（果树学专业论文）福建柑桔种质的RAPD分析及龙眼LEAFY基因克隆和表达的研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：五久建 日期：种。6 、f 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即 学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全 部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 王认：篷 日期：细。6 1 指导教师亲笔签名： 轴强 日期：。加占奠。 福建农林大学硕士学位论文中文摘要 福建柑桔种质的r a p d 分析 及龙眼l e a f y 基因克隆和表达的研究 摘要 本论文中“福建柑桔种质的r a p d 分析”部分，对柑桔基因组d n a 的提取方法作出 探索。在参考有关r a p d 分析的反应体系和程序的基础上，对影响p c r 扩增的重要参数 进行优化，经过反复试验，确立了适合柑桔大量样品p c r 反应的优化体系和反应程序。 筛选出扩增多态性较高的引物2 1 条，对从福建各地所采集的5 4 份柑桔材料( 包括杂 柑种质) 进行r a p d 鉴定分析，并探讨了它们之间的差异和亲缘关系：此外，对聚类结 果中几个品种间的差异和亲缘关系进行了再次聚类分析，以验证第一次的聚类结果。结 果表明，在遗传距离d 值= o 4 5 水平上，5 4 份柑桔材料基本上可以聚为三大类，与常 规的柑桔属分类相同，即金柑属、枳属、柑桔属，表现出较远的亲缘关系；在遗传距 离d 值= o 3 9 水平上，柑桔属种质又可分成三类。这充分表明了福建柑桔种质的遗传 背景复杂，种质资源遗传差异大；同时也说明了使用r a p d 技术对柑桔种质资源遗传多 样性及其之间的亲缘关系鉴定的可行性和可靠性。 本论文中“龙眼刮基因克隆和表达的研究”部分，对龙眼总r n a 和基因组d n a 的提取方法进行了优化；根据柑桔、葡萄、梨、苹果和芒果等果树上已克隆得到的吖 同源基因的保守区序列，设计合成兼并引物，在龙眼果树上克隆得到了长度分别为4 2 5 b p 和1 8 1 6b p 龙眼中的l f y c d n a 和d n a 片段，且都已经在g e n b a n k 中登录，其登记 号分别是d q 2 4 7 6 9 4 和d q 3 0 7 3 9 1 ；利用定量r t - - p c r 方法，将兼并引物重新合成特异 引物，对此基因在龙眼不同器官组织中的表达情况进行了研究分析，实验得知l f y 基 因在龙眼花序芽、冲梢芽、花芽、叶芽中都有表达，在茎段和叶片中没有表达，从扩 增的d n a 条带的亮度可以看出，龙眼舻y 基因在花序芽中的表达量最大，其次是花芽 和冲梢芽( 冲梢芽中的表达稍弱于花芽) ，叶芽中的表达量较小：最后，利用r a c e 方法，根据本实验所得l f yc d n a 序列，设计3 一端特异引物，克隆得到了此基因的 3 7 一端的序列。 关键词 柑桔；r a p d ；龙眼；l e a f y 基因；克隆：表达 福建农林大学硕士学位论文 英文摘要 t h er a p d a n a l y s i so fc i t r u sg e r m p l a s m si nf u j i a n & c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so fal e a f yh o m o l o g u ef r o m l o n g a n ( d i m o c a r p u s 如n g a nl o u t ) a b s t r a c t i nt h ep a r ta b o u t t h er a p d a n a l y s i so fc i t r u sg e r m p l a s m si nf u j i a n ”t h em e m o do f i s o l a t i o no fg e n o m i cd n af r o mc i t r u sw a ss t u d i e d c o n s u l t i n gt h er e l a t i o n a lp r o g r a mo f r a p dr e a c t i o n ，s o m ee s s e n t i a lf a c t o r st h a tm i g h ta f f e c tt h er e s u l t so fr a p dr e a c t i o nw e r e c o m p a r e d ，a f t e ri t e r a t i v ee x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a la m p l i f i c a t i o ns y s t e ma n dp r o g r a mf o r c i t r u sr a p d - p c rw e r ee s t a b l i s h e d i d e n t i f i c a t i o n ，c l a s s f i e a t i o na n dg e n e t i cr e l a t i o n s h i po f 5 4c i t r u sg e r m p l a s m s ( i n c l u d i n gt h ec i t r u s h y b r i dv a r i e t i e s ) o ff u j i a np r o v i n c ew e r e m e a s u r e da tm o l e c u l a rl e v e lb yr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) w i t h t w e n t y o n ep r i m e r so f1 0b a s e s m e a n w h i l e ，t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fs e v e r a lc i t r u sv a r i e t i e sw a s a n a l y s e da g a i nt ot e s tt h ev e r a c i t yo ft h ef i r s tc l u s t e r a n dt h et w oc l u s t e ra n a l y s i sb a s e do n d i s c o r d a n tc o e f f i c i e n ts h o w e dt h a tt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e n5 4c i t r u sg e r m p l a s m s o ff u j i a np r o v i n c ew e r ec l o s e rr e l a t e d 5 4c i t r u sg e r m p l a s m sw e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ( f d r t u n e l l as w i n g l e ，p o n c i r u sr a f ，a n dc i t r u sl ) w h e nt h eh e r e d i t yd i s t a n c ew a s0 4 5 ， w h i c hw a st h es a m et ot h et r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o ns y s t e m a n dt h eg e r m p l a s m so ft h e c i t r u sl w e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p sa g a i nw h e nt h eh e r e d i t yd i s t a n c ew a s0 3 9 w e p r o p o s er a p d si nc i t r u sc o u l db eu s e da sm o l e c u l a rm a r k e r st oa s s e s st h eg e n e t i co fc i t r u s a n di t sr e l a t e dg e n e r aa n dc l a r i f yt l l e i re v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p s i nt h ep a r ta b o u t “c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so fal z 埘f yh o m o l o g u ef r o m l o n g a n ( d i m o c a r p u sl o n g a nl o u t ) ”，t h ee x t r a c t i o nm e t h o d so f t o t a lr n aa n dg e n o m i e d n af r o ml o n g a nw e r eo p t i m i z e df i r s t l y s e c o n d l y ，a4 2 5 b pe d n af r a g m e n ta n da 1 8 1 6 b pg e n o m i ef r a g m e n tw e r ei s o l a t e df r o ml o n g a nu s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r s ，w h i c hw e r e d e s i g n e db a s e do ns e v e r a ll e a f yh o m o l o g s c o m p a r i s i o no fs e q u e n c es i m i l a r i t ys h o w e d t h a tt h es e q u e n c e sw e r el 已l f yh o m o l o g g e n e t h i st w os e q u e n c e sh a v eb e e ns u b m i t t e di n t h eg e n b a n k ，a n dt h es u b m i s s i o nn u m b e r sw e r ed q 2 4 7 6 9 4a n dd q 3 0 7 3 9 1 t h i r d l y ，t h e e x p r e s s i o np a t t e r n so ft h el e a f yh o m o l o gg e n ew e r ea l s oa n a l y z e db yq u a n t i t a t i v e r t p c r i t st r a n s c r i p t sw e r ed e t e c t a b l es t r o n g e ri ni n f l o r e s c e n c ea n df l o r a lb u d s w e a k l yi n s h o o tb u d s ，n oe x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nl e a v e sa n ds t e m s ，i nv e g e t a t i v eb u d s ，w h i c h r e v e r s e df r o mi n f l o r e s c e n c e i t se x p r e s s i o nw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a t i ns h o o tb u d s f i n a l l y ，w eg a i n e dt h e3 l _ t e r m i n a ls e q u e n c eo f t h el f y g e n eb yt h e3 t - r a c em e t h o d k e y w o r d s ： c i t r u s ；r a p d ；l o n g a n ；l e a f y g e n e ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n 2 福建农林大学硕士学位论文缩写词 英文缩写 a f l p a m p a p a u a p b d c d n a c 1 1 a b d d h ，0 d e p c d n t p e b e d t a i p t g l s s r k b l b m r n a n a a c o d p c r p i p v p p v p p r a c e r a p d r f l p r n a s e r t - p c r s d s s s r t b e t r i s u p g m a x - g a l 缩写词 英文全称 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m p i c i l i n a d a p t e rp r i m e r a b r i d g e du n i v e r s a la m p l i f i c a t i o np r i m e r b a s ep a i r s c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y lt r i e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i s t i l l e dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o e a r b o n a t e d i o x yn u e l e i o t i d et r i p h o s p h a t e s e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y t h i o - - 1 3 - - d - - g a l a c t o s i d e i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t k i l o b a s ep a i r s l u r i a - - b e r t a n im e d i a m e s s e n g e rr n a s o d i u ma c e t a t e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i s o e l e e t r i ep o i n t p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e p o l y v i n y lp o l y p y r r o l i d o n e r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r n a a s e r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s o d i u md o d e e y ls u l f a t e s i m p l es e q u e n c er e p e a t s t r i s - - - b o r a t ee l e f r o p h o r e s i sb u f f e r t r i - h y d r o x y m e t h y ia m i n o m e t h a n e u n w e i g h t e dp a r i - g r o u p , a r i t h e m e t i ca c e r a g e s 5 - b r o m o - 4 - e h l o r o - 3 - i n d o l y l 1 3 d g a l a e t o s i d e 中文全称 扩增片段| 王= 度多态性 氦苄青霉索 接头引物 缩短的通h j 扩增引物 碱基对 互补d n a 十六烷基二乙基溴化馈 双蒸水 焦碳酸二乙脂 脱氧核苷三磷酸 演化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基硫代1 3 d 、r 乳糖茁 锚定简单重复序列 千碱基对 l b 培养基 信使r n a 乙酸钠 光密度 多聚酶链式反廊 等电点 聚乙烯毗咯烷酮 聚乙烯聚吡咯烷酮 e d n a 末端的快速扩增 随机扩增多态性d n a 限制性片段k 度多态性 r n a 酶 反转录p c r 十二烷基磺酸钠 简单重复序列 硼酸电泳缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 非加权类平均距离 5 澳4 氯3 吲哚b d i i ，乳糖萤 福建农林大学硕士学位论文h 鬲 柑桔( c i t l w ss p ) 属于热带、 心和遗传变异中心，具有桔、柑、橙、 源十分丰富。 前言 亚热带的常绿果树。我国是世界相桔的起源中 金柑、柚、枳等多种柑桔食药用种类，品种资 福建，地处我国东南沿海，属亚热带海洋性季风气候区，适宜各类柑桔生长，是 我国柑桔主要产区之一。1 9 5 8 1 9 5 9 年，省农业厅组织进行全省果树品种资源调查， 查清全省柑桔品种资源有3 属1 3 个种，约有4 0 0 多个品种品系。近4 0 年我省引进了 大量的柑桔种类，为丰富柑桔产业种类和品种更新作出很大的贡献。由于柑桔种属间 可以广泛的受精能育性以及长期的自然杂交等原因，造成至今在丰甘桔分类的概念上仍 处于争论之中。杂柑作为柑桔的杂交后代，其亲缘关系也更加的复杂，有人称杂柑是 2 l 世纪柑桔发展中最重要的一类。由于杂柑类具有很大的发展潜力，部分品种现在已 经开始作为区域性的换代品种推广种植，为进一步开发利用这类种质，必须对其遗传 多样性进行深入研究。目前，在柑桔上应用较为广泛的分子标记有r a p d 、r f l p 、a f l p 、 s s r 、s c a r 、i s s r 和p c r r f l p 等，其中，r a p d 分子标记技术，因其优点并能在亲缘关 系较近的亲本中放大出不同类型，对难于区别的品种间的差异，可望用r a p d 鉴别。 本实验利用r a p d 技术，对从福建各地所广泛采集的各种柑桔种质材料进行了鉴定 分析，并探讨了它们之间的差异和亲缘关系，使我们对柑桔的遗传多样性及其之间的 亲缘关系也有了更进一步的认识，为柑桔果树的遗传进化、分类、亲本选配、杂种优 势预测、品种鉴定、遗传育种及种质资源的保护和利用提供了分子水平的依据和背景 资料。其中，对一些来历不明的杂柑品种的亲缘关系的鉴定分析，使我们对其遗传背 景、起源、亲缘关系及其利用价值也有了一定的认识，也为进步开发利用这类种质 提供了分子水平的依据和背景资料。 l e a f y 同源基因是从拟南芥中克隆出的花分生组织特性( f l o r a lm e r i s t e m i d e n t i t y ) 基因，是决定营养生长向生殖生长过渡的一个关键基因。该基因发生突变 后拟南芥的无限花序转变成了无限伸长的次生枝；而使该基因在3 5 s 启动子调控下过 量表达，则能使花期提早和使所有的侧枝转变为单生花。因此，被认为与启动花芽发 育的遗传控制有关。 龙眼( d i m o c a r p u sl o n g a n ) 是我国较重要而有特色的一种亚热带木本果树，也是 福建省主要种植的果树之一。龙眼花芽分化好坏与龙眼产量密切相关，同时，龙眼生 产中存在“大小年结果”的现象，“小年”的产量往往不及“大年”的半，甚至几近 绝收，严重影响龙眼生产的发展和果农生产的积极性。造成龙眼“大小年”的原因是 4 福建农林大学硕士学位论文前言 多方面的，但8 0 年代末以来，“冲梢”已被认为是主要原因( 林顺权等，2 0 0 1 ) 。对龙 眼成花逆转的原因和机理进行研究，有助于探索克服“冲梢”的方法和途径。已有报 道从内源激素( 苏明华等，1 9 9 7 ) 、树体营养( 王纪忠，2 0 0 4 ) 、温度和湿度( 温福光， 1 9 9 4 ) 等方面对龙眼成花逆转的原因进行了研究，研究者们也提出了一些龙眼成花逆 转的调控方法( 刘国强等，1 9 9 5 , 庄伊美等，1 9 9 5 ) ，但仍欠深入。据_ _ _ e 纪忠( 2 0 0 4 ) 的调查，不同龙眼品种发生成花逆转的难易存在差异，龙眼成花逆转不仪受环境因素 的控制，也与遗传因子有关。对于龙眼开花和成花逆转分子生物学研究刚刚起步，因 此，对龙眼开花和成花逆转的研究有必要深入到分子和基因水平。 本实验克隆了龙眼l f y c d n a 和d n a 的基因序列片段，并都已经在g e n b a n k 中登 陆：用r t - - p c r 的方法对此基因在龙眼正常花芽分化过程以及“冲梢”逆转成的营养 芽中的表达情况进行了初步研究，使我们对龙眼中f y 同源基因的功能有了初步的了 解，为进一步从分子水平研究龙眼开花和成花逆转的机理奠定的基础；此外，本实验 还克隆得到了龙眼l f y3 7 一端的基因序列，为进一步得到此基因的全长作了良好的铺 垫。 福建农林大学硕士学位论文 第。一章研究的进展和意义 第一章研究的进展和意义 1 福建柑桔种质的r a p d 分析 1 1 柑桔概况 柑桔( c i t r u ss p ) 属于热带、亚热带的常绿果树。我国是世界相桔的起源中心 和遗传变异中心，具有桔、柑、橙、金柑、柚、枳等多种柑桔食药用种类，品种资源 十分丰富。 柑桔主要分布在南亚热带、中亚热带和北亚热带，热带地区仅有少量栽培。据研 究，柑桔起源于我国云贵高原，途经长江而下，传向淮河以南、长江下游，直到岭南 地区。现在，柑桔栽培遍及五大洲，而以巴西、美国、中国、日本、西班牙、意大利、 摩洛哥、墨西哥、以色列、南非、阿尔及利亚、埃及、希腊、土耳其、阿根廷、印度、 澳大利亚的栽培蕊积和产量居多。我国的柑桔产区主要集中在北纬2 0 。3 3 。之间、 海拔1 0 0 0 米以下的地域，2 0 个省( 市、区) 均有柑桔分布，其中共有柑桔生产县( 市) 9 5 0 多个。2 0 0 4 年我国柑桔总产量1 4 4 8 2 万t ，主要集中在长江流域的浙、赣、湘、 鄂、川、渝等六省( 市) 和闽、粤、桂省( 区) 九地。柑桔是我国南方主要种植的果 树之一，在我国南方果树业中占有非常重要的地位。 1 1 1 福建柑桔种质概况 福建地处我国东南沿海，属亚热带海洋性季风气候区，适宜各类柑桔生长，是我 国柑桔主要产区之一，南宋梁克家撰三山志记载，福建柑桔有柑类8 种、桔类8 种、橙类6 种和香橼子等。明黄仲昭八闽通志记载福州一带柑、桔、柚、香橼、 金桔等1 2 个品种，漳州一带柑4 种、桔6 种及香橼、橙、金豆等。1 9 5 8 1 9 5 9 年， 省农业厅组织进行全省果树品种资源调查，查清全省柑桔品种资源有3 属1 3 个种，约 有4 0 0 多个品种品系。甜橙类有雪柑、印子柑、夏橙、改良橙、锦橙和新引进的血橙、 哈姆林橙、脐橙；宽皮桔类有芦柑、福桔、桶柑、温州蜜柑、本地早、马鼻蜜桔、南 丰蜜桔、瓯柑等：柚类有坪山柚、文旦柚、瑁溪蜜柚、下河蜜柚、度尾蜜柚、四季柚、 渡口蜜柚、芦芝柚等；金柑类有金弹、金枣、金豆等：还有酸橙、葡萄柚、柠檬、木 黎檬、枸橼等零星种植；枳壳有许多品系，有成片种植，而且闽枳实的药用价值大于 川枳实和云贵枳实。 1 1 2 杂柑品种的现状及其意义 杂柑，是柑桔属间种间天然杂交或人工杂交的后代。由于其综合了双亲的优点， 兼有橙、桔、柚等的风味，其品质优、营养丰富、丰产性好、熟期不同、抗病虫且易 剥皮，部分品种还兼有多种疗效作用等特性，鲜食加工兼用，适应性强。现在在各柑 6 福建农林大学硕士学位论文第一章研究的进展和意义 桔产区均有栽培，生产上应用较多的杂柑是甜橙、宽皮柑桔类和柚类问的杂种，主要 有清见、不知火、天草( 象山红) 、春见、宫内伊予柑、秭归等桔橙，以及诺瓦、麻坡、 常山胡柚等桔柚。 杂柑在我国柑桔品种结果调熬中，可以在调整品种熟期结构、调整加工鲜食品种 比例、增加果实风味特色等方面起到重要的调节和搭配作用，将成为局部地区的特色 主栽品种，同时也将成为鲜食柑桔优势区域和加工柑桔优势区域的重要调节和搭配品 种。因此，被视为2 1 世纪柑桔主要研究和推广的种群，特别是中国加入w t o 后，加快 种植业结构和水果内部品种结构优化调整是当前面临的主要任务之一。有人称杂柑是 2 1 世纪柑桔发展中最重要的一类。由于杂柑类具有很大的发展潜力，部分品种现在已 经开始作为区域性的换代品种推广种植。 1 1 3 柑桔分类在国内外的研究现状 柑桔分类，是栽培和利用柑桔果树的一项重要的学问和技术。从我国( 西晋博 物志、唐书本草拾遗、南宋桔录等) 古籍中已有描述柑桔品种的特性的记载。 对柑桔品种的鉴定，以往采用比较植株的形态、果实的形态特征，并结合细胞学 和生理生化特征的方法。随着电子显微技术、电泳技术、细胞学技术等的发展及其在 柑桔研究中的应用，大大扩展了柑桔种质研究的深度和广度。i g l e s i a 等首先利用 p o x 和e s t 同工酶分析来鉴定柑桔杂种。此后又有不少学者利用多种同工酶进行柑桔 分类、亲缘关系和杂种鉴定等研究；叶萌民等。1 应用电镜扫描技术，从孢粉学角度讨 论了柑桔类的起源与进化；梁国鲁“1 和魏文娜等( 1 9 8 8 ) 从细胞学角度对若干种类柑 桔的起源、进化和亲缘关系作了阐述。 近年来，随着分子生物学的发展，开发了一类基于d n a 变异的分子标记。用分子 标记技术可在d n a 水平上提供大量的遗传信息，引用这些信息对柑桔品种进行研究， 可以进行有效的鉴别。目前，在柑桔上应用较为广泛的分子标记有r a p d 、r f l p 、a f l p 、 s s r 、s c a r 、i s s r 和p c 肛r f l p 等。这些分子标记在柑桔上的应用主要有以下几方面： 遗传多样性研究、亲缘关系分析、遗传图谱构建、体细胞杂种鉴定、基因作图等。r a p d 分子标记技术，因其优点并能在亲缘关系较近的亲本中放大出不同类型，对难于区别 的品种间的差异，可望用r a p d 技术进行鉴别。 i 2r a p d 技术及其在柑桔中应用的研究进展 1 2 ir a p d 技术及其现状 r a p d ( r a n d o ma m p l i f l e dp o l y m o r p h i cd n a ) ，即随机扩增多态性d n a ，是1 9 9 0 年由美国杜邦公司科学家j g k w i l lj a m s 和加利福尼亚生物研究所j w e l s h 分别领导 的2 个研究小组几乎同时发展起来的一种分子标记技术“1 ，是基于多聚酶链式反应 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r ) 技术的一种分子标记技术，利用一系列人 福建农林大学硕士学位论文 第章研究的进展和意义 工合成的碱基随机排列的寡聚核营酸单链( 通常8 l o b p 核苷酸) ，对生物的基因组 d n a 进行p c r 扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺( p a g e ) 或琼脂糖凝胶电泳分离，经溴 化乙锭( e b ) 染色或放射自显影来检测扩增产物d n a 片段的多态性，d n a 片段的多态 性反映了基因组相应区域的多态性。 单个引物检测d n a 多态位点数量有限，但多个引物或引物组合，则可检测模板d n a 几乎所有的位点”_ 7 1 。 1 2 】1r a p d 技术的优点及其应用的国内外研究进展 r a p d 技术可以在没有任何分子生物学基础信息的情况下，进行d n a 多态性分析； 操作简单易行，不需要克隆制备、同位素标记及s o u t h e r n 印迹等工作；所需d n a 样品 量少( n g 级) ，引物没有特异性，分析速度快，多态性丰富、检测密度高、经济快捷、 短期内即可获得大量的遗传标记；在物种、个体之间可以表现出多态性，而且克服了 多位点酶电泳条带少和r f l p 操作技术复杂的弊端；同时，r a p d 还避免了使用放射性 同位素。因而，近年来在果树品种资源鉴定方面得到了广泛的应用。 国外从1 9 9 3 年就开始将r a p 9 技术用于植物品种的鉴别中，已成功的应用于苹果、 葡萄、猕猴桃、桃、香蕉、柑桔、杏以及番荔枝、柿、草莓、悬钩子、柱果等”。1 ”经济 价值比较高的果树树种中，在保护育种者的权益方面很有帮助；国内学者利用r a p d 技术对枣、葡萄属、梨属、柑桔等珊1 3 1 多种果树树种进行了研究。普遍认为r a p d 分析 可以达到对果树不同种质资源进行鉴定的要求。 1 2 1 2r a p d 技术的基本步骤及其反应条件的优化 r a p d 技术的反应程序主要包括3 个基本步骤：一是目的材料的d n a 提取，提取方 法因材料品种及组织部位的不同而有差异；二是模板d n a 扩增体系的构建及p c r 扩增； 三是扩增产物的凝胶电泳分析o “。 在进行r a p d 研究时，应设计实验浓度梯度，进行适宜的d n a 浓度的选择，d n a 模 板分子在l o k b 以上时不会影响扩增结果：m 9 2 + 浓度是r a p d 反应中的重要限制因子， 目前较为一致的看法是2 0m m o l l 的终体积浓度可获得较好实验结果；d n t p s 最佳浓 度在1 0 0 2 0 0 州之间：弓i 物g + c 含量高于6 0 ，对r a p d 有较好作用；t a qd n a 聚合 酶也需要进行浓度梯度选择，但一般范围在0 5 2 0u 之间，不同商家的酶也会对同 一实验有影响，需要对其进行纯度检测。p c r 反应体积大于2 5 儿易获得好的重复结 果 退火温度是影响r a p d 反应最重要的条件之一，并具有相对的灵活性，是优化r a p d 反应的重要控制措施，为了更加有效快速鉴定并节约时间，可对退火温度及其热循环 数等反应程序进行优化。另外，不同型号的p c r 仪对r a p d 结果会有一定的影响，需要 优化反应程序，在同一实验中应尽量使用同一台或同型号的p c r 仪，有利于结果的 重复”卿。同时。由于r a p 9 标记技术使用的是随机引物，当对大量实验材料进行研究 福建农林大学硕士学位论文第一章研究的进展神i 意义 时，往往首先要对引物进行筛选啪1 。 - 二 l 2 2r a p d 技术存在的问题及其解决方法 r a p d 技术源予p c r 技术，虽然继承了p c r 技术的优点，但同时也保留了p c r 固有 的缺陷。 首先，易产生假阳性带。可能来源于相近的非特异性扩增产物削的结合或异源双 链的形成，这些假带通过重复两次或两次以上就可以排除。 其次，重复性和稳定性较差。”。在遗传多样性研究中，重复性和稳定性一直是人 们争论的问题。m 9 2 + 浓度、引物浓度、退火温度、p h 值大小等诸多因素都会影响实验 的结果。其中，退火温度的影响较大，较低的退火温度允许适当错配，扩大了引物在 基因组中配对的随机性；而较高的退火温度虽可提高配对的专一性，却影响引物与模 板的结合程度。前者提高了扩增的检测效率，却会影响重复性：后者能够较好的保证 重复性，却会降低扩增的检测效率。因此，在对果树品种进行r a p d 分析之前，要对 r a p d 反应条件反复进行优化实验，建立标准化的反应体系“，以得到令人信服和可靠 的结果。 第三，r a p d 过于灵敏。r a p d 一般为显性标记，不能识别杂合子位点，有时会使遗 传分析变得复杂化。”。许多的实验结果还证实，r a p d 对反应条件对m g 浓度、基因组 d n a 浓度、t a qd n a 聚合酶浓度和温度条件等的改变极为敏感，稍有改变便影响产物的 重现。因而，采用同一的p c r 反应体系，严格控制反应程序，在同一台p c r 仪上进行， 同时要做到操作规范，就可获得重复性高的r a p d 标记同时，在数据统计时最好只统计 有明显多态性的主带，忽略弱带，从而提高结果的准确性。 此外，r a p d 标记有时不能依照预期的遗传样式，在遗传多样性研究中运用时应当 非常谨慎，还需注意以下几个问题： ( 1 ) 适用的局限性：r a p d 在亲缘关系很相近的物种之间，其合成的谱带也可能 存在差异，因此需要用大量的随机引物重新进行筛选鉴定，同时，r a p d 在种间或属间 的变异水平也很高，取样代表性也是一个非常值得注意的一个问题，柑桔类就属于这 种情况。 ( 2 ) 弱带的处理：弱带的形成有多种原因，处理方法不尽相同。重复性好的弱带 可以记录，但退火温度稍高就会影响其稳定性；重复性不好( 无规律出现) 的弱带可 能是由非专一性扩增或其他人为因素造成的，不能记录。 ( 3 ) 位点分析：位点的取舍不能仅根据带的强弱，重复性好是最重要的指标。 1 2 3r a p d 技术在柑桔育种研究中的应用 r a p d 技术已经在柑桔品种鉴定分析、遗传变异分析、亲缘关系分析及分类研究、 o 福建农林火学硕士学位论文第一章研究的进展利意义 基因连锁图谱的构建和体细胞杂种、嵌合体及珠心苗与合子苗的鉴定等研究领域也得 到了广泛的应用。 1 2 3 1 品种鉴定与遗传变异分析 对柑桔品种鉴定，o m u r a 等”于1 9 9 3 年发现温州蜜桔的r a p d 带型接近中国宽皮 柑桔，雨与日本原产的立花桔差异较大，说明温州蜜桔起源于中国。陈力耕等o 采用 r a p d 技术并结合品种表型性状特征和抗寒性，对5 个主要柑桔种类进行分析结果推断 出胡柚是由宽皮桔、柚和甜橙重复进行自然杂交所产生的杂柑类品种。采用r a p d 技术 对柑桔的遗传变异的分析，目前也已进行了一些研究。s u g a w a r a 等”1 1 对4 个柑桔嵌合 体进行r a p d 分析表明，嵌合体含有2 个亲本的特征谱带，朋娜、大三岛脐橙是华盛顿 脐橙的芽变，葡萄柚品系马叙是邓肯的珠心变异，星路比则是邓肯经几次变异和热中 子辐射而来的。王三红等。5 1 采用r a p d 技术，对刘本橙( 刘勤光本地早) 代代及其 3 个实生后代进行鉴定，得出3 株实生苗均为珠心苗的结论。钱吉等。对激光诱导产 生的无核沙田柚( 处理) 及未经激光处理的有核沙田抽( 对照) 进行了r a p d 分析，结 果表明激光诱变植株，存在d n a 分子水平上的差异。谢永红等。证实了抗碱枳砧与普 通枳砧在d n a 水平上存在较大的差异。仲山民等1 对常山胡柚的1 2 个优良无性系及7 个优株之问进行了r a p d 分析，表明目前所选的常山胡柚优良无性系及优株之间在分子 水平上并无什么差异，部分经济性状( 多基因) 的综合变化，r a p d 技术无法分辨出差 异。 1 2 3 2 亲缘关系分析及分类研究 由于柑桔属间种间广泛的受精能育性和长期的自然杂交等原因，目前对于柑桔的 亲缘关系及其分类仍需进行研究。 王三红等o ”采用r a p d 技术，筛选出了能在朋娜、大三岛二个脐橙品系和马叙、星 路比二个葡萄柚品系上分别扩增出清晰带型的引物，同时找到了能在朋娜和大三岛、 马叙和星路比上扩增出差异的引物。张太平等。”对柚的主要品种及柚的1 个野生近缘 种云南红河橙、1 个栽培近缘种葡萄柚共7 9 个样品的总d n a 进行p c r 扩增，以 n t s y s p c ( v e r s i o n1 8 0 ) 软件计算样品间的j a e c a r d 遗传相似系数，并进行u p g m a 聚 类分析，结果表明，野生近缘种云南红河橙及栽培近缘种葡萄柚与柚3 个种种内聚合 良好，种间差异明显，为柚的物种分类奠定了遗传学基础。此外，还对酸柚、沙田柚、 文旦柚和泰国柚共4 个品种的柚类进行了r a p d 标记的引物筛选研究，计算出了样品间 的相似系数和遗传距离，并对遗传距离进行了u p g m a 聚类分析，论证了利用所筛选出 的引物对柚类进行r a p d 标记研究的可行性和可靠性“。 1 2 3 3 基因连锁图谱的构建 r a p d 是一种显性标记，可以将基因定位于某一特定染色体上，以及测定基因在染 1 0 福建农林大学硕士学位论文第一章研究的进展年意义 色体上线形排列的顺序和距离。不但可以单独用于遗传图谱构建，也一。j 与其它标记方 法相结合构建遗传图谱。但构建遗传图谱要有适当大小的作图群体和大量能揭示亲本 多态性的遗传标记，在热带作物研究中，这方面的工作还不是很多。c a iq ( 1 9 9 4 ) 用柑桔属间杂种的b c ，代( 回交第l 代) 群体构建了由r a p d 、r f l p 和同工酶标记组成 的包括9 个连锁群、总长1 1 9 2 c m ( c e n t i - m o r g a n ，厘摩) 的分子连锁图，其平均密度 为7 5 c m 对标记，覆盖了整个基因组的7 0 8 0 ”“。 1 2 3 4 柑桔体细胞杂种、嵌合体及合子苗与珠心苗的鉴定 r a p d 技术可在不清楚目的基因序列的情况下对体细胞杂种进行鉴定，只需两亲本 作对照，根据d n a 扩增片段的多态性即可确定体细胞杂种的性质，而且可将r a p d 特异 带作为遗传标记，进一步分祈杂种后代的分离情况。 利用r a p d 技术对体细胞杂种的鉴定，国内外都有报道。史永忠等”“通过优化反应 条件，建立起了柑桔的r a p d 分析体系，并成功地应用于体细胞杂种的鉴定。用于果树 的也很多，肖顺元等“”利用改进的d n a 提取方法，从v o l k a m e r 柠檬和酸橙( c a u r a n t i u ml ) 及其原生质体杂种植株的叶片中抽提总d n a ，进行的r a p d 分析结果表 明，随机选取的1 5 个引物中，有1 0 个可单独或与其它引物一道鉴定这一组合的体细 胞杂种。与形态学性状观察、同工酶及d n a 杂交分析等方法相比较，r a p d 分析是一种 可在试管苗期即可直接、准确、快速鉴定柑桔体细胞杂种的方法。s u g a w a r a 等”用 1 2 一m e r 的引物分离鉴别了4 个柑桔周缘嵌合体，嵌合体含有两个亲本的特征谱带。 珠心胚现象使柑桔合子苗与珠心苗在苗期很难区别，给柑桔的杂交育种带来障碍。 王三红等。5 1 采用r a p d 技术成功地鉴别出刘本橙与亲代杂交后代的珠心苗，在多个引物 的扩增产物中珠心苗与母本完全一样，未出现特异带。l u r o 应用单一引物对 v o l k a m e r 柠檬( 口t r u sv o l k a m e r i c a n at e n p a s q ) 的1 9 株实生后代进行的p c r 扩增结果表明，珠心苗产生的r a p d 带型与母本完全一致，而杂交的合子苗出于引进了 外源基因，使谱带有所增加，自交产生的含子苗则使谱带减少，从而能准确地将珠心 苗与台子苗区分开。 1 3 福建柑桔种质的r a p d 分析研究的意义 福建有丰富的柑桔种质资源，除了传统的优良品种，如福桔、蕉柑等外，还有不 少特殊的种质，如苏柑、瑭溪蜜柚和四季柚等。近4 0 年引进了大量的柑桔种类，为丰 富柑桔产业种类和品种更新作出了很大贡献，但是这些种质往往来历不明，对其遗传 背景、起源、亲缘关系及其利用价值缺乏研究，影响了进一步开发利用。 因此，对分布在福建各地的柑桔种质所进行的亲缘关系鉴定分析，使我们这些柑 桔种质的遗传多样性及其之间的亲缘关系有更进一步的认识，为柑桔果树的遗传进化、 分类、亲本选配、杂种优势预测、品种鉴定、遗传育种及种质资源的保护和利用提供 福建农林大学硕士学位论文 第一章研究的进展和意义 分子水平的依据和背景资料，进而指导柑桔类果树在食用和药用上选择育种工作和果 品生产实践。 2 龙眼l e a f y 基因克隆和表达的研究 2 1 花的发育和成花基因 2 1 1 花的发育过程 植物的花器官具有基本的四轮结构，由外至内依次是花萼、花瓣、雄蕊和心皮。 根据花发育过程的特点，可以将花的发育分为三个阶段“：( 1 ) 诱导( i n d u c t i o n ) ， 由植物自身因子和环境因子诱导从营养生长向生殖生长转变，形成花序分生组织 ( i n f l o r e n s c e n c em e r i s t e m ) ；( 2 ) 引发( e v o c a t i o n ) 和花的发端( i 1 3 i t i a t i o n ) ， 花序分生组织逐步转变为花的分生组织( f l o r a lm e r i s m ) ，再分化形成花器官原基； ( 3 ) 花器官原基发育为成熟的花器官“”1 。 2 1 2 成花基因 随藿植物分子生物学的逐步发展和模式植物的建立，1 9 9 0 年，y a n o f s k y 等在拟南 芥( a r a b i d o p s i sc