（内科学专业论文）穿心莲内酯对博来霉素致大鼠肺纤维化的影响.pdf

大鼠肺纤维化的影响。方法：取健康雄性s d 大鼠9 0 只，随机分为 生理盐水( n s ) 组、b l m 组、泼尼松( p r e d ) 组、不同剂量穿心莲 内酯组( 即穿a 组6 2 5 m g l ( g 、穿b 组1 2 5 m g l ( g 、穿c 组2 5 0 m g l 【g ) ， 各组大鼠1 5 只，分别气管内灌注b l m ( b l m 组、p r e d 组、穿a 组、 穿b 组、穿c 组) 或n s ( n s 组) 后，每天给予n s ( n s 组、b l m 组) 、p r e d ( p r e d 组) 或穿心莲内酯( 穿a 组、穿b 组、穿c 组) 灌 胃，各组分别于气管内灌注药物后第7 、1 4 、2 8 天处死大鼠5 只。用 h e 、m a s s o n 染色观察肺泡炎症和纤维化改变；实时荧光定量逆转录 一聚合酶链反应( i 圃- 血mn u 泺s 硎卿刎蛔确懈咖s a 礁湎誓灿燃 d l 血幽，f qr 1 1 - p c r ) 检测肺组织i 、i 型胶原i i l 】刚a 表达；酶 联免疫吸附试验( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b n e n ta s s a y ，e l i s a ) 测 定支气管肺泡灌洗液( b 舢- 一f ) 中n 盯眠t g f p l 浓度；同时监测肾 功能指标血尿素氮( b u n ) 、肌酐( c r ) 及肝功能指标血丙氨酸氨 基转移酶( 舢) 、天冬氨酸氨基转移酶( a s t ) 。结果：( 1 ) 肝肾 功能监测显示：不同剂量穿心莲内酯组、n s 组、b l m 组、p r e d 组所 监测的a s t 、a l t 、b u n 、c r 比较，差异无统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。 ( 2 ) n s 组大鼠肺组织未发现肺泡间隔水肿、炎性细胞浸润和纤维化 形成。b l m 组第7 天时肺泡腔内可见大量炎性细胞浸润，第1 4 天时 肺泡炎仍存在，但炎症细胞明显减少，肺泡间隔内成纤维细胞明显增 多，肺泡结构破坏，肺泡隔增宽，第2 8 天时炎症较前减轻，肺纤维 化程度加重，部分肺泡腔消失，形成严重纤维化。穿a 组病理形态 改变与b l m 组相似。p r e d 组、穿b 组、穿c 组大鼠第7 天有较多的 炎症细胞浸润及局部聚积，第1 4 天和第2 8 天的纤维化病理改变均较 b l m 组、穿a 组明显减轻。( 3 ) n s 组各个时间点b a l f 中t g f p l 、 n 师0 【含量均明显低于同时间点b l m 组、p r e d 组、穿a 组、穿b 组、穿c 组b a l f 中的浓度，差异有统计学意义( 户 o 0 5 ) 。b l m 组三个时间点b a l f 中t g f b 1 、n 师0 【含量较p r e d 组、穿b 、穿c 组高，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。与b l m 组比较，穿a 组b a l f 中t g f p 1 、n 晒a 含量无统计学差异。( 4 ) n s 组各个时间点肺组织 i 、i 型胶原m r n a 表达均明显低于同时间点b l m 组、p r e d 组、 穿a 组、穿b 组、穿c 组肺组织中的表达，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。b l m 组三个时间点i 、型胶原1 1 1 】5 斟a 表达较p r e d 组、 穿b 组、穿c 组高，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。与b l m 组比较， 穿a 组肺组织i 、i 型胶原m r n a 表达无统计学差异。结论：一定 剂量穿心莲内酯灌胃可减轻博来霉素致肺纤维化大鼠肺泡炎和肺纤 维化程度，降低肺组织i 、型胶原i i 删a 表达，降低b a l f 中 t n f 叭t g f p l 浓度，且对肝肾无明显毒副作用。 关键词：穿心莲内酯；博来霉素；肺纤维化；泼尼松 a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：1 oi i l v e s t i g a t et h ee 骶c t so f a n d r o 伊a p h 0 1 i d eo nb l e o m y c i n ( b l m ) 一m d u c e dp u l m o n a 巧f i b r o s i si nr a t s m e t h o d s ：9 0h e a l t l l ys dm a l er a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o6 g r o u p so na v e r a g e t h e yw e r en o m a ls a l i i l e ( n s ) g r o u p ，b l m g r o u p ，p r e d i l i s o n e ( p r e d ) g r o u pa n dd i 腩r e n td o s e so fa n d r o 驴 印h 0 1 i d eg r o u p s ( a n d r o g r a p h o l i d eag r o u p6 2 5 m 班g ，a n d r o 铲a p - h o l i d eb g r o u p12 5 m g l ( ga n da n d r o 伊a p h o l i d ecg r o u p2 5 0 m g l ( g ) i n 仃a t r a c h e a li n s t i n a t i o no fb l mw a sg i v e nt ob l mg r o u p ，p r e d g r o u pa j l da n d r o g r a p h o l i d ea ，b ，cg r 0 1 l p ，a 1 1 dn sw a sg i v e nt on s g r o u p u 曲i 1 1 仃a 仃a c h e a l a n dm e nn s ( n sg r o u p ，b l mg r o u p ) ， p r e d ( p r e dg r o u p ) o ra n d r o 伊a p h 0 1 i d e ( a n d r o g r a o h o l i d ea ，b ，c g r o u l p ) w a sg i v e nt or a t sb yg a v a g ee v e r yd a yf i v er a t so fe a c h g r o u pw e r e 虹1 1 e dr e s p e c t i v e l ya td a y7 ，14 ，2 8a r e ri n 仃a t r a c h e a l i i l s t i l l a t i o n a 1 v e o l i t i sa 1 1 d 舶r o s i sw e r eo b s e e db yh ea n dm a s s o n s t a i n i i l g r e a l t i m en u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v er e v e r s e 仃a n s c 邱t i o n 一 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( f qr 卫p c i uw a sp e r f i o n n e dt od e t e c t c o l l a g e n ia n d m r n ae x p r e s s i o ni i l 1 u n gt i s s u e ， a n dt l l e c o n c e n t r a t i o no ft n f 一0 【a n dt g f p1i nb r o n c h o a l v e o l a rl a v a g en u i d ( b a l f ) w a sd e t e m i n e db ye nz y t ne 一1 i n k e di m m u n o s o r b n e n ta s s a y - 3 b l o o du r e a n i 仃o g e n( b l 玎田， c r e a t i i l i l l e ( c r ) a l l da l a n i i l e 砌n o s f e r a s e ( 脚) ，唧叭a t e 锄i 1 1 0 仃a n s f e r a s e ( a s t ) w e r ea l s o e x a n 妇e d r e s u i t s ：( 1 ) 1 1 1 ec o m p a r i s o no f a s t 、舢l t 、b u n 、c r i i l d i 彘r e n td o s e so f g r o u pa n d r o 蹦l p h 0 1 i d e ，n sg r o u p ，b l mg r o u pa n d p r e dg r o u ph a dn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( 2 ) a 1 v e 0 1 a rs 印t a le d e m a ， i n f l a m m a t o 秽c e l li 1 1 f i l 仃 l t i o na n df i b r o s i sw e r en o tf o u l l di nn s g r o u p ag r e a td e a lo fi i l f l a m m a t o wc e l l si 1 1 f i l t r a t i o ni i l t om e a l v e 0 1 a u rw e r eo b s e e di 1 1b l m g r o u pa td a y7 t h ea l v e o l i t i sw a s s t i l l h e a v ya td a yl4 ，b u ti i l f l a n u i l a t o 巧c e l l sw e r es i g n i f i c a l l t l y r e d u c e d ，a n dt h en u m b e ro ft h e 舶r o b l a s t sa n dm a t r i xi na l v e o l a r s 印t l l mw e r eo b v i o u s l yi 1 1 c r e a s e d a tm es 锄et i m e ，a l v e o l a r s t r u c t u r ew a s d 锄a g e d a n da l v e o l a r s 印t u mw i d e n e d ； m e i n n a m m a t i o n r e l i e v e d ，p u l m o n a 巧f i b r o s i s i i l c r e a s e d ，p a r t s o f a l v e 0 1 a u rs p a c ew a s d i s a p p e a r e da n ds e v e r ef i b r o s i sw a sf o u n da td a y 28 i tw a ss i m i l a ri 1 1p a t l l o m o 印h 0 1 0 9 yb e t e e na n d r o 铲印h 0 1 i d ea g r o u pa n db l mg r o u p al o to fi n n a n l l l l a t o 巧c e l l si i l f i l 仃a t i o na i l d 1 0 c a la c c u m u l a t i o nw e r eo b s e r v e da td a y7i 1 1g r o u pa 1 1 d r o g r a p h 0 1 i d e b ，ca n dp r e d l u n gt i s s u ee d e m aw a sn o to b v i o u s ，a n dm e p a c l l 0 1 0 9 i c a lc h a n g eo f 舶r o s i sa td a y14 ，2 8w a sm o r es i g i l i f i c a n t l y r e d u c e dt 1 1 a i l g r o u pa i l d r o g r 印h o l i d eaa n db l m ( 3 ) t h e c o n c e n 仃a t i o no f t g f p l 、盯岬一ai i lb a l fo fn s g r o u p a te a c ht i m e p o m w a s s i 9 1 1 i f i c a n t l y 1 0 w e rt h a n g r o u pp r e d ，b l m ， 4 a i l m o 伊a p h 0 1 i d ea ，b ，ca tt l l es 锄et i m ep o m ，a n d 廿1 ed i 毹r e n c e h a ds t a t i s t i c a ls i 嘶f i c a n c e 俨 o 0 5 ) t h ec o n c e n 瞳a t i o no ft g f p1 a n d 耵昨一ai 1 1b a l fo fb l m g r o u pa td a y7 ，1 4 ，2 8w 嬲h i 曲e r t h a n p r e dg r o u p ，a n d r o g r 印h o l i d eb g r o u pa 1 1 da i l d r o 聊h o l i d ecg r o u p ， a n dm ed i 丘j ；。r e n c eh a ds t a t i s t i c a ls i 印i f i c a n c e ( p o 0 5 ) c o m p a u r e d w i mb l m g r o u p ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft g f p la n dt 砸- ai nb a l f o fa n d r o 鲫h o l i d ea g r o u ph a dn os t a t i s t i c a ls i 班i f i c a n c e ( 4 ) t h e e x p r e s s i o no fc 0 1 1 a g e ni 龇l di m r n a i i ll u n gt i s s u eo fn s g r o u p a te a c ht i m ep o i n tw a ss i g n i f i c a n t l y1 0 w e rt 1 1 a l lg r o u pp r e d ，b l m ， a n d r o 伊印h 0 1 i d ea ，b ，ca tt h es 锄et i m ep o i n t ，a n dt 1 1 ed i 筇胃e n c e h a ds t a t i s t i c a l s i 盟i f i c a l l c e ( 尸 o 0 5 ) t l l ee x p r e s s i o no fc o l l g e ni a n d i i 讧ai i ll u n gt i s s u eo fb l m g r o u pa td a y7 ，1 4 ，2 8w a s h i 曲e r l a l l p r e d g r o u p ，a n d r o 鲫h o l i d e b g r o u p ，a n d a n d r o g r a p h 0 1 i d ecg r o u p ， a n dt 1 1 ed i 虢r e n c eh a ds t a t i s t i c a l s i 盟i f i c a l l c e ( 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dw i mb l mg r o u p ，t h ee x p r e s s i o n o fc 0 1 l a g e nia i l di m r n ai i ll u i l gt i s s u eo fa 1 1 d r o g r a p h 0 1 i d ea g r o u ph a dn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a i l c e c o n c l u s i o n ：i nb l e o n b i n g r o u pn a nn os t a t l s t l c a 上s 1 9 n l t l c a i l c e c o n c l u s i o n ：l l lb l e o n l 、1 n - i n d u c e dr a tp u l m o n a i yf i b i o s i s ，ac e r t a i nd o s a g eo fa n c i r o g i a p h 0 1 i d e - 1 n d u c e a 残旺p u n n o n a i v 士l b i o s l s ，ac e r t a l nd o s a g eo 士a n c l r o g i a d h o n d e c o u l da t t e n u a t ea 1 v e o l i t i sa n d 肋r o s i s ，d e c r e a s em r n a e x p r e s s i o no f c o l l a g e n ia n di i ii i l 1 u n gt i s s u ea n dd e c r e a s et l l ec o n c e n 仃a t i o n o ft n f 一0 【a n dt g f p1i 1 1b a l f i th a dn os i d ee f l f e c t so nl i v e ra n d h d n e y 劬c t i o n - 5 k e yw o r d s ：a 1 1 d r o 铲a p h o l i d e ；b l e o m y c i i l ；p u h n o n a 哕f i b r o s i s ； p r e d n i s o n e 6 病率( 2 0 2 1 0 0o o o ) 稍高于女性( 1 3 2 l o oo o o ) 【1 1 。i p f 是一种典型 的进展性疾病，可以导致明显的劳动能力丧失，5 年存活率仅为 2 0 【1 】【4 】。过去认为，不间断的炎症反应导致进展性的肺纤维化，因 而i p f 的治疗方案被设计为通过抑制免疫系统阻断炎症进展来减轻 后续的纤维增殖【1 1 。尽管缺乏有力的证据，皮质激素( 如泼尼松) 和 ( 或) 细胞毒性药物仍曾被用作首选药物治疗，但由于其治疗效果差， 加之副作用大，因此寻找新治疗策略已经刻不容缓【1 】【4 】。 气管内灌注博来霉素( b l e o m y c i n ，b l m ) 复制的肺纤维化动物 模型，其病理组织学改变与i p f 有许多相似之处，是目前公认的、经 典的、成熟的研究i p f 实验方法。大鼠经b l m 处理后形成的纤维化 过程可以分为两个阶段，首先是以炎性细胞( 如巨噬细胞和多核白细 胞) 浸润为特征的急性期，即早期( 第1 7 天) 的肺泡炎阶段；随 后是一个以细胞外基质重塑与胶原沉积为特征的慢性过程，即晚期 ( 第1 4 2 8 天) 炎性损伤过度修复的肺纤维化阶段，其中第7 天肺 泡炎症最明显，抑制炎症反应有助于防止肺纤维化的发生【2 】【5 】。 穿心莲内酯( a n d r o g r a p h i s ) 为爵床科植物穿心莲中提取得到的 7 二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，具有抗炎、 抗病毒、提高免疫、抗肿瘤等作用网，目前对其研究热点主要在抗肿 瘤方面，作用机制可能为阻滞细胞周期忉，激活宿主免疫，抑制n 师a 产生【8 】，抑制核因子1 出( n f 心) 活性叼等方面。而其对肺纤维化作用 研究甚少，肺纤维化病理过程中炎症贯穿始终，而穿心莲内酯具有抗 炎、抑制核因子1 ( b ( n f 1 出) 活性等作用，因此推测其可预防或治疗 肺纤维化。 本研究中，我们观察了不同剂量穿心莲内酯灌胃对b l m 致肺纤 维化大鼠肺纤维化程度、支气管肺泡灌洗液中( b a l f ) t g f p 、n 晒a 浓度及肺组织i 、i i i 型胶原1 1 1 】州a 表达的影响。 材料和方法 1 实验动物 实验动物为成年雄性健康s d 大鼠9 0 只，体重1 8 0 2 0 0 9 左右， 购于泸州医学院实验动物中心，分笼饲养，自由饮水与摄食。 2 主要实验试剂 博来霉素a天津太河制药有限公司 穿心莲内酯四川济生堂药业有限公司 氯化钠市售分析纯 无水乙醇市售分析纯 溴化乙锭a l 砒e s c o 琼脂糖 s p a n i s h 公司 氯仿市售分析纯 异丙醇市售分析纯 氯胺酮江苏恒瑞医药股份有限公司 d e p ca m r e s c o i 、i 型胶原引物上海生物工程公司 鼬妊提取试剂盒 t l g e n 逆转录试剂盒成都博瑞克生物技术有限公司 r e a l - t i m ep c r 试剂盒上海生物技术有限公司 n 盯仅、t g f pe l i s a 试剂盒武汉博士德生物工程有限公司 3 主要实验仪器 光学显微镜o i 压p u s 通用手术器械上海医疗器械有限公司 电泳仪b i o 旧 凝胶成像系统 l a b w o r l “5 微量移液器 e p p e n d o r f 公司 电子称g & g 核酸电泳槽北京市六一仪器厂 b 3 2 0 型医用低速离心机白洋离心机厂 7 21o 分光光度计上海分析仪器厂虹桥分厂 b i o m d 酶标仪美国伯乐b i o r a d 公司 干燥箱上海实验仪器总厂 l e i c ad mi i m 荧光倒置显微镜德国l e i c a 公司 a b ip 血7 9 0 0 h t 型荧光定美国应用生物系统公司 量p c r 仪 超净台苏州安泰空气技术有限公司 4实验方法 4 1 肺纤维化动物模型的建立与分组及灌胃 将9 0 只重量约1 8 0 2 0 0 9 的健康雄性s d 大鼠，实验条件下饲养 1 周，随机分成6 组，即生理盐水( n s ) 组、b l m 组、强的松( p r e d ) 组，穿a 、b 、c 组，每组1 5 只。六组大鼠用氯胺酮( 1 0 0 m 眺g 体重) 腹腔注射麻醉并固定，在无菌操作下经气管两软骨环间隙朝向心端刺 入气管，将大鼠直立，继续朝向心端进针约1 o 1 5 c m ，回抽无阻力 见气体，穿刺成功，将含b l ma 5 ( 5 m g l ( g 体重) 的n so 2 o 3 1 1 1 1 注入气管( b l m 组、p r e d 组，穿a 、穿b 、穿c 组) ，同体积n s 注入n s 组，旋转动物，使药液在肺内分布充分、均匀。第二天开始 每天给予各组大鼠相应灌胃干预，p r e d 组给予5 m g l ( gp r e d ( 均溶于 2 m n s 中) ，穿a 组给予6 2 5 m g l 【g 穿心莲内酯，穿b 组给予1 2 5 m g l ( g 穿心莲内酯，穿c 组给予2 5 0 m g l 【g 穿心莲内酯，n s 组、b l m 组给 予n s2 l i l l 。六组分别于气管内灌注药物后第7 ，1 4 ，2 8 天各处死大 鼠各5 只。 4 2 i 、型胶原引物设计与合成 从美国国立生物技术信息中心( n c b i ) 获取大鼠i 、型胶原序 列，由上海生物工程公司设计合成引物。 4 3 支气管肺泡灌洗( b a l ) 氯胺酮( 1 0 0 m g l ( g 体重) 腹腔注射麻醉大鼠后开胸，暴露心肺， 右心室采血处死动物( 血清用于肝肾功检测) ，剪开左心耳，经肺动 脉插管注入n s ，冲洗双肺至肺脏呈苍白胶冻样，结扎左主支气管， 右肺用n s 行b a l5 i i l l 8 次，回收b 脚于无菌离心管中，离心( 4 ，1 2 0 0 印m 1 5 m i n ) 。离心后上清液装入1 0 0 1 1 1 1 无菌瓶中，7 0 冰 箱中保存备用。 4 4 肺组织标本的留取 b a l 后结扎右主支气管，经气管向左肺注入4 多聚甲醛，使胸 膜展开，结扎气管后将左肺置于4 多聚甲醛中固定。在不同部位任 意取材三块，常规制成5 岬的石蜡切片，h e 染色观察肺泡炎、m a s s o n 染色观察肺纤维化程度。肺泡炎分级 9 】：o 级，无肺泡炎；i 级，轻 度肺泡炎，受累面积 5 0 。肺纤维化分级1 0 】： 0 级，无纤维化；i 级，轻度纤维化，受累面积 4 0 。用1 、 2 、3 、4 、5 分分别代表o 、i 、i i 、级进行肺泡炎和肺纤维化 严重程度评分。右肺放入7 0 冰箱保存备用。 4 5 肝肾功能检测 右心室取血，血清用全自动生化分析仪检测肝肾功能。 4 6 酶联免疫吸附试验( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 测定b 舢一f 中t g f p 1 、n 晒伐浓度 4 6 1原理：按e u s a 试剂盒说明书进行：采用双抗体夹心酶联免疫 吸附法测定n 师一0 【、t g f p1 ，抗大鼠t n f 0 、t g f - p1 单克隆抗体包被 于酶标板上，标准品和样品中的上述细胞因子与相应单抗结合，加入 生物素化的抗大鼠n 旺扒t g f p1 ，形成免疫复合物连接在板上，辣 根过氧化物酶标记的s t 玎e p t a v i d i n 与生物素结合，t g - f - p 1 、n 师一0 【试剂 盒加酶底物四甲基联苯胺( 3 ，3 ，5 ，5 t 咖m e t h y l be n z i d i n e ，t m b ) 出现 蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄。在4 5 0 l 1 1 处测吸光度( o p a c i t y d e n s i 劬 o d ) 值，t g f b 1 、n 盯仅的浓度与o d 值成正比，可通过绘制标准曲 线求出b a l f 中细胞因子的浓度。 4 6 2 准备试剂 洗涤液用双蒸水1 ：2 0 稀释 底物工作液配制 标准品液配制 4 6 3 检测程序 每片底物放入5 m 1 底物稀释液中溶解 每管加入蒸馏水2 0 0 “l 溶解 4 6 3 1 标准曲线的建立： ( 1 )设标准孔8 孔，每孔各加入样品稀释液1 0 0 山。 ( 2 )第一孔加标准品1 0 0 p l ，混匀后用加样器吸出l o o 山，移至 第二孔，如此反复对倍稀释至第七孔。 ( 3 )从第七孔中吸出1 0 0 山弃去，使之体积均为1 0 0 山。 ( 4 )第八孔为空白对照。 ( 5 )待测品孔每孔加入待测样品1 0 0 m 。 ( 6 )将反应板充分混匀后置3 7 1 2 0 i i l i n 。 ( 7 )用洗涤液将反应板充分洗涤4 6 次，向滤纸上印干。 ( 8 )每孔加第一抗体工作液5 0 山。 ( 9 ) 将反应板置3 7 6 0 觚n 。 ( 1 0 ) 同前洗板。 ( 11 ) 每孔加酶标抗体工作液1 0 0 山。 ( 1 2 ) 将反应板置3 7 6 0m i n 。 ( 1 3 ) 同前洗板。 ( 1 4 ) 每孔加入底物工作液1 0 0 肛1 ，置3 7 暗处反应5 1 0 i i l i n 。 ( 1 5 ) 每孔加入1 滴终止液混匀。 ( 16 ) t g f p1 、n 盯一仪在4 5 0 砌处测o d 值。 ( 1 7 ) 根据各标准品的浓度和o d 值作图，绘出标准曲线。 4 6 3 2 样品的检测 ( 1 ) b a l f 浓缩1 0 倍后再测定。 ( 2 ) 待测品孔每孔各加入待测样品1 0 0 山。 ( 3 ) 余步骤同上。 ( 4 ) t g f - p l 、t n f - 0 【在4 5 0 m n 处测o d 值。 ( 5 ) 根据样o d 值在该曲线图上查出相应细胞因子的含量。 4 7 实时荧光定量p c r 检测肺组织i 、i 型胶原m r n a 的表达 4 7 1 肺组织总对峪的提取 7 0 冰箱中取出肺组织，称重1 0 0 2 0 0 m g 提取总础妊，具体步 骤如下： ( 1 ) 研钵中加入液氮，研碎肺组织移入1 5 r n le p 管中。 ( 2 ) 加1 1 1 1 1 裂解液i 泫，混匀，置室温5m i n 。 ( 3 ) 4 离心，1 2 0 0 0 9 5m i n 。 ( 4 ) 仔细吸取上层水相，移入另一e p 管中。 ( 5 ) 加氯仿o 2 “，摇振1 5s ，置室温21 1 1 i n 。 ( 6 ) 4 离心，1 2 0 0 0 9 1 0m i n ，转移水相到新e p 管中。 ( 7 ) 缓慢加入0 5 倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱c r 3 中，4 离心，1 2 0 0 0 9 3 0 s 。 ( 8 ) 加漂洗液r w 漂洗三次，4 离心，1 2 0 0 0 9 3 0 s ，静置2 i i l i n ，弃废液，晾干。 ( 9 ) 沉淀重置于无r n a s e 水中，7 0 冰箱保存备用。 4 7 2r n a 纯度检测及定量 取提取的砌蛆溶液4 m ，检测砌妊纯度和浓度，所测样品 a 2 6 0 眦8 0 比值在1 7 2 o 之间，表示砌临纯度较好，适于试验。 4 7 3 实时荧光定量r 1 一p c r 检测肺组织i 、i 型胶原m r n a 表达 4 7 3 1 p c r 引物的设计与合成：分别合成i 型胶原( 1 7 8 b p ) 、i 型 胶原( 1 6 2 b p ) 及 廿d h ( 内参照，1 4 l b p ) 引物： i 型胶原上游引物：5 a t c a a g g t c t a c t g c a a c a t 3 t i 型胶原下游引物：5 c a g g a t c g g a a c c t t c g c t t 3 t i 型胶原上游引物：5 t g c c a c c c t g 础蛇t c a a g a g c 3 i 型胶原下游引物：5 a g c a c c a g c a t c t g t c c a c c a 3 g a p d h 上游引物：5 c c t c c a g a 订g t c a g c a a t 3 g a p d h 下游引物：5 c c a t c c a c a g t c t t c t g a g t 3 4 7 3 2 操作流程 ( 1 ) 按试剂盒说明书结合使用经验，加下列组分到置于冰上的小 离心管中配制成i 盯反应体系( 总体积：2 0 “l 管) 组分加入体积 r n a s ef r e eh 2 0 5 i 盯b u 虢r d n t p s u p e r - 对 i m e n h a n c c r o l i g o ( d t ) 18 模板i a 8 山 4 m 2 山 o 5 “l o 5 m 1 山 3 山 1 5 ( 2 ) 将上述体系置入p c r 扩增仪中进行l h 反应，将训卧队转 换为c d n a ： ( 3 ) 将c d n a 放入4 冰箱保存。按试剂盒说明书结合使用经验， 加下列组分到置于冰上的小离心管中，s r 骶e n 掺入法配制实时 荧光定量p c r 反应体系( 总体积：2 5 山管) 组分 加入体积( 山) 灭菌蒸馏水8 s y b r g r e e nr e a l t i m ep c rm a s t e rm i x 12 5 目的基因上游引物( 1 0 小) 1 目的基因下游引物( 1 0 州) l 样品溶液2 5 ( 4 ) p c r 循环( 三步法，退火温度5 7 1 延伸温度7 2 ) 5 统计学处理 应用s p s s l 3 o 统计软件进行统计学处理，数据用均数标准差 ( f 妇) 表示，样本均数的比较采用单因素方差分析和g 检验，以铲o 0 5 为检验水准，如果尸 o 0 5 ) 。见表1 。 表1穿心莲内酯灌胃对大鼠肝肾功的影响( n _ 5 ，f 士s ) t a b l e1me 行e c to f 锄d r o 伊a p h 0 1 i d eo nl i 懈锄dk i d i l e y i n 眺( n _ 5 ，i 士s ) 注：用、尸2 、丹、p 4 、丹分别为b l m 组、p r e d 组、穿a 组、穿b 组、穿c 组 与n s 组比较所得p 值。 n o t e ： p j ，f 2 ，丹，p 4 ，丹w e r e 也er e s u l t s o fb l mg r o u p ，p r c dg r o u p ， a 1 1 d r o 聊h 0 1 i d eag r o u p ，a n d r o g r a p h o l i d ebg r o u p ，a n d r 0 笋a p h 0 1 i d ecg r o u pc o m p a r e d w i n ln l e n s 孕d u p 1 8 2 肺组织病理变化 2 1 大体形态观察 n s 组大鼠双肺呈粉红色，表面光滑，弹性好。b l m 组、穿a 组大鼠双肺呈苍白色泽，肺体积明显缩小，硬度显著增加，弹性明显 降低，可见散在细小出血点。p r e d 组、穿b 组、穿c 组第7 天大鼠 双肺呈苍白色泽，肺体积无明显缩小，可见散在出血点，第1 4 天与 第2 8 天比较大体形态无明显差异，双肺呈苍白色泽，肺体积明显缩 小，硬度显著增加，弹性降低，可见细小出血点。 2 2 肺组织病理学观察 n s 组大鼠肺组织未发现肺泡间隔水肿、炎性细胞浸润和纤维化 形成。b l m 组第7 天时肺泡腔内可见大量炎性细胞浸润，第1 4 天时 肺泡炎仍存在，但炎症细胞明显减少，肺泡间隔内成纤维细胞明显增 多，肺泡结构破坏，肺泡隔增宽，第2 8 天时炎症较前减轻，肺纤维 化程度加重，部分肺泡腔消失，形成严重纤维化。穿a 组病理形态 改变与b l m 组相似。p r e d 组、穿b 组、穿c 组大鼠第7 天有较多的 炎症细胞浸润及局部聚积，第1 4 天和第2 8 天的纤维化病理改变均较 b l m 组、穿a 组明显减轻。见表2 3 ，图1 1 2 。 图l 图2 图1 、2n s 组大鼠第2 8 天肺组织，肺泡间隔无增厚，无炎性细胞浸润，未见纤维化组织。 图1 ：脏染色2 0 0 ；图2 ：m 舔s o n 染色4 0 0 。 图3图4 图3 、4b l m 组大鼠第2 8 天肺组织，正常肺泡结构破坏，肺泡腔融合、闭陷、消失，由 胶原纤维和炎症细胞占据。图3 ：脏染色2 0 0 ；图4 ：m 髂s o n 染色4 0 0 。 图5图6 图5 、6 穿a 组大鼠第2 8 天肺组织，正常肺泡结构破坏，肺泡腔融合、闭陷、消失，由胶 原纤维和炎症细胞占据。图5 ：脏染色2 0 0 ；图6 ：m 嬲s o n 染色4 0 0 。 2 0 图7 、8 ：穿b 组大鼠第2 8 天肺组织，正常肺泡结构破坏，见炎症细胞和纤维增生，肺纤维 化程度较b l m 组及穿a 组反应轻。图7 ：脏染色2 0 0 ；图8 ：m 勰s o n 染色4 0 0 。 图9图1 0 图9 、1 0 ：穿c 组大鼠第2 8 天肺组织，见炎症细胞和纤维增生，肺纤维化程度较b l m 组 及穿a 组反应轻。图9 ：h e 染色2 0 0 ；图1 0 ：m 舔s o n 染色4 0 0 。 图1 1图1 2 图1l 、1 2 ：胁d 组大鼠2 8 天肺组织，见炎症细胞和纤维增生，肺纤维化程度较b l m 组及 穿a 组反应轻。图1 l ：脏染色2 0 0 ；图1 2 ：m 鹤s o n 染色4 0 0 。 2 1 表2 穿心莲内酯灌胃对b l m 致肺纤维化大鼠肺泡炎程度的影响( n - 5 ，i 土j ) t a b l e2t h ee 虢c to fa n d r o 伊a p h o l i d eo nt h ed e g r c eo fa l v e o l i t i si nb l e o m y c i n i n d u c e d er a tp u l m o n a 巧f i b r o s i s ( n = 5 ，可士j ) 注：与n s 组比较a 尸 o 0 5 ；与b l m 组比较b 尸 0 0 5 ；与p r e d 组比较c 尸 0 0 5 ；与穿a 组比较d 尸 0 0 5 。 n o t e ：c o m p a r e dw i t hn s 乒o u pa 尸 o 0 5 ；c o m p a r e d 谢t hb l mg m u p 畛 0 0 5 ；c o m p a r e d 谢t hp r e d 伊o u pc 尸 o 0 5 ；c o m p a r e d 谢t ha n d r o 伊a p h o l i d eag r o u p d p o 0 5 表3 穿心莲内酯灌胃对b l m 致肺纤维化大鼠肺纤维化程度的影响( n _ 5 ，i 士j ) t a b l e3t h ee 脏c to fa n d r o 聊h o l i d eo nt h ed e g r e eo f 助r o s i si nb l e o m y c i n i n d u c e d ef 纰p u l m o n a 巧f i b r o s i s ( n = 5 ，f 士s ) 注：与n s 组比较a 尸 0 0 5 ：与b l m 组比较巾 o 0 5 ；与p r e d 组比较c 尸 o 0 5 ；与穿a 组比较d 尸 0 0 5 。 n o t e ：c o m p a r e d 埘t hn sg r o u p8 尸 o 0 5 ；c o m p a r e d 州t hb l mg r o l j pb p 0 0 5 ；c o m p a r e d 州mp r e dg r o u p 中 0 0 5 ；c o m p a r e d 州t h 锄d r o g r a p h o l i d eag r o u p 中 0 0 5 2 2 3e l i s a 测定b a l f 中t g f - p l 、t n f - 仅浓度 3 1 各组大鼠b j 心中t g f - p 1 浓度的变化 b l m 组、p r e d 组、穿a 组、穿b 组、穿c 组大鼠三个时间点 b 剐- 一f 中t g f p 1 浓度明显高于n s 组( 尸 o 0 5 ) 。与b l m 组比较， p r e d 组、穿b 组、穿c 组b a l f 中t g f p 1 浓度明显降低( p o 0 5 ) 。 与穿a 组比较，穿b 、穿c 组b a l f 中t g f p 1 浓度明显降低( 尸 o 0 5 ) 。p 删组、穿b 组、穿c 组b a l f 中t g f p 1 两两比较差异无 统计学意义。见表4 。 表4 穿心莲内酯对肺纤维化大鼠b a l f 中t g f p 1 浓度的影响( n = 5 ，f 士s ) t a b l e4t h ee 毹c to f a n d r o g r a p h 0 1 i d eo nt h ec o n c e l l t r a t i o no f t g f p 1i nb a l fi n b l e o m y c i ni n d u c c dr a tp u l m o n 哪矗b r o s i s ( n _ 5 ，i 士d 注；与n s 组比较中 0 0 5 ：与b l m 组比较b 尸 o 0 5 ；与p r e d 组比较c p 0 0 5 ；与穿a 组比较叩 0 0 5 。 n o t e ：c o m p a r e dw i mn s 酏u pa 户 0 0 5 ；c o m p a r o d 、析lb l m 印u p 巾 o 0 5 ；c o m p 躺dw i mp r e d 黟0 u p 。尸 o 0 5 ；c o i n p a r e dw i m 觚d r o g r a p h 0 1 i d eag r o u p 巾 o 0 5 2 3 3 2 各组大鼠b a l f 中n 师仅浓度的变化 b l m 组、p r e d 组、穿a 组、穿b 组、穿c 组大鼠三个时间点 b 铷强中t n f 一0 c 浓度明显高于n s 组( 尸 o 0 5 ) 。与b l m 组比较， p r e d 组、穿b 组、穿c 组b a l f 中t n f 0