（微生物学专业论文）苏云金杆菌伴孢晶体中20kb+dna上cry基因的鉴定和克隆.pdf

摘要 苏云金芽孢杆菌( b a c i l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 4 0 7 18 菌株能够产生双金字塔形和立方体形晶体，它们分别由c r y l 和c r y 2 原毒素组成。本研究在p c r r f l p 方法的基础上，对与c r y l 原毒素 相结合的2 0 k bd n a 上含有的晶体蛋白基因进行了鉴定。在此基础上， 采用p c r 方法扩增了该d n a 片段上c r y l a a 和c r y l a c 基冈的全长编 码序列，并且对c r y l a a 基因编码序列的p c r 产物进行了克隆。 1 b t4 0 7 18 菌株伴孢晶体的选择性溶解与2 0 k bd n a 的提取 对b t4 0 7 1 8 菌株产生的伴孢晶体在不同的条件下选择性溶解， 然后对不同的原毒素组分进行s d s p a g e 和琼脂糖凝胶电泳，发现 c r y l 和c r y 2 原毒素均与2 0 k bd n a 相结合。与立方体形晶体相比， 双金字塔形晶体溶解时所需的条件更温和。因此在溶解时，与c r y l 原毒素相结合的2 0 k bd n a 没有发生降解。采用p h l 0 5 的苯酚：氯 仿在6 5 下对与c r y l 原毒素相结合的2 0 k bd n a 进行抽提，并用透 析袋电洗脱法将这一大片段d n a 进行有效的回收。 2 2 0 k bd n a 上c r y 基因的鉴定 采用c r y 和c r y 2 基因的通用引物对2 0 k bd n a 上的核酸序列进 行初步分析，结果表明该片段上含有这两类基因，而且c r y l 基因的 拷贝数要低于c r y 2 基因的拷贝数。为了对c r y 基因的类型作进一步 的鉴定，本研究对该d n a 片段进行了p c r r f l p 分析。研究发现，该 片段能够扩增出1 6 k b 和1 2 k b 的预期产物，而且1 6 k b ? c r 产物 的扩增量要低于1 2 k bp c r 产物的扩增量，这与通用引物的扩增结 果一致。p c r 产物的大小及其酶切结果表明2 0 k bd n a ：二含有c r y l a a 、 c r y l a c 、c r y 2 a a 和c r y 2 a b 基因。对c r y l a a 和c r y l a c 基因1 6 k b ? c r 产物进行测序的结果与p c r r f l p 分析的结果相符。 3 2 0 k bd n a 上c r y l a a 基因的克隆 在获得c r y l a a 和c r y l a c 基因37 端1 6 k b 和57 端1 4 k bp c r 产物的基础上，设计了一对引物用于扩增得c r y l a a 和c r y a c 基因 的全长编码序列。将所得的3 5 k bp c r 产物与p u c m t 载体连接，然 后转化到大肠杆菌d h 5q 菌株，对随机挑取的转化子的重组质粒进 行酶切分析及p c r r f l p 鉴定，确定其中含有c r y l a a 基因。 关键词：苏云金芽孢杆菌，原毒素一2 0 k bd n a 复合物，p c r r f 。p ， 序列分析，c r y l a a 基因克隆 i i a b s tr a c t b a c i l l u s 拍u r i n g i e n s i s s t r a i n4 0 71 8 p r o d u e e s t w o d i f f e r e n tk i n d so fc r y s t a l l i n ei n c l u s i o n s w i t hf o r m so f b i p y r a m i d a la n dc u b o i d a l t h e ya r ec o m p o s e do f1 3 0 k dc r y l a n d 6 5 k dc r y 2 p r o t o x i nr e s p e c t i v e l y o n t h eb a s iso fp c r r f l p s t r a t e g y w h i c hh a s p r o v e n t ob ea p o w e r f u l t o o lf o r i d e n t i f i c a t i o no ft h es p e e i f i ei n s e t t i c i d a lg e n e sc a r r i e db y d i f f e r e n tb ts t r a i n s 。t h ec r r 弋y p eg e n e s o nt h e2 0 k bd n a f r a g m e n t w e r e d e t e r m i n e d s u b s e q u e n t l y ，a n p c rm e t h o dw a s a p p l i e dt oa m p l i f yc o d i n gs e q u e n c eo fc r y l a aa n dc r y l a cg e n e s o nt h e2 0 k bd n af r a g m e n t t h e n 3 5 k bp c r p r o d u c t e n e o d i n g c r y l a ap r o t o x i nw & sc l o n e di n t op u c m t f o rf u r t h e rs t u d i e s ， 1 s ele c tiv es olu bi iiz a tio n fr o mb ts t r a in4 0 7 1 8a n d o fcr y s t a iiit i ein ciu sio n s e x t r a c t io no f2 0 k bd n a c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n sf r o mb ts t r a i n 4 0 7 1 8w e r e s 0 1 u b i l i z e ds e l e c t i v e l yu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s t h e nt h e o b t a i n e dp r o t o x i n d n ac o m p l e xw a sm e n i t e r e db ya g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n ds d s p a g e e x p e r i m e n t a lr e s u l ts h o w e dt h a t c r v la n dc r y 2 p r o t o x i n w e r ea s s e e i a t e dw i t h2 0 k bd n a t h e c o n d i t i o no fs 0 1 u b i l iz a t i o n r e q u i r e db yb i p y r a m i d a l c r y s t a l l i n ei n c l u s i o n sw a sm o r eg e n t l ec o m p a r e dw i t ht h a t o f c u b o i d a lc r y s t a l l i n ei n c l u s i o n c o n s e q u e n t l y ，2 0 k b d n ai n a s s o c i a t i o nw i t hc r y lp r o t o x i n r e m a i n e di n t a c tw h i l e d n a f r a g m e n ta s s o c i a t e dw i t hc r y 2p r o t o x i nw a sp a r t i a l l y b r o k e n d o w nb yb e i n gb e i l e d t h ee x t r a c t i o no fd n af r o mc r y lp r o t o x i n w a sa c h i e y e db ya d d i t i o n o f p h e n o l c h l o r o f o r m a t6 5 p r e v i o u s l ye q u i l i b r a t e d t o p h l 0 5 t h et a r g e t 2 0 k bd n aw a s r e c o v e r e de f f e c t i v e l yf r o ma g a r o s eg e lb y e l e c t r o e i u t i o n i i i 2 id e n t i f ic a t io no f c r y - t y p eg e r e s t w op a i r so fk i n i v e r s a l0 1 i g o n u c l e o t i d ep r i m e r st op r o b et h e m o s tc o n s e r v e dr e g i o n so fa l lk n o w nc r y la n dc r y 2g e n e sw e r e e h o s e nt oa n a l y s et h en u c l e o t i d es e q u e n c e o f2 0 k bd n a p r e l i m i n a r i l y t h ed n af r a g m e n tw a sp o s i t i v ef o rc r y l a n dc r y 2 g e n e sa n dc o p i e so fc r y lg e n e w e r e1 0 w e rt h a nt h a to fc r y 2g e n e t h e nt h ep o s i t i v ed n af r a g m e n tw a sf u r t h e rp r o b e dw i t ha s e t o fs p e c i f i cp r i m e r sa n ds u b j e c tt op c r r f l pa n a l y s i sw h i c hw a s k n o w nt ob eaf a c i l em e t h o dt od e t e c tb o t hk n o w na n dn o v e lc 刀 g e n e s t h e t e s t e dd n at e m p l a t ep r o d u c e dt h ep r e d i c t e ds i z e s o fp c rf r a g m e n tw i t ht h es iz e so f1 6 k bf o rc r y lg e n e sa n d1 2 k b f o rc r y 2g e n e s t h eq u a n t i t yo fp c rp r o d u c to f1 6 k bw a sm o r e t h a nt h a to fp c rp r o d u c to f1 2 k b t h e r e s t r i c ti o nf r a g m e n t 1 e n g t hp o l y m o r p h i s mp a t t e r n so ft h ep c r a m p l i f i e df r a g m e n t s r e v e a l e dt h a t2 0 k bd n ac o n t a i n sc r y l a a 、c r y l a c 、c r y 2 a a a n d c r y 2 a bg e n e s d n as e q u e n c i n g r e s u l t so f 1 6 k bp c rp r o d u c t w e r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t s o fr f l pp a t t e r na n a l y s l s 3 c io n in go fc r y l a ag e n e fr o m2 0 k bd n a a f t e rt h es e q u e n c e o fn - t e r m i n a lr e g i o na n dc - t e r m i n a l r e g i o nf r o m c r y l a aa n dc r y l a cw e r ea m p l i f i e d s u c c e s s f u l l y ， a n o t h e rp a i ro fp r i m e r sw a sd e s i g n e d t oa m p l i f yt h ec o d i n g s e a u e n c eo fc r y l a aa n dc r y l a cg e n e t h e3 5 k bp c rp r o d u c tw a s c l o n e di n t od u c m tv e c t o r ，a n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oe c o l i d h 5q p c r - r f l pa n a l y s i sa n de n z y m ed i g e s t l o n r e s u l t s d a m o n s t r a t e dt h a t t h es e l e c t e dp o s i t i v e t r a n s f o r m a n tc l o n e c o n t a i n e d3 5 k b p c rp r o d u c tf o rc r y l a ag e n e k e yw o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，p r o t o x i n 一2 0 k b d n ac o m p l e x p c r r f l p ，s e q u e n c e a n a l y s i s ，c l o n i n g o fc r y l a a g e n e 刖吾 苏云金芽孢杆菌( 幽c j - “s 五“，j 力f j e 力s j 只简称b t ) 是一种 分布广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时能够产生伴孢晶 体，其中含有一种或几种杀虫晶体蛋白( i c p s ，ir l s e c t i c i d a l c r y s t a lp r o t e i n s ) ，即6 一内毒素( d e l t a e n d o t o x ir 1 ) 。苏云金 芽孢杆菌的杀虫活性范围从无脊椎动物节肢动物门中的鳞翅目 ( l e p i d o p t e r a ) 扩大到对双翅目( 9 i p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、 直翅目( o r t h o p t o r a ) 等9 个目的昆虫有活性，同时还发现对线形动 物门( 船脚t h e l 坷i n t h e $ ) 、原生动物门( 厅d t o z o a ) 中某些有害种类有 杀虫活性心1 。目前苏云金芽孢杆菌制剂及转杀虫晶体蛋白基因植物 已成为对害虫进行生物防治的重要手段，在农产品安全性和保护农 业生态环境上具有重要意义。1 。 1 9 8 1 年，w h i t e l e y 等从库斯塔克亚种( b ts u b s p k u r s t a k i ) h d 一1 菌株中克隆出第一个苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因1 。 随着人们对b t 的研究不断深入，大量新的i c p s 基因被分离克隆， 其种类从1 9 9 5 年底的9 0 余种，增加到2 0 0 0 年11 月的1 9 6 种，它 们可分为e l y 基因和c y t 基因两大类n “。人们在分离克隆新的i c p s 基因的同时，还应用基因工程的方法将已有的i c p s 基因进行遗传改 良，构建不同的b t 工程菌及培育转杀虫晶体蛋白基因植物。人们在 研究伴孢晶体的溶解和激活过程时，在溶解的晶体蛋白中检测到 d n a 片段哺“。这一令人兴奋的发现吸引人们对晶体中d n a 分子的序 列、来源和功能进行广泛的研究，以利于进一步深化对b t 制剂杀虫 机理的认识，探索提高其杀虫活性的有效途径。 1b t 杀虫晶体蛋白基因 1 。1 b t 基因组及其转座因子 苏云金芽孢杆菌基因组( g e n o m e ) 大小在2 4 1 0 6 5 7 1 0 6 b p 之间。绝大多数b t 具有数个线状或环状的染色体外遗传因子一质粒 ( p l a s m i d ) 。研究发现质粒普遍存在于b t 中，而且质粒的组成具有 多样性，其大小为2 2 0 0 k b ，数量为l 1 2 个。绝大多数b t 的晶 体蛋白基因定位于可转移的质粒上阳1 ，少数位于染色体上。b t 的质 粒不仅能够携带毒素基因，而且能够携带转座因子( t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ) 及具有接合转移的功能。 自从1 9 8 6 年从苏云金芽孢杆菌中分离出t n 4 4 3 0 转座子以来呻1 ， 到目前为止，已经分离并描述的转座因子达1 9 种，可分为插入序列 ( i s ) 和转座子( t n ) 。研究表明，苏云金芽孢杆菌的转座因子大多 位于c r y 基因的附近，其长度从0 1 8 k b 到4 8 k b 不等，它们可能在 c r y 基因的转移中起重要作用。这些转座因子共同的结构特征是它 们的两端具有局部对称的重复序列。在各种转座因子中至少包含一 个转座酶基因，它在靶位点的识别和利用上可能起重要作用。转座 因子的研究对于探讨苏云金芽孢杆菌的杀虫谱和杀虫特异性、研究 毒素基因的变异规律和遗传背景等方面具有重要的理论和现实意 义。这一研究的深入将会大大拓宽苏云金芽孢杆菌的应用领域。 1 2 c r y 基因的分类 1 9 8 9 年，h o f t e 和w h i t e l e y 根据4 2 个c r y 基因编码的氨基酸 序列的同源性和杀虫谱的差异，提出了h w 分类系统。该系统将己公 布的c r y 基因分为5 类( c r y i 、c r y i i 、c r y i i i 、c r y w 、c y t a ) ，1 4 个亚类。随着新的c r y 基因的克隆，发现更多的基因不适合该系 统，矛盾集中在h w 分类系统所依据的两个原则，即同源性和杀虫谱 之间存在冲突。例如c r y ic 基因能编码对海灰翅夜蛾( s p o d o p 日，a j t t o r a j i s ) 高毒力的杀虫晶体蛋白。最近发现它对蚊幼虫也有活 性，若根据杀虫谱，h w 分类系统应将它归到c 眇i i 。 1 9 9 5 年，由n c r i c k m o r e 等组成的杀虫晶体蛋白基因命名委 员会提出了新的分类原则，与h w 分类系统不同的是它只根据i c p s 氨基酸序列同源性的差异，而不再考虑杀虫谱的不同哺3 。新的分类 体系为：c r y 基因编码蛋白质氨基酸的同源性不到4 5 定为第一分类 等级，用阿拉伯数字表示；同源性在4 5 一7 5 之间定为第二分类等 级，用大写英文字母表示；同源性在7 5 一9 5 之间定为第三分类等 级，用小写英文字母表示；同源性在9 5 以上定为第四分类等级， 用阿拉伯数字表示。新的基因纳入该系统必须符合以下条件：1 ) 基 因必须克隆自苏云金芽孢杆菌；2 ) 编码的杀虫晶体蛋白具有杀虫活 性；3 ) 表达的晶体蛋白必须存在于包涵体中；4 ) 基因的核苷酸序 列或杀虫晶体蛋白的氨基酸序列必须在一个主要的国际数据库巾登 记，如e m b l ，g e n b a n k 或p i r 。 2b t6 f y 基因表达的调控 由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体在芽孢形成末期可达整个细 胞干重的2 0 3 0 ，这种大量的杀虫晶体蛋白的产生源于它特定的 调控机制n “3 。深入认识苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的调控 系统，对更进一步提高晶体蛋白的表达水平，构建高效广谱 程菌 具有重要的指导意义。 2 1 转录水平的调控 2 1 1 c r y 基因的转录与芽孢形成。因子的关系 苏云金芽孢杆菌在芽孢形成的同时积累杀虫晶体蛋白，表明杀 虫晶体蛋白基因的转录与芽孢形成因子密切相关。在其生长过程中， 芽孢的形成将细胞分成母细胞室和前芽孢室，进入稳定生长期后， 原毒素在母细胞中积累并组装成晶体，这是一种精巧的时空调控。 对苏云金芽孢杆菌质粒所携带的杀虫晶体蛋白基因转录的研究表 明，除基因c r y 3 a 外，其它所有杀虫晶体蛋白基因的转录都依赖于 芽孢形成的0 因子，转录活性由芽孢形成过程中0 因子的替换来完成。 早在1 9 8 3 年w o n g 等n2 1 研究确认c r y l a a 基因具有重叠的两个 启动子b ti 和b t i i ，b ti 启动子被含o3 5 的r n a 聚合酶识别，b ti i 启动子被含o ”的r n a 聚合酶识别而启动转录。o ”和d ”的氨基酸 序列与枯草芽孢杆菌芽孢形成特异性的o8 和o 分别有8 8 和8 5 的同源性，并且o3 5 和o2 8 基因能够补偿o5 和o 的缺失。b ti 启动 子是一强启动子( p r o m o t e r ) ，能在苏云金芽孢杆菌中独立存在并发 挥作用，而b ti i 是一弱启动子，与b ti 共存，不能独立存在于苏云 金芽孢杆菌中“。c r y g a a 也具有两个启动子p - 和p 。，当p 。的缺失 并不明显减少c r y 4 a a 总转录活性，故p 。为弱启动子，c r y 4 a a 主要 依赖于o “的p 。启动子而启动转录。 编码对鞘翅目昆虫有特异毒性的c r y 3 a 基因是杀虫晶体蛋白基 因中唯一典型不依赖于芽孢形成的基因。c r y 3 a 基因在营养期被转 录，并且有两个转录起点，分别位于翻译起始位点一1 2 9 和一5 5 8 ，这 两个不同转录位点启动子的一1 0 区和- 3 5 区序列类似于依赖于o “ r n a 聚合酶的启动子，可被05 r n a 聚合酶识别而启动转录，并不依 赖于芽孢分化特异性的0 因子。在不形成芽孢的突变株中，c r y 3 a 的表达量增加，且表达延长。c r y 3 a l a c z 转录融合实验分析表明 t - 5 5 8 启动子是一个弱启动子，在营养生长期大量表达，其活性一 直保持到芽孢形成第1 期( 约t ，期) n 。1 川。而c r y 3 a l a c z 融合的 b 一半乳糖苷酶动力学曲线暗示芽孢形成的同时也关闭了c r y 3 a 的 表达。 2 1 2 启动子的结构与转录调控 杀虫晶体蛋白基因启动子结构在转录调控方面的独特之处在 于依赖于芽孢形成的杀虫晶体蛋白基因几乎都具有双启动子，它们 含有重叠的双启动子( 如所有的c r y l 类和c r y l i a 基因上游启动子 b ti i 的一1 0 区位于下游启动子b ti 的一3 5 区和一1 0 区之间) 和非重叠 的双启动子( 如c r y 4 a a 和c y t l a 基因的上游启动子p 。和下游启动 子p 。) ，由含芽孢形成。因子仃6 和o 的r n a 聚合酶识别而启动转录。 从启动子作用的时间看，b ti 启动子从芽孢形成t 。到t 。起作用，b t i i 则在芽孢t 。以后起作用( t 。是指对数生长期结束以后的r l 小时) 阻“。 双启动子保证了这些基因在芽孢形成的几个时期内被不同。因子的 r n a 聚合酶有效地识别而持续转录。启动子的重叠是原毒素合成模 型的一种机制，一种启动子调控了另一种启动子的转录程度。当一 种r n a 聚合酶结合到双重叠启动子的一种启动子上后，很可能干扰 另一种启动子的转录作用。 不依赖于芽孢形成的c r y 3 a 基因的转录有启动子一5 5 8 和一1 2 9 ， 上游t 一5 5 8 启动子是c r y 3 a 基因表达必不可少的，而下游t 一1 2 9 启 动子的缺失并不影响c r y 3 a 表达，但t - 5 5 8m r n a 非常不稳定，可被 降解为大量的短分子t 一1 2 9m r n a ”“蚓。这种t 一1 2 9m r n a 分子的5 7 端具有的s t a b - s d 序列，能与核糖体的3 0 s 亚单位的1 6 sr r n a 的3 7 末端结合，保护了m r a n 免遭5 7 37 核酸酶的进一步降解，从而增 加了m r n a 的稳定性而调节其表达。 2 1 3 盯因子的竞争与转录调控 苏云金芽孢杆菌质粒所编码的原毒素基因的转录和芽孢形成 基因的转录共同使用连续激活的o “、oi t 、05 和o 的r n a 聚合酶， 伴随芽孢形成而在母细胞中连续不断地积累杀虫晶体蛋白。共同使 用这些。因子则存在多种拷贝的原毒素基因竞争芽孢形成基因相同 的。因子。如果克隆的基因与受体菌中的基因具有相同的表达机制， 那么重组菌表达的总蛋白量不会高于受体菌。当增加了一个相同类 型启动子的基因后，则必然出现基因之间竞争细胞内有限的u 因子， 从而影响其表达；如果增加的是另一种类型启动子的基因，则无这 种0 因子的竞争，它们的表达则是两种基因的相加。这一现象与细 胞合成能力的有限性有关，而主要原因是竞争转录的a 因子。 2 2 转录后水平的调控 在b t 中，由c r y 基因转录的m r n a 有较长的半衰期，平均可达 1 0 分钟。长效而稳定的m r n a 对于保证c r y 基因的高水平表达是有 利的。决定m r n a 稳定性的顺式元件一般位于非翻译区。研究表明， 大多数c r y 基因的37 末端含有反向重复序列，能够形成稳定的茎 环结构，可以作为一种正调节因子，保护已转录的m r n a 免受37 5 7 核酸外切酶的降解，从而增加了m r n a 的稳定性。w a n g 和c h a n g 首 次发现b t 库斯塔克亚种( b ts u b s p k u r s t a k i ) h d 一1 菌株中c r y l a a 基因的37 末端序列是一种正调节因子，将该序列与异源基因的37 末 端连接，能够增强融合基因转录物的稳定性并提高异源基因的表达 水平n “。此外，c r y 3 a 、c r y 3 b 基因在其m r n a 的57 末端具有相似 的s d 共有序列。该序列和核糖体3 0 s 亚单位中的1 6 s r n a 的37 末 端互补，两者结合后，可阻止核糖核酸酶从57 末端的消化作用， 因此s d 序列可能是c r y 基因转录物的又一个稳定因子“。 2 3 翻译后水平的调控 原毒素合成后通过形成晶体来抗胞内蛋白酶的降解，不同的杀 虫晶体蛋白形成包涵体的途径不同。1 3 0 1 4 0k d 的c r y l 类原毒素 能够自发形成晶体。普遍认为c r y l 类原毒素分子能够通过富含c y s 残基的c 端区域与相邻分子形成对称的链间二硫键，而且这些二硫 键处于晶体的表面，这种排列方式有助于不溶性晶体在鳞翅目昆虫 e 中肠道的碱性环境中发生溶解n 。7 3k d 的c r y 3 a 原毒素没有富含 c y s 残基的c 端区域，对c r y 3 a 毒素的三维结构进行分析表明，在 三个相邻的原毒素分子间存在4 个分子间的盐桥( a s p l 4 2 a r 9 1 6 5 ， a s p 2 2 4 a r 9 5 6 2 ，a s p 5 9 0 a r 9 1 7 8 ，g 1 u 2 2 3 l y s 2 9 3 ) ，这些盐桥可 能参与了晶体包涵体的形成心。c r y 2 a ( 7 1k d ) 和c y t l a ( 2 7k d ) 形成晶体时需要p 1 9 、p 2 0 、o r f l 和o r f 2 等辅助蛋白的参与n 。“。 促使晶体形成的作用力既要能够有效地防止菌体细胞中蛋白酶对晶 体的降解，又要保证晶体在昆虫中肠道的极端p h 环境中快速有效地 溶解。研究表明，晶体的稳定性和溶解性依赖于原毒素的分子结构、 二硫键的键能以及其它特异性因子。近期的研究发现，与原毒素相 互结合的d n a 分子不仅能够促进晶体的形成，而且在毒素的产生过 程中起着重要的作用。“。 3b t 杀虫晶体蛋白的结构及功能 3 1 b t 杀虫晶体蛋白的结构 通过比较c r y 基因编码的c r y 蛋白的氨基酸序列，发现原毒素 的毒性片段在一级结构上都含有5 个保守区。一些分子量大的原毒 素( 1 3 0 1 4 0k d ) 在c 端非毒性区还含有3 个保守区2 1 ，这些原 毒素在c 端含有丰富的c y s 残基，在溶液中巯基暴露在分子表面， 使得原毒素很容易受蛋白酶的作用而激活。研究表明，b t 杀虫晶体 蛋白的毒性多肽由三个典型的结构域组成“川。结构域i 位于肽链 的n 端，为一组由7 个两亲性的一螺旋围绕一个疏水的q 一螺旋形 成的d 一螺旋束，主要参与在中肠上皮细胞形成孔道；结构域i i 位于 肽链的中间，为三组以“希腊钥匙”拓扑结构连接在一起的反向平 行的d 折叠片层，其顶端的三个突环( 1 0 0 p ) 参与了毒素与受体蛋 白的结合；位于c 端的结构域i 是由两组反向平行的b 折叠片层组 成的夹心结构，以b “果酱卷”拓扑结构排列，它能够防止蛋白酶 对毒素分子的过度降解。毒素的结构域与其保守区具有一定的对应 关系。保守区一1 内含有结构域i 中q5 螺旋。保守区一2 含有结构域 i 的q7 螺旋和结构域i i 中的第一条b 链，它们构成了两个结构域 之间的连接。保守区一3 是跨于结构域1 i 和i i i 的一条b 链。保守区一4 含有结构域i i i 中的条b 链。保守区一5 含有肽链的c 端，包埋于结 构域i i i 的b 链中心3 。 c y t 蛋白是一种由c y t 基因编码的溶细胞蛋白乜“，对各种细胞 皆有毒性，是杀蚊幼虫的苏云金杆菌以色列亚种( b ts u b s p i s r a e l e n s i s ) 伴孢晶体的成分之一。c y t 蛋白大致可分为两类：c y t l 类蛋白和c y t 2 类蛋白阻“。c y t i a a l 蛋白的编码基因在1 9 8 5 年首先 从b t 以色列亚种中克隆出来，核苷酸序列分析表明它是一个编码 2 4 9 个氨基酸的开放阅读框。c y t l a 不仅能提高c r y l l a 的杀虫活性， 而且可能对于克服昆虫对苏云金芽孢杆菌的抗性有作用。与c r y 蛋 白不同，c y t 2 a a 为a b 单结构域( q 螺旋2 4 ，b 折叠3 3 ) ，是 由两外层的a 螺旋发卡被混杂的b 折叠片层缠绕而成。原毒素形式 的c y t 2 a 为二聚体，它们以由1 2 条链组成的b 折叠片层交互连接。 经蛋白酶水解可释放出单体，然后再切去c 端尾巴而成为活性形式“2 “。 3 ，2 晶体蛋白的作用机理 3 2 1 毒素与受体的相互作用 伴孢晶体进入敏感昆虫的消化道后发生溶解并释放出2 7 1 4 0 k d 的原毒素。在中肠蛋白酶的作用下，原毒素被激活为2 3 7 0k d 的毒性多肽。随后毒素与中肠刷状缘膜泡( b b m v ，b r u s hb o r d e r m e m b r a n ev e s i c l e ) 上的特异受体发生结合并且在细胞膜上形成孔 道，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终导致幼虫的死亡。 不同原毒素形成的伴孢晶体发生溶解时需要不同的条件。对鳞 翅目和双翅目具有毒杀作用的c r y l 、c r y 4 a 、c r y 4 b 发生溶解时，需 要靶昆虫中肠道的碱性环境。而c r y 3 蛋白只有在鞘翅目昆虫中肠道 的酸性环境中才能溶解。伴孢晶体溶解所需条件的多样性有利于扩 大苏云金杆菌的杀虫谱。分子量较大的原毒素在幼虫中肠蛋白酶 的作用下被切去n 端的2 8 至2 9 个氨基酸以及c 端区域而被激活为 毒素心。对于较小的原毒素如c r y 3 蛋白，在切去n 端的大约5 0 个 氨基酸后即被激活n “。在c r y 毒素结构域i 插入中肠上皮细胞膜造 成膜穿孔之前，毒素首先是通过结构域i i ( 或结构域h i ) 与上皮细 胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。结合分为两步，第一步即初始 结合( i n i t i a lb i n d i n g ) ，结合上的毒素可以再次与受体发生解离， 故又称可逆性结合( r e v e r s i b l eb i n d i n g ) ；初始结合之后，毒素进 一步与膜受体蛋白发生紧密结合或直接插入细胞膜，此时的毒素与 受体难以发生解离，故为不可逆性结合( i r r e v e r s i b l eb i n d i n g ) 乜6 川。 结构域i 在与靶细胞膜作用之前受毒素一受体结合的诱导要发生显 著的构象变化，使直接参与膜穿孔的螺旋暴露，与膜接触并插入 细胞膜，继而造成膜穿孔心。与c r y 蛋白不同，c y t 蛋白在细胞膜 上没有专一的受体蛋白。它首先通过与膜中的不饱和脂肪酸亲和而 与膜结合，而且膜孔是通过多个毒素分子寡聚合形成跨膜的b 一桶状 ( b b a r r e l ) 结构，最后造成膜穿孔心。l i 等提出这一结构由1 2 1 8 个b 一链围成，孔的直径为5 1 0a 。假如每个毒素分子提供三条b 一 链，那么每一个孔需由4 6 个毒素分子参与形成“。 3 2 2 晶体蛋白在毒杀昆虫中的协同作用 w u 和c h a n g 叫首先观察到，当b t 以色列亚种产生的包涵体中 的不同蛋白质组分相互混合时，混合组分对埃及伊蚊( 一d e d e s a e g y p t i ) 的毒力要高于单个组分的毒力。其它报道也证实了来自b t 以色列亚种不同毒素之间的协同作用口”川。毒素的不同组合已经阐 明了毒素之间的协同作用，尽管其协同作用的程度随组合的不同而 变化。然而还没有任何一种组合的毒性达到原始的b t 以色列亚种的 包涵体的水平，其原因可能是其它因子对原始的毒性有关系。原始 晶体比来自重组菌株的晶体能更有效地被昆虫吞食和消化，此外， 含有四种毒素的一个单独包涵体比四种包涵体的混合物更为有效。圳。 1 9 9 1 年f r a n k e n h u y z e n 等人报道了来自b t 以色列亚种以外的其它 毒素也表现出协同作用。“。来自b t 库斯塔克亚种h d 一1 菌株的不同 c r y l 毒素之间在毒杀昆虫时表现出协同作用。c r y l a a 和c r y l a c 在 毒杀舞毒蛾( l y m a n t r i ad f s p a r ) 时表现出协同作用，因此可以推测 不同毒素形成的孔道之间具有协同作用，或者毒素的异源寡聚体形 成了一个更有效的孔道。某一毒素的存在可能通过阻止无效结合而 增强另一毒素的活性6 ”。 除了在不同毒素之间存在协同作用之外，毒素与芽孢口”4 “、毒 素与其它细菌之间对毒性也表现出增效作用口“。在上述情况中，芽 孢或细菌感染昆虫引起的败血症被认为是这种协同作用的原因，因 为这种败血症将引起中肠的溃烂。此外，b t 芽孢的存在降低了某些 昆虫对毒素产生抗性的可能性h “。 3 3 晶体蛋白结构与功能的关系 为了在分子水平上阐述c r y 毒素的结构与其形成孔道能力的关 系，目前提出了三种模型。“铅笔刀”模型认为h ，结构域i 的c 15 螺旋和6 螺旋最可能是孔形成的结构单位，在作用于膜时，这两 个螺旋象打开的铅笔刀一样从结构域i 中伸出，插入脂双层膜。这 种模型不需要结构域i 中其它q 螺旋的重排，一个亲水离子通道将 由多个寡聚体通过相同的作用方式排成一个圆而形成。“伞状”模型 认为h3 川，结构域i 的q4 和q5 以及连接这两个螺旋的环( 1 0 0 p ) 形成了一个疏水的发夹结构。d4 - l o o p q5 发夹结构处在毒蛋白的 疏水核心，毒蛋白与受体结合后，其构象发生变化，使得发夹结构 插入到细胞膜内。而“六聚体”模型则认为“4 ，由于5 螺旋在 所有的i c p s 中都是高度保守的，而且在体外它能够在平面脂双层膜 上形成孔道，因此认为q5 螺旋可通过一个六聚体形式组成一个亲 水离子通道，镶嵌在脂双层中间。 近年来，人们着重通过定点诱变技术对i c p s 分子不同结构域 的_ j i f ：结构进行研究，从蛋白质工程的角度更深入地阐明了c r y 毒素 结构与功能的关系。a r t h u ri a r o s o n 发现，由于q5 发生突变而 失去活性的c r y l a c 突变体不能同烟草天蛾( g a n d u c as e 工t a ) 的b b m v 结合，而对于q2 、3 、q6 螺旋进行突变并不影响其毒力“4 。 但是当在连接a2 和q3 的环上进行突变使之失去正电荷，则导致毒 性的丧失，这可能是因为此环是毒素的表厦部分，它能同细胞膜的 磷脂双分子层发生相互作用。研究表明结构域1 i 的每个b 一折叠片都 终止于一段暴露在溶剂中的环，这些环构成该结构域的顶端。环 上的残基在受体识别和结合中起着重要作用。研究者对c r yi a ( b ) 结构域i i 上环2 的残基”1 f n i g i 375 进行定点诱变来检验该环在结合 受体中的作用随“1 。结果表明，除了1 3 7 3 a ( 用a 代替3 7 3 位的i ) 突变体不能形成稳定的内毒素外，其余突变体f 3 7 1 a 、n 3 7 2 a 、g 3 7 4 a 、 1 3 7 5 a 均能产生稳定的内毒素，并且对于烟草天蛾的b b m v 具有同野 生型c r yia ( b ) 相同的起始结合速率。此外，3 7 0 p f n i g i 3 7 5 的缺失 形成的突变体d 2 也没有改变对同一受体的起始结合能力。这表明环 2 的突变不影响同烟草天蛾的b b m v 的起始结合，环l 和环3 可能参 与了同受体的起始结合。为了进一步论证结构域i i 的功能， r a j a m o h a nf 等人对c r yia ( b ) 结构域i i 上环3 的残基”8 s g f s n s “3 用a l a 替换得到6 个总体结构与野生型毒素相同的突变体n ”。生物 测定表明g 4 3 9 a ( 用a 代替第4 3 9 位的g ) 和f 4 4 0 a 对烟草天蛾和烟 芽夜蛾( h e l i o t h i sv i ，e s c e n s ) 的毒力下降许多，其它突变体$ 4 3 8 a 、 $ 4 4 l a 、n 4 4 2 a 、$ 4 4 3 a 仅使毒性稍有下降。分析表明，g 1 y 4 3 9 能促进 环的回转和移位，它被a l a 替换后使环的柔性发生了较小的改变， 进而间接地影响毒素同受体的起始结合，最终导致g 4 3 9 a 的毒性下 降。p h e “o 比a 1 a 更具疏水性，它被a l a 替换后影响了毒索与受体的 起始结合。c r yia ( b ) 结构域i i 上环2 的带正电荷的残基”8 r r 3 6 9 被a l a 取代后，完全丧失了同烟草天蛾的b b m v 发生起始结合的能力。 因此有人认为毒素对受体的识别是环2 的电荷和环3 的疏水性共同 作用的结果。对于b t 毒性多肽的结构域i i i ，有人提出了它的几个不 同的功能：例如，结构域i i i 能增强毒素分子的稳定性”；诱变实验 表明它与孔道的形成有一定的关系瞄“；在某些昆虫中，结构域i i i 的 替换甚至影响到对受体的识别，这表明它具有结合受体的功能“。 虽然不同的结构域都有特定的功能，但是在毒素与靶细胞膜作用的 整个过程中它们并不是独立作用，而是相互配合的。 4 b t 杀虫晶体蛋白与d n a 分子的相互作用 4 1 伴孢晶体和原毒素中存在d n a 分子的依据 早在1 9 2 7 年，m a t t e s 就提出了d n a 分子参与晶体形成的实验 证据。他在对b t 的生活周期进行了详细的研究后发现，在细胞形成 晶体的区域存在染色质。当时对d n a 进行染色使用的是吉姆萨染液。 目前已经对来自b t 库斯塔克亚种h d 一7 3 菌株的c r y i a c 原毒素及其 晶体与d n a 之间的相互作用进行了深入的研究。在将要产生芽孢的 b t 培养物中加入溴化乙锭( e b ) ，可以看到核酸物质在细胞中的分布 情况发生明显的变化。在即将形成芽孢之前，核酸聚集在芽孢形成 区域，芽孢形成之后，荧光在这一区域消失并转移到形成伴孢晶体 的区域。从b t 细胞中提纯晶体并将其溶解，然后分别进行s d s p a g e 和琼脂糖凝胶电泳，发现了1 3 0k d 的蛋白带和2 0k b 的核酸带。除 了b t 库斯塔克亚种h d 一7 3 菌株外，库斯塔克亚种h d - i 菌株、阿莱 亚种( b ts u b s p a l e s t i ) 、杀虫亚种( b ts u b s p p 力t o m o c i d u s ) 、 多窝亚种( b ts u b s p t o l w o r t h i ) 、蜡螟亚种( b ts u b s p 舻，e r i a ) 以及分别含有c r y l a a 、c r y l a b 、c r y l a