（发育生物学专业论文）npm1在小鼠卵泡发育和黄体形成过程中的表达和功能研究.pdf

中文摘要i 英文摘要。i i i i 弓l 言。1 1 1 卵泡发育与黄体形成的研究进展。1 1 1 1 卵泡发育及其调控l 1 1 2 排卵机制及其调控3 1 1 3 黄体的形成及其调控4 1 2n p m i 基因的研究进展。5 1 2 1n p m i 基因的生物学特性5 1 2 2n p m i 基因的生物学功能6 1 2 3n p m i 基因与动物生殖1 0 1 3 本研究的目的与意义。11 2 材料与方法1 3 2 1 实验动物1 3 2 2 动物模型1 3 2 2 1 小鼠性成熟模型1 3 2 2 2p m s g 诱导卵泡发育模型。1 3 2 2 3p m s g 1 1 c g 诱导的排卵模型1 3 2 2 4p m s g m c g 诱导的黄体形成模型1 3 2 3 原位杂交：1 3 2 3 1c r n a 探针的制备1 3 2 3 2 原位杂交过程1 6 2 4 小鼠卵巢颗粒细胞收集和体外培养l8 2 5n s c 3 4 8 8 8 4 处理的体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞活力分析1 8 2 5 1 标线测定1 9 2 5 2 细胞活力测定。1 9 2 6w e s t e r nb l o t 方法1 9 2 7r t - p c r 检测n s c 3 4 8 8 8 4 处理的体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞中n p m l 、s t a r 、p 4 5 0 s c c 基因的表达。2 l 2 7 1p c r 引物的设计2l 2 7 2 颗粒细胞总r n a 提取。2 l 2 7 3 反转录反应2 1 2 7 4p c r 反应2 2 2 7 5p c r 产物相对定量分析2 2 3 结果2 3 3 1n p m l m r n a 在小鼠卵泡发育和黄体形成过程中的表达2 3 3 1 1n p m l m r n a 在小鼠性成熟中卵泡发育过程中的表达2 3 东北农业大学理学硕士学位论文 3 1 2n p m l m r n a 在p m s g 诱导下小鼠卵泡发育过程中的表达2 3 3 1 3n p m l m r n a 在p m s g h c g 诱导的排卵过程中的表达。2 3 3 1 4n p m lm r n a 在p m s g h c g 诱导的黄体形成过程中的表达。2 3 3 2n s c 3 4 8 8 8 4 对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响2 4 3 2 1n s c 3 4 8 8 8 4 处理体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞活力分析2 4 3 2 2n s c 3 4 8 8 8 4 对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞中n p m l 寡聚化蛋白水平的影响2 4 3 2 3n s c 3 4 8 8 8 4 对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞中n p m l 、p 4 5 0 s e e 、s t a r 基因表达水 平的影响。2 5 4 讨论2 7 4 1n p m l 与卵泡发育2 7 4 2n p m l 与黄体形成一2 8 4 3n p m l 与类固醇激素合成2 8 5 结论二31 致谢3l 参考文献3 2 图版。4 0 攻读硕士学位期间发表的学术论文。4 4 矗 f 一 ， c o n t e n t s c o n t e n t s a b s t r a c ti nc h i n e s e i a b s t r a c ti ne n g l i s h i i i 1i n t r o d u c t i o r 1 1 1r e s e a r c hp r o g r e s si nf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t , c o r p u sl u t e u mf o r m a t i o n 1 1 1 1f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ta n dr e g u l a t i o n 1 1 1 2o v u l a t i o na n dr e g u l a t i o r l 3 1 1 3c o r p u sl u t e u mf o r m a t i o na n dr e g u l a t i o n 4 1 2r e s e a r c hp r o g r e s si nn p m l 。5 1 2 1b i o l o g i c a lp r o p e r t yo f n p m l 5 1 2 2f u n c t i o na n dm e c h a n i s mo f n p m l 一6 1 2 3n p m li na n i m a lr e p r o d u c t i o n 1 0 1 3a i m so fr e s e a r c h 11 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 3 2 1a n i m a l s 1 3 2 2a n i m a l sm o d e l s 1 3 2 2 1s e x u a lm a t u r a t i o n 1 3 2 2 2f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c e db yp m s g 1 3 2 2 3o v u l a t i o ni n d u c e db vp m s g m c g ：1 3 2 2 4c o r p u sl u t e u mf o r m a t i o ni n d u c e db yp m s g h c g 13 2 ：；ns t uh y b r i d i z a t i o n 1 3 2 3 1p r e p a r a t i o no f c r n a p r o b e s 1 3 2 3 2p r o c e d u r eo f ns t uh y b r i d i z a t i o n 1 6 2 4o v a r yg r a n u l o s ac e l l sc o l l e c t i o na n dc u l t u r e 18 2 5c e l lv i a b i l i t ya n a l y s i so fc u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l st r e a t e dw i t hn s c 3 4 8 8 8 4 18 2 5 1d e t e r m i n a t i o no f s t a n d a r dl i n e 1 9 2 5 2d e t e r m i n a t i o no f c e l lv i a b i l i t y 1 9 2 61 眠s t e r nb l o t 1 9 2 7a n a l y s i so ft h ee x p r e s s i o no fn p m l 、s 认r 、p 4 5 0 s c ei nc u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l s t r e a t e dw i t hn s c 3 4 8 8 8 4b vr i ：p c r 2 1 2 7 1p r i m e rd e s i g no fp c r 2l 2 7 2t o t a ll ；【】j i ae x t r a c t i o n 2 1 2 7 3r e v e r s et r a n s c r i p t i o nr e a c t i o n 2 1 2 7 4p c rr e a c t i o n 2 2 2 7 5r 启i a t i v eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f p c rp r o d u c t i o n 。2 2 3r e s u l t s 2 3 3 1e x p r e s s i o no f n p m l m i 心悄。i nf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ta n dc o r p u sl u t e u mf o r m a t i o n 2 3 i i l 东北农业大学理学硕士学位论文 3 1 1e x p r e s s i o no f n p m l m r n ai nf o l l i c l ed u d n gs e x u a lm a t u r a t i o n 2 3 3 1 2e x p r e s s i o no f n p m l m r n ai nf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c e db yp m s g 2 3 3 1 3e x p r e s s i o no f n p m lm r n ai no v u l a t i n gf o l l i c l ei n d u c e db yp m s g h c g 2 3 3 1 4e x p r e s s i o no f n p m l m r n ad u n n gc o r p u sl u t e u mf o r m a t i o np m s g h c g 。2 3 3 2t h e s t e r o i d o g e n i ci nc u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l st r e a t e dw i t hn s c 3 4 8 8 8 4 2 4 3 2 1c e l lv i a b i l i t ya n a l y s i so f c u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l st r e a t e dw i t hn s c 3 4 8 8 8 4 。2 4 3 2 2t h ee x p r e s s i o no fn p m lp r o t e i no l i g o m e r si nc u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l st r e a t e d w i t hn s c 3 4 8 8 8 4 ：! z l 3 2 3t h ee x p r e s s i o no f n p m l 、p 4 5 0 s e e 、s t a ri nc u l t u r e dm o u s eg r a n u l o s ac e l l st r e a t e dw i t h n s c 3 4 8 8 8 4 ：1 5 4d i s c u s s i o n 2 7 4 1n p m la n df o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ：7 4 2n p m la n dc o r p u sl u t e u mf o r m a t i o n ：1 8 4 3n p m la n ds t e r o i d o g e n i c 2 8 5c o n c l u s i o n ，31 a c k n o w l e d g m e n t 3l r e f e r e n c e s ：；：! f i g u r e s 4 0 p u b u l i c a t i o n s 4 4 i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得一 ( 洼! 垫逡直基丝壶墨挂别重魉的! 奎拦亘窒) 或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：左j ：j t 日期：砒年多月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：士通日期：z 4 0 年月7 日 导师签名： f 钇牟 1 日期：纠汐年厶月7 日 f“ f p 摘要 摘要 核磷蛋白( n u c l e o p h o s m i n ，n p m i ) 是一种多功能蛋白，可参与核糖体的生物合成，通过 调节中心体的复制来维持基因组的稳定性，可在核质问穿梭，具有分子伴侣作用，并可通过 多种信号通路调节细胞增殖和凋亡，参与多种肿瘤的发生。 本实验利用原位杂交的方法检测了n p m l 在小鼠性成熟卵巢、p m s g 诱导的卵泡发育过 程、h c g 诱导的排卵以及黄体形成中的表达。在小鼠性成熟过程中，即从出生开始到出生后 4 0 天，n p m l m r n a 在各个阶段的卵泡中均有表达。n p m l m r n a 在原始卵泡和初级卵泡的 颗粒细胞中表达，随着卵泡发育，在次级卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞中的表达增强。在成熟 卵泡中，n p m l m r n a 在卵丘颗粒细胞中表达较强，壁颗粒细胞中表达减弱。在p m s g 诱导 的小鼠卵泡发育过程中，n p m l m r n a 在颗粒细胞中的表达从p m s g 处理后的第6 小时开始 增强，在第1 2 小时出现峰值，此时颗粒细胞处于增殖时期。在第3 6 小时和4 8 小时，颗粒细 胞增殖下降，n p m i m r n a 在颗粒细胞中的表达明显减弱。此外，小鼠注射p m s g4 8 小时之 后注射h c g ，诱导成熟卵泡排卵。在h c g 处理后4 小时和8 小时，n p m l m r n a 分别在排卵 前的g v b d 和卵丘扩展时的卵丘颗粒细胞中有较强的表达。在h c g 处理后1 6 小时和1 8 小 时的排卵后的卵泡中，n p m l m r n a 在壁颗粒细胞中表达较弱。注射p m s g4 8 小时后注射 h c g ，2 至3 天后，n p m i m r n a 在黄体形成过程中的黄体中有较强的表达。 我们于体外培养了小鼠原代颗粒细胞，用不同浓度的n p m l 的特异性抑制剂n s c 3 4 8 8 8 4 ( 0 州，0 5g m ，l 州，2 州) 处理2 4 h 后，利用r t p c r 技术检测了n p m l 、p 4 5 0 s e c 、 s t a r 基因的表达情况。结果显示p 4 5 0 s c c 基因的表达量随着n s c 3 4 8 8 8 4 浓度的增加而下降， 而s t a r 的表达没有显著的变化趋势，推测n p m l 可能通过作用于p 4 5 0 s c c 促进类固醇激素 的合成。 这些结果表明，n p m l 可能在小鼠卵泡发育的颗粒细胞增殖和黄体形成过程中起重要作 用，并且可能促进类固醇激素合成。 关键词核磷蛋白；卵泡发育；黄体形成；类固醇激素合成 ：0；r一 警f。 a b s t r a c t e x p r e s s i o na n d f u n c t i o no fn p m li nm o u s e o v a r y d u r i n gf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ta n dc o r p u sl u t e u m f o r m a t i o n a b s t r a c t n p m l ( n u c l e o p h o s m i n ) i sa m u l t i f u n c t i o n a lp r o t e i n n p m lp a r t i c i p a t e si nt h er i b o s o m e b i o g e n e s i s ；i tm a i n t a i n sg e n e t i cs t a b i l i t yt h r o u g ht h er e g u l a t i o no fc e n t r o s o m ed u p l i c a t i o n ；i t c o n s t a n t l ys h u t t l e sb e t w e e nt h en u c l e u sa n dc y t o p l a s m ；i th a sf u n c t i o n 弱m o l e c u l a rc h a p e r o n e ；i ti s i n v o l v e di nc e l l u l a ra c t i v i t i e sr e l a t e dt ob o t hp r o l i f e r a t i o na n dg r o w t hs u p p r e s s i o np a t h w a y s i nt h i ss t u d y , w eu s e d ns i t uh y b r i d i z a t i o nt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fn p m li nm o u s e o v a r yd u r i n gs e x u a lm a t u r a t i o n ，f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c e db yp m s qo v u l a t i o na n dc o r p u s l u t e u mf o r m a t i o ni n d u c e db yp m s g h c gw ef o u n dt h a td u r i n gs e x u a lm a t u r a t i o n f r o mb o r nt o4 0 d a y s a f t e rb i r t h , n p m1m r n ae x p r e s s e di n g r a n u l o s ac e l l s o ff o l l i c u l a r sa t e v e r ys t a g e n p m l m r n ae x p r e s s e di ng r a n u l o s ac e l l so fp r i m o r d i a lf o l l i c u l a r sa n dp r i m a r yf o l l i c u l a r s ，t h e e x p r e s s i o no fn p m li ng r a n u l o s ac e l l sw a se n h a n c e di ns e c o n d r yf o l l i c u l a r sa n da n t r a lf o l l i c u l a r s i nm a t u r ef o l l i c u l a r s ，n p m le x p r e s s e dh i g h l yi nc u m u l u sc e l l s ，a n dd e c r e a s e di ng r a n u l o s ac e l l s d u r i n gf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c e db yp m s g ，t h ee x p r e s s i o no fn p m li ng r a n u l o s ac e l l sw a s u p r e g u l a t e da f t e r6h o u r so fp m s gi n j e c t i o na n da c h i e v es u m m i t12h o u r sl a t e r , g r a n u l o s ac e l l s p r o l i f e r a t e da tt h i st i m e t h ee x p r e s s i o no fn p m ld e c l i n e ds i g n i f i c a n t l y3 6h o u r sa n d4 8h o u r s a f t e rp m s g i n j e c t i o n w ei n j c o t e dh c g 4 8h o u r sa f t e rp m s gi n j e c t i o nt oi n d u c eo v u l a t i o n 4h o u r s a n d8h o u r sl a t e r , h i g hl e v e ln p m l m r n aw a sf o u n di nc u m u l u sc e l l sw h e ng v b da n dc u m u l u s e x p a n s i o no c c u r r e db e f o r eo v u l a t i o n 16h o u r sa n dl8h o u r sl a t e r , aw e a ks i 霉a a lw a sd e t e c t e di n g r a n u l o s ac e l l sa f t e ro v u l a t i o n 4 8h o u r sa f t e rp m s gi n j e c t i o na n dt w od a y sa n dt h r e ed a y sa f t e r h c gt r e a t m e n t , t h e r ew a sa i l i g hl e v e lo f n p m le x p r e s s i o ni nn e w l yf o r m e dc o r p u sl u t e u m i nv i t r o ，w ec u l t u r e dm i c ep r i m a r yg r a n u l o s ac e l l s t r e a t e dw i 也d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f n p m ls p e c i f i ci n h i b i t o rn s c 3 4 8 8 8 4 ( 0 州，0 5 州，10 m ，2 州) f o r2 4h o u r s ，n p m l 、s t a r a n dp 4 5 0 s c c m r n aw e r ed e t e r m i n a t e db yr r p c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw i t ht h ee o n c e n t r a t i o i l s o fn s c 3 4 8 8 8 4i n c r e a s e d ，t h ee x p r e s s i o no fp 4 5 0 s c c m r n aw a sd e c l i n e d ，h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o n o fs t a r m r n ah a dn o s i g n i f i c a n tc h a n g i n gt e n d e n c y , s u g g e s tt h a tn p m l m a ys t i m u l a t e s t e r o i d o g e n i ct h r o u g hi n t e r a c t i o nw i t hp 4 5 0 s c c o u rd a t as u g g e s tt h a tn p m lm a yp l a yar o l ei ng r a n u l o s ec e l lp r o l i f e r a t i o nd u r i n gf o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t ，c o r p u sl u t e u mf o r m a t i o na n ds t i m u l a t es t e r o i d o g e n i c k e y w o r d sn u c l e o p h o s m i n ；f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ；c o r p u sl u t e u mf o r m a t i o n ；s t e r o i d o g e n i e i i i 东北农业大学理学硕士学位论文 i v c a n d i d a t e ：z u ot 0 n g s p e c i a l i t y ：d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f n ih u a l 矗 ， 引言 1 引言 1 1 卵泡发育与黄体形成的研究进展 1 1 1 卵泡发育及其调控 在哺乳动物中，卵巢的功能主要包括卵子的产生和生殖激素的分泌。卵泡发育( f o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t ) 是指卵泡由原始卵泡发育成为初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡的生 理过程。其中初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡为生长时期的卵泡( 杨增明等，2 0 0 5 ) 。 1 1 1 1 原始卵泡形成过程 在胚胎期，原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s 。p g c s ) 从卵黄囊迁移到生殖嵴，在生殖 嵴处分化成生殖细胞。对于雌性哺乳动物，生殖细胞分化成卵原细胞，卵原细胞边增殖边向 卵巢皮质迁移，随后卵原细胞开始进入减数分裂成为初级卵母细胞，并被一层纺锤状原始颗 粒细胞包裹后形成原始卵泡( e p p i ge ta l , 2 0 0 4 ；g i n s b u r ge ta t , 1 9 9 0 ) 。大量的原始卵泡聚集 在卵巢的皮质，形成原始卵泡库。近年来，发现了与原始卵泡形成相关的分子。b a x 是b 细胞淋巴瘤白血病蛋白家族成员( bc e l ll y m p h o m a l e u k e m i a ，b c l ) ，减数分裂开始发生前的 e 1 3 5 天，缺乏b a x 使此时的生殖细胞数量增加( g r e e n 佗l dc re ta t , 2 0 0 7 ) ，表明b a x 可 促进原始卵泡的形成。将新生鼠的卵巢体外培养，在雌激素，孕酮中培养7 天后，发现有较 少的单个卵母细胞和较多的生殖细胞群，表明这些类固醇激素可阻碍生殖细胞群的分散和原 始卵泡的形成( c h e n ye t 她2 0 0 7 ) 。在发育的小鼠中，雌性激素可阻止生殖细胞群的分散， 而在出生时这些雌性激素下降，使生殖细胞群分散，原始卵泡开始形成。( c h e nye t 口7 2 0 0 7 ； k e z e l epe t a t , 2 0 0 3 ) 。在啮齿类，n o t c h 通路可能在原始卵泡形成过程中起促进作用。在体 外培养的卵巢中，用丫分泌酶抑制剂阻止n o t c h 通路，导致原始卵泡形成减少，并维持了 生殖细胞群( t r o m b l yd je t 刃，2 0 0 9 ) ，所以n o t c h 通路可能在原始卵泡的形成过程中起促 进作用。 1 1 1 2 腔前卵泡的发育过程 原始卵泡启动募集进入生长卵泡阶段，初级卵母细胞周围的原始颗粒细胞由扁平变为立 方状的颗粒细胞，此时卵泡处于初级卵泡阶段。初级卵泡的主要发育事件包括f s h 受体的表 达和卵母细胞的生长分化。在啮齿类动物中，颗粒细胞产生的激活素( a e t i v i n ) 可通过自分 泌及旁分泌的机制促进f s h 受体的表达。卵母细胞的生长主要表现为卵母细胞的体积明显增 大。在小鼠中发现，颗粒细胞产生的k i t 配基可促进卵母细胞生长。在卵母细胞中表达的重 要基因包括生长分化因子9 ( g d f - 9 ) 和骨形态发生蛋白1 5 ( b m p 1 5 ) ，它们对促进腔前卵 泡颗粒细胞的发育有非常重要作用( s h i m a s a k ie ta l , 2 0 0 3 ；f e u e r s t e i ne ta t , 2 0 0 6 ) 。卵母细胞表 东北农业大学理学硕士学位论文 达连接蛋白3 7 ( c ) ( 3 7 ) ，颗粒细胞和卵母细胞间可通过c x 3 7 形成间隙连接，c x 3 7 基因敲除 小鼠的颗粒细胞在很早阶段就黄体化，卵母细胞发育不到具有恢复减数分裂能力的状态 ( g o o d o n o u g he t a l , 1 9 9 9 ) 。物质通过间隙连接从颗粒细胞运送到卵母细胞，这些物质对卵母 细胞生长起着调节和营养的作用，也可能是促进卵母细胞恢复减数分裂的物质。另外，卵母 细胞产生的信号，也可通过间隙连接传递给颗粒细胞，防止颗粒细胞过早分化。 腔前卵泡发育是一个f s h 非依赖性的过程，最近的研究发现在这个过程中有很多基因参 与其中，包括f i g a ( s o y a le t a l , 2 0 0 0 ) 、f o x 0 3 a ( c a s t r i l l o ne t a t , 2 0 0 3 ) 、n o b o x ( r a j k o v i ee t a t , 2 0 0 4 ) 、f o x l 2 ( s c h m i d te ta t , 2 0 0 4 ；u d ae ta t , 2 0 0 4 ) 、s o h l h l ( p a n g a se t a l , 2 0 0 5 ) 和s o h l h 2 ( b a l l o w p fa l ，2 0 0 6 ) 等。其中n o b o x ，s o h l h l 和s o h l h 2 是原始卵泡向初级卵泡转换的关键转录因子。 缺失三个转录因子中的任何一个，小鼠都会不育( c h o iye ta t , 2 0 0 8 ；h a oje ta t , 2 0 0 8 ；p a n g a s s ae t a t , 2 0 0 6 ) 。在n p b o x 乒的小鼠卵巢中，关键的卵母细胞特异基因的表达水平显著下降， 包括g d f 9 ，b m p l 5 等( c h o iye t a t , 2 0 0 7 ) 。在s o h l h l 小的小鼠卵巢中，与n p b o x 的卵巢基 因变化相似，但还有n o b o x ，f i g l a ，z p l ，z p 3 的表达水平显著下降( p a n g a ss a e ta l , 2 0 0 6 ) 。 在新生的s o h l h 2 士的小鼠卵巢中与s o h l h l 斗小鼠的基因变化类似( t o y o d ase ta t , 2 0 0 9 ) 。 为了使卵泡发育越过腔前阶段，颗粒细胞和膜细胞开始表达促性腺激素的受体。颗粒细 胞表达f s h 受体，膜细胞表达l h 受体。促性腺激素受体的出现导致了雌激素合成的细胞间 相互作用的形成，即“两激素两细胞”学说。膜细胞在l h 的作用下分泌雄烯二酮，雄烯二 酮通过基膜到达颗粒细胞，颗粒细胞在f s h 的刺激下诱导p 4 5 0 芳香化酶的产生，雄烯二酮 在p 4 5 0 芳香化酶的催化下生成雌酮，雌酮又在1 7 1 3 羟甾脱氢酶( 1 7 1 3 - h s d ) 的作用下转化为 雌二醇。 1 1 1 3 有腔卵泡的发育过程 饮级卵泡进一步发育成为三级卵泡，在此阶段，卵泡细胞分泌的液体进入卵泡细胞和卵 母细胞间隙，形成卵泡腔，卵泡腔内的液体成为卵泡液。颗粒细胞表达的k i t 配基和卵母细 胞表达的间隙连接蛋白c x 3 7 对卵泡腔的形成是必需的。随着卵泡腔的扩大，卵母细胞被挤 到一边，并与其周围的颗粒细胞一起形成卵丘，其余的颗粒细胞形成卵泡壁层的颗粒细胞层。 受体内内分泌环境的调节，下丘脑分泌的g n r h 对体内f s h 和l h 发生的周期性变化进行调 节，选择优势卵泡排卵。三级卵泡的颗粒细胞大量合成f s h 受体，当体内的f s h 水平下降 而l h 水平上升时，只有那些含有足够f s h 受体的卵泡才可以在低浓度的f s h 水平下继续 发育成为成熟卵泡，形成优势卵泡。其余的不能顺利排卵的卵母细胞则在发育的各个阶段发 生卵泡闭锁( f o l l i c u l a ra t r e s i a )( i r e l a n dj je ta t , 2 0 0 0 ) 。 排卵前期，在l h 峰的刺激下，颗粒细胞开始表达l h 受体、类固醇激素快速合成调节 蛋白( s t a r ) 、p 4 5 0 侧链裂解酶( p 4 5 0 s c c ) 以及3 羟甾醇脱氢酶( 3 h s d ) ，而膜细胞表面 也开始表达l h 受体、胰岛素、胰岛素样生长因子i ( i g f i ) 、脂蛋白、活化素、抑制素、生 长分化因子- 9 和骨形态发生蛋白4 等( e r i e k s o ne ta t , 2 0 0 1 ) 。l h 与膜细胞中膜间质细胞上的 l h 受体结合后会催化胆固醇合成雄烯二酮，而胰岛素、胰岛素样生长因子i 、脂蛋白、活化 素和抑制素等可以调节雄激素的合成量。排卵前还伴随着卵母细胞成熟，包括蛋白质和 m r n a 的积累、恢复到第二次减数分裂中期和生发泡破裂( g ；d ) 等过程。 2 引言 卵泡发育是一个及其复杂的调控过程，受下丘脑。垂体卵巢轴调控，还需要多种因子协 调，配合。卵泡发育最重要的发育因素是促性腺激素，它的调节作用表现为：f s h 促进颗粒 细胞的增殖；f s h 和l h 协同调节卵泡发育过程中的旁分泌调控；f s h 和l h 诱导卵母细胞 恢复减数分裂；诱导成熟卵泡排卵；l h 诱导颗粒细胞黄体化。除此之外，卵巢内还有其他 因子，通过旁分泌作用调控卵泡发育。其中主要的几种是：转化生长因子家族( t r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r , t g f ) ，k i t 及其配体k i tl i g a n d ( k i t l ) ，胰岛素样生长因子等。 1 1 2 排卵机制及其调控 排卵是指突于卵巢表面的成熟卵泡发生破裂，包围有卵丘颗粒细胞的卵母细胞随卵泡液 排出的过程。排卵是一个受激素和多种酶类调节的非常复杂的过程，对哺乳动物来说，这个 过程需要来自下丘脑垂体卵巢轴的自分泌旁分泌因子的联合调控。 排卵前l h 峰起始了卵丘扩展，卵泡液侵入卵丘细胞之间，使卵丘细胞聚合力松散，并与 颗粒细胞逐渐分离，卵母细胞从颗粒细胞层释放出来，并游离于卵泡腔中。卵丘扩展对正常 的排卵和受精是必需的，该过程是由很多因子调节的，并依赖m a p k 通路的激活( f a nh y , 2 0 0 9 ) 以及卵母细胞分泌的旁分泌因子( b u c c i o n ere la t , 1 9 9 0 ) 。在l h 峰后