（植物学专业论文）麻疯树水通道蛋白jcpip2的分离、基因克隆及功能鉴定与调控分析.pdf

四川大学博士学位论文 麻疯树水通道蛋白j c p i p 2 的分离、基因克隆 及功能鉴定与调控分析 植物学专业 研究生张颖指导教师陈放( 教授) 摘要 麻疯树( j a t r o p h ac u r c a s 上) 是一种大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 的油料植物， 广泛分布于热带和亚热带地区。它具有极强的抗旱性，甚至可以在沙漠地区正 常生长。为了研究麻疯树抗旱性的分子机制，本实验分离了一个与抗旱密切相 关的植物水通道蛋白j c p i p 2 并展开了功能研究。 l 、麻疯树j c p i p 2 蛋白的分离及基因克隆 本文采用两相法从麻疯树幼苗组织中提取质膜囊泡组织，再进行质膜内膜 蛋白的分离。在s d s p a g e 电泳下分离出一条分子量为2 9 k d a 的蛋白富集带。 由于其与菠菜叶肉细胞分离出的质膜内膜蛋白富集带分子量相近，被选择进行 质谱分析。将质谱分析所得的数据在n c b i 的蛋白质数据库上进行鉴定，发现 一条最长的属于植物p i p 蛋白的肽段：n p y n h l l g g g a n s v n t g y s k 。根据 该肽段结合麻疯树已有基因密码子的偏爱性设计简并引物进行麻疯树p i p 基因 的克隆。采用r t - - p c r 和r a c e 技术成功克隆了麻疯树j c p l p 2 基因。其c d n a 全长为9 8 5b p ，包括一个8 4 3 b p 的完整的开放阅读框( o r f ) ，3 9 b p 的5 非翻译 区片段和1 0 3 b p 的3 - 非翻译区片段f g e n b a n k 登录号为：e f 0 3 0 4 2 0 。以开放 四川大学博士学位论文 阅读框的e d n a 序列两端设计引物进行d n a 克隆得到一个长为1 2 7 3 b p 的序 列，与c d n a 序列比较分析发现有3 个内含子。七肿2 基因的o r f 编码2 8 0 个氨基酸。 2 、生物信息学分析 同源性分析表明j c p t p 2 和其它植物的p i p 氨基酸序列问有很高的同源性， 其中与蓖麻p i p 的同源性最高( 9 4 ) 。与已经鉴定出蛋白三维晶体结构的菠菜 s o p m 2 8 a 的同源性也高达8 6 。对蛋白疏水区和跨膜区进行预测表明该蛋白 有六个跨膜区和5 个亲水环，整个蛋白的疏水性很强属于典型的膜蛋白的特征。 对j c p i p 2 蛋白质结构预测表明，j c p i p 2 的三级结构和菠菜p i p 2 的晶体结构极 为相似，主要由6 个跨膜的a 一螺旋和5 个亲水环( l o o p a 、b 、c 、d 、e 1 连 接，其中a 、c 、e 环位于胞膜外侧，b 、d 环及氨基和羧基末端位于胞膜内侧。 羧基端和氨基端有高度相似的氨基酸序列且纵向重复，多肽链的两端显示明显 的对称性，每端( 胞外的e 环、胞内的b 环上) 由高度保守的天门冬酰胺脯氨酸 一丙氨酸( a s h - p r o - a l a ，n p a ) 组成一个小的结构域n p a 基序，n p a 基序高度保 守。对j c p i p 2 蛋白的化学修饰位点进行预测发现该蛋白有5 个磷酸化位点，为 研究j c f i p 2 蛋白的磷酸化调控垫定了基础。 3 、s o u t h e r n 杂交 用限制性内切酶e c o ri 、b a m h i 、s a ci 和r p ni 将基因组d n a 酶切消化， 每种酶切产物至少可以产生2 条杂交带，说明j c p i p 2 在麻疯树基因组中至少有 2 个以上拷贝。 4 、n o r t h e r n 及w e s t e r n 杂交 麻疯树水通道蛋白j c p i p 2 广泛分布于麻疯树的各个组织。虽然其基因的表 达和蛋白分布不是一一对应的关系，但都共同反映了j c p i p 2 广泛分布在麻疯树 的各个组织。 5 、j c p i p 2 水通道蛋白功能的鉴定 在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中对j c p l p 2 蛋白的功能进行了鉴定，发 四川大学博士学位论文 现该基因编码一个功能的水通道蛋白。表达了j c p i p 2 基因的爪蟾卵母细胞的细 胞质膜水通透性提高了1 0 倍以上。 6 、j c p i p 2 蛋白的亚细胞定位 为了研究j e p i p 2 的亚细胞定位情况，我们构建了j c p i p 2 一g f p 融合基因， 将其在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中进行异源表达发现荧光信号只表现在 细胞膜上，这说明麻疯树j c p i p 2 蛋白是一个膜蛋白，这一结论也与我们第一章 质谱分析的结果相吻合。 7 、干旱胁迫下j c p i p 2 基因的表达及蛋白丰度的变化 对j c p i p 2 在干旱胁迫条件下的基因表达和蛋白分布情况进行了研究表明， 干旱胁迫下j c p i p 2 在基因表达量和蛋白含量上都有明显增加。 8 、j c p i p 2 蛋白的磷酸化调控位点分析 通过构建磷酸化位点突变体，并在异源表达系统非洲爪蟾卵母细胞中进行 检测发现j c p i p 2 蛋白有两个磷酸化调控位点s e r f l 4 和s e r 2 r 3 。说明j c p i p 2 蛋白 活性受磷酸化调控。 四川大学博士学位论文 i s o l a t i o n ，m o l e c u l a rc l o n e ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d f u n c t i o n a la n a l y s i so fa n a q u a p o r i n ( j c p i p 2 ) i n j a t r o p h a m a j o r ：b o t a n y p h d c a n d i d a t e ：z h a n gy i n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e nf a n g j a t r o p h ac l r c a sl ，ae u p h o r b i a c e a ep l a n ts p e c i e s ，t h r i v e si nm a n yt r o p i c sa n d s u b t r o p i c sa r e a s i ti sh e a v i l yr e s i s t a n tt od r o u g h ta n dc a nb ep l a n t e de v e ni nd e s e r t a r e a s i no r d e rt oe x p l o r et h em o l e c u l a rb a s i so fd r o u g h tr e s i s t a n c ei nj a t r o p h a c u r c a sl ，w ei s o l a t e da na q u a p o r i nf r o mj a t r o p h ac u r c a s ( j c p i p 2 ) i ti sc o n s i d e r e d t h a ta q u a p o r i n sa r er e l a t e dt od r o u g h t ! o l e r a n c ei n p l a n tt h o u g ht h er e l a t i o n s h i p b e t w e e na q u a p o r i n sa n dd r o u g h tr e s i s t a n c es t i l lr e m a i n se l u s i v e 1 i s o l a t i o na n dm o l e c u l a rc l o n eo f j c p 口2 p l a s m am e m b r a n ep r o t e i n sw e r ep u r i f i e d b ya q u e o u sp o l y m e rt w o - p h a s e p a r t i t i o nm e t h o d f r o mp l a s m am e m b r a n ep r o t e i n so f j a t r o p h ac z l r c c l s ，a2 9 k db a n d w a si s o l a t e d b e l o n g i n gt op l a n tp l a s m am e m b r a n ei n t r i n s i cp r o t e i n s ( p i p s ) b y l c - m s m sa n a l y s i s d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep e p t i d e ： n p y n h l l g g g a n s v n t g y s k t h ee d n aw a so b t a i n e db yr t - p c ra n dr a c e t h ee x o nm a t e r i a lo fj c p i p 2c o n t a i n sac o d i n gs e q u e n c eo fo r f ( o p e nr e a d i n g f r a m e ) c o m p o s i n go f8 4 3n u c l e o t i d e s 5 a n d3 u n t r a n s l a t e ds e q u e n c e so fj c p i p 2 g e n ew e r e3 9 b pa n d1 0 3 b ps e p a r a t e l y t h el e n g t ho fd n ao fj c p i p 2o r fw a s 1 2 7 3 b pi n c l u d i n gt h r e ei n t r o n s g e n b a n ka c c e s s i o nn o i se f 0 3 0 4 2 0 四川大学博士学位论文 2 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f j c p i p 2 c o m p a r i s o no ft h ec o d i n gp r o t e i n ss h o w e dh i 【g hi d e n t i t yb e t w e e nj c p i p 2a n d o t h e rp l a n tp i p s t h e9 4 i d e n t i t yw a sf o u n db e t w e e nj c p i p 2a n dr i c i n u s c o m m u n i sp i et h e8 6 i d e m 曲w a sf o u n db e t w e e nj e p i p 2a n ds p i n a c hs o p m 2 8 a w h o s ep r o t e i ns t r u c t u r eh a db e e nr e p o r t e d a n a l y s i so fp r e d i c t e dh y d r o p a t b yp j o t a n dt m h m mp o s t e r i o rp r o b a b i l i t i e sf o rj e p i p 2i n d i c a t e dt h a tj c p i p 2c o m p r i s e ds i x t r a n s m e m b r a n eh e l i c e sa n df i v eh y d r o p h o l i cl o o p s i ts h o w e dt h a tj e p i p 2w a sa m o d e lm e m b r a n ep r o t e i nf o rt h eh i g hh y d r o p h o l i c p r e d i c t i o no ft h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r eo fj c p i p 2s h o w e di t ss i m i l a r i t yw i t ht h es t r u c t u r eo fs p i n a c hs o p m 2 8 a p h o s p h o r y l a t i o ns i t e sw e r ea n a l y z e dt ob ef i v e ，a n di tw a st h eb a s i sf o rt h es t u d yo f p h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a d o no f j c p i p 2a c t i v i t y 3 s o u t h e r nb l o t g e n o m i cd n aw a sp r e p a r e df r o my o u n gl e a v e su s i n gt h em e t h o do fc t a b a n dc o m p l e t e l yd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e se c o ri ，b a m hi ，s a cia n dk p ni s e p a r a t e l y t h eb l o tr e s u l t sr e v e a l e dt h a tm o r et h a nt w oh y b r i d i z e db a n d sw e r ef o u n d i ne a c hd i g e s t e dp r o d u c t 4 n o r t h e r na n dw e s t e r nb l o t n o r t h e r nb l o ta n a l ) i s i sr e v e a l e dt h a ti t st r a n s c r i p t se x p r e s s e di na l lt e s t e dt i s s u e s i m m a n o d e t e c t i o no fj c p i p 2w i t ha n t i - j c p i p 2a n t i b o d yi n d i c a t e dt h a tt h i sp r o t e i n u b i q u i t o u s l yl o c a t e di na l lt e s t e dt i s s u e so f t h ep l a n tt o o 5 a n a l y s i so f j c p i p 2a c t i v i t y t od e t e r m i n ew a t e rt r a n s p o r t i n ga c t i v i t yo fj c p l p 2 、t h ec r n ao fj c p l p 2w a s h e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di n t ox e n o p u so o c y t e se x p r e s s i o ns y s t e m o o c y t e si n j e c t e d w 独1j c p i p 2c r n ah a das w e l l i n gr a t e1 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a ti no o c y t e si n j e c t e d 埘t hw a t e nt h er e s u l ts h o w e dt h a tj c j p 伊2e n c o d e daf u n c t i o n a lw a t e rc h a n n e l p r o t e i n 堕! ! ! 查兰堡主堂垡鲨兰 6 s u b - c e l ll o c a t i o no fj c p i p 2i nx e n o p u so o c y t e s w es y n t h e s i z e dt h ej c p i p 2 - g f pc r n aa n di n j e c t e di ti n t ox e n o p u so o c y t e s e x p r e s s i o ns y s t e m t h er e s u l to fh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s i o ni n d i c a t e dt h a t i t o n l y l o c a t e do nt h em e m b r a n eo fx e n o p u so o c y t e s i ta l s op r o v e dt h a tj c p i p 2w a sa m e m b r a n ep r o t e i n 7 c h a n g e so f a b u n d a n c ea n de x p r e s s i o no f j c p i p 2u n d e r w a t e rd e f i c i t p r o t e i nl e v e l si n c r e a s e di nj a t r o p h ac z l r c a sw i t ht h ea g g r a v a t i o no ft h ed e g r e e o fd r o u g h ts t r e s s i na d d i t i o n ，t h e 订锄s c r i p t so fj c p i p 2w e r eh i g h l ye x p r e s s e di n r o o t st o o 8 p h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a t i o no f w a t e rt r a n s p o r ta c t i v i t yo f j c p i p 2 j c p i p 2e n c o d e daf u n c t i o n a lw a t e rc h a n n e lp r o t e i na s d e m o n s t r a t e db y h e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e d i nx e n o p u so o c y t e s t h ew a t e rt r a n s p o r ta c t i v i t yw a s r e g u l a t e db yp h o s p h o r y l a t i o n t h ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e sw e r ei d e n t i f i e db ym u t a n t s o f j c p i p 2e x p r e s s i o ni nx e n o p u so o c y t o s 四川大学博e 学位论文 图片目录 第一章 图1 1 质谱仪示意图4 图1 ，2 各引物相对位置一7 图1 3 3 r a c e ( t a k a r a ) 流程图一9 图1 45 - r a c e 的技术流程示意图1 1 图1 5 获得j c p l p 2 基因全长e d n a 的实验流程图，1 5 图1 6 麻疯树幼苗和菠菜幼叶质膜内膜蛋白的s d $ - - p a g e 电泳图1 7 图1 72 9 k d a 的麻疯树质膜内膜蛋白中一个胰蛋白酶酶解肽片段的质谱图1 8 图1 8 麻疯树幼叶的总r n a 一1 9 图1 9 麻疯树幼叶的总d n a ，1 9 图1 2 0 麻疯树水通道蛋白基因e d n a3 末端片段电泳图一2 0 图l _ 2 1 麻疯树水通道蛋白基因e d n a5 末端片段电泳匿2 0 图1 2 2 麻疯树j c p i p 2 基因e d n a 电泳图，2 0 图1 2 3 麻疯树j c p i p 2 基因0 r fd n a 电泳图2 0 图1 2 4 麻疯树水通道蛋白( j c p i p 2 ) e d n a 全长序列及其编码的氨基酸序列2 l 图1 2 5j c p i p 2 基因开放阅读框的d n a 序列2 2 图1 2 6 3 7 种植物p i p s 的系统进化树一2 6 图1 2 7j e p i p 2 蛋白氨基酸系列的疏水区预钡0 2 7 图1 2 8 j c p i p 2 蛋白氨基酸系列的跨膜区预测一2 8 图l ，2 9j c p i p 2 蛋白的修饰位点的预测2 9 图1 3 0 用s o p m a 预测j c p i p 2 蛋白的二级结构3 1 图1 3 1j e p i p 2 与菠菜s o p m 2 8 a 蛋白氨基酸序列及二级结构比对结果3 2 图1 3 2 ( a ) j e p i p 2 与s o p m 2 8 a 的三级结构 ( b ) j c p i p 2 三级结构顶视图 3 3 第二章 圈2 1 非洲爪蟾卵毋细胞表达系统技术路线图4 6 4 四川大学博七学位论文 图2 2 p s p 6 4 t 质粒图谱 图2 3r t - p c r 研究结果， 图2 4 j c p i p 2 基因的n o r t h e r n 杂交分析一 图2 5 免疫检测j e p i p 2 蛋自在麻疯树植株体内的分布情况5 3 图2 6j c p i p 2 蛋白在异源表达系统非洲爪蟾9 日母细胞中的亚细胞定位5 4 图2 7j c p i p 2 基因的s o u t h e r n 杂交分析 图2 8 非洲爪蟾卵母细胞表达j c p i p 2e r n a 第三章 图3 1 图3 2 图3 3 j c p i p 2 蛋白磷酸化调控检测 5 5 过程中细胞体积的变化一5 6 干早胁迫下麻疯树根的七儿p 2 基因的n o r t h e r n 杂交6 6 干旱胁迫下j c p i p 2 蛋白车度的变化 文献综述 图4 1 拟南芥基因组中的3 8 个水通道蛋白7 3 图4 2 植物水通道蛋白单体结构示意图7 5 图4 3菠菜质膜水通道蛋白s o p p 2 ；l 在水孔开启中和关闭状态下的结构图7 6 图4 4 菠菜质膜水通道蛋白s o p i p 2 ；1 四聚体一7 7 图4 5 植物水通道蛋白的活性调控机制7 8 图4 6 植物水通道蛋白磷酸化位点的保守性8 1 图4 7 爪蟾卵母细胞( x e n o p u so o e y l e s ) 检测系统技术路线图8 4 图4 8 拟南芥p 1 p 2 一g u s 融合基因在转基因植株中的表达，8 5 铝 钇 舄 四川i 大学博士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的， 论文成果归四川大学所有，特此声明。 四川大学博士学位论文 第一章麻疯树水通道蛋白j c p i p 2 的分离和基因克隆 摘要 本文采用两相法从麻疯榭幼苗组织中提取质膜囊泡组织，再进行质膜内膜 蛋白的分离。在s d s - - p a g e 电泳下分离出一条分子量为2 9 k d a 的蛋白富集带。 由于其与菠菜叶肉细胞分离出的质膜内膜蛋白富集带分子量相近，被选择进行 质谱分析。将质谱分析所得的数据在n c b i 的蛋白质数据上进行鉴定，发现一 条属于植物p i p 蛋白的肽段；n p 叮h l l g g g a n s v n t g y s k 。根据该肽段结 合麻疯树已有基因密码子的偏爱性设计简并引物进行麻疯树p i p 基因的克隆。 采用r t - - p c r 和r a c e 技术成功克隆了麻疯树j c p i p 2 基因。其e d n a 全长为 9 8 5b p ，包括一个8 4 3 b p 的完整的开放阅读框( o r f ) ，3 9 b p 的5 非翻译区片段 和1 0 3 b p 的3 非翻译区片段。g e n b a n k 登录号为：e f 0 3 0 4 2 0 。以开放阅读框 的e d n a 序列两端设计引物进行d n a 克隆得到一个长为1 2 7 3 b p 的核苷酸序 列，与e d n a 序列比较分析发现有3 个内含子。j c p i p 2 基因的o r f 编码2 8 0 个氨基酸。同源性分析表明j c p i p 2 和其它植物的p i p 氨基酸序列间有很高的同 源性，其中与大戟科植物蓖麻p i p 的同源性最高为9 4 。与唯一鉴定出三维晶 体结构的植物水通道蛋白( 菠菜s o p m 2 8 a ) 的氨基酸同源性也高达8 6 。对 蛋白疏水区和跨膜区进行预测表明该蛋白有6 个跨膜区，整个蛋白的疏水性很 强属于典型膜蛋白的特征。对j e p i p 2 蛋白质结构进行预测表明，j c p i p 2 的三级 结构和菠菜p i p 2 的晶体结构极为相似，主要由6 个跨膜的a 一螺旋和5 个亲水 环( l o o p a 、b 、c 、d 、e ) 连接，其中a 、c 、e 环位于胞膜外侧，b 、d 环及 氨基和羧基末端位于胞膜内侧。羧基端和氨基端有高度相似的氨基酸序列且纵 向重复，多肽链的两端显示明显的对称性，每端( 胞外的e 环、胞内的b 环上) 由高度保守的天门冬酰胺脯氨酸丙氨酸( a s n p r o - a l a ，n p a ) 组成一个小的结构 域一n p a 基序，n p a 基序高度保守。对j e p i p 2 蛋白的化学修饰位点进行预测 发现该蛋白有5 个磷酸化位点。 关键词：麻疯树，植物水通道蛋白，植物质膜内膜蛋白的分离，质谱鉴定，克 隆，生物信息学分析 四j f i 大学博i 学位论文 1 引言 水是生命之源。植物的固着生活决定了自身对水分的强依赖性。从水分长 距离运输到单个细胞扩展以及渗透调节等许多生理过程都离不开水分的跨膜运 输。在水分的跨膜运输过程中，植物水通道蛋白( a q u a p o d n ) 起到非常重要的 作用。它们介导细胞与介质之间快速的被动的水分运输，是水进出细胞的主要 途径【1 】。在植物中，水通道蛋白属于多基因家族。目前，已经从模式植物拟南 芥中克隆了3 8 个水通道蛋白同系物，在水稻、玉米、小麦、油菜、大豆、菠菜 等高等植物中都发现了水通道蛋白同系物。它们在种子萌发、细胞伸长、气孔 运动及逆境应答等许多植物生长发育过程的水分运输中起着关键作用1 2 】。由于 在高等植物的质膜及液泡膜上存在着大量的水通道蛋白，对水通道蛋白的含量 及活性的调控可能是生物体在水分亏缺条件下调控水分交换的重要方式之一。 因此，植物水通道蛋白作为与抗旱相关的重要蛋白受到了广泛的关注1 3 1 。 麻疯树( j a t r o p h ac u r c a s ) 是一种大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 的油料植物， 广泛分布于热带和亚热带地区。在我国的云南、四川、贵州、广东、广西、海 南、福建和台湾都有大量分布。麻疯树是一种具有较大经济开发潜力的植物。 种子含油率高达5 0 ，可用来研制生物柴油。汁液含有大量毒蛋白，麻疯酮等 抗病毒、抗肿瘤成分。由于繁殖生长快，喜暖热气候，尤其耐干旱、贫瘠，麻 疯树已成为我国于热河谷地区荒山绿化、保水固土的重要树种。为了进一步研 究麻疯树的抗旱机理，为麻疯树的育种工作提供理论基础，本实验室分离了麻 疯树水通道蛋白j c p i p 2 ( j a t r o p h ac u r c a sp l a s m am e m b r a n ei n t r i n s i cp r o t e i n ) 并 进行了克隆基因。 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 从四川省攀西地区采集麻疯树幼嫩叶片立即保存于液氮中，带回实验室后 保存在一7 0 冰箱中备用。采集成熟、饱满、无病、虫害的种子在温室中发芽 培养。菠菜种子( s p i n a c i ao l e r a c e al ) 9 9 0 3 购自四川农科所。 四川大学博士学位论文 2 1 2 菌株和载体 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) j m l 0 9 菌株：r e c a l ，s u p e 4 4 ，e n da l ，h s d r l 7 ， g r y r a 9 6 ，r e l a l 为本实验保存。质粒载体p m d1 8 - t v e c t o r ：购自宝生物工程( 大 连) 有限公司【t a k a r ab i o t e c t m o l o g y ( d a l i a n ) c o l t d 】a 2 1 3 试剂盒、酶及药品 e x t a q t m 聚合酶、反转录酶( a m v ) 、氨卞青霉素、各种d n a 限制酶和小 量胶回收试剂盒购于t a k a r a 公司。v e n t r d n a 聚合酶购自b i o l a b 9 公司。e d t a 和d e p c 为a n l e s c o 公司产品；琼脂糖为s i g m a 公司产品，所有化学药品为 进口或国产分析纯。 2 2 实验方法 2 2 1 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白的分离 2 2 1 1 质膜囊泡的制备 收集幼嫩的麻疯树幼苗用水洗净，将其先在冰上迅速剪碎切成1c l n 的小段， 以鲜重( g ) 与匀浆液( m i ) 1 ：5 的比例混合。5 0 9 植物幼苗组织，加2 5 0 m l 预冷 的匀浆液( 3 3 0 m ms u c r o s e ，1 0 0 m me d t a ，5 0 m mt r i s ，0 0 5 m e s ，5 m m d i t h i o t h r e i t o l ，c o m p l e t ep r o t e i n a s e i n h i b i t o r c o c k t a i l 【r o c h e ，m a n n h e i m ， g e r m a n y l ，2 m md t t ，p h7 5 ) 1 4 1 。组织匀浆器中打磨4 5 次，每次6 8s 。用四 层纱布( 或2 0 目尼龙网) 过滤，滤液1 0 ，0 0 0 x g 离心1 0m i n ，收集上清液。取上 清液，1 5 0 ，0 0 0 x g 离心3 0 m i n ，沉淀用少量预冷的粗膜缓冲液o o m mp o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f e r ，l m md t t ，0 2 5 ms u c r o s e ) 悬浮。上清1 5 0 ，0 0 0 x g 离心3 0 m i n 后，沉淀悬浮于相同的b u f f e r 里从而得到粗膜制剂即微粒体( 1 5 m l ) 。粗膜沉淀 1 0 m l 与两相系统液f 3 0 9p e g3 3 5 0 ，3 0 9d e x t r a nt - 5 0 0 ，2 8 m ls u c r o s e - k p b u f i e f ，4 8 m i3 0 0 m m n a c l ) 混匀，0 * c ，激烈搅拌5 m i n ，然后1 0 ，0 0 0 x g 沉 淀4 m i n 。吸上清液，用纯膜悬浮液( o 2 5 ms o r b i t o l ，l m me g t a ，2 0 m m i r i s a c e t a t e ，2 m md t t ，2 m mm g c l 2 ) 稀释，然后1 5 0 ，0 0 0 x g 沉淀3 0 r a i n 。沉 淀悬浮于相同的b u t i e r 中即为质膜，贮于- - 7 0 。 叫川大学博士学位论文 2 212 质膜内膜蛋白的分离 根据j a v o t 的方澍5 l 将质膜提取物加入蛋白增溶缓冲液( 5 m me d t a ，5 r a m e g t a ，4 mu r e a , a n d5 m m i r i s h c i ，p h9 5 ) ，冰上1 0m i n 。然后1 0 0 ，0 0 0 g 离心沉淀3 0m i n 。再用缓冲液( 2 0 m mn a o h ，2 m me d t a 2 m me g t a ，1 0 0 m m n a c l ，5 m mt r i s - h c i ，p h8 ) 抽提沉淀物4 次，以去掉膜组织。最后用缓冲液( 9 r a m k c i ，3 0 0m ms u c r o s e ，5 m mn a 2 e d t a ，5 m mn a 2 e g t a , 5 0 m mn a f , 5 r a md 7 - r , 2 | t g m ll e u p e p t i n ，a n d1 0 m mt r i s b o r a t e ，p h8 3 ) 溶解沉淀物，并储存在一7 0 0 c 备 用。 2 2 1 3s d s p a g e 凝胶电泳 利用b i o r a dm i n ip r o t e i ns y s t e m ，参照分子克隆上的基本操作步骤进 行适当的调整，分离胶浓度为1 5 。将蛋白液在1 0 0 ，0 0 0 x g 离心3 0m i n 收集 沉淀。样品在上样前加入1 ( w v ) s d s 和1 0 0m m1 , 2 二巯基乙烷，并于3 7 下温育3 0 m i n 以用来分开植物水通道蛋白的二聚体嘲。每个上样孔上样的蛋 白量大约1 5 | lg 。 2 2 1 4 质膜蛋白的质谱( l c - - m s f m s ) 分析 图1 1 质谱仪示意图 f i g 1 1l c - - m s m s a n a l y s i s 将目标蛋白带从聚丙烯酰胺凝胶中切下，经过胰蛋白酶酶解后采用生物质 谱进行分析鉴定。具体过程如下： 四川大学博十学位论文 2 214 1蛋白样品的胰蛋白酶酶解 将蛋白带均分为两部分，在样品中加入t c e p ，d t t ，n h 4 h c 0 3 ，c a n 溶 液和固体尿素( u r e a ) 并使混合物最终成分的浓度为：1 0 m m d t t ，l m m t c e p ， l o o m mn f h h c 0 3 ，1 0 a c n ( v v ) 和8mu r e a 。将混合液在3 7 下温育4h ， 再在黑暗状态下温育6 0 m i n ，然后将其置于离心超滤装置( c e n t r i c o ny m 一3 ， m i l l i p o r e ) 中以1 0 0 m mn h 4 h c 0 3 为平衡缓冲液进行超滤。当样品最终体积为 1m l 时，将其转移至e p p e n d o r f f 管中。以样品和酶1 0 0 ：1 的比例加入t r y p s i n 胰蛋白酶溶解液( 胰蛋白酶用1 0 0 m m n i - h h c 0 3 溶解) 。对混合液温和振荡并 于3 7 下温育。为了保证酶解的彻底，在酶解4 h 后，再以样品和酶5 0 ：l 的 比例加入胰蛋白酶溶解液，持续温育至2 4 h 。最后将温育产物加入蚁酸( f o r m i c a c i d ) 在s p e e d v a c 系统中进行干燥。在样品进行质谱分析前加入5 c a n 和 o 】f o r m i ca c i d 。 2 2 ，1 4 2l c m s m s 分析 根据说明书，将1 2 1 t l 胰蛋白酶酶解的多肽片段加入到一个p i c o f f i tr p c 1 8 柱中0 0 7 5 x1 0m m ( n e wo b j e c t i v e ，w o b u m ，m a ，u s a ) 。该柱子用溶解液a 1 ( 0 1 f o r m i ca c i d ) 预处理1 5r a i n 。再用溶解液b 1 ( 9 5 a c e t o n i t r i l e 0 1 f o r m i c a c i d ) 以速度2 0 0n l m i n ( d i o n e xu l t i m a t e ) 进行洗脱，因为该柱子会直接影 响质谱分析的结果。 2 2 14 3 数据库的搜索蛋白的鉴定 l c q 产生的m s m s 原始数据直接用s e q u e s t ( u n i v e r s i t yo fw a s h i n g t o n , l i c e n s e d t o t h e r m o f i r m i g a n ) 在n c b i 蛋白质数据库中进行蛋白质鉴定。方法参 见j a v o t 5 1 。 2 2 2 麻疯树幼苗质膜水通道蛋白基因的克隆 2 2 2 1r n a 提取 按皂土法【7 1 从麻疯树幼嫩叶片中提取总r n a 。取绿色叶片0 5 1 0g ，在 液氮中研磨成粉末并快速转移到事先预冷的离心管中；加入2 3 m l 提取缓冲 四川大学搏士学位论文 液，剧烈振荡混匀；加入与提取缓冲液相同体积的水饱和酚，振荡混匀：再加 与提取缓冲液相同体积的氯仿，振荡混匀。4 ，1 0 ，0 0 0 g 离心1 5 m i n 。 取上清液到一新管，加入l 2 体积的5 m 0 1 lk a c ( p h 4 ，8 ) ，冰上放置1 0 m i n ； 4 ，1 3 。0 0 0 g 离心1 0 r a i n 。取液相到另一新离心管，加入1 2 体积的水饱 和酚和l 2 体积的氯仿，振荡混匀，4 ，1 0 ，0 0 0 g 离心5m i n 。重复抽提， 直到界面清亮。取上清液再加入等体积的氯仿抽提一次。将上清液转到新管中， 加入等体积的乙二醇丁醚，冰上放置1 0 m i n ：4 ，1 4 ，0 0 0 g ，离心1 5m i n 。 去液相，沉淀用7 5 乙醇洗2 次。干燥，溶于适量d e p c h 2 0 中，- 7 0 保存。 r n a 提取液为：2 5m m o l l 柠檬酸钠( p h7 o ) ，1 0m m o l le d t a ，1 0 0 m m o l l n a c l ，0 5 s d s ，1 2 - - 巯基乙醇，0 1 5 皂土。以上试剂均用0 1 的d e p c 室温处理过夜，然后再高压灭菌；玻璃器皿于2 0 0 干热灭菌8 h 。 塑料制品用氯仿处理5 m i n ，再高压灭菌。水饱和酚( p h 4 1 7 ) ，5 m o l l k a c ( p h 4 8 ) ，乙二醇丁醚，氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 1 。 2 2 2 2 基因组d n a 的提取 用c t a b 法( 8 i 从麻疯树幼叶中提取基因组d n a 。将2 0 0 m g 麻疯树幼叶用 液氮研磨成粉末，转移到9 0 0 l al 的2 x c t a b 缓冲液中，轻轻摇匀，6 5 温育 9 0 m i n ，并不时轻轻摇动。将混合物冷却到室温后加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ： 1 ) ，颠倒混匀，再1 0 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，重复一次。取水相，再加入o 7 倍体 积的异丙醇，混匀后室温放置3 h 沉淀d n a 。7