（预防兽医学专业论文）鹅细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆及原核表达.pdf

学位论文独创性声明 本入声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及耿得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名= 岁悫涛签字同期乒毋3 - a 潮 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子文档。本人授权学校可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。( 保密的学位论文在解密后适用本 授权书) 。 学位论文作者签名 泌涛翩踩榭 签字日期：ao 。眸f 月u 同签字日期：文”件r 月1 a 同 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 鹅细小病毒非结构蛋白n s l 基因的克隆及原核表达 研究生姓名：沈涛 指导教师姓名职称：朱新产教授 学科专业：预防兽医学 摘要 鹅细小病毒( g o o s ep a r v o v i r u s 。g p v ) 是小鹅瘟的直接瘸原。临床病理变化以消化逆，尤 其是小肠部位典型纤维性栓塞为特征。我国学者方定一丁1 9 6 t 年首次分离到g p v 的瘸原体。 g p v 是细小病毒科、细小病毒属成员，属自主复制型细小病毒。病毒基因组为单股、线性d n a ， 核苷酸序列长约5 1 k b ，含有两个开放阅读框架( o r f ) ，右侧o r f ( r o r f ) 编码3 种结构蛋白( v p ) ， 即v p l 、v p 2 、v p 3 ；左侧o r f ( l o r f ) 编码非结构蛋自n s l 和n s 2 ，参与调节病毒生命周期的各个 环节。 检索g e n b a n k 所发表的g p vb 株全基冈序列，借助p r i i 1 e fp r e m i e r50 和0 1i g o6 4 4 软件 设计一对引物采刚p c r 技术扩增g p vy z 株非结构蛋向n s l 基困，并与p m d l 8 一t 载体迕接后测 序。利用软件d n a s s i s t2 ，2 对投8 序结果进行分析，结果表明：g p vy z 株稚结构蛋白n s l 基因核 苷酸全长1 8 8 1 b p ，编码6 2 7 个氪基酸残基。与g p vb 株的n s l 基冈相比，核苜酸数目相同，有 3 6 个碱基、1 3 个氮基酸的差异。二者核菅酸序列同源性为9 8 0 9 推导氨基酸序列同源性为 9 7 9 3 。 将n s l 基因插入到原核表达质粒p q e 一3 0 x a 的b a z , t hi 、妇i 多克隆位点之间，将重量j 【原核 表达质粒p q e 一3 0 x a n s l 转化到大肠杆菌m 1 5 感受态细胞中，获得表达n s l 基冈的附陛重组子， 在含a m p 的l b 液体培养基中培养，经i p t g 诱导表达，刖s d s - p a g e 分析表达产物。结果表明： n s l 基因在原核表这细菌大肠杆菌m 1 5 中获得了高效表达，表达产物为约7 3 k u 的融台蛋向，表达 量达菌体总蛋白的2 6 5 。 应用蛋白质分析软件a n t h e p r o t5 0 对得到的g p vy z 株的n s l 蛋白进行蛋白序列的理化特 性、蛋白质的二级结构、蛋白滴定曲线与等电点、蛋白序列分子培、比重与各蛋白残基自分组成、 蛋白质信号肽潜在的断裂位点等进行分析，得出了相应的特征曲线和分析结果，为进一步研究其 生物和免疫学性质奠定了基础， 关键词：鹅细小病毒：n 8 1 基因；克隆：序列分析：原核表达 攻读学位期间发表学术论文目录 作者姓名刊物名称期( 卷) ：页年 沈涛，朱新产，李艳梅 生命的化学2 4 卷4 期( 总第i 3 9 期) ：p 3 0 9 ，2 0 0 4 8 1 5 作者简介：沈涛，男，t 9 7 8 年生，河北石家庄入，2 0 0 2 年从师于朱新产教授，2 d 0 5 年0 6 月将完成本校预防兽医学专业硕士论文答辩并获农学硕士学位。 c l o n i n ga n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fn o n s t r u c t u r a lp r o t e i nn s1 g e n eo fg o o s ep a r v o v i r u s p o s t g r a d u a t e ：s h e nt a o a d v h o r ：p r o lx i n c h a nz h u m a j o r ：p r e v e n t i v ev e t e r i n a r ys c i e n c e a b s t r a e t g o o s ep a r v o v i r u s ( g p v ) w a st h ep a t h o g e no fg o s l i n gp l a g u e t h et y p i c a lp a t h o l o g i c a ll e s i o n s w e r ea c u t ei n t e s t i n ei n f l a m m a t i o n t h ep a t h o g e nw a sf i r s ti s o l a t e db yf a n gd i n g y ii nc h i n ai n 】9 61 n o w a d a y s ，g pw a si n f l u e n c i n gi na s i a ，i tm a d el a r g eh a r m f u l n e s sf o rf e e d i n g g e e s e g p vh a db e e nc l a s s i f i e da sam e m b e ro f t h ep a r v o v i r u sg e n u so f t h ep a r v o v i r i d a e n oh e l p e rv i r u s w a s r e q u i r e d f o r r e p l i c a t i o n o fg p v t h eg e n o m eo fg o o s ep a r v o v i r u sw a sa5l0 6 n t l i n e a r s i n g l e - s t r a n d e dd n a ，i tc o n t a i n e dt w oo p e nr e a d i n gf r a m e s ( o r f ) a n dw a sf l a n k e db yi n v e r t e d t e r m i n a lr e p e a t s ( i t r s ) t h er i g h to r fe n c o d e dt h r e e s t r u c t u r e dp r o t e i n s ( v p l 、v p 2 、v p 3 ) ，a n dt h el e f t o r fe n c o d e da tl e a s tt w on o n s t r u e t u r a lp r o t e i n st h a tw e r ei n v o l v e di nr e g u l a t i n ga l la s p e c t so f t h ev i r a l l i f es t y l e a c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e do fg p vbs t r a i ng e n o m en u c l e o t i d es e q u e n c e si ng e n b a n ka n dap a i ro f s p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e dw i t hp r i m e rp r e m i e r5 0a n do l i g o6 4 4 n s1g e n eo fg p vy zw a s a m p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t h ei n t e r e s tg e n ew a sc l o n e di n t op m d l 8 - tv e c t o ra n d s e q u e n c e d w h e nw ea n a l y z e dt h er e s u l tw i t hd n a s s i s t2 2 i ti n d i c a t e dt h a tg p vn s l g e n ec o n t a i n e d 1 8 8 1b a s e sa n de n c o d e d6 2 7a m i n oa c i d s c o m p a r i n gw i t hg p vbs t r a i nt h e r ew e r e3 6n u c l e o t i d e sa n d 1 3a m i n oa c i d sv a r i a t i o n a n a l y s i sr e s u l ts h o w e dt h a tt h e ys h a r e d9 8 0 9 s i m i l a r i t ya tt h ed n a ，a n d 9 7 9 3 a tt h ep r o t e i n n sl g e n ew a sc l o n e di n t ot h em u l t i p l ec l o n i n gs i t e so fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp q e - 3 0 x a t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp q e - 3 0 x a - n s lw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e dt ot h ec o m p e t e n tc e l lm15 p o s i t i v eb a c t e r i u ms t r a i nw a si n d u c e db yi p t g s d s p a g er e v e a lt h a tt h en s lg e n ew a se x p r e s s e di n e c o l iml5w i t hh i g he f f i c i e n c y t h ew e i g h to fp r o d u c tw a s7 3 k u ，w h i c hc o n t a i n i n go r eo rm o r e6 x h i s a f f i n i t yt a g s ，l o c a t e da te i t h e r t h ea m i n oa n d o rc a r b o x y lt e r m i n u so f t h ep r o t e i n t h ee x p r e s s e dp r o t e i n a c c o u n t e df o r2 65 o f t h et o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n ， a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ，t h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c ，s e c o n d a r ys t r u c t u r e ， p h ia n dt i t r a t i o nc u r v e ，m o l e c u l a rw e i g h t p r o p o r t i o na n dc o m p o s i n go fa m i n oa c i d ，p o t e n t i a lc l e a v a g e s i t eo fs i g n a lp e p t i d ec o u l db ea n a l y z e dw i t ha n t h e p r o t5 0 t h i ss t u d yw o u l dp r o v i d et h eb a s i sf o r t h ef u r t h e rr e s e a r c ho f b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i ca n dc o m m e r c i a lu t i l i z a t i o no f n s lp r o t e i n k e yw o r d s ：o p v ：n s lg e n e ；c l o n i n g ；s e q u e n c ea n a l y s i s ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n t h es c i e n t i f i cp a p e rc a t a l o g u ep u b l i s h e dd u r i n gs t u d y i n gf o r t h ed e g r e e n a m eo f a u t h o r n a m eo fp u b l i c a t i o ns c h e d u l e dt i m e ：p a g e ，y e a r s h a nt a o ，x i n c h a nz h u ，y a n m e il i c h e m i s t r yo f l i f e2 4 ( 4 ) ( t o t a l1 3 9 ) ：p 3 0 9 ，2 0 0 4 2 b r i e f i n t r o d u c t i o no f a u t h o r ：s h e n t a o ，m a l e ，b o r n i n1 9 7 8 ，f o l l o w e dp r o f e s s o r z h ua n d m a j o r e d i np r e v e n t i v ev e t e r i n a r ys c i e n c ei n2 0 0 2 ，w i l lg r a d u a t ef r o mo u rc o l l e g ea n dg e tt h ed e g r e eo fm a s t e ro f a g r o n o m yo nm a y ：2 0 0 5 3 第部分文献综述 1 小鹅瘟的研究简史 1 9 5 6 年方定一等人首先在江苏扬、i 1 发现本病，并分离到病毒。1 9 6 1 年在扬州重 新分离到此病毒，将其引起的疾病命名为小鹅瘟，称其病原为小鹅瘟病毒【i i 。1 9 6 2 年研制成功抗血清，1 9 6 3 年研制成功种鹅弱毒疫苗，1 9 8 0 年研制成功雏鹅弱毒疫苗 口】。6 0 年代，日本和许多欧洲国家也暴发了类似疾病，但使用了不同的名称，如在意 大利称为传染性心肌炎，匈牙利称为鹅流感，法国称为腹水性肝肾炎，前苏联称为传 染性病毒性肠炎，荷兰称鹅瘟，德国称鹅肝炎。以匈牙利病毒学家d e r z s y 为代表的 研究人员对该病进行了详细的描述。1 9 7 4 年世界家禽协会为纪念匈牙利病毒学家 d e r z s y 在描述该病方面做出的突出贡献，将该病命名为d e r z s y 氏病。近年来杂志刊 物中多将之称为鹅细小病毒感染( g o o s ep a r v o v i r u si n f e c t i o n ) 。1 9 9 5 年b r o w n 等第一 次发表了g p v 基因组的部分序列，不久z a d o r i 等又发表了g p v 的全基因组序列， 为从分子水平研究g p v 奠定了基础。 2 小鹅瘟的病症学概况 鹅细小病毒( g o o s ep a r v o v i r u s ，g p v ) 是小鹅瘟( g o s l i n gp l a g u e ，g p ) 的病原 体。该病是以雏鹅消化道，尤其是以小肠部位的纤维性栓塞性病变为主要特征的一种 高度致死性疾病【3 】。 在自然情况下，小鹅瘟病毒能感染各种鹅，包括白鹅、灰鹅、狮头鹅与雁鹅。其 他动物，除番鸭外，均无易感性【4 1 。出壳后3 4 d 直至2 0 d 左右的雏鹅均可发生本病。 近年来，小鹅瘟发病及死亡日龄已有增大趋势，有报道称，g p v 能引起6 0 日龄雏 鹅发病，病毒人工感染6 0 日龄雏鹅能引起1 0 0 发病和1 0 0 死亡，这可能是由于 病毒毒力增强所致5 1 。 病鹅的内脏、脑、血液及肠管中均含有病毒，小鹅瘟病毒主要经消化道感染f 6 1 。 本病可通过与病鹅接触或接触被病鹅的排泄物污染的饲料、饮水、用具和场地而传染。 本病能通过种蛋传播，被带毒的种蛋( 常常是蛋壳表面被污染) 污染了的孵房和孵化 器对该病的水平传播起重要作用。 小鹅瘟发病及死亡率的高低与母鹅的免疫状况有关。病愈的雏鹅、隐性感染的成 年鹅均可获得坚强的免疫力，成年鹅的这种免疫力可通过卵黄将抗体传给后代，使雏 鹅获得被动免疫，因此本病的暴发具有周期性【7 1 。在我国，每年全部更新种鹅群饲养 方式的地区，在大流行后的第二年一般不再发生大流行。在该病流行的年份，雏鹅的 发病，少数从第一孵开始，大多在第3 5 孵中大量发生，此后普遍发生。雏鹅最早 于3 - 5 日龄开始发病，数日以内波及全群，死亡率可达7 0 9 0 ，甚至1 0 0 。雏 鹅的易感性随着日龄的增长而逐渐下降。易感的育成鹅、成年鹅自然感染g p v 后往 往不表现明显的临床症状1 8 j 。本病在每年更换部分种鹅饲养方式的地区的流行并不出 现周期性，每年都有流行发生，但死亡率低( 2 0 5 0 ) 。易感雏鹅进入有本病存在 的疫区后常常导致该病的暴发。 该病的诊断主要根据流行病学表现、临床症状、病理变化做出初步诊断，确诊还 需辅以一些血清学诊断方法：也有用免疫荧光 9 “0 1 、免疫组化m 】、免疫酶斑点法、 e l i s a 1 4 川，16 1 、p cr 【1 7 。18 1 和核酸探针 1 9 1 来诊断本病的报道。布f | 额，王君伟等 2 0 , 2 1 1 制备出了鹅细小病毒v p l 一v p 3 非重叠序列地高辛探针用于检测鹅细小病毒病，取得 了满意的效果。相比较来说，血清学方法虽简单易行但需要较长时间， 免疫组化、 e l i s a 、p c r 和核酸探针更需要较高的实验条件才能进行。 治疗g p v 感染目前尚无有效药物，本病的防治主要依靠疫苗和抗血清【2 引。小鹅 瘟抗血清分为同源抗血清2 4 】和异源抗血清2 6 】两种。周瑞进，布同额等【2 7 】应用鹅 细小病毒弱毒疫苗及灭活疫苗免疫1 1 1 只2 月龄鹅，制备了g p v 免疫血清，第二次免 疫后6 8d 采取血清，经检测e l i s a 抗体效价达l ：8 0 0 0 以上，经保护试验后初步应用 于鹅细小病毒感染的田间防治，收到了良好的疗效。 g p v 的疫苗可以分为普通疫苗和基因疫苗两大类。普通疫苗主要分为种鹅用和 雏鹅用两种【2 8 】。种鹅用疫苗又可分为鹅胚化强毒疫苗和鸭胚化弱毒疫苗两种。前者仅 限于在小鹅瘟流行地区使用：后者属于弱毒苗，使用安全性较高。雏鹅用疫苗可分为 鹅胚化弱毒疫苗和鸭胚化弱毒疫苗两种。赵丽荣，王君伟等1 2 9 】在实验中采用质脂体转 染方法将禽痘病毒转移载体质粒p s y 6 8 1 v p 3 l a c z 转染被禽痘病毒f p v - 0 1 7 感染的 鸡胚成纤维细胞c e f ，通过蓝白斑筛选和6 轮蚀斑克隆纯化，获得了稳定的重组病毒。 p c r 鉴定，重组病毒基因组中含有v p 3 基因。d o t e l i s a 实验证明，重组病毒表达了 v p 3 ，并且表达产物具有抗原性。 3 鹅细小病毒的类型 鹅细小病毒在分类学上被划分为细小病毒科( p a r v o v i r i d a e ) 细小病毒属 ( p a r v o v i r u sg o h u s ) 成员1 3 0 1 。同属病毒除g p v 外，还有牛细小病毒( b p v ) 、猫泛 ( p a r v o v i r u sg e n u s ) 成员【3 0 】。同属病毒除g p v 外还有牛细小病毒( b p v ) 、猫泛 白细胞减少病毒( f p v ) 、水貂肠炎病毒( m e v ) 、貂阿留申病毒( a d v ) 、绵羊细小 病毒( s p v ) 、猪细小病毒( p p v ) 等川。g p v 可以在鹅胚、番鸭胚及来自它们的组 织细胞培养物上繁殖，其复制不需辅助病毒，属于自主复制型细小病毒 3 2 1 。但是g p v 的复制依赖于宿主细胞的有丝分裂过程。虽然g p v 在理化性质及培养特性上被分在 了自主复制型细小病毒属，但这种划分结果尚没有被d n a 序列分析所证实。关于病 毒粒子内基因组的极性，细小病毒属成员有3 种不同情况【3 3 1 ：1 ，d n a 的极性与m r n a 互补，多数自主复制型细小病毒属于这一类型，如p p v 、m e v 、f p v 等；2 ，数目不 等的两种极性链，如b p v ；3 ，两种极性链数目相等，如g p v 、m d p v 。 g p v 不仅在病毒粒子的d n a 极性、正负极性链基因组特性等方面，而且在核菅 酸序列上与依赖病毒属成员具有很高的同源性，提示g p v 与依赖病毒可能起源予共 同的祖先【3 4 】。 4 鹅细小病毒的生物学特性 4 1g p v 的分类及形态学特征 g p v 为小鹅瘟的病原体，属细小病毒科、细小病毒属成员。病毒外观呈球形或 六角形，无囊膜，呈二十面体对称，有3 2 个壳粒。直径为2 0 2 2 n m 是一种单股 d n a 病毒，大小约为5 2 k b t 3 s i 。 4 2g p v 的理化特征 g p v 在氯化铯、蔗糖和氯化钠溶液中的浮密度分别为1 , 3 1 1 3 5g c m 3 、1 0 8 - 1 1 8 g e m 3 和1 4 1 1 4 3g c m 3 , 病毒有完整的病毒粒子和不含d n a 的空衣壳两种存在形式， 其在c 。c i 溶液中的浮力密度分别为1 3 9 1 4 2 9 c m 3 和1 2 9 1 , 3 1 c m 3 3 6 1 ，沉降系 数为9 0 5 s 。 因为g p v 无囊膜且结构紧密，所以g p v 对外界理化因素具有较强的抵抗力。据 报道m 掘3 哪，病毒粒子能抵抗各种化学试剂如乙醚、氯仿、n 一丁醇、0 5 苯酚、 1 1 0 0 0 福尔马林等的处理，在p h 3 溶液中毒力不减弱，并且具有较强的热稳定性。 方定一等报道f 4 】，病毒分离株在5 6 。c 加热l h ，接种后仍能使鹅胚死亡，5 04 c 下处理 3 h 对病毒滴度无影响。 4 3 g p v 的培养特性 g p v 在进行初代分离时，只能用鹅胚、番鸭胚或它们的原代细胞培养物，其它的 6 禽胚或细胞培养物均不能使细胞增殖1 4 2 1 。将病料悬液接种到1 0 1 5 同龄鹅胚尿囊腔 内，5 7 d 后胚体出现死亡，死亡胚胎周身出血、肝脏呈黄褐色。在鹅胚中连续传十 代以后，病毒对鹅胚的致死时间缩短至3 d 左右，死胚出现绒毛尿囊膜水肿，胚体多 数鲜红色，有充血和出血变化，心肌和肝脏变性。经鹅胚连续传十几代以后，病毒对 雏鹅的毒力明显减弱，将这种传代病毒接种鸭胚成纤维细胞培养物，不出现细胞病变， 培养物中所含病毒的浓度也很低。经鹅胚连续传三十代后，毒力显著降低，以至接种 雏鹅常不能使其发病。g p v 能适应于鹅胚成纤维细胞，将病料接种在未长满单层的鹅 胚或番鸭胚原代细胞培养物中，感染后3 - 5 d 纽胞出现折光性增强、圆缩直至溶解脱 落等明显病变。取这种细胞培养物经伊红一苏木素染色后可见c o w d r y a 型核内包涵体 和合胞体一“。 g p v 对体外细胞培养物的专一性很强，鹅和番鸭胚适应毒株可以在鹅和番鸭胚组 织培养细胞内增殖，在鸡胚成纤维细胞、兔肾上皮细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、猪的 肾上皮和睾丸细胞以及p k 一1 5 细胞上，均未见6 p v 增殖1 4 4 1 。f 丑晋红等报道1 4 5 i g p v 在 产蛋母鸡体内具有垂直传播和持续感染的特性。用g p v 强毒或鹅胚尿囊液或鸭胚化 弱毒人工接种产蛋母鸡，接种后5 7 d 在卵黄提取液中能测到病毒抗原，并一直持续 到4 5 d 。说明g p v 感染的鸡卵可暂时保存g p v 4 6 1 。 5 鹅细小病毒的基因组结构特点 g p v 是一种自主复制型细小病毒( a u t o n o m o u s l yr e p l i c a t i n gp a r v o v i r u s ) ，其基 因组为单股线性d n a ，含有数目基本相等的正链病毒粒子和负链病毒粒子。在病毒 核酸提取过程中，两种极性链很容易发生退火形成互补双链d n a ，大小约为5 k b ， 热变性的d n a 可用作单股分子变为双股分子的模板。病毒d n a 可作为模板在体外 复制形成大小约5 k b 的双股d n a 【4 7 1 。正负股d n a 分子均具有末端回文结构，是单 股d n a 分子易发生退火形成双链的原因【4 8 】。 g p v 基因组长为5 1 0 6 b p ，两端为回文序列折叠形成的发卡结构。即末端倒置重 复序列( i n v e r t e d t e r m i n a lr e p e a t s ，i t r ) 。中间为编码区，其中含有两个主要开放阅读 框架( o p e nr e a d f r a m e ，o r f ) ，两个o f f 之间阕隔1 8 n t 。左侧o r f ( 乙o r j ) 编 码非结构蛋白( r e p ) ，即调节蛋白n s l 、n s 2 ；右侧o r f ( r o r f ) 编码3 种结构 蛋白( v p ) ，即v p l 、v p 2 、v p 3 。整个编码区相互重叠，非结构基因和结构基因分 别终止于同一个终止密码子。 g p v 基因组的两端含有倒罱末端重复序列( i t r ) ，i t r 的大小和结构与人的细 小病毒b 1 9 非常接近【4 9 】。i t r 长4 4 4 个核苷酸， 5 端的4 0 7 个核苷酸可折叠形 成u 形双链发夹结构，发夹结构中含有1 8 1 b p 的无错配“茎”部和4 4 个碱基的 “泡”区，形成了一个形似“箭”状的结构，限制性内切酶s p hi 可切掉“箭头”， 形成二分对称中心。g p v 的正极性链和负极性链的3 和5 端均具有发央样结构。 i t r 中g c 含量高，其完整的“泡”区在e c o l i 中存在“翻”、“转”方向的互变， 表明i t r 是活跃的重组位点。 o p v 两端i t r 中均含有推测的与其它细小病毒檑类似的末端解离位点 ( t e r m i n a lr e s o l u t i o ns i t e ，t r s ) ，分别位于4 0 7 n t 、4 7 0 0 n t 处在病毒复制过程中n s l 以a t p 依赖方式在t r s 处切割d n a 的复制起始位点【5 0 】。i t r 中含大量长4 。1 0 个核苷酸的短重复序列，如“t t c c g g t ”或它的衍变形重复了1 8 次。另外，还存 在如y 盒、e 盒、g c 盒及a t f c r e b 、c f o s 、c m y c 、c b p 、a p 1 等川许多结 构域，这些短的结构域与己知的转录因子识别序列相吻合，表明d n a 结合蛋白的相 关结构域在i t r 中发现频率最高，揭示了i t r 在病毒基因组转录或复制调节过程中 发挥重要作用【5 2 l 。g p vi t r 内还具有由g t t c 形成的3 个四联碱基和由g a a c 形成的3 个四联碱基，这可能是g p vr b s 结合的结构区1 5 射。同时g p v 的i t r 与 其他细小病毒的i t r 相同，可作为复制的起点，并为包装提供顺式信号【5 4 。 6 鹅细小病毒的结构蛋白与非结构蛋白 6 1 结构蛋白 o p v 基因组共编码三种结构蛋白：v p l 、v p 2 和v p 3 。v p 3 是病毒的主要衣壳蛋 白，约占衣壳蛋白总量的8 0 【5 5 i 。其中衣壳蛋白v p l 和v p 3 的翻译分别起始于两个 a t g 密码子，衣壳蛋白v p 2 的翻译起始于不典型的的a c g 密码子。 衣壳蛋白是决定病毒嗜性、宿主域和致病性的关键因素。其中v p i 可协助痫毒 或其d n a 通过核孔转运至细胞核内，还可与宿主细胞的特殊受体结合，使病毒粒子 进行有效感染f 5 6 1 。v p 2 是主要免疫功能区，可刺激机体产生中和抗体，在没有v p l 的 存在下，v p 2 可自我组装病毒样颗粒酬。s t r a s s h e i m e 等研究犬细小病毒衣壳蛋白 时发现两个决定中和抗体产生位点区。一个位于纤突顶端，另一个位于v p 2 第3 0 0 个氨基酸残基周围及三倍体纤突的“肩”部，它们的碱基突变可引起病毒抗原性的变 化。李宝臣，齐岩等 5 明研究通过序列测定及分析证实，不同毒株鹅细小病毒v p 3 基 因存在如下共性：v p 3 基因全长均为16 0 5b p ，编码5 3 4 个氨基酸，只有一个完整的丌 放阅读框架。z a d o r i 等通过g p v 与a a v 2 衣壳蛋白三维结构模拟比较分析发现， 暴露于病毒粒子表面的氨基酸序列出现在v p 3 蛋白多肽链内，暴露于病毒衣壳表面 的氨基酸区域共有9 个，均位于三种结构蛋白的共同区内，即v p 3 段，故v p 3 可 能是暴露于g p v 表面的多肽是g p v 主要免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有 中和作用的抗体。 1 9 9 6 年，l eg a l l r e c u l e 等【6 】利用杆状病毒表达系统表达了番鸭细小病毒 ( m d p v ) 的v p 2 基因，表达产物可自我装配成m d p v 样空衣壳，接种番鸭后可 检测到e l i s a 抗体和中和抗体，说明具有免疫原性。1 9 9 9 年t a k e h a r a 等6 2 1 用杆状 病毒表达的g p v v p i 蛋白用于间接免疫荧光抗体实验( i f a ) ，取得良好的效果。近 期研究结果表明：v p l 不参与衣壳的形成和子代病毒的输出，但对于形成感染性病 毒粒子却必不可少【6 3 】。t u l l i s 等发现【6 4 l ，缺少v p i 的m v m 病毒粒子与野生型相 比可以更好的结合细胞，但不能引起有效的感染。试验证明v p i 的独特区不暴露于 病毒粒子表面，但用加热( 5 5 7 5 。c ) 或3 - 5 m o l l 的尿素处理后，可暴露出来，v p l 独特区在病毒衣壳侵入细胞后4 8 h 可检测到，同样证明此序列的暴露与衣壳转运至 细胞核有关。同时k a i l g a y a 发现1 6 5 lb 1 9 的v p i 可诱导产生中和抗体，提示v p l 可 能参与病毒粒子表面的构象改变，在部分脱壳后只瞬时出现在病毒粒子表面。最新研 究表踢b 1 9 v p i 独特区内存在一个磷脂酶a 2 的结构域，此酶活性表现为典型的 c a + 依赖性【6 6 1 。 6 2 非结构蛋白 g p v 基因组左侧o r f 编码至少两种非结构蛋白n s l 和n s 2 。根据g p v 、m d p v 、 a a v 2 非结构蛋白相似性。推测g p v 非结构蛋白有两个翻译起始点，第一个a t g 位 于g p v5 3 7 n t 处，起始最大非结构蛋白n s l ，第二个a t g 位于g p v1 0 6 5 n t 处，起始 n s 2 多肽”。 g p v 的n s 蛋白均为磷酸化蛋白，具有同a a v 2 的r e p 7 8 相似的生化特性：1 ， 具有d n a 高度亲和序列组成的d n a 复制区：2 ，具有同n t p 相结合的d n a 解旋酶 活性；3 t 含有双链线性d n a 复制特异起始区。研究证明g p vn s l 蛋白参与病毒 d n a 的复制、表达及对细胞的毒性作用；n s 2 可能与病毒核酸和蛋白的有效合成及 病毒增殖有关【6 8 , 6 9 1 。 细小病毒最大的非结构蛋白n s l 参与病毒生活周期中的许多重要步骤，如 d n a 的复制、转录的调节，对宿主细胞的毒性作用，而且n s l 还具有各种生物化 学功能，如与a t p 结合，a t p a s e 的活性，位点特异的d n a 结合和切割活性，解 旋酶活性等1 7 。研究发现n s l 蛋白与参与调节启动子活性的细胞内因子结合发挥各 种不同的功能，同时这些活性依赖于n s l 转移后的磷酸化或部分磷酸化 7 1 , 7 2 】。m v m 的研究表明细小病毒的另一非结构蛋白n s 2 本身不具有细胞毒性作用，但可协助 n s l 发挥对宿主细胞的毒性作用，其氨基末端为此作用的活性区域【7 3 】：缺失n s 2 基 因的突变子，感染初期衣壳蛋白可正常合成，但病毒粒子的装配受到削弱，最终影响 衣壳蛋白的合成 7 4 1 ：同时m v m 的n s 2 具有核输出信号( n u c l e a re x p o r ts i g n a l n e s ) 的功能，可与c r m i ( c h r o m o s o m a lr e g i o nm a i n t e n c e1 ) 相作用，使n s 2 从细胞核 不断输出到细胞质，在此发挥作用【7 5 1 。 7 鹅细小病毒与其它细小病毒的关系 7 1 鹅细小病毒与番鸭细小病毒的关系 番鸭细小病毒( m u s c o v yd u c kp a r v o v i m s ，m d p v ) 是引起雏番鸭细小病毒病的病 原，该病是近年来番鸭饲养中普遍存在的一种急性传染病 7 6 , 7 7 。在细小病毒成员中 g p v 与m d p v 同源性最高，两者核苷酸同源性为8 1 9 ，v p l 的氨基酸同源性为 8 7 ，7 ，低于非结构蛋白的同源性，这可能是宿主免疫系统的压力所致。衣壳蛋自中 变化最大的区域位于v p 2 的起始密码子到v p 3 之间的1 6 2 1 7 8 位氨基酸m 7 9 1 。 两者如此高的同源性表明它们具有共同的祖先。尽管g p v 与m d p v 在基因组结 构、致病性、流行病学、临床症状、病理变化等方面极为相似，抗血清也存在一定的 交叉保护性【8 0 1 ，但经核苷酸序列比较发现，g p v 比m d p v 在i t r 区缺失2 6 n t ， 编码区不存在缺失，但有许多替代现象具有不同的酶切图谱，存在的差异可能是由于 两种病毒的生活周期受细胞内因子的不同调节所致【8 1 i 。 7 2 鹅细小病毒与依赖病毒属成员的关系 腺联病毒( a a v ) 是依赖病毒属中的成员，是一类缺陷病毒，它们基因组不完备， 必须在有辅助病毒一腺病毒与之同时存在的条件下，才能复制出有感染性的后代。 g p v 与腺联病毒a a v - 2 不仅在病毒粒子的极性、基因组的特性等方面极为相似， 而且核苷酸序列及由核昔酸序列推导的氨基酸序列均具有很高的同源性。a a v 的非 结构蛋白r e p 7 8 与g p v 的n s l 的核心区域的核苷酸序列同源性达到6 7 ，氨基 o 酸序列同源性为8 3 ，该区域包含了四个高度保守的n t p 螺旋酶结合位点。经 d n a 杂交研究证明，g p v 与a a v _ 1 、a a v - 3 比a a v - 2 更相近。这些均表明g p v 与a a v 可能具有共同的起源 8 2 , 8 3 】。尽管g p v 和a a v - 2 在复制方式上差异很大， 但是k i s a r y 报道g p v 与鸭瘟病毒共转染非分裂期的细胞可产生子代病毒【8 4 】， y a k o b s o n 报道a a v - 2 在某些特殊条件下不需辅助病毒就可以自主复制8 5 i ，这更表明 了两者在进化方面的密切关系。 7 3 鹅细小病毒与红病毒属成员的关系 红病毒属中唯一确定的成员是b 1 9 病毒，主要引起入的皮疹、慢性溶血性贫血、 孕妇流产和死胎等。b 1 9 与g p v 的基因组结构非常相似，也是术端具有i t r 结构的 单链d n a ，正负极性的病毒粒子约各占一半，在核苷酸提取过程中，也易退火形成 双链d n a ”j 。 8 本试验的目的和意义 l e g r a n d 已阐明m m v 病毒非结构蛋白n s l 和n s 2 对细胞有毒性作用，n s 2 蛋 白可能与病毒d n a 和蛋白质有效合成以及病毒增殖有关。王君伟，李勐等8 7 i 首先 对鹅细小病毒的n s l 蛋白进行了克隆和原核表达。目前有关鹅细小病毒的非结构蛋 白n s l 基因产物生物学活性的研究尚未见报道，本试验目的在于克隆出g p v 非结 构蛋白n s l 基因，然后进行原核表达并对其结构性质进行研究，进而为对非结构蛋 白n s l 进行开发利用打下基础。 细小病毒可以抑制多种肿瘤的发生，包括不同类型的肿瘤以及不同诱变剂( r n a 和d n a 肿瘤病毒、化学致癌物) 引发的肿瘤l 韶】。但经常从肿瘤组织或细胞中分离 出细小病毒，说明细小病毒不能彻底地抑制肿瘤的发展。从肿瘤中分离出细小病毒， 这种现象出现的原因可能是：肿瘤组织为细小病毒的增殖提供了适宜的环境条件8 9 】。 目前的研究推测细小病毒的抑瘤作用与其非结构蛋白的毒性有关。本研究将为进一步 研究g p v 非结构蛋白n s l 的生物学活性奠定基础。 目前有关鹅细小病毒的研究主要集中在病毒结构蛋白方面，而对非结构蛋白的 研究则少有报道 9 0 1 。故本研究克隆出g p v 的ns 1 基因，并将其亚克隆x p q e 3 0 x a 载体的多克隆位点，然后在大肠杆菌m 1 5 q u 进行了原核表达。为研究ns l 的免疫原 性及其在细胞毒性、病毒的复制等方面的作用葜定了必要的基础。 第二部分材料与方法 1 材料与仪器 】1 种毒 g p vy z 株出扬州大学王永坤老师提供。 1 2 质粒与菌种 克隆载体p m d l 8 一t ，购于大连宝生物工程有限公司：感受态m 1 5 大肠杆菌，由本 教研室保存。 1 3 引物 参考o e n b a n k 发表的g p vb 株全基因序列，设计一对用以扩增g p vn s l 基因的引 物，由大连宝生物工程有限公司合成。 上游引物g f5 t t 鳗! 盟t c t g c t c t c a g a g a g a a c g 一3 t ，设计一个b a m hi 位点。 下游引物g rs t - g g t c g a c t a t c t g c t t t g a g t c a t c t t 一3 t ，设计一个妇i 位点。 1 4 主要试剂 t a q 聚合酶，限制性内切酶b a , z z h i 、s a li 购于大连宝生物工程有限公司：t 4d n a 连接酶购于p r o m e g a ：x - g a l 、i p t g 购于g i b c o 公司：a m p 购于a m e r s c o 公司。 1 5 主要仪器设备 恒温水浴锅：恒温数显水浴锅h h - s 6 ，国立环境试验设备研究所 纯水仪：k l u p 一8 0 1 0 型超纯水机，成都唐氏康宁科技发展有限公司 低温台式高速离心机：( k u b o t a ) 6 2 0 0 型高速冷冻离心机，北京东迅天地医疗器械 有限公司 p c r 仪：t c 一5 1 2 梯度p c r 仪，美国惠泽公司 恒温培养箱：d n p - 9 0 5 2 电热恒温培养箱，上海精宏 超净工作台：d z x l 5 1 0 ，上海精密 垂直板电泳系统：b a i s t 双垂直系列电泳槽，上海邦华科学器材行 紫外分光光度计：$ 5 2 紫外分光光度计，上海精密 水浴振荡器：w r 一1 型恒温水浴振荡器，上海思尔达科学仪器有限公司 微型混合器：h - 1 微型漩涡混合型，上海精密 超声清洗仪：k q 一8 0 0 g t d v 型超声波清洗器，上海精密 直流电泳仪：g e 一1 0 0 型，杭州博日科技有限公司 电子天平：b x 型电子天平，日本岛津 2 实验方法 2 1g p v 病毒的增殖及鉴定 将种毒g p v 适当稀释后经尿囊腔接种1 3 同龄的非免疫鹅胚，收集接种后3 5 天死亡的鹅胚尿囊液，用阳性血清作琼脂扩散试验进行鉴定，一2 0 冻存备用。 2 2g p v 病毒核酸的提取( 蛋自酶k 、s d s 法) 取含g p v 的鹅胚尿囊液、9 0 c 水浴1 0 m i n 后，冰浴5 m i n 。取水浴处理过的鹅胚尿 囊液4 3 7 5 u l ，加蛋白酶k 至终浓度为5 0 0 u g m l ，s d s 至终浓度1 。5 6 c 水浴lh 。 加等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：i ) ，充分混匀，1 0 0 0 0r m