生物学技术在土壤微生物多样性 研究上不断涌现，并逐步成为揭示各种生命规律的有效手段后，科学家们越来越倾向于 在分子水平上进行土壤微生物多样性研究。分子生物学所采用的方法是通过从环境样品 中直接提取和纯化土壤微生物总d n a 后，就可以用特异性或通用引物扩增出目标片段， 对其进行科学分析。在p c r 的基础上，采用r f l p ( 末端限制性片断长度多态性) ，a r d r a ( 扩增r d n a 限制性分析) ，r a p d ( 多态性d n a 随机扩增) ，d g g e ( 变性梯度胶电 泳) ，t g g e ( 温度梯度胶电泳) ，s s c p ( 单链形成多态性) 和r i s a i g s ( 核糖体内间 隔区分析) 等技术分析土壤微生物多样性，可以克服其他研究方法造成的信息大量丢失 的缺点，能更客观更全面地对样品进行研究，更精确地揭示土壤微生物种类和遗传多样 一i 生。 2 4 ii 疆l p 技术 1 6 s r d n a 的限制性片段长度多态性1 3 9 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，即 r f l p ) 分析方法是b o s t e i n ( 1 9 8 0 ) 首先提出的一种分子遗传标记，其方法是从环境样品中 提取d n a 作为模板，在合适的引物下进行p c r 扩增目的基因( 1 6 s r d n a 或是i t s 常 作为土壤微生物的目的基因) 。扩增的目的基因由限制性内切酶进行消化酶切，根据酶 切后d n a 片段的数量和大小可以用来评价土壤群落的基因多样性【38 1 ，或者将酶切后的 d n a 用标记探针杂交，揭示微生物r f l p 的多样性【4 1 1 。r f l p 反映的是d n a 水平上