（病原生物学专业论文）视蛋白基因的克隆及其与抗药性耐药性关系的研究.pdf

南京医科大学博士学位论文 论文独创性声明 是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰 写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中 作了明确的声明并表示了谢意。 专业：圳者签名：j 牛日期：2 1 五丝 论文使用授权声明 本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 名出 1 一部 p z 1 印，p 6 口舌 日期： 第一部分 淡色库蚊视蛋白基因( n y d 一卯7 ) 的克隆及 其与溴氰菊酯抗药性关系的研究 南京医科大学博士学位论文 中文摘要 长期以来，大范围和不加选择地使用杀虫剂导致了媒介抗药性的 发生和发展发现和研究新的抗药性相关基因将有助于阐明抗药，睦的 分子基础和寻找新的治理抗药性的靶标 本研究根据本实验室已经获得的淡色库蚊胁o l p j 7 基因的 序列，设计引物，从淡色库蚊抗性品系成蚊c d n a 文库中扩增出 n y d - o p 7 基因的全长序列，t a 克隆入p g e m te a s y 载体，经测序， 对位拼接获取全长序列获得的淡色库蜕v y d - o p 7 基因长14 3 7 b p ， 开放阅读框为11 1 6b p ，编码3 7 1 个氨基酸( g e n b a n k 登- 录号： a y 7 4 9 4 1 3 ) 用b l a s t x 软件将该基因推导编码的氨基酸序列与蛋白质公共数 据库s w i s s p r o t 分析，用c l u s t a l w 软件作序列比对和聚类分析推导 的氨基酸序列与埃及伊蚊( a e d e s a e g y p t i ) 和冈比亚按蚊( a n o p h e l e s g a m b i a e ) 的视蛋白具有8 0 以上的同源性 定量p c r 的方法研究其在敏感品系和抗性品系淡色库蚊各发育 阶段中的表达差异结果显示，n y d - o p 7 在淡色库蚊溴氰菊酯敏感 和抗性品系卵及1 ，2 。3 4 龄幼虫中有微弱表达，在蛹及成蚊中有 较高表达，而且该基因在抗性品系蛹和成蚊中的表达较敏感品系显著 升高 将该基因克隆入昆虫细胞表达载体p i e l - 3 ，转染蚊c 6 3 6 细胞， g 4 1 8 筛选两周后获得稳定表达的细胞系，【3 h 】t d r 检测结果显示： 各种浓度的溴氰菊酯处理4 8 小时后，在1 5 i m 。2 0 p m 争2 5 1 s m - 浓度 南京医科大学博士学位论文 组，转染组细胞的存活率较对照组分别升高了1 1 0 8 、1 3 0 7 和 1 1 1 0 ( p 1 50 0 0 9 ， 离心3 0 m i n 小心去除上清 用2 m l 室温的7 0 乙醇洗涤d n a 沉淀，4 。c ， 1 50 0 0 9 ，离心1 0 r a i n 小心去除上清，勿破坏沉淀 空气中干燥沉淀5 1 0 m i n ，将d n a 溶于合适体积( 约1 0 0 p 1 ) 的 b u f f e r ( 如p h 8 0 的t e b u f f e r 或p h 8 5 的1 0 m m t r i s c l ) 中 注意：勿用枪头吹打 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒d n a 的纯度和浓度 7 3 2 基因转染 将处于对数生长期的c 6 3 6 细胞计数后按4 x 1 0 5 个孑l 接种于6 孔 板，置于c 0 2 培养箱2 8o c 培养1 8 2 4 h ，待细胞融合率达3 0 5 0 时， c e l l f e c t i n 转染试剂转染，共设3 组，转染p i e l 3 1 n y d - o p 7 + p i e l - n e o 组、转染p l e l 3 空载$ = j k + p i e l - n e o 组、未转染组( 阴性对照) 方法如 下： 依据各组转染的质粒，分别在无菌1 5 m le p 管内准备下列溶液： 溶液a ：将2 p g 质粒d n a ( p m l 一3 或p i e l - 3 1 n y d - o p 7 ：p i e l - n e o = 4 ：1 ) 加入1 0 0 p 1 不舍血清的r p m l l 6 4 0 培养液稀释； 溶液b ：将6 lc e l l f e e t i n 转染试剂加入1 0 0 1 a l 不合血清的r p m l l 6 4 0 培养液稀释 ( 注意：c e l l f e c t i n 转染试剂是脂样悬浊液，随时间会沉淀使用前 2 0 南京医科大学博士学位论文 将试管上下颠倒5 1 0 次使充分混匀) 将a 、b 两种溶液混合，轻轻混匀，室温孵育1 5 4 5 m i n 用2 m l 不舍抗生素的r p m l l 6 4 0 无血清培养液洗涤每组细胞 加1 8 m lr p m l l 6 4 0 无血清培养液到上述包含质粒d n a 和转染试 剂的混合液中，轻柔混匀，然后将其均匀地加入到培养孔中 将细胞置c 0 2 培养箱，2 8 。c 培养5 2 4 h 弃去含d n a 和转染试剂的培养液，换用含1 0 胎牛血清的 r p m l l 6 4 0 完全培养液继续培养 7 4 单克隆化及稳定转染细胞系的建立 7 4 1g 4 1 8 筛选 转染后7 2 h ，将细胞以1 ：6 传代后用含3 0 0p g m lg 4 1 8 的 r p m l l 6 4 0 培养液选择培养，直至阴性对照组细胞全部死亡 7 4 2 单克隆化建立稳定转染细胞系 约1 0 一1 5 天后见抗性克隆出现，待其逐渐增大，传代扩大培养， 有限稀释法进行单克隆化，方法如下： 取一决9 6 孔板，对克隆细胞计数后，取2 3 0 个左右( 大约) 的细胞 于4 6m l 培养液中，用弯头滴管先滴前3 排，2 滴孑l ，平均每孔5 个 细胞；剩l m l 培养液，再补加4 m l ，滴中间3 排，平均每孔1 个细胞； 剩1 4 m l 培养液，补加1 4 m l ，滴最后两排，平均每孔0 5 个细胞。待 细胞长满后，用0 2 5 胰蛋白酶消化，并将消化下来的细胞转移至6 孔板继续培养待细胞又长满后，在移至2 5 c r n 2 培养瓶扩大培养，保 种 南京医科大学博士学位论文 7 5r t - p c r 鉴定稳定转染的细胞系 7 ，5 1 细胞r n a 抽提 用t r i z o l 试剂抽提稳定转染p i e l 3 n y d - o p 7 和p i e l 3 空载体 的单克隆细胞的总r n a 方法如下： 匀浆 直接向3 5 c m 直径的培养皿中加入l m lt r i z o l v ：z 裂解细胞，并用 吸头反复吹打几次细胞裂解液所；扣t r i z o l 的体积取决于培养皿的体 积( 每1 0 c m 2 面积加入i m lt r i z 0 1 ) 而不是取决于细胞数目t r i z o l 量过少将可能导致提取的r n a 中污染d n a 收集裂解液，4 0 c1 20 0 0 9 离心1 0 m i n ，将上清移至另一e p 管中 相分离 将样品匀浆在1 5 3 0 0 c 孵育5 m m 以使核蛋白复合物充分裂解 每l m lt r i z o l 加a 0 2 m l 氯仿小心盖好管盖剧烈震动e p 管1 5 s ， 1 5 3 0 。c 孵育2 3 m i n 4 。c1 20 0 0 9 i g 心1 5 m i n 离心后混合液分成 一个浅红色的酚一氯仿相，一个中闯相和无色的上部水相r n a 4 y , 存 在于水相中水相的体积大约是匀浆时所加t r i z o l 体积的6 0 r n a 沉淀 将上清水相移至一个新的e p 管中( 如需分d n a 或蛋白则需保 留有机相) 向有机相中加入异丙醇以沉淀r n a ，每l m lt r i z o l 加a o 5 m l 异丙醇1 5 3 0 。c 孵g1 0 m i n ，4 。c1 2o o o g g 心1 0 m i n 通常不 可见的鼢蛆沉淀离心后在管壁和管底形成胶样沉淀 r n a 洗脱 南京医科大学博士学位论文 去除上清用7 5 乙醇洗涤一次r n a 沉淀( 每l m lt r l z o l 至少 囊薹i 三) s 。个循环移a c 血：2 5 个循环， 2 3 南京医辩大学博士学位论文 7 2 o c 1 0 m i n 取8 p lp c r f f ：物0 9 - a c t i n ：5 r d ) ，1 的琼脂糖凝胶电泳鉴定( 1 2 0 v ， 3 0 r a i n ) ，凝胶成像系统拍照保存 7 6 3 h 】t d r 法测定各纽细胞对于溴氰菊酯的敏感性 操作步骤如下： 将处于对数生长期的蚊细胞消化后，制成单细胞悬液，以50 0 0 个细胞1 0 0 p 鹏l 接种于9 6 孔板中，每个药物浓度设3 个复孔； 2 8o c 、5 c 0 2 孵箱培养4 h 后，分别加入溴氰菊酯至0 、1 0 、1 5 、 2 0 、2 5 3 0 ，4 0 、8 0 、1 2 0 b t m 浓度； 细胞培养2 天后加入含有3 h 的新鲜培养液，0 5 心孵l ，再培养1 2 1 8 小时： 胰酶消化细胞后，用p b s 洗涤细胞2 次，用多头细胞样品收集器 收集细胞； 用预冷的1 0 - - 氯乙酸沉淀d n a ，o 5 m ll m o l ln a o h 提取， 0 5 m ll m o l lh c l 中和； 4 9 4 玻璃纤维滤膜滤出d n a 提取物，8 0 烘干： 液体闪烁计数仪测定每m i n 放射性脉冲波 与对照组相比，计算细胞相对存活率。 8 统计学分析 所有数据以均数士标准差o 吐s ) 表示，用s t a t a 7 0 软件进行分析， 组间比较用s t u d e n t st 检验，p 0 0 5 表示有统计学意义 南京医科大学博士学位论文 结果 1n y d - o p 7 基因的克隆 为分离淡色库蚊的视蛋白基因，我们p x s p 6 和t 7 引物以及视蛋白 基因特异性引物( 根据我们以前得到的差减杂交片段序列设计， g e n b a n k , 登 录号：b e 2 4 7 8 1 2 ) ， x p c r 的方法对淡色库蚊的e d n a 文库 进行了扩增( 图1 ) 我们又把扩增得到的两个片段和我们以前已经报 告的片段组合成一个推导的视蛋白全长基因然后我们又根据这个推 导的全长基因设计了一对扩增视蛋白全长基因的引物再次进行p c r 扩增，最后，我们得到了一个全长的淡色库蚊的视蛋白基因并将之命 名为n y d - o p 7 ( g e n b a n k - 登录号：a y 7 4 9 4 1 3 ) 这个全长的n y d - o p 7 基因的开读框有l1 1 6 b p ，编码3 7 1 个氨基酸( 图2 ) ab 图1 n y d - o p 7 基因5 和3 端扩增产物电泳图 a n y d - o p 7 基因5 ，端扩增产物电泳图b n y d - o p 7 基因3 端扩增产物电泳图 1 ：p c r 产物：m ：m a r k e rd l 20 0 0 1 一t t 从g t 删g t g t t c g t t c t a g g a c g t t t t c 盯c g c t t c r r a a c c g t t c g 从 一6 0 6 l c t t a g t g 从a c c c g c t c t a g a c c - c t g t g g a t t j 丌 c t t t t t g t 从c t c c c 从一1 2 0 1 2 1 t c c , g a a g c a t g g c a g c t r t c g t t g a g c c g c a t t t c g c g c c t a t c a g g c g g g t a a t g g a a - - 1 8 0 一 mfy e p h fdy0gn g n 1 8 1 一砬姐g 托c 钮c a 峨瓠嘲k t c c c c 鼹懿吼1 吼托冁g 锶c 枝钮c 敝镐k 一2 4 0 一邕洌v v d m vsp d m l 1 tm v h ph-n 南京医科大学博士学位论文 2 4 1 一 t c g t t c c c g c c g a t g 从c c c g c t g t g g c a c t c g a t c c t c g g a t c t g c c 盯口g t t 一3 0 0 一 qf pp npl-hs il le l 3 0 1 一t g g g a a t 踟c g a t g t t g g c c g g t t g t g t c t t t c g a t c t t c c c g c a c c 从g t 一3 6 0 一 g mvsmig n g cvisifts tks 3 6 1 一c a c t c 从a a c c c c g t c c 从c c t g c t a g t g g t c a a t c t g c c t t c t c c g t t t c 盱6 t g a 一4 2 0 一lk t p snl ! ! mk sq lm ￥ 4 2 l 一哪c a c g t g g g a c c g c c g a l l g g t g a t c 从c t g c t g g c a t c a g a c c r g g g c t t c g 脚忆一4 8 0 一 f t m g p p m vinc hqt-8fg p 4 8 1 一c t t t 娜g c g 从c t g t a c g c c t g c c t g g g a t c g c t g t t 嘲g t g c c t c g a t c t g g 一5 4 0 一fa 目el ! l sl eq 6 i ! 1 5 4 1 一c c 瓠g 敞目1 g a 矾g c 弧5 敞：矾a c 轴l g 弧瓶c 吼g | 艇g 置a 1 c c c 地g 一6 0 0 一 m 1 lifbr ! ( | nviv k glkp 6 0 1 一c a t g a c c 从c a g t g g t g m t g g t c a a g t c c i 镪玎c g t g t g g g c t t t c g c a c t 暖t c t 一6 6 0 一 m t nsg 矗邕 ! kll l !曼盎e叁坠e 1 6 6 1 一g g c t c t g g c c c c a l t c t i r c g g t c 岳a a c c g a t a t g t c c c a g a g g 6 t a a c g t g c t g c c r 一7 2 0 一tlpf f g w n r y y peg n vt af q 7 2 1 一g c g g c t g g c t a c c t g a c c c a g c c t g g t t g a g c c g 凹c g t a c a t a t c g 研a c g c c g 一7 8 0 g t g y l tqt-lsr8xi ! ! ! 1 7 8 1 一t c t t c g t c t a c t g g c t g c 盯f r g c t c c c 觚c a m a c g t a c a c g t t c a t c c t g 从g g 一8 4 0 一! ! ! l bl ! ! ! ! ! ! il k a 8 4 1 一c r g t c t c t g c c c a c g a g g 从c a g a t g c g t g 从c a g g c c 从g 从g a t g a c g t t g c c t c g c 一9 0 0 一vs 自溺qmre 目：! ：i ：j i ：j 圃 sl 9 0 1 一t g c g a t c g t c g 6 从g c t c 从c a g a c c g c g c t g a j c 从g c t g g c ( ：从g g t c g c c c t c g 一9 6 0 一 r s s e aq qtseik l ak ! 1 9 8 1 1 g 弑鼹n c c 吼矾g m c 酲踟g g c t c c a t a c c t g g t c a t c a a c t t c a c c c 嚣a a 一1 0 2 0 一 !苎坠! e丛叁! !羔l !堕里!鱼 i 1 0 2 1 一t c t t c a a g g c t g c c c c g a t c a g c c c a c t g g c c a c c a t c t g g g g a t c g c t g t t c g c c a a g g 一1 0 8 0 一 fkpispl ! ! ! le k 1 0 8 1 一c c 从c g c t g t c t c a c c c g t c g t g t a c g g 从t c a 6 c c a t c c g a a g t a c c g t g c t g c t c 一1 1 4 0 一 n a v y n piy y gish pk yrl 1 1 4 1 一卫g t a c c a g o t a c c c a g g a c t g t c g t g c c a g t c a g a c a a c t c t c c c a a c g a c a c c c a g t 一1 2 0 0 一 y q r y p g l s c qs d nsp n d tqs 1 2 0 1 一c g g t t g c t t c c g ( 船g c g a c g a c c g c c t c c g a c g a g a a g g c t t a a g t a c a a a g g t g a g a t a 一1 2 6 0 一vsgttsd e ka 1 2 6 1 一g g a c a j a c 嘲瞄1 姐n 1 强g 姐1 g c t g a t c t t t g c t a g a a a a a a a a a a t t g 一1 3 2 0 1 3 2 1 一啦峙 u h 讯畸蕊 蛆g 蝇幽c h 帆镐m 地c 硒娲蝇坚墼姐拣一1 3 8 0 1 3 8 1 一g a a g 嗡吼吼嫩h 编虬嗡嗽a 瞄碥椒c a a a a a g t a a a a g a a c c t c c t 一1 4 3 7 图2 淡色库鼬 y d = o p7 t 基因的核苷酸序列和推导的氯基酸序列细线下划序列 为7 个跨膜区序列末端粗线下划序列为多聚腺苷化信号序列框中的两个“c 为第一和第二胞外区的两个半扰氨酸第3 1 7 4 瞌g 赖氨酸( k ) 用黑体显示d r y 基 序弄p q a k k m n v 基序用方框框中显示n 端可能的糖基化位点和 玎! e 基序用阴影 显示 2 6 - 南京医科大学博士学位论文 2 序列分析表进化树分析 将推导的n y d o p 7 的氨基酸序列和冈比亚按蚊以及埃及伊蚊的 视蛋白序列比对后我们发现，n y d o p 7 的氨基酸序列与埃及伊蚊的 o p s l 和o p s 2 视蛋白序列分别有8 7 和8 3 的同源性，与冈比亚按蚊的 g p r o p l 4 视蛋白序列有8 6 的同源性n y d o p 7 的氨基酸序列具有 典型的视蛋白序列的特征，如：在第7 跨膜区的3 1 7 位有一个高度保守 的赖氨酸，其功能是与视色素相结合；在c 端有磷酸化位点( s e t ， t h r ) ；在n 端有糖基化位点( a s n - x a a - s e r t h r ) ；在第一和第二细胞外 环上有可以形成双硫键的两个半胱氨酸残基( c y s 1 2 1 和c y s 一1 9 8 ) 等 在n y d o p 7 的第三螺旋和第二细胞内环的接头处存在一个d r y 基 序，该基序与牛视蛋白的e r y 基序非常相似，并且该基序舍有一对可 以活化下游转导蛋白的电耦 3 9 ；4 0 同时，在n y d o p 7 的胞内g _ - 环的n 端还存在一个在无脊椎动物视蛋白序列中高度保守的 q a k k m n v 基序 4 l 】( 图2 ，图3 ) 分子进化树分析结果显示，n y d o p 7 与埃及伊蚊的o p s l g 蛋白 的亲缘关系最近( 图4 ) 狮移_ o p 7 0 p s l 0 p s 2 g p r o p 2 g p r o p 4 g p r o p 3 o p r o p l g p r o p 6 o p r o p 5 一m 姓列e p h 功a y q a g _ p 盼n m n 啊d 7 s p d 地删v 啦h 烈3 8 _ m “m p 肝d a i o a a - g g n l t v v d k v p p e m l i - m i i , i p h w n3 8 姒a f v a p 职d a 船s r g 眦嗍y p p e m l 删v 唧科3 7 一螂afvem肌tqs-ggnmsvvdkvppemlimvhphwn 3 8 虬k t e v l i f p d 姒a f v e p 断d a 盯q s 稍n 啦w d k v p p e m l 删p h 州4 9 舰蚺f 忱p h f d a i r q s g g n m s v v d k v p p e m l i f l d v t w h w n3 8 叫a f v e p h f d 肌q g - s g n m s v v d k v p p e 札i m v h p i 嗍嬲 s v i ) n r t p l c l w g n c q r r e t e m a a f a e p i 妒s a w t f f f v v s n v t v v i ) k v p p e m l i m v d a h w y6 0 协职p v g i f g p k s p q a l t 盯i s - v mt v l k v p p m 也碰v i r r y w4 6 ：，阜：料搴： 南京医科大学博士学位论文 n y i ) - o p 7 o p s l 0 p s 2 g p r o p 2 g p r o p 4 g p r o p 3 g p r o p l g p r c i p 6 g p r o p 5 n p 7 0 p s l 0 p s 2 g p k o p 2 g p r o p 4 g p r o p 3 g p r o p l g p r o p 6 g p r o p 5 n y d - 0 p 7 0 p s l s 2 g p r o p 2 g p r c l p 4 g p r o p 3 g p r o p l g p r o p 6 g p r o p 5 矾争巾p 7 0 p s l 0 p s 2 g p r c p 2 g p r o p 4 g p r o p 3 g p r o p l g p r o p 6 g p r o p 5 0 f p p m n p l w 璐i l g s a i f c l g m v s m i g n c , c v i $ 1 f t s t l 【s l k t p s n l l w n l a f s d f u 似9 8 q f p p i i n p l w h s i l g f a i l g 梆鲥i g n g f y 略i f r s t p s l r t p s n l l w n n f s d f l 删9 8 q f p p g n p l i n s i l g f a i f v l g w s 虹g 眦v i y 工f t g t l i s l i 玎p s n l l v v n l a f s d f f 埘9 7 q f p p 州p 埔 i s i l g f a i n l l g m i s l n n g c v l 盯i f l w t k s l r t p s n l l v v n l a f s d f f i 删9 8 0 f p p 蛐 i p u f l - b i l g f a i f t & g i l s t o g n g c v v y i f t n t k s l r 丁p s n l l v v n l a f s d f f i 腑1 0 9 q f p 蹦n p 墉磁i l g f a i f 虬g m i s 舯洲g c v 耵i f 咖c s l r t p s n l l v v n l a f s d f f i s i9 8 q f p p m n p l t h s i l g f a i f w l g w i s r t 甜g 吖毗i f t n t k s ir t p s n l l y v l a f s d f f 删9 8 o f p p _ n p l i q q s i l g f a i f v l g w s i i g n g c v i y i f n 盯k a l r t p s n l i v m f s d f l l 删1 2 0 q f p p l e t k i 旺i a a l a t t i g l l a l i s i v g n g c v i l i f s s t k g l r t p s n u i n l a f a d 删i 0 6 和i ：奉：奉宰：和。： ：事 ：# + ：牛： # ：# ：中 f 1 粥p p 肼i n c 硼口伸s f g p f a c e l 眦l g s l f g c a s i 耵l i a f d r y n v i v i ( g l a 觚p1 5 8 嗍p 盯i n c l l e t 吖f g p f a c e ”a c l g s l f g c a s l l 盯棚i a f d r y w i v k g l 从l 【p1 5 8 f t n g p p i o i n o t t e t w y l p p f a c e l y a 虾g s l f g c a s i 竹柳嗍i a f d r y n v i v k g l s a i 【p1 5