（分析化学专业论文）1植物多糖的单糖组成研究2魔芋化学成分的初步分析.pdf

1 植物多糖的单糖组成研究 2 魔芋化学成分的初步分析 摘 要 本论文由两部分组成： 第一部分主要研究了植物多糖的单糖组成。用苯酚硫酸法测定了乌梅、苦丁 茶两种植物多糖的含量。采用毛细管气相色谱法测定了其单糖组成和摩尔比。利 用水提、醇沉法提取粗多糖，苯酚硫酸法测定含量。乌梅的多糖含量为1 4 8 2 ， 苦丁茶的多糖含量为5 5 4 。采用s e v a g 和三氯乙酸相结合的方法除蛋白。纯化后 的多糖水解成单糖后进行糖醇乙酸酯反应，得到各单糖的糖醇乙酸酯衍生物，进 行毛细管气相色谱分析。通过标准物色谱保留时间定性、峰面积定量法得到马边 乌梅多糖的单糖组成和摩尔比为：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖： 半乳糖= 0 6 5 4 9 6 ：0 。9 3 ：1 ：7 0 3 ：8 6 1 ；余庆小叶苦丁茶多糖的单糖组成和摩 尔比为：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖_ - - - 1 ：3 3 l ：o 2 4 ： 0 5 8 ：2 9 6 ：5 7 0 ；用相同的方法直接对已纯化的川明生多糖进行衍生酯化，测得 川明生多糖含甘露糖和葡萄糖，其摩尔比为1 ：1 6 1 8 。该方法精密度( r s d ) 为 0 3 7 o 9 1 ，加标回收率为9 5 9 1 0 2 3 。这部分工作均未见报道。 第二部分研究了魔芋的化学成分。用气相色谱质谱联用技术分析了新鲜魔芋 的醇溶性成分，经分析确定了31 个组分( 占总量的9 4 4 ) ，并通过t i c 色谱图 峰面积归一化法计算出各个组分的相对百分含量。醇溶物主要成分为2 3 乙基胆甾 醇、豆甾醇、亚油酸乙酯、亚油酸和维生素e 。采用微波消解i c p a e s 法测定了 两种不同产地的魔芋粉中n a 、m g 、c a 、k 、m o 、m n 、n i 、c r 、b a 、f e 、z n 、c u 、 p b 和c d 十四种元素的含量，相对标准偏差r s d 2 6 3 ，检出限在o 1 4 9 鹏几 之间。比较了微波消解和干灰化法溶样的测定结果。最后对魔芋中的神经酰胺类 物质的提取分离方法和结构鉴定进行了较多的探索。 关键词：天然植物、多糖、单糖、魔芋、醇提物、元素、神经酰胺 1s t u d i e so nt h em o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o ni nn a t u r a lp l a n t p o l y s a c c h a r i d e s 2p r i m a r y a n a l y s i so f t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t si na m o r h o p h a l l u s b l u m e l ij u a n ( a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f x i a oc h a n p i n ga n da s s o c i a t ep r o f w a n gh o n g a b s i r c i 。 t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft w op a r t s ： t h ef i r s tp a r ti sa b o u tt h em o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o ni n p o l y s a c c h a r i d e s d e t e r m i n e dt h ec o n t e n t so f p o l y s a c c h a r i d ei nf u c t u sm u m ea n dl i g u s t r u mja p o n i c a t e a b yp h e n o l s u l p h o a c i dm e t h o d t h ec o t e n to fp o l y s a c c h a r i d e si nf u c t u sm u m ei s 1 4 8 2 ；t h ec o t e n to f p o l y s a c c h a r i d e si nl i g u s t r u m j a p o n i c at e ai s5 5 4 t h e na n a l y z e d t h em o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o na n dt h e i rm o l a rr a t i oi nt h e s et w op l a n t sb yu s i n g a c e t y l a t i o nd e r i v a t i z a t i o na n dc a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y t h em o n o s a c c h a r i d e s c o m p o s i t i o n a n dt h e i rm o l a rr a t i oo ft h ef u c t u sm u m ep o l y s a c c h a r i d ea r e ： r h a m n o s e ：a r a b i n o s e ：x y l o s e ：m a n n o s e ：g l u c o s e ：g a l a c t o s e = 0 6 5 ：4 9 6 ：0 9 3 ：1 ：7 0 3 ：8 6 1 ；t h e m o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o na n dt h e i rm o l a rr a t i oo ft h el i g u s t r u mja p o n i c at e a p o l y s a c c h a r i d ea r e ：r h a m n o s e ：a r a b i n o s e ：x y l o s e ：m a n n o s e ：g l u c o s e ：g a l a c t o s e = 1 ：3 31 ：0 2 4 ： 0 5 8 ：2 9 6 ：5 7 0 t h i sm e t h o di s a p p l i e d t oa n o t h e rn a t u r a l p l a n t c h u a n m i n g s h e n v i o l a c e u m t h em o n o s a c c h a r i d e s c o m p o s i t i o n a n dt h e f tm o l a rr a t i oo ft h e c h u a n m i n g s h e nv i o l a c e u mp o l y s a c c h a r i d ea r e ：m a n n o s e ：g l u c o s e = 1 ：1 6 18 t h em e t h o d w a se s t a b l i s h e d 、析mt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sa n dt h er e c o v e r i e sb e i n gi nt h e r a n g eo f0 3 7 - 0 9 1 a n d9 5 9 - 1 0 2 3 ，r e s p e c t i v e l y t h es e c o n d p a r t i sa b o u tt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fa m o r h o p h a l l u s b l u m e f i r s t ，t h ea l c o h o l s o l u b l ec o m p o n e n t so fa m o r h o p h a l l u sb l u m ea r ea n a l y z e db y g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y at o t a lo ft h i r t y f i v ep e s k sw e r ei s o l a t e da n d t h i r t y o n ec o m p o n e n t sw e r ei d e n t i f i e d t h er a l a t i v ea m o u n to ft h ec o m p o n e n t sw a s d e t e r m i n e db yn o r m a l i z a t i o nm e t h o d t h em a i nc o m p o n e n t sa r ev i t a m i ne ，2 3 一e t h y l - c h o l e s t e r o l ，s t i g m a s t e r o l ，e t h y ll i n o l e a t e a n dl i n o l e i ca c i d t h e ns t u d i e dt h ec o n t e n t so f n a ，m g ，c a ，k ，m e ，m n ，n i ，c r ，b a ，f e lz n ，c u ，p ba n dc d i n t w ok i n d s o fa m o r h o p h a l l u sb l u m ei nd i f f e r e n th a b i t a t sb ym i c r o w a v ed i g e s t i o na n di c p a e s m e t h o d t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o na n dd e t e c t i o nl i m i ta r ei nt h er a n g eo f 0 10 0 o 2 6 3 a n d 0 1 4 9 p g lr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t so b t a i n e d b ym i c r o w a v e d i g e s t i o na n dd r y - a s h i n gd i g e s t i o nw f f f ec o m p a r e d t h el a s tc h a p t e ri s a b o u tt h e e x t r a c t i o n 、p u r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f c e r a m i d ei na m o r h o p h a l l u sb l u m e k e yw o r d s ：n a t u r a lp l a n t ，p o l y s a c c h a r i d e ，m o n o s a c c h a r i d e s ，a m o r h o p h a l l u sb l u m e ， a l c o h o l s o l u b l ec o m p o n e n t s ，i n o r g a n i ce l e m e n t ，c e r a m i d e 声明 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师肖朝萍研究员和王红副研究员指导 下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得任何大学或研 究所的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在中国科学院成都有机化学研究所读书期间在导师指 导下取得的，论文成果归成都有机化学研究所所有，特此声明。 5 7 第一章文献综述 第一章文献综述 第一节多糖研究的意义 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 是构成生命的四大基本物质之一，是一类由醛糖或酮糖 通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是自然界含量最丰富的生物多聚物， 也是构成生命分子的基础之一。多糖广泛存在于高等植物、动物、微生物、地衣 和海藻等中，按其来源不同，可分为细菌多糖、真菌多糖、藻类地衣多糖、植物 多糖和动物多糖等【l 】。 人们对多糖的初始研究可追溯到1 9 3 6 年s h e a r 对多糖抗肿瘤活性的发现。从上 世纪7 0 年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源 和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各 种活动。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、 降血脂、抗辐射等药理作用，而且几乎没有毒性，愈来愈引起国内外药理学家、 生物学家和化学家们的兴趣，成为当前的研究热点。 1 1 多糖的药理作用： 1 1 1 抗肿瘤 1 1 1 1 多糖的抗肿瘤作用 多糖主要通过增强机体免疫功能，激活免疫监视系统来实现抗肿瘤的作用。 多糖能在多条途径，多个层面对免疫系统发挥调节作用。如激活免疫细胞( 巨噬细 胞、t 细胞、b 细胞、n k 细胞) 、激活补体系统及单核巨噬细胞系统及对多种细胞 因子的影响，如促进干扰素生成，促进白细胞介素生成，诱生肿瘤坏死因子等。 如绞股蓝多糖、长松萝多糖能明显提高小鼠碳粒廓清速率，能增强肝癌h e p s 小鼠的n k 细胞活性，对小鼠血清溶血素和s 1 8 0 小鼠脾指数有显著提高作用1 2 。而 灵芝多糖能激活补体系统，增强特异性血浆蛋白l a 、l b 、l c 的量。茯苓多糖、香 菇多糖、云芝多糖、猪苓多糖、白术多糖及甘草多糖等均能够不同程度诱导i l 2 和i f n 的产生【3 】。 1 1 1 2 多糖直接抑瘤作用 1 第一部分植物多糖的单糖组成研究 1 ) 直接杀伤作用 枸杞多糖、茯苓多糖、刺五加多糖在体内外能明显抑带i j s l 8 0 、k 5 6 2 j 中瘤细胞 的生长【4 】。 2 ) 诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的诱导分化 相对较低分子质量( 1 0 0 0 2 0 0 0 ) 的地黄多糖可使小鼠l e w i s 肺癌细胞内抗癌p 5 3 基因表达明显增强，从而引起l e w i s j 市癌细胞的程序性死亡【5 1 。 3 ) 对抗癌基因的影响 红毛五加多糖能诱导肿瘤细胞s g c 7 9 0 1 的作用，并使s g c 7 9 0 1 细胞周期明显 阻滞于g 0 g 1 期。另外，云芝多糖可使结肠癌细胞阻滞于g 1 期。人参多糖、当归 多糖能使h l 。6 0 、k 5 6 2 癌细胞生长阻滞于g o 和g 1 则6 】。 1 1 2 抗病毒作用 多糖的抗病毒作用包括抗h i v 和抗其他病毒的作用，其中以抗h i v 研究较多。 1 1 2 1 在抗h i v 方面 李小赳7 1 等报告灰树花多糖具有直接抑制h 病毒，改善艾滋病相应症状的功 能，将灰树花多糖加入盛有受h i v 病毒感染的辅助t 淋巴细胞中，发现h i v 的活性 受到抑制。另外，许多经硫酸酯的多糖如香菇多糖、地衣多糖、右旋多糖酐、裂 褶菌多糖，木聚糖等均有明显的抑制h 1 活性，其作用机理是干扰h i v 1 对宿主 细胞的粘附作用，抑制转录酶的活性。 1 1 2 2 多糖对其它的病毒的抑制作用 多糖可以抑制很多其它病毒，如单纯疱疹病毒( h s v 1 ，h s v 一2 ) 、巨噬细胞病 毒( h l m v ) 、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒等。张斌等【8 】 研究发现从红藻中提取的红藻多糖( r p z 和r p 2 ) 在细胞水平上有明显抑制牛免疫缺 陷病毒b i v 的生长。卡拉胶是某些红藻的细胞壁多糖，对h s v 1 具有强抑制作用 9 1 。 1 1 3 抗衰老作用 多糖抗衰老与其免疫调节剂调节机体免疫功能及增强机体对自由基的清除和 抗氧化能力有关。 1 1 3 1 作为免疫调节剂调节机体免疫功能 一些学者认为，免疫功能具有增龄性变化，即年龄增大，其免疫功能下降或 紊乱，结果胸腺萎缩，t 细胞损耗，从而导致机体衰老，寿命缩短。芦笋多糖可明 显提高小鼠血超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化物酶 2 第一章文献综述 ( g s h v x ) 活力，显著降低血浆、脑肝匀浆脂质过氧化物( l o p ) 水平，可显著拮抗衰 老所致胸腺和脑组织的萎缩【1 0 l 。 1 1 3 2 增强机体对自由基的清除和抗氧化能力 枸杞多糖具有清除o h 的作用，可以减少o h 所致丙二醛的产生，抑制o h 所致膜流动性下降和减轻肝线粒体膨胀程度。枸杞多糖、牛膝多糖均能提高经 1 0 0 9 m o l lh 2 0 2 处理的2 1 3 s 细胞的存活率。降低细胞的p 半乳糖苷酶( s a b - g a l ) 染色 阳性率以及丙二醛( m d a ) 水平，抑制细胞的单胺氧化酶一b ( m a o b ) 活性，增强s o d 活力【1 。 1 1 4 降血糖 多糖降血糖作用可能与影响糖代谢酶的活性，加速糖的分解，抑制糖异生或 肝糖原的输出，促进外周组织对葡萄糖的利用及对激素的调节有关。王妮娜等【1 2 】 对虫草菌丝多糖的研究发现虫草菌丝多糖c s f 1 0 能显著降低链脲佐菌素所致的糖 尿病小鼠以及肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖水平，能升高血清胰岛素水平， 对实验性糖尿病小鼠的肝、肾有保护作用。此外，南瓜多糖、羊栖菜多糖、人工 虫草多糖、知母多糖、茶多糖等均可使四氧嘧啶诱发的小鼠高血糖的血糖明显下 降。 1 1 5 降血脂 昆布多糖能明显降低高血脂症大鼠血清总胆固醇( t c ) 水平，升高低高密度脂 蛋白胆固醇( h d l c ) 的作用，明显改善高脂血症大鼠卵磷酯胆固醇酰基转移酶 ( l c a t ) ，促进胆固醇的逆向转运和代谢1 3 】。南瓜多糖也可明显降低正常及糖尿病 大鼠的血清中甘油三脂( t g ) 、血总胆固醇( t c h ) 、低密度脂蛋i 刍( l d l ) ，升高高密度 脂蛋i 刍( h d l ) ，故对糖尿病并发症的预防和治疗有重大作用。 1 1 6 抗炎 茯苓多糖对二甲苯所致的小鼠耳肿：大剂量组能增强小鼠耳肿胀，小剂量组 则明显抑制小鼠耳肿，对大鼠慢性皮下肉芽肿生成有一定抑制作用【1 4 】。人工培养 虫草多糖c m p s 对小鼠耳肿胀及毛细管通透性均有抑制作用。目前国外研究较多的 是细菌的夹膜多糖，其中对脆弱类杆菌夹膜多糖的抗感染活性研究较为深入。脆 弱类杆菌的夹膜多糖p s a 、p s b 具有显著的生物活性，在体外具有t 细胞增殖活性 在体内具有抗脓肿形成作用。p s a j d 丕具有促有丝分裂能力【1 5 】。 1 1 7 抗凝血活性 3 第一部分植物多糖的单糖组成研究 目前报道具有抗凝血作用的多糖多为来源于海藻的硫酸化多糖。作为强酸性 大分子，硫酸化多糖能在低离子浓度和蛋白质表面的基础碎片非特异性的结合。 许多例子表明硫酸化多糖的非常特殊的结构对应特殊的蛋白质有非常高的亲和力 1 6 1 。在我国，茶是我国人民喜爱的一种饮料，由安徽屯溪绿茶中得到的茶叶多糖 有显著抗凝血和抗血栓的作用【1 7 1 。此外银耳多糖、岩藻多糖、硫酸软骨素均有抗 凝血活性【1 1 1 。 1 1 8 抗辐射 口服南沙参多糖1g k g 、0 5g l 【g 一周后能明显对抗6 0 c o y 线所致小鼠外周血 白细胞总数降低和胸腺、脾脏重量减轻，使淋巴细胞( a x a e ) 比率升高，t h t s 比 值升高，腹腔巨噬细胞吞噬功能明显增强，显著减轻小鼠肠腺脾脏病理损伤，使 修复加速【1 8 】。螺旋藻多糖、芦荟多糖都可提高受射线，致死剂量照射小鼠3 0 d 内的 存活率，促进小鼠干细胞和造血细胞的增殖和分化，促进受到辐射损伤的小鼠造 血系统的恢复，增强小鼠的抗辐射能力1 9 捌。 1 1 9 抗肿瘤药产生的细胞毒性 对老鼠皮下注射环磷酰胺( 2 0 0 m g k g ) ，引起鼠体内白细胞数、胃和十二指肠的 粘膜再育细胞的明显下降。注射当归属报春黄甙多糖后，老鼠体内明显可见白细 胞数、胃和十二指肠的粘膜再育细胞的恢复。免疫印迹法显示环磷酰胺明显降低 胃粘膜血管内皮生长因子，原癌基因，鸟氨酸脱羧酶的蛋白质表达。报春黄甙多 糖能够逆转这种环磷酰胺的这种作用。这些资料表明报春黄甙多糖是一个细胞保 护试剂，能对抗环磷酰胺在造血和胃肠道组织的细胞毒性【2 1 1 。 1 1 1 0 其他 云芝多糖、柴胡果胶多糖、当归多糖、海藻多糖、螺旋藻多糖等胃溃疡具有 明显拮抗作用】。鹿草多糖、木姜子根多糖、茶多糖能显著延长小鼠常压耐缺氧 存活时间，提高小鼠游泳时间。 综上所述，多糖广泛参与了细胞的各种生命活动，从而产生了多种生物学功 能。我国是中药的发源地，常用中药达5 0 0 0 余种，而多糖就广泛的存在于这些药 材中。由于多糖资源丰富，成本相对低廉【2 3 1 ，药理活性好，对多糖的研究与开发 已越来越引起人们的广泛关注。在对多糖的结构及其活性的研究中发现，自然界 中存在着许多有各种生物活性的多糖，但并不是所有的多糖都具有活性，多糖的 4 第一章文献综述 活性直接或间接地受到其结构的制约。有的多糖由于结构或理化性质等障碍而不 利于其生物学活性的发挥，有的多糖尽管药效良好，但同时也会产生些不良反应， 甚至毒副作用，如有些具有抗病毒活性的低分子量硫酸葡聚糖可产生不利于其抗病 毒活性的抗凝血现象。还有的从天然生物体内分离的多糖活性较弱，需进行一定 的结构修饰，以获取高活性多糖【2 4 】。因此，对多糖的结构进行更深入的研究将帮 助人们更好地了解多糖的结构与活性的关系，更好地利用多糖这一天然资源。在 各种结构研究中，多糖的单糖组成和摩尔比测定是一项较为重要的工作，多糖的 单糖组成可以提供多糖结构最基本的信息，也是控制多糖质量标准最重要的环节。 第二节多糖的研究现状 目前世界各国，尤其是日本、美国等国对多糖都进行了大量深入的研究。2 0 世纪7 0 年代以来，我国在芸芝多糖、银耳多糖、刺五加多糖、竹黄多糖的研究中 取得了很大进展，近年来我国对多糖的研究更加广泛深入，发展很快，形成了空 前迅速发展的趋势。 研究对象：植物、动物、真菌、细菌、地衣、藻类、花粉多糖等 研究方法：涉及各种化学方法及仪器分析方法 研究范围：涉及多糖的提取纯化和分级、理化性质、结构分析、化学变性、 免疫学、药理学以及治疗应用等方面。 在这众多研究中，因为化学结构是生物活性的基础，故而也是目前糖化学和 糖生物学共同关注的焦点问题，在此主要介绍活性多糖结构的研究现状。 多糖的一级结构是指糖基组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头 碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。糖的一级结构非常复杂，加上 糖残基上可以连接硫酸基团、乙酯基团、磷酸基团、甲基化基团，更加剧了糖一 级结构的复杂性。多糖的高级结构是在一级结构的基础上，各侧链通过非共价键 相互作用结合而形成复杂的高级结构。多糖一级结构的描述包括：多糖的分子量 范围；多糖的单糖组分；单糖的连接点类型；单糖和糖苷键的构型；重 复单位【2 5 1 。 如上所述，多糖的一级结构本身就很复杂。由于多糖结构的微观不均一性，或 结构键中有缺陷，或是分子量分散，使多糖的一级结构分析难以得出完全正确的 5 第一部分植物多糖的单糖组成研究 结构式。目前多糖结构分析的方法主要有化学方法和物理方法。下面将简单介绍 这两种方法。 2 1 化学分析法 化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典 而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和酸水解等。 2 1 1 甲基化分析 甲基化分析是多糖也是寡糖结构分析的最有力的手段之一。它包括糖的所有 自由羟基全部生成甲醚，接着通过水解释放出甲基化单糖，再经n a b h 4 还原成糖醇， 进而乙酰化水解后生成的羟基，得到各种部分甲基化的糖醇乙酰衍生物，生成的 产物用气相色谱进行定性和定量分析，可确定组成多糖的各单糖种类和比例，进 而用气相色谱质谱，结合标准谱图的分析，可得到各种部分甲基化单糖衍生物的 归属，从而确定各单糖的连接位置，即糖苷键的位置。但甲基化分析还无法知道 异头碳糖苷键构型及多糖中单糖残基的顺序信息【2 6 1 。 2 1 2 过碘酸氧化及s m i t h 降解 多糖的过碘酸氧化反应通常在p h 3 。5 的水溶液中进行，用过碘酸盐为氧化剂， 因双醛型的氧化产物在水中不稳定，因此需要在酸水解前用n a b h 4 将它们还原为 醇。最后，通过水解产物的分析结果可获得多糖中单糖连接的类型是1 _ 4 ，1 6 ， l - 2 ，还是各种连接兼而有之。 s m i t h 降解实际上是一种改良的过碘酸氧化，它是将多糖过碘酸盐氧化，n a b h 4 还原后用弱酸部分水解( 通常在室温下用稀无机酸水解还原产物) ，生成具有特征 性的糖连接的重复单元，从而获得更多的结构信息口7 1 。 2 1 3 酸水解 这是多糖结构分析中一个很有用的技术。阐明结构的第一步就是要鉴别多糖 的单糖组分，酸水解是常用的方法，可根据需要选择适当的条件( 酸的种类、浓度、 温度及水解时间等) ；也可以在特殊糖苷键处断裂，帮助整个结构分析【2 8 】。此外通 过部分酸水解可以获得结构较为容易测定的短链片段，从而集零为整推断出多糖 的结构。 2 2 物理分析法 6 第一章文献综述 2 2 1 贼 m 在多糖结构分析上主要是判断多糖的特征吸收峰。利用8 9 0 c m 。1 吸收峰来判别 p 糖苷键的存在，8 4 0 c m 1 吸收峰来判别q 糖苷键的存在，吡喃糖苷在1 1 0 0 - - 1 0 1 0 c m 间应有3 个吸收峰，而呋喃糖苷在相应区域只有2 个吸收峰 2 9 1 ，此外，多糖结构中 的特征官能团也可从艰图中推断。 2 2 2m s 、g c m s g c 分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但g c m s 是多糖结构分析不 可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴 别出糖的异构体叫。m s 在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确 定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于f a b m s 、e s i m s 和 m a l d i m s 等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构3 1 1 。 2 2 3n m r 用n m r 技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通 过化学位移、偶合常数、积分面积、n o e ) 及驰豫时间等参数来表达 3 2 】。 第三节课题的设计和提出 3 1 乌梅 乌梅始载神农百草经，是由蔷薇科植物梅( a r m e n c a c am a r n es c e b ) 的成 熟或未成熟果实经熏制和烘制等方法加工而成，是一种开发前景广阔的药食两用 植物果实。乌梅不仅能敛肺，涩肠，生津，安蛔，还具有保肝，抗肿瘤，抗疲劳， 抗过敏、抗菌和抗病毒等功效。其在医药方面已被广泛应用于肠胃疾患，妇科疾 病，儿科，神经系统疾病等各个方面【3 3 ，3 4 1 。此外它还能使血液保持微碱性，促进 体内乳酸分解，具有抗疲劳作用。由于其富含多种营养成分，故乌梅在食品饮料 方面也有相当大的挖掘探讨的潜力。我国很早就有乌梅饮品，用以消暑解疲，恢 复体力。 产自四川小凉山( 马边) 地区的乌梅是我国最好的乌梅之一。由于乌梅具有 多种功效，药效突出，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒等方面都和多糖的药理作用有相 似之处，故研究乌梅多糖及其结构对其药效的进一步探索有重要意义。 3 2 苦丁茶 7 第一部分植物多糖的单糖组成研究 苦丁茶具有清热解毒，杀菌消炎，健胃消积，止咳化痰，生津止渴，提神醒 脑的功效，在我国南部及西南部民间作药品和饮品使用已有悠久历史。贵州余庆 小叶苦丁茶在民间为常用中草药，当地用于消肿、止痛、抗风湿、治疗疖疮、痹症、 降血压等，为木樨科女贞属植物粗壮女贞( l i g u s t r u mr o b u s tb l ) 的叶片加工而成， 作为一种药食两用植物，已成为民间喜爱的保健饮料之一【3 5 1 。苦丁茶的栽培是为 了获得高产优质的新梢，而新梢的生长主要来源于糖的积累与转化。糖是苦丁茶 新梢中重要的可溶性成分，其含量高低和组成直接影响苦丁茶的风味品质，糖分 的多少和组成已成为苦丁茶品质优劣的重要指标之一，也成为苦丁茶药效的决定 成分【3 6 】。因此研究苦丁茶多糖及其结构( 单糖的摩尔比) 对进一步开发利用苦丁 茶资源有重要意义。 本部分主要针对四川马边乌梅和贵州余庆小叶苦丁茶中的多糖进行研究，通 过对多糖的提取、分离、纯化，再经过水解、酯化，利用气相色谱对其多糖中的 单糖组成和摩尔比进行了较为细致的分析与探索，以期为这两种植物多糖的药理 学研究以及相关产品的深度开发提供依据。 8 第二章多糖的提取纯化和含量测定 第二章多糖的提取纯化与含量测定 第一节多糖的提取和纯化 多糖是极性很大的大分子化合物，通常用水作溶剂来提取，可以用热水浸煮 提取，也可以用冷水浸提。水提取的多数是中性多糖，用弱碱性水溶液可以提取 含有糖醛酸的多糖，应注意的是在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，提 取时应尽量避免酸性条件。植物多糖在提取前先用8 0 乙醇除去单糖、低聚糖及苷 类等干扰性成分。许多植物或动物样品含较多的脂类物质，因此在提取多糖之后 用石油醚、乙醚等溶剂除去脂溶性杂质， 多糖的含量测定可分为两大类：一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱 法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚硫酸法、 葸酮硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时干扰较大，重现性 差，受影响因素多【3 9 】。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量测定仍然主要采 用后者。 目前文献中进行含量测定的多糖大多为粗多糖，因为如果纯化后测定，纯化 过程本身就有多糖损失，且损失量是不确定的，故测定时选用粗多糖进行含量测 定。 1 1 实验仪器、试剂及样品 1 1 1 实验仪器： 回流装置、抽滤装置、托盘天平、移液管、圆底烧瓶、容量瓶、试管、电光分 析天平( 万分之一，上海天平仪器厂) 1 1 2 试剂： 乙醇、乙醚、丙酮、双氧水、活性碳、茚三酮、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、 无水葡萄糖、苯酚、一次蒸馏水、浓硫酸( 均为分析纯) 1 1 3 样品： 四川马边乌梅( 四川省马边县农业科研所提供) 、贵州余庆小叶苦丁茶( 贵 州省余庆县农业生产办公室向明全主任提供) o 第一部分植物多糖的单糖组成研究 1 2 多糖的提取 热水浸提法是一种常用的多糖提取方法，其影响因素主要有加热温度、加热 时间、加水比、提取次数、最终醇沉浓度等。从热力学角度上讲，温度越高，加 热时间越长，对植物细胞壁的破坏作用越大，多糖的提取率会越高。但是温度过 高，加热时间太长，有可能引起多糖结构的变化和破坏。从这两方面考虑，在提 取多糖时，应选择合适的加热温度和加热时间。 通过查阅文献p 7 1 和不断实践，选择如下条件提取多糖，得率最高。加热温度： 1 0 0 ；加热时间：2 h ；加水l l 1 ：4 ；提取次数：2 次；最终醇沉浓度：8 0 。 提取条件：各取1 0 0 0 9 植物粉末，用8 0 乙醇煮提两次，每次2h ，除去单 糖、低聚糖、苷类及生物碱等干扰成分。倒出回流液后，用8 0 乙醇清洗一次。 干燥后，用沸水煮提两次，每次2h ，合并滤液并浓缩，加入一定体积的无水乙醇， 使含醇量达到8 0 ，醇析过夜，过滤，沉淀分别用乙醇、丙酮、乙醚洗涤多次后 常规干燥，得粗多糖。 1 3 多糖的纯化 用醇析法所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质，需要除蛋白。除蛋白的方法 传统上有s e v a g 法、三氟三氯乙烷法及三氯乙酸法等【3 9 1 。s e v a g 蝴得最多的方 法，该方法是将多糖的水溶液与氯仿混合，并震摇成乳化液，此时蛋白质变性成 胶状，离心后蛋白层存在于有机相和水相之间。为了加速蛋白质的变性，最好用 p h = 4 - - 一5 的缓冲溶液代替水，并加少量正丁醇或正戊醇，或将氯仿、正丁醇( 4 ：1 ) 加入糖液中振摇后离心除去蛋白质。三氯乙酸法是多糖的水溶液中加入三氯乙酸， 低温静置，因为蛋白质在酸性条件下带正电荷，与三氯乙酸的酸根结合形成沉淀， 和多糖的水溶液分开。另外，也可以利用蛋白酶可水解蛋白质的特性，在多糖的 水提液中加人中性蛋白酶和糜蛋白酶，与s e v a g 法结合进行脱蛋白；或将蛋白酶与 三氯乙酸法结合除蛋白。有机溶剂与去蛋白酶结合的除蛋白法效率要高得多，节 省许多试剂和资金。但是，加入过多的蛋白酶反而会加重除蛋白的难度。除蛋白 的效果可以用茚三酮反应检测，结果呈阴性。 1 3 1 除色素 尝试了双氧水氧化法和活性碳吸附法除色素，但效果均不明显。 1 0 第二章多糖的提取纯化和含量测定 1 3 2 除蛋白 尝试了s e v a g 法和三氯乙酸法，这两种方法均有除蛋白效果，但是多糖都有不 同程度的损失，故以乌梅多糖为例对这两种方法进行考察。 s e v a g 法：取乌梅粗多糖p 1 5 9 ，配成5 0 m l 糖液，在水溶液中加入其体积1 5 的氯 仿、正丁醇( 4 ：1 ) 混合液，震摇1 5 m i n ，此时蛋白质变性成胶状，放置l o m i n ，蛋白 层存在于有机相和水相之间，离心取上层水相，从中取出1 0 m l 水溶液，加无水乙 醇至含醇量达8 0 ，静置过夜，沉淀物经无水乙醇洗涤后真空干燥，得粗多糖 s e v a g l ( s e v a g 法去除蛋白1 次) ，计算多糖得率( 以p l 为参照) 并用苯酚一硫酸法测定其 纯度。其余水溶液，再用s e v a g 法除蛋白，重复以上的操作( 2 次) ，得粗多糖s e v a 9 2 、 s e v a 9 3 ( s e v a g 法去除蛋白分别为2 、3 次) ，分别计算得率( p f l , p l 为参照) ，并以用苯酚 硫酸法测定所得多糖的纯度。 三氯乙酸法：称取乌梅粗多糖p 1l g ，配成5 0 m l 糖液，加入其体积3 的浓度为 1 0 三氯乙酸，摇匀后冰箱静置2 4 h ，蛋白质沉淀析出，离心得多糖液，取出2 0 m l 多糖清液，加无水乙醇至含醇量达8 0 ，静置过夜，沉淀物经无水乙醇洗涤后真 空干燥，得粗多糖t c a i ( t c a 法去除蛋白1 次) ，计算多糖得率( 以p i 为参照) 并用苯 酚一硫酸法测定其纯度。其余水溶液，再用t c a 法除蛋白，重复以上的操作，得 粗多糖t c a 2 ( t c a 法去除蛋白2 次) 。分别计算得率( 以p l 为参照) ，并以用苯酚一硫酸 法测定所得多糖的纯度。 结果：粗多糖p l 经上述方法纯化后，得到s e v a g l 、s e v a 9 2 、s e v a 9 3 、t c a l 和 t c a 2 这几种样品，用苯酚硫酸法分别测定它们的多糖纯度，并计算它们的得率。 如表1 所示。 表1 除蛋白后的多糖含量 由上表可知，用s e v a g 法除蛋白效果不佳，三氯乙酸( t c a ) 一次去除蛋白质后， 上清液中多糖的纯度就比s e v a g 法3 次处理后的结果还高，i 而j t s e v a g 法需反复多次， 这样较麻烦，费时且正丁醇和氯仿的消耗量大，样品损失也较大，所得粗多糖颜 色较深，含有许多色素；而用t c a 方法除蛋白效果较好，无须重复许多次，节省 1 l 第一部分植物多糖的单糖组成研究 时间，所需试剂也大量节省，实验中还发现，采用三氯乙酸法后溶液中的色素随 着蛋白质的沉淀而除去，除色素效果明显。但三氯乙酸法反应剧烈，能够引起多 糖成分降解，因此收率较低，不宜大量应用。 最后采用了三氯乙酸和s e v a g 法相结合，即先用三氯乙酸法一次，后用s e v a g 法三次即可达到满意的除蛋白效果，而且三氯乙酸的除色素效果也很明显。 1 3 3 结果与讨论 将以上两种方法结合使用的原因是：在多糖的提取过程中，有大量蛋白质和 色素进入多糖水溶液。由上述结果可知，在单独用s e v a g 法去除蛋白质三次后， 如果再用此法去除蛋白质，除蛋白效率很低，而且多糖损失严重。单独用三氯 乙酸法除蛋白质，能够引起多糖成分降解，收率很低。由于以上原因，本实验在 纯化多糖时，用s e v a g 法和三氯乙酸法相结合去除蛋白质。这是去除多糖溶液中 蛋白质方法的一种新尝试，并取得了理想的实验结果。除蛋白后的多糖和茚三酮 反应呈阴性。同时三氯乙酸具有脱色效果，糖液呈无色。 经分离、提取、纯化的乌梅、苦丁茶多糖的红外光谱图如图1 、图2 所示。红 外谱图在4 0 0 0 4 0 0 c m d 区间均具有多糖类物质的一般特征。主要表现在： 3 6 0 0 3 2 0 0 c m 。1 出现的宽峰为糖类物质中分子内和分子间氢键的o h 伸缩振动； 3 0 0 0 2 9 0 0 c m 。1 处的弱峰为饱和c h 伸缩振动；1 7 4 0 c m 1 处为羰基吸收峰； 1 4 0 0 1 2 0 0 c m 1 的一些峰为c h 的弯曲振动；1 2 0 0 1 0 0 0 c m - 1 间的吸收峰是由两种 c o 的伸缩振动引起的，一种是属于c o h 的，另一种是糖环的c o c 的。另外 l l l o c m 1 附近有吸收峰表明该多糖的单糖为六元杂环。 综合以上结果，可以确定为多糖类化合物。 1 2 第二章多糖的提取纯化和含量测定 图1 乌梅多糖的红外光谱图 图2 苦丁茶多糖的红外光谱图 1 3 第一部分植物多糖的单糖组成研究 第二节多糖的含量测定 多糖类成分在硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，之后和 苯酚缩合成橙色化合物，在波长4 9 0 n m 左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸 收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定，根据标准工作曲线计算出多 糖的含量【3 踟。所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖， 这样测得的值较准确。 多糖詈一仑艮：。 多糖辨黼。- 坐。，。，、 浓缩飞 ” “了。 共轭酚( 有最大吸收波氏 2 1 实验仪器、试剂及样品 2 1 1 实验仪器： 托盘天平、移液管、圆底烧瓶、容量瓶、试管、7 2 1 型分光光度计、电光分析 天平( 万分之一，上海天平仪器厂) 1 3 1 2 试剂： 乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、浓硫酸、无水葡萄糖、一次蒸馏水、( 均为分析 纯) 1 3 1 3 样品： 同本章1 1 3 2 2 标准曲线的绘制 由于多糖水解成单糖后方可测定含量，而一般多糖中均含有较高的葡萄糖， 且葡萄糖易得，故选择葡萄糖做标准曲线。 、 标准溶液配n - 精密称取经1 0 5 。c 干燥至恒重的葡萄糖标准品2 1 9 1 m g ，置 1 4 第二章多糖的提取纯化和含量测定 1 0 0 m l 容量瓶中，加水溶解并定容，即得。 苯酚试液的配制：称取苯酚5 9 ，置于棕色试剂瓶中，加水7 5 m l ，得到6 2 5 的苯 酚试液。 标准曲线的绘制：精密吸取上述标准溶液1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0m 1 分别置于 2 5 m l 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。各精密吸取2 0 m l 置具塞试管中， 分别依次加入苯酚试液l m l ，浓硫酸5 m l ，放置1 0 m i n 后6 0 反应2 0 m i n 。冷却至 显色稳定后在4 9 0 n m 处测定吸光度，见表2 。 表2 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度 51 01 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 04 5 x a x i s 讹 图3 葡萄糖标准工作曲线 根据葡萄糖浓度和吸光度计算得回归方程为：( r = 0 9 9 8 9 ) a = 4 9 2 2 1 0 2 c + i 4 1 1 1 0 之 a 为吸光度，c 为浓度( u g m 1 ) 注意事项：各样品应严格平行操作，才能得到线性较好的工作曲线。 2 3 换算因素的测定 本法是以葡萄糖为标准，但植物多糖含有多种单糖，不同单糖与苯酚硫酸试 1 5 盯 旺 刚 是l一v卜 第一部分植物多糖的单糖组成研究 剂的显色情况不同，因此需根据葡萄糖的标准工作曲线求出多糖水解成葡萄糖的 转换因子一换算因素。 准确称取干燥至恒重的精制乌梅多糖5 7 5 m g ，分别置于l o o m l 容量瓶中，用蒸 馏水稀释至刻度，吸取2 0m l 置具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法测定吸 光度，三次测定值均为0 2 5 1 。对照标准曲线求出多糖中的葡萄糖量，进而得到样 品的葡萄糖浓度。计算换算因素f 的公式为： 。多糖重量 多糖液的葡萄糖浓度x 稀释因素 凡怖：竺堂l ：1 1 。9 5 如梅一巫0 2 5 亘1 - 1 巫4 11甄x1 0 - z 一 4 9 2 2 x 1 0 叫 同理，准确称取干燥至恒重的精制小叶苦丁茶多糖8 1 2 m g ，照上法测定吸光 度，三次测定值均为为0 3 0 2 。苦丁茶的换算因素f o 怎t 苯：一一些堕生一一一：1 3 8 8 苦丁茶 q ：! q 三二! ：兰! ! 兰三q ：1 0 0 4 9 2 2 1 0 “ 综上所述，乌梅和苦丁茶