（内科学专业论文）磁性纳米四氧化三铁颗粒对藤黄酸诱导的白血病细胞凋亡效应的影响.pdf

e f f e c t so f m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e o na p o p t o s i si n d u c e d b yg a m b o g l e u k e m i ac e l l s at h e s i ss u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i t y o ff e 3 0 4 l ca c l di n l f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro fm e d i c i n e b y l i a n g y i q i o n g s u p e r v i s e db y p r o f e s s o rc h e nb a o a n s c h 0 0 1o fc l i n i c a lm e d i c i n e s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a p r i l2 0 1 0 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文足我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：期：2 0 1 0 0 5 2 3 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生 院办理。 研究生签名：差篁遂导师签名：日期：2 0 1 0 一0 5 2 3 中文摘要 中文摘要 磁性纳米四氧化三铁颗粒对藤黄酸诱导的白血病细胞 凋亡效应的影响 东南人学医学院内科学血液专业 硕士研究生梁艺琼导师陈宝安 目的本课题旨在观察磁性纳米四氧化三铁颗粒 m a g n e t i cn a n o p a r t i c l eo ff e 3 0 4 ， m n p ( f e 3 0 4 ) 对藤黄酸( g a m b o g i ca c i d ，g a ) 诱导的k 5 6 2 和u 9 3 7 白血病细胞凋亡效应的 影响，并通过测定b c l - 2 ，b a x ，c a s p a s e - 3 ，n f k b 和s u r v i v i n 的转录与表达情况探讨可 能的机制，为临床白血病的治疗提供一定的理论依据。 方法( 1 ) 应用四甲基偶氮哗蓝( m t t ) i ：l 色法分析币独及联合应用m n p ( f e 3 0 4 ) 和g a 对 k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞的细胞毒作用。( 2 ) 应用流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 分别检测单 独及联合应用m n p ( f e 3 0 4 ) 和g a 后k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞的凋亡率。( 3 ) 采用普通光学显微 镜和荧光显微镜观察药物作用前后k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞的形态特征。( 4 ) 采用实时定量逆 转录聚合酶链反应( r e a lt i m er e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r e a lt i m er t - p c r ) 和蛋白免疫印迹法( w e s t e r nb l o t ，w b ) 检测药物作用前后b c l 2 ，b a x ，c a s p a s e 3 ，n f k b 和s u r v i v i n 的m r n a 和蛋白水平。 结果( 1 ) m t t 结果显示： g a 对k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞的抑制作用有浓度和时问依赖性， 作用4 8 h 的i c s o 值分别为1 1 3 m g l 和0 4 1 m g l ；( 窑) 2 0 m g l 浓度以下的m n p ( f e 3 0 4 ) 对 u 9 3 7 细胞无明显生长抑制作用，与空白对照组相比差异无统计学意义( 矿0 0 5 ) ； g a 与5 2 0 m g lm n p ( f e 3 0 4 ) 联合应用后，k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞的生长较单用g a 不同程度受 抑，差异有统计学意义仞 o 0 5 ) ；g a 单用及联合 m n p ( f e 3 0 4 ) 应用时k 5 6 2 细胞的凋亡率分别为3 5 2 0 社3 3 7 及4 8 7 士1 4 7 ，两组问 差异有统计学意义仞 o 0 5 ) ； g a 单用及联合m n p ( f e 3 0 4 ) 应用时u 9 3 7 细胞的凋亡率 东南人学硕f j 学位论文 分别为3 5 0 5 0 o _ - 1 = 3 2 5 及5 4 2 5 + 2 4 5 ，两组问差异有统计学意义( 胯o 0 5 ) 。( 3 ) d , 齐l j 量 g a ( 0 6 m g l 、0 2 r a g l ) 分别联合1 0 m g lm n p ( f e 3 0 4 ) 作用于k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞4 8 h 后， 光镜下均可见细胞胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡：形态改变， 荧光显微镜下均可见大量细胞染色质高度浓聚并边缘化、核碎裂、碎片状非均质荧光增 强等凋亡细胞核荧光改变；而大剂量g a ( 6 m g l ) 单独作用3 ：- k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞4 8 h 后 细胞呈现胞体高度肿胀、胞膜破裂、内容物溶解并释放等坏死改变。( 3 ) m n p ( f e 3 0 4 ) 与 g a 联合作用于k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞4 8 h 后，b c l 2 、n f r b 和s u r v i v i nm r n a 和蛋白水 平明显下调，b a x 和c a s p a s e 一3m r n a 和蛋白水平明显上调，与单用g a 相比差异有统 计学意义( 萨0 0 5 ) 。 结论( 1 ) m n p ( f e 3 0 4 ) 单独处理k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞对细胞f 常生长无明湿影响，且不能 有效促进k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞凋亡；( 2 ) g a 与m n p ( f e 3 0 4 ) 联合应用后可发挥更大的细胞 毒作用；( 3 ) m n p ( f e 3 0 4 ) 能增强g a 诱导k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞凋亡的效应；( 4 ) m n p ( f e 3 0 4 ) 与g a 联合处理k 5 6 2 和u 9 3 7 细胞4 8 h 后，细胞出现典型的凋亡特征，不同于大剂量 化疗导致的肿瘤细胞坏死；( 5 ) g a 联合m n p ( f e 3 0 4 ) 诱导k 5 6 2 和u 9 3 7 凋亡可能与b a x 和c a s p a s e 3 转录与表达上调，b c l 2 、n f k ：b 和s u r v i v i n 转录与表达下调有关。 关键词k 5 6 2 细胞；u 9 3 7 细胞；磁性纳米四氧化三铁颗粒；藤黄酸；凋亡 英文摘要 a b s t r a c t e f f e c t so fm a g n e t i c n a n o p a r f i c l eo ff e 3 0 4o na p o p t o s i si n d u c e db y g a m b o g i ca c i di nl e u k e m i ac e l l s m e d i c a lc o l l e g eo fs o u t h e a s tu n i v e r s i t y p o s t g r a d u a t el i a n gy i q i o n gs u p e r v i s o rc h e nb a o a n o b j e c t i v e t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lb e n e f i to fc o m b i n a t i o n t h e r a p yw i t hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l eo ff e 3 0 4 【m n p ( f e 3 0 4 ) 】a n dg a m b o g i ca c i d ( g a ) o n l e u k e m i ac e l l sa n dt op r o v i d et h e o r e t i ce v i d e n c ef o ram e t h o do fn e wl e u k e m i at h e r a p yi nt h e c l i n i c a la p p l i c a t i o n m e t h o d sc e l lp r o l i f e r a t i o nw a sd e t e r m i n e db ym t ta s s a y t h ea p o p t o s i sp e r c e n t a g eo f k 5 6 2a n du 9 3 7c e l l sw e r ea n a l y z e db yf c m m o r p h o l o g i c a lf e a t u r e sw e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p ea n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h et r a n s c r i p t i o n so fb c l 一2 ，b a x ，c a s p a s e - 3 ，n f - k b a n ds u r v i v i nm r n aa n de x p r e s s i o n so fp r o t e i nw e r ed e t e c t e db yr e a lt i m er t - p c ra n d w e s t e r nb l o t ，r e s p e c t i v e l y r e s u l t sg ac o u l di n h i b i tt h es u r v i v a lo fk 5 6 2a n du 9 3 7c e l l si nad o s e a n dt i m e d e p e n d e n t m a n n e r s t h ea d d i t i o no fm n p ( f e 3 0 4 ) d i de n c h a n c et h ei n h i b i t i o no fg at ok 5 6 2a n du 9 3 7 c e l l s ，w h i l em n p ( f e 3 0 4 ) a l o n ec o u l dh a r d l yi n h i b i tt h e i rp r o l i f e r a t i o n a n a l y s i so ft h e a p o p t o s i sp e r c e n t a g es h o w e dt h a tg ac o u l di n c r e a s et h ea p o p t o t i cp e r c e n t a g eo fk 5 6 2a n d u 9 37c e l l s ，w h i l em n p ( f e 3 0 4 ) a l o n eh a dn oe f f e c to nt h e a p o p t o s i sb u te n h a n c e d g a i n d u c e da p o p t o s i si nb o t hc e l l s a f t e rt r e a t e dw i t ht h i sc o m p o s i t ef o r4 8h o u r s ，t y p i c a l a p o p t o t i cf e a t u r e so fk 5 6 2a n du 9 3 7c e l l s ：c o n d e n s a t i o no fc e l l sa n dn u c l e a r , d i s i n t e g r a t i o n o fn u c l e a rc h r o m a t i na n da p o p t o t i cb o d yw e r eo b s e r v e db yl i g h tm i c r o s c o p e ；t h ec e l l s e m i t t i n gb r i g h tf l u o r e s c e n c ei n c r e a s e da n dd i s p l a y e dt h et y p i c a lp h e n o m e n ao fa p o p t o s i s i n c l u d i n gc h r o m a t i nc o n d e n s a t i o n ，n u c l e o l u sp y k n o s i s ，a n dn u c l e a rf r a g m e n t a t i o nu n d e rt h e f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h el e v e lo fb a xa n dc a s p a s e 3m r n aa n dp r o t e i nw e r e u p r e g u l a t e dw h i l et h el e v e lo fb c l - 2 n f k ba n ds u r v i v i nm r n aa n dp r o t e i nw e r e d o w n r e g u l a t e di nk 5 6 2a n du 9 3 7c e l l sw h e nt r e a t e dw i t ht h ec o m p o s i t ef o r4 8h o u r s c o n c l u s i o n s m n p ( f e 3 0 4 ) c o u l de x e r tap o t e n tc y t o t o x i c i t yo fg at ok 5 6 2a n du 9 3 7c e l l s 东南人学硕j j 学位论文 a n d s y n e r g i s t i c a l l ye n h a n c eg a i n d u c e da p o p t o s i si nb o t hc e l l s t h es y n e r g i s me f f e c to ft h a t c o m p o s i t eo na p o p t o s i sm a yo w et ot h ed o w n r e g u l a t i o no fb c l 一2 ，n f - k ba n ds u r v i v i n m r n aa n dp r o t e i na n du p - r e g u l a t i o no fb a xa n d c a s p a s e 3m r n aa n dp r o t e i n ，t h u s d e m o n s t r a t i n gt h a tac o m b i n a t i o no fm n p ( f e 3 0 4 ) a n dg am a yb ep o s s i b l et od e v e l o pam o r e s u f f i c i e n ta n dl e s st o x i cm e t h o do fn e wl e u k e m i at h e r a p y k e y w o r d s k 5 6 2c e l l s ；u 9 3 7c e l l s ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l eo ff e 3 0 4 ；g a m b o g i ca c i d ； a p o p t o s i s 目录 目录 t l r l -，l _ 、， t 和p 3 8 磷酸化水平下降有关。 7 其他 高表达c m y c 可导致细胞失控性生长。急性早幼粒细胞白血病、乳腺癌、结肠癌、 胃癌等恶性肿瘤均出现c m y c 基因的扩增。郭青龙等【4 】研究发现，g a 能降低肝癌 s m m c 7 7 2 1 细胞株c m y cm r n a 和蛋白的表达，他们认为t r e t 启动予的c m y c 结合区是 g a 的一个作用靶点。 核孔蛋e t 8 8 ( n u p 8 8 ) 的高表达与肿瘤的关系极为密切，它能影响某些原癌基因或抑 癌基因表达产物的核质转运过程，使细胞发生癌变。至目前为止，已在多种肿瘤细胞系 和原发肿瘤组织中检测剑n u p 8 8 高表达。舒文秀掣3 5 ，5 1 1 研究发现，g a 能诱导急性白血病 h l 6 0 及u 9 3 7 细胞n u p 8 8 的重新分布并下i g j n u p 8 8 的表达。 四、藤黄酸抗肿瘤作用特点 1 藤黄酸的作用靶点 目前认为，g a 的主要作用靶点是细胞膜表面的转铁蛋白受体( t r a n s f e r r i nr e c e p t o r , t f r ) 。t f r 是- - 种i i 型跨膜蛋白，在多种肿瘤细胞中过表达。g a 与t f r 结合能迅速触发胞 内信号引起肿瘤细胞凋亡。尽管t f r 是g a 的作用靶点，但g a 并非结合于t f r 的转铁位点 上，g a 和转铁蛋白分别结合于t f r 上不同的部位且并不相互竞争，因此g a 诱导细胞凋 亡为非铁依赖性的。另外，研列1 4 1 显示g a 能抑制膜表面t i r 的细胞内摄作用，t f r 表达 的下调会减弱细胞对g a 诱导凋亡作用的敏感性。 2 藤黄酸对肿瘤细胞的抑制有较高的选择性 体外研究表明，g a 对肿瘤细胞的抑制作用有较高的选择性。郭青龙等【6 1 体外研究 显示，g a 对人肝癌细胞株s m m 7 7 2 1 和q g y 7 7 0 1 有明湿的增殖抑制作用，州时对正 常人j l f ：组织细胞株l 0 2 作用相对较弱。通过进一步枪测碘标记的g a ( 佗5 i g a ) 与不同细 胞的结合活性，结果显示人肝癌细胞株s m m 7 7 2 1 的1 2 5 i - g a 结合活性明显高于诈常人 肝组织细胞株l 0 2 。 义献综述 3 藤黄酸在肿瘤组织中有较高的分布和较长的持续时问 郭青龙掣6 】通过高效液相色谱法( h p l c ) 检测g a 在荷瘤小鼠体内分布情况发现，静 脉注射给药后，g a 主要分布在小鼠肝、肺、肾、胃、肠及肿瘤组织中，给药2 4 0 m i n 及4 8 0 m i n 后，只能在小鼠移植瘤组织内检测到g a 分布。结果显示g a 在肿瘤组织中 有较高的分布和较长的持续时间。 4 藤黄酸在有效剂量范围内毒性小 体内研究结果表明g a 在有效剂量范围内毒副作用小，对t f 常的造血系统和免疫功 能无明显影响。郭青龙等【l8 】体内研究发现，静脉注射g a ( 8 ，4 ，2m g k 曲对荷瘤小鼠外 周血白细胞总数、血清溶血素及巨噬细胞吞噬能力均无明显影响，( 6 ，3 ，1 5m g k g ) 对 正常大鼠外周血白细胞总数、骨髓有核细胞数、体重、胸腺及脾脏也无明显影响，认为 g a 在有效剂量范围内对正常实验性动物的造血系统和免疫功能无明显影响。 五、藤黄酸的代谢与动力学 药代动力学研究f 5 2 】发现g a 经静脉给药能迅速从大鼠血浆消除( t l 2 = 1 5m i n ) ；给药后 g a 能广泛分布于大鼠体内，但主要分布于心、肝、肺、脾、肾、胃和肠，其中以肝脏 的分布最多；排泄实验的结果表明g a 主要以原型和代谢物的形式从胆汁中排泄，但粪 便中原型药物排泄较少，尿液中则未检测到原型药物。g a f i 甚迅速地在大鼠肝脏微粒体 被降解成代谢产物m i 和m 2 。m 1 是g a 的主要代谢产物，其形成依赖n a d p h 。参与g a 代谢的主要细胞色素p 4 5 0 ( c y p 4 5 0 ) 同分异构体为c y p l a 2 。 六、藤黄酸的临床应用 目前关于g a 的i 期和i i a 临床试验已经结束。i 期临床试验【5 3 】结果显示，单次给药剂 量7 0 m g m 2 时出现剂量限制性毒性，主要为肝功能损害和疼痛，其他不良反应有恶心、 呕吐、血管刺激等，最大耐受剂量为5 5m g m 2 。连续给药时不良反应有疼痛、恶心、呕 吐、转氨酶升高，均为i 。i i 。，但在6 0m e d m 2 ( 5 d ) 时转氨酶升高持续时间较长；疗效评 价结果为稳定和进展各占5 0 。i i 期临床试验【5 4 】结果显示，不良反应主要为胃肠道反应、 注射部位反应，不良反应评价为i o i i o ，无严重不良反应。研究过程中对生命体征无影 响，对骨髓、心、肝、。肾功能无明显影响。总体不良反应发生率为4 0 ；疗效评价：临 床缓解率6 。3 8 ，临床收益率6 8 0 3 。结论：g a 单药治疗晚期癌症显示出一定的抗肿 瘤作用，毒副作用轻微，耐受性良好，是一种值得进一步研究的抗肿瘤新药。 ： ，7 东南人学硕一l ：学位论文 七、展望 总之，g a 作为一种天然来源的抗肿瘤药，具有耐受性好，来源厂“泛，价格低廉等 特点，凭借其安全性、较广的抗瘤谱及令人满意的治疗效果，g a 在肿瘤治疗中展现了 较好的应用前景。对构效关系的深入研究使设计合成g a 衍生物类的药物成为可能。从 已有的g a 抗肿瘤机制来看，其作用机制与一般抗肿瘤药有一定的区别，说明g a 可以与 其他抗肿瘤药物联合使用，拓展了抗肿瘤治疗的手段。随着对其作用机制的深入研究以 及临床药理实验的开展，g a 有望应用于人类癌症的治疗和化学预防。 第部分材料j 方法 1 材料 1 1 细胞株及来源 第一部分材料与方法 k 5 6 2 ( 人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株) ：本实验室保存。 u 9 3 7 ( 人急性单核细胞白血病细胞株) ：本实验室保存。 1 2 主要器材 1 2 1 超净工作台( s w - c j i f d 型) ：苏州安泰空气技术有限公司 1 2 2c 0 2 恒温细胞培养箱：德国h e r a e u s 公司 1 2 3台式高速冷冻离一1 1 , 机：德国h e r a e u s 公司 1 2 4 台式高速普通离心机( t g l 1 6 c ) ：上海安亭科学仪器厂 1 2 5 低速自动离。1 1 , 机( l d 2 5 一z 型) ：北京医用离，t l , 机厂 1 2 6 混合纤维素微孔滤膜( o 2 2l a m ) ：上海医药工业研究所产品 1 2 7恒压恒流电泳仪：北京东方仪器厂 1 2 8 微量移液器及相应t i p s ( 1 0 、2 0 、1 0 0 、2 0 0 、1 0 0 0p l ) ：法国g i l s o n 公司 1 2 9s k 1 快速混匀器：常州国华电器公司 1 2 1 0 电热恒温水槽( d k 8 d 型) ：上海精宏实验设备有限公司 1 2 1 1 台式干燥箱( d g b l 2 0 0 0 2 型) ：重庆试验设备厂 1 2 1 2 普通冰箱：上海三菱冰箱 1 2 1 3 超低温冷冻冰箱：美国a s h e v i l l e 公司 1 2 1 4 精密p h 仪：上海电磁仪器厂 1 2 1 5 电子天平( b s l l 0 s 型) ：德国s a r t o r i u s 公司 1 2 1 6 恒温磁力搅拌器( 8 5 1 型) ：江苏国华仪器厂 1 2 1 7 旋涡混合器( r d a 8 5 1 型) ：上海环宇仪器厂 1 2 18 o l y m p u s c k 2 光学倒置显微镜：同本o l y m p u s 公司 1 2 1 9 o l y m p u s c x 2 1 生物显微镜：r 本o l y m p u s 公司 1 2 2 0 o l y m p u s 。b x 一6 0 荧光显微镜数码成像采集系统：f 本o l y m p u s 公司 1 2 2 l平板振荡器( 7 5 2 a 型) ：上海医用分析仪器厂 东南人学硕 ：学位论文 1 2 2 2 培养板( 9 6 孔，6 孔) ：n u n c 公司 1 2 2 3 流式细胞仪( f a c sv a n t a g es e 型) ：b i o - r a d 公司 1 2 2 4 三维摇床：l a b l i n e 器械公司 1 2 2 5 酶标仪：b i o r a d 公司 1 2 2 6d n a 凝胶成像系统：美国u v p 公司生产 1 2 2 7 稳压电源( p o w c r p a e2 0 0 ) ：b i o r a d 公司 1 2 2 8 i m a g e r m a s t e rv d s 图像分析仪：美国p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 1 2 2 9 紫外检测仪：上海天能公司 1 2 3 0 水平电泳槽：北京六一科学仪器厂 1 2 3 1r n a d n a 定量仪：g e n eq u a n ti i ，p h a r m a c i ab i o t e c h 公司 1 2 3 2r e a l t i m ep c r 扩增仪：l i g h t c y c l e ，r o c h e 公司 1 2 3 3 硝酸纤维素膜：h y b o n d r m e c l t m ，a m e r s h a ml i f es c i e n c e ，u k 1 2 3 43m m 滤膜：a m e r s h a ml i f es c i e n c e ，u k 1 2 3 5 垂直电泳槽：m i n i p r o t e a ni i ，0 7 5m m ，1 0w e l l ，b i o r a d ，u s a 1 2 3 6 半干转移槽：p h a r m a c l ab i o t e c h 产品 1 3 试剂 1 3 1r p m i1 6 4 0 培养基：美国g i b c ob r l 公司 1 3 2 羟乙基哌嗪乙磺酸( h e p e s ) ：美国g i b c ob r l 公司 1 3 3 小牛血清( b c s ) - 杭州四季青生物工程材料研究所 1 3 4 藤黄酸( g a ) ：连云港港康源药业有限公司馈赠，纯度9 6 1 3 5 磁性纳米四氧化三铁 m n p ( f e 3 0 4 ) ：东南大学生物医学工程系 1 3 6 四甲基偶氮唑盐( m t t ) ：s i g m a 公司 1 3 7 二甲基亚砜( d m s o ) ：美国f l u k a 公司 1 3 8 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：北京中山生物技术有限公司 1 3 9d a p i 染色液：上海碧云天生物技术有限公司 1 3 1 0 碳酸氢钠( n a h c 0 3 ) ：分析纯，上海试剂一厂 1 3 1l磷酸二氢钠：分析纯，上海试剂一厂 1 3 1 2 磷酸氢二钠：分析纯，上海试剂一厂 1 3 1 3 氯化钠：分析纯，南京化学试剂一厂 1 0 第一部分材料与方法 1 3 1 4 1 3 1 5 1 3 1 6 1 3 1 7 1 3 1 8 1 3 1 9 1 3 2 0 1 3 2 1 1 3 2 2 1 3 2 3 1 3 2 4 1 3 2 5 1 3 2 6 1 3 2 7 1 3 2 8 1 3 2 9 1 3 3 0 1 3 3 1 1 3 3 2 1 3 3 3 1 3 3 4 1 3 3 5 1 3 3 6 1 3 3 7 1 3 3 8 1 3 3 9 1 3 4 0 1 3 4 1 甲醇：分析纯，上海试剂一厂 无水乙醇：分析纯，南京化学试剂一厂 丙酮：分析纯，宝应化学试剂厂 异丙醇：分析纯，南京化学试剂一厂 氯仿：分析纯，南京化学试剂一厂 凯基a n n e x i nv f i t c 细胞凋亡检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司 二乙基焦磷酰胺( d e p c ) - s i g m a 公司 三羟甲基氨基甲烷( 嘶s ) ：p r o m e g a 公司 乙二胺四乙酸( e d t a ) s i g m a 公司 十二烷基磺酸钠( s d s ) - p r o m e g a 公司 溴化乙锭( e b ) ：s i g m a 公司 琼脂糖：中科院上海药物研究所 d n a m a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) ：广东东盛生物科技有限公司 6 x d n a 加样缓冲液( d n al o a d i n gb u f f e r ) ：广东东盛生物科技有限公司 t r i z o lr n a 提取液：g i b c o l 公司 r e a l t i m ep c r 试剂盒：t a k a r a 公司 g a p d h ( 2 0 5 b p ) 引物：t a k a r a 公司 b c l 一2 ( 4 5 2 b p ) ；j 物：t a k a r a 公司 b a x ( 11 4 b p ) 弓 物：t a k a r a 公司 s u r v i v i n ( 2 5 5 b p ) 弓i 物：t a k a r a 公司 n f k b ( 2 2 7 b p ) 弓1 物：t a k a m 公司 c a s p a s e - 3 ( 2 7 0 b p ) i j 物：t a k a r a 公司 w e s t e r nb l o t t i n g 试剂盒( p m t e i nd e t e c t o r t mw e s t e r nb l o tk i tb c i p n b ts y s t e m ) ： k p l 公司 蛋白提取试剂盒( n u c l e a re x t r a c tk i t ) ：a c t i v em o t i f 公司 蛋白定量测定试剂盒( m o d i f i e dl o w r yp r o t e i na s s a yk i t ) ：p i e r c e 公司 中分子量标准蛋白质( 1l8 0 ，8 6 0 ，4 7 0 ，3 4 0 ，2 6 0 ，1 9 0 k d a ) ：f e r m e n t a sl i f es c i e n c e 公司 s d s p a g e 次高分子量标准蛋白质：中科院上海生物化学研究所产品 丙烯酰胺：分析纯，南京化学试剂一厂 东南人学硕l ：学位论文 1 3 4 2 亚甲双丙烯酰胺：分析纯，南京化学试剂一厂 1 3 4 3 过硫酸铵( a p s ) ：分析纯，宜兴市第二化学试剂厂 1 3 4 4 p n q 甲基乙二胺( t e m e d ) ：p h a r m a c i ab i o t c c h 产品 1 3 。4 5 p - a c t i n ( p 一肌动蛋白) ( 4 2 k d ) ：a m r e s c o 产品 1 3 4 6 鼠抗人b c l 2 ，b a x ，c a s p a s e 一3 ，n f r b ，s u r v i v i n 抗体：福州迈新生物技术丌发 公司 1 3 4 7 碱性磷酸酶标记的羊抗鼠i g g 抗体( 2 0 0i - t g o 5m l ) - s a n t ac r u z 产品 1 3 4 8 脱脂奶粉：上海光明乳业股份有限公司 1 3 4 9 二硫苏糖醇：i n a l c o 公司 1 3 5 0 显色液：冠龙照相器材有限公司 1 4 试剂的配制 1 4 1细胞培养液 r p m i16 4 0 培养粉剂 1 0 4 9 h e p e s 4 8 9 n a h c 0 3 2 4 9 青霉素0069 链霉素 0 1 9 加双蒸水至8 0 0 m l 完全溶解，p h 值调为7 o 7 2 ，定容至10 0 0 m l ，用0 2 2i j m 混合纤维素微孔滤膜正压过滤除菌，每瓶9 0 m 1 分装后于2 0 ( 2 保存备用。用时加 入1 0 m l 小牛血清并使其终浓度为1 0 。 1 4 2 小牛血清：经3 7 解冻后，5 6 水浴3 0 m i n 灭活，小量分装，2 0 保存备用。 1 4 3 藤黄酸( g a ) ：以d m s o 溶解至5 m g m l ，小量分装，2 0 。c 保存备用，用时以 r p m i1 6 4 0 培养液稀释至所需浓度并确认d m s o 浓度低于0 1 。 1 4 4 磁性纳米四氧化三铁 m n p ( f e 3 0 4 ) ：由东南大学生物医学工程系提供，在使用前 将纳米粉粒用灭菌水溶解，超声混匀，制备成饱和溶液，小量分装，4 保存备用。 1 4 5 瑞氏染液：瑞氏染料1 9 加甲醇6 0 0 m l 将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中，加少量 甲醇，充分研磨使染料溶解，将己溶解的部分倒入棕色试剂瓶中，未溶解部分再 加少量甲醇淹没，直至染料完全溶解，甲醇全部川完为止。 1 4 6 4 多聚甲醛固定液：将4 9 多聚甲醛加入8 0 m lp b s 中，搅拌过夜或者搅拌过程 中微热直至固体全部溶解，定容至1 0 0 m l 。 1 ， 第一部分材料与方法 1 4 7o 5 me d t a ( p h 8 0 ) - e d t a l8 6 9 加入双蒸水5 0 m l ，搅拌器上激烈搅拌均匀，n a o h 调节溶液p h 值至8 0 ，用双蒸水定容至1 0 0 m l ，室温保存。 1 4 8 o 1 d e p c 水( 尤r n a s e 水) ：取1 0 m ld e p c 原液加入1 0 0 0 m l 去离子水中，剧烈 震荡混匀，3 7 。c2 h ，高温高压灭活d e p c ，4 保存备用。 1 4 95 0 x t b e 缓冲液 t f i s 1 0 8 9 硼酸 5 5 9 o 5 me d t a ( p h 8 0 ) 4 m l 用双蒸水定容至2 0 0 m l ，用时稀释5 0 倍。 1 4 1 07 0 乙醇：取7 0 m l 无水乙醇加入3 0 m l 双蒸水中混匀，4 c 保存备用。 1 4 1 17 5 乙醇：取7 5 m l 无水乙醇加入2 5 m 1 0 1 d e p c 水混匀，4 c 保存备用。 1 4 1 2 1 5 琼脂糖凝胶：称取0 3 9 琼脂糖溶于2 0 m l1 x t b e 溶液中，加热完全溶解，待 冷却至5 0 c 左右加入1 山( 1 0 m g m 1 ) 溴化乙锭溶液，使之弥散均匀，倒入插好样 品梳的水平电泳槽制胶板中，胶凝固3 0 m i n 后拔出梳子，将胶板置于电泳槽中， 加入lx t b e 溶液，使液面高于胶面1 m m 备用。 1 4 1 3 1 0 s d s ( w v ) ：称取s d s l o g ，溶于5 0 m l 温热的去离子水中，搅拌使之充分溶解， 定容至1 0 0 m l ，室温保存。 1 4 1 40 1 s d s ：1 0 s d s l m l j f l 入去离子水9 9 m l ，4 c 保存。 1 4 1 5 1 0 过硫酸铵( a p s ) ：称0 1 9 过硫酸铵溶于l m l 去离子水中，4 c 保存，保存一周。 1 4 1 6 t r i s h c i 缓冲液( 1 0m ，p h6 8 ) - i r i s3 0 2 8 9 溶于1 5m l 双蒸水中，用浓盐酸调至 p h6 8 ，定容至2 5m l 。 1 4 1 7 i r i s - h c i 缓冲液( 1 5m ，p h8 8 ) ： i r i s2 7 2 3 9 溶于8 0m l x 2 蒸水中，用浓盐酸调至 p h8 8 ，定容至1 5 0m l 。 1 4 18 3 0 聚丙烯酰胺溶液( a c r b i s ) ：丙烯酰胺，2 9 2 1 9 ；亚甲双丙烯酰胺，o 7 8 9 ，溶 于去离子水1 0 0 m l 中，p h 7 0 。 1 4 1 9 1 0 分离胶配制( 5m 1 ) - 去离子水，2 m l ； i r i s h c i ( 1 5m ，p h8 8 ) ，1 2 5m l ；3 0 a c r b i s ，1 6 5m l ；1 0 s d s ，5 0p l ；1 0 a p s ，5 0 l ；1 0 t e m e d ，2r t l ，充 分混匀后，用吸管加入安装好的胶槽中，2 0 2 5 聚合3 0m i n 。 1 4 2 0 4 浓缩胶的配制( 约2m 1 ) ：去离子水，1 4m l ； i r i s - h c i ( i 0m ，p h6 8 ) ，0 2 5m l ； 3 0 a c r b i s ，0 3 3m l ；1 0 s d s ，2 0l a l ；1 0 a p s ，2 0l a l ；1 0 t e m e d ，2 l a l ， 1 3 东南人学硕i ：学位论文 充分混匀后，用吸管加入已凝好的分离胶上，插入梳子，2 0 2 5 聚合4 5m i n 左右。 1 4 2 12 s d s 凝胶加样缓冲液：0 1m 秭s h c i ( p h6 8 ) ；2 0 甘油；4 s d s ；0 2 溴酚 兰，4 保存。临用前加入1 m 二硫苏糖醇使其终浓度为0 2 m 。 1 4 2 2 考马斯亮兰染液：0 5 考马斯亮兰r 2 5 0 ；4 5 q j 醇；1 0 乙酸。 1 4 2 3 脱色液：3 0 甲醇；1 0 乙酸；6 0 去离子水。 1 4 2 4 丽春红贮存液：丽春红sl g ；三氯乙酸1 5 9 ；磺基水杨酸1 5 9 ，加去离子水至5 0 m l 。 使用时用一份贮存液加9 份去离子水成丽春红使用液，使用后即予废弃。 1 4 2 5 转移缓冲液：t r i s5 8g ；甘氨酸2 9g ；甲醇2 0 0m l ；s d so 3 7g 溶于双蒸水6 0 0m l ， 浓盐酸滴定至p h8 3 ，加双蒸水定容至1 0 0 0m l ，4 c 保存。 1 4 2 6 洗涤缓冲液( p b s t ) ：8 0 0 m l 水中溶解8 9n a c i 、0 2 9k c i 、1 4 4 9n a h 2 p 0 4 和0 2 4g k h 2 p 0 4 ，用h c i 调节p h 值7 4 ，并定容到ll ，含0 1 t w e e n 2 0 。 1 4 2 7 封闭液：含1 脱脂奶粉的p b s 。 2 实验方法 2 1 细胞培养 将冻存的k 5 6 2 细胞、u 9 3 7 细胞从液氮罐中取出，迅速投入3 7 水浴箱解冻，吹 打混匀后转移入离心管，8 0 0 r p m 离心5 m i n 。弃去上层冻存液，再次离心后吸取配制好 的含1 0 小牛血清的培养液轻轻吹打混匀，接种于含1 0 小牛血清的r p m i1 6 4 0 培养 液，置于3 7 。c 、5 c 0 2 培养箱中，每天换液一次，2 3 天传代一次。取对数生长期细 胞，于培养瓶内生长至8 0 时，离心细胞悬浮液，细胞沉淀后经培养液沈涤并离心后， 混匀后计数，台盼蓝染色，计数活细胞数9 8 以上。 2 2 药物浓度选择 参考本课题组前期实验结梨2 4 2 5 】及预实验【5 5 1 ，得出2 0 m g l 浓度以下的m n p ( f e 3 0 4 ) 对k 5 6 2 细胞系无明显细胞毒性，最终选取5 、l o 、1 5 、2 0 m g l 四个浓度m n p ( f e 3 0 4 ) 与g a 联合用药观察k 5 6 2 细胞增飧情况。 2 3 药物纳米粒的制备 m n p ( f e 3 0 4 ) f 2 1 1 是由东南大学生医系在o 1 m 的四庚基铵盐溶液中采用氧化条件下的 第一部分材料j 方法 电化学沉积方法合成的，磁性为2 5 6x l o - 3e m u m g ，直径为3 0l