（农药学专业论文）不同诱变方法对毒死蜱降解菌o6降解效果的影响研究.pdf

摘要 本文以本实验室筛选出的一株毒死蜱降解菌0 6 为供试材料，以紫外线和离子 注入为诱变方法，对处理过的菌株进行筛选，得到了h y l 、h y 2 、h y 3 等突变菌株。 研究了影响突变菌株生长的因子；研究了突变菌株降解动力学；研究了突变菌株和 出发菌株酶的电泳条带的差异。主要研究结果如下： 1 对0 6 菌株进行紫外诱变，得到了两株突变菌株h y l 、h y 2 ，在加菌量为 9 x 1 0 1 1 c f i ，m l ，毒死蜱添加量为1 0m g l - 1 时，两株突变菌株的降解率分别提高了 8 4 8 8 、9 6 16 。 2 对0 6 菌株进行离子注入诱变，得到了一株突变菌株h y 3 ，在加菌量为 9 x 1 0 1 1 c h ，m l ，毒死蜱添加量为1 0m g l 1 时，突变菌株的降解率提高了7 9 7 8 。 3 在温度为3 0 ，p h 值不同的情况下，4 8 h 时h y l 、h y 2 、h y 3 的生长量大 小均为p h 7 0 p h 8 0 p h 9 0 p h 6 0 p h 5 0 ； 4 在p h 7 0 ，温度不同的情况下，h y l 、h y 2 和h y 3 在4 8 h 时生长量大小均为 3 0 3 5 2 5 4 0 2 0 ： 5 在温度为3 0 0 ，p h 7 0 时，三株突变菌株的生长量分别在2 4 h 左右达到最大 值而进入平稳期。 6 研究了不同菌量和不同降解时间对突变株降解动力学的影响，均符合一级降 解动力学方程。在不同降解时间的降解动力学研究中，h y l 、h y 2 、h y 3 的速率常 数分别为o 1 3 1 0d - 1 、o 1 4 0 0d - 1 、0 1 6 4 2d 一，半衰期分别为5 1 5 d 、4 7 2 d 、4 3 1 d 。 7 通过对出发菌株与突变菌株的酶的电泳条带分析，发现胞外酶电泳条带变化 不明显。胞内酶条带有变化，说明降解酶可能存在细胞内。 关键词：毒死蜱，降解菌，诱变，突变株，酶 s t u d i e so fe f f e c t so nd e g r a d a t i o no f c h l o r p y r i f o s d e g r a d i n g b a c t e r i ai nd i f f e r e n tm e t h o d s a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h el a b o r a t o r ys c r e e n i n go fac h l o r p y r i f o s d e g r a d i n gb a c t e r i af o rt h e t e s tm a t e r i a l st ou va n di o ni m p l a n t a t i o nm e t h o d sf o rm u t a g e n e s i s ，t od e a lw i t ht h e s t r a i n ss c r e e n e dh a db e e nh y l ，h y 2 ，h y 3a n do t h e rm u t a n ts t r a i n s s t u d i e dt h ee f f e c t s o fm u t a n tg r o w t hf a c t o r ；s t u d i e dm u t a n tk i n e t i c s ；s t u d i e dm u t a n te n z y m ea n ds t r a i n d i f f e r e n c e si ne l e c t r o p h o r e t i cb a n d s t h em a i ns t u d yr e s u l t sw e r es u m m a r i z e d 觞 f o l l o w s ： 1 t h r o u g hu vm u t a g e n e s i st o0 6 ， i nb i o m a s so f 9 x1 0 c f u m l ，c h l o r p y r i f o s c o n c e n t r a t i o no f1 0m g l - 1c a s e s ，t h et w om u t a n ts t r a i n si n c r e a s e dt h ed e g r a d a t i o nr a t eo f 8 4 8 8 、9 6 16 r e s p e c t i v e l y 2 m u t a g e n e s i st h r o u g ht h ei o ni m p l a n t a t i o nt o0 6h a sb e e nam u t a n th y 3 ，i n b i o m a s sw a s9 x 1 0 l l c h l ，c h i o r p y r i f o sc o n c e n t r a t i o no f1 0m g l 1c a s e s ，t h em u t a n t s t r a i ni n c r e a s e dt h ed e g r a d a t i o nr a t eo f7 9 7 8 3 a tat e m p e r a t u r eo f3 0 ，c u l t u r et i m ef o r4 8 hc i r c u m s t a n c e s ，h y l ，h y 2 ，h y 3 a r et h es i z eo f t h eg r o w t hp h 7 o p h 8 0 p h 9 0 p h 6 0 p h 5 o ； 4 i nc u l t u r et i m ef o r4 8 h ，p h 7 0c i r c u m s t a n c e s ，h y l ，h y 2 ，h y 3a r et h es i z eo ft h e g r o w t h o f 3 0 3 5 2 5 4 0 2 0 ； 5 a tat e m p e r a t u r eo f3 0 ，p h 7 0c i r c u m s t a n c e s ，t h eg r o w t ho fm u t a n ts t r a i n s r e a c ht h em a x i m u mi na b o u t2 4 h ，a n dt h e ne n t e r e dt h es t a t i o n a r yp h a s e 6 i nt h i sp a p e r , a td i f f e r e n tb i o m a s sa n dd i f f e r e n tt i m eo fd e g r a d a t i o nc i r c u m s t a n c e s ， d e g r a d a t i o nk i n e t i c sa r ei nl i n ew i t ht h el e v e le q u a t i o n i nd i f f e r e n td e g r a d a t i o nt i m eo n d e g r a d a t i o nk i n e t i c so ft h es t u d y , t h er a t ec o n s t a n t sh y l ，h y 2 ，h y 3o fa r eo 1310d 1 、 o 1 4 0 0d 一、o 1 6 4 2d 1 ，h a l f - l i f eo f 5 1 5 d ，4 7 2 d ，4 3 1 d 7 t h ea d o p t i o no ft h eo r i g i n a ls t r a i na n dt h em u t a n te n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i sb a n d sa n df o u n dt h a te x t r a c e l l u l a re n z y m ee l e c t r o p h o r e s i sb a n d sd i dn o tc h a n g e s i g n i f i c a n t l y i tc a nb et h a td e g r a d i n ge n z y m ee x i s t si nt h ec e l l s k e yw o r d s ：c h l o r p y r i f o s ，d e g r a d i n gb a c t e r i a ，m u t a g e n e s i s ，m u t a n t ，e n z y m e i i 术语及略语英文全称 g r a m m i l l i g r a m 术语与略语表 c o n c e n t r a t i o n m o l e m i l l i l i t e r l i t r e h a l f l i f e c o n s t a n tr a t e m i n u t e h o u r d a y u l t r a v i o l e t d e t e r m i n a t i o n m i l l i g r a m l i t r e k i l o g r a m v o l u m e m i c r o l i t r e i i i 中文全称 克 毫克 浓度 摩尔 毫升 升 半衰期 速率常数 分钟 小时 天 紫外 决定系数 毫克每升 千克 体积 微升 气相色谱 g 嘴 一 州 d l 嘞 k 璺 h d w 疋 蜡 v 此 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特另j j 3 n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研壳生签名：固乏4 一时间：w 哆年多月7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 帆。丫年伽7 日 文献综述 通过物理和化学的方法对微生物进行处理，使其目的活性得到提高，从而得到 比出发菌株更为优良的突变菌株，在微生物育种中的应用已经越来越广泛。众所周 知，微生物和我们的生活密切相关，尤其在酿造工业，食品工业和生物制品工业等， 更是有着举足轻重的作用。近几年来，随着人们对环境问题的重视程度越来越高， 有机污染物的降解菌也越来越多地被分离筛选出来，如吴祥为等【l 】在2 0 0 6 年从废水 处理系统出口处的污泥中筛选出的降解毒死蜱的玫瑰红红球菌，李莹莹等【2 】在2 0 0 8 年从农药厂的污水处理池中分离到一株能高效降解甲基对硫磷的菌株l 1 ；陈巧莲口】 从农药厂土样中分离到一株能以甲胺磷为唯一碳源、氮源和能源生长的芽孢杆菌 ( b a c i l l u s ) b 4 。并对此菌株的个体形态、生理生化特点进行了分类研究，初步鉴 定为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 。菌株b 4 能有效降解甲胺磷，同时对敌 敌畏、对硫磷也有降解效果，是一株广谱性较强的菌株。在以甲胺磷( 甲胺磷浓度为 2 0 0 m g l ) 为唯一碳源的基础培养基中摇床( 2 8 c ，1 5 0 r m i n ，) 培养7 2 h ，测得降解率 为7 2 5 。有机污染物不仅仅对人畜属于有毒物质，对微生物也有一定的杀灭和抑 制作用，在碳源丰富的自然界寻找以有机污染物为专一碳源的微生物比较困难，因 此，在现有材料中，如何选择一种直接高效的育种方法显得尤为重要。诱变育种作 为一种重要途径，被广泛应用于微生物育种。目前，国内微生物诱变育种仍是采用 常规的物理及化学因子等诱变方式。但是诱变育种方法在有机污染物降解菌中的应 用尚不多见。 1物理诱变 1 1 紫外线诱变 紫外诱变是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常实用的工 具。紫外辐射的生物学效应主要是引起d n a 的变化。d 卜队链上的碱基对紫外辐射很 敏感。因为碱基( 嘌呤碱和嘧啶碱) 吸收的光波波长和紫外辐射发射波长非常接近， 最大吸收峰都在2 6 0 n m ，所以d n a 强烈吸收紫外辐射。引起d n a 结构变化的形式有 多方面，例如：d n a 链的断裂，d n a 分子内和分子间的交联，核酸与蛋白质的交联， 胞嘧啶和鸟嘌呤的水合作用及胸腺嘧啶二聚体的形成等【4 】。此外，二聚体的形成会 阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡【5 j 。 正鼋伪n 瑚l 茧链壁拦伤焉 j j 胸膻嘘啶：耀体 图1 紫外辐射对0 n a 的破坏和d n a 的修复【4 j f i g lt h ed a m a g et od n a b e c a u s e o f u va n dr e s t o r a t i o no f d n a 车可舒【6 】等通过紫外诱变，对多杀菌素产生菌株刺糖多孢菌进行选育，筛选丙 酸钠耐性变株，得到菌株s 4 6 6 ，摇瓶发酵单位为8 7 1 m g l 1 ，比自然选育获得的出 发菌株提高了3 5 。其传代实验表明菌株s 4 6 6 的高产遗传特性稳定，为应用于发 酵罐进行工业化生产奠定了基础。吕聪掣7 】采用紫外照射的方法对好氧反硝化菌株 进行诱变，从中筛选出一株优势正突变菌株z r 4 3 ，结果显示，相对于亲本r 1 ，菌 株z r 4 3 对亚硝态氮的积累量大幅度降低，从7 5 0 5 m g l - 1 减少到1 7 4 2 m g - l - 1 ，t n 去除率提高了1 8 。马晓燕【8 】等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌 株马克斯克鲁维酵母菌株z r - 2 0 ，比优化前的酒精产率提高1 0 5 ，较出发菌株提高 了6 8 。 紫外灯发出的紫外光具有强烈的杀菌效果，但是紫外线的穿透能力非常弱，甚 至连一层玻璃都不能穿过，因此在诱变过程中要使供试材料裸露于紫外光下。另外， 微生物所受辐射的剂量决定于灯的功率、灯和微生物的距离及照射时间。 灯的功率和灯的距离通常不变，剂量和照射时间成正比，可用照射时间作为相对 剂量。不同的菌种，作用时间不同。作用时间也可以转化为致死率。由于正变型多 出现在低剂量，负变型多出现在高剂量。所以，可选用致死率为7 0 - 8 0 ，甚至 致死率为3 0 7 0 的剂量【4 】。紫外诱变的操作相对简单，经济实惠，一般实验室 均能达到此条件，且正变率比较高，因此在微生物育种中较多应用。 1 2 离子注入诱变 离子注入诱变又称离子束诱变，是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种新型诱变源， 最初用于金属材料表面的改良【9 1 ，在1 9 8 6 年用于农作物诱变育种，同时在改良微生 物方面也表现出很好的应用效果，其特点是损伤轻，突变率高，突变谱广【1 0 1 。在离 子注人生物学效应研究中，人们首先关注的是存活率和注入剂量的关系。经过专家 2 的实验研究：随着注入剂量的增加，存活率呈下降趋势。但总的说来，离子注入引 起的生理损伤是较轻的，损伤是局部的、非致命的【1 1 1 。 在离子注人生物学效应研究中，人们最关心的不仅在于存活率，更重要的是突 变率。低能离子引起的遗传变异在群体生物学上突变率在1 0 - - 2 0 。突变率高、 突变谱广是低能离子注入的一大特点，而且这种突变率高和突变谱广并不是以增大 生理损伤为代价的，而是以生理损伤较轻为前提的。因此，离子注入技术在诱变育 种方面取得了突破性的进展【l l j 。 离子注入引发生物效应，其原理是相当复杂的。多年来物理工作者从核物理、 固体物理学原理出发，利用现代化的分析技术，已基本弄清了其原理。一般认为， 低能离子和生物体作用的原初过程包含了能量的沉积、动量的传递、粒子的注入、 电荷的交换四个方面。这些过程差不多是在1 0 。1 9 - - 1 0 d 6 秒中同时发生的，但对于各 自独立的作用尚在研究之中【1 2 j 。 在作物育种方面，江昌俊，李卓民【1 3 2 0 0 7 年曾对7 个茶树品种无性系种子进行矿 离子注入诱变，m 1 代个别单株在叶面积，叶型、叶色、叶面隆起性及萌芽期、抗 寒性等重要农艺性状上发生明显变异，说明旷离子注入对茶树种子有较为明显的诱 变作用。离子注入在微生物育种方面的应用报道也越来越多。赵丛等【1 4 j 为获得中性 蛋白酶高产菌株，选用低能( 3 0 k e v ) n + 离子柬以不同剂量注入中性蛋白酶产生 菌枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) a s l 3 9 8 ，经多次筛选，获得l 株稳定高产突变 株z c 1 2 ，突变株产中性蛋白酶活力为初始菌株的1 8 4 倍。张宁掣”】采用低能矿注 入处理发酵生产番茄红素的三孢布拉霉，得到四株高产菌株，其番茄红素的平均产量 比出发菌株提高5 0 。其中b h 3 7 0 1 表现出很强的发酵积累番茄红素的能力，尤其 在发酵后期更为突出，极大地提高了生产效率。在有机污染物降解菌方面，魏明宝 等【l6 】利用n 注入葸降解茵进行诱变选育，在1 0k e v 、8 x 1 0 1 5 n + c m 2 的注入条件下， 得到一株高效降解葸菌株，其降解蒽能力和降解速度比出发茵有明显提高，多次传 代实验表明该茵株的遗传稳定性较好。庞晓坤等【1 7 】利用离子束对降酚菌株进行诱变 筛选，获得高效降解菌株k e 2 ，它与出发菌株k e 相比较，降解苯酚的能力显著提高。 离子注入法进行微生物诱变育种，一般实验室条件难以达到，目前应用相对较 少。但是，由于离子注入射程具有可控性，随着微束技术和精确定位技术的发展，定 位诱变将成为可能【1 8 】。因此，离子注入在微生物育种方面的应用效果及前景值得期 待。 1 3 电离辐射 电离辐射主要包括丫射线、x 射线、p 射线和快中子等。丫射线是电离生物学 上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改 变d n a 结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖 磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基，这些自由基可 以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致d n a 分缺失和损伤【1 9 1 。 周建琴，高荣梅【2 0 】利用丫射线对康乐霉素c 产生菌s 2 s 1 3 的孢子进行了诱 变育种。变株“3 3 康乐霉素c 的产量比出发茵株s 2 s 1 3 的康乐霉素c 的产量提高 2 0 0 ，且传至5 代发酵单位仍较为稳定，说明“3 3 的稳定性较好。张伟【2 l j 等将较 高产酒精酵母制备成原生质体，经c 0 6 0 诱变后，采用四级筛选，得到高产酒精酵母菌 株c o 1 5 8 ，其遗传性状稳定，其成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高了1 6 3 4 ，比 a d y 提高了2 4 4 8 ，残还原糖含量亦远远低于出发菌株和a d y 。 电离辐射诱变育种有一定的局限性，操作要求较高，有一定的危险性，同时，由于 微生物与作物的种子或枝条相比，对于电离辐射的承受能力相对较弱。因此在微生物 育种上，电离辐射应用较少，通常在不能使用其他诱变方法或其他诱变方法效果不 明显的情况下使用。 1 4 激光诱变 激光能诱发生物遗传结构改变，甚至发生突变，从而培育优良的新品种，这种科学 的方法称为激光育种【2 2 】。激光诱变是一种新型的物理诱变剂，对微生物产生不同的 诱变效应【1 0 1 。激光诱变作为物理诱变的一种方式，其生物学效应直接来源于其产生的 光、电、热、压力和磁效应的综合作用。上述效应积累，是细胞d n a 分子吸收、积 聚能力并进行能量再分配，是细胞d n a 处于一种易于突变的状态，继而发生一系列 的诸如断键、聚合、交联等物理和化学变化，导致d n a 分子结构的改变即d n a 分子 的损伤和突变，最终引起突变株生物学属性变化【2 3 1 如果是控制某种代谢途径的酶系 基因水平上的改变，则有可能增加某一特定代谢产物的积累【2 4 】。相对于传统的紫外诱 变手段，激光诱变具有高效、稳定、高选择性、回复突变率低、定向变异率高，辐 射损伤轻、当代变异、无污染等优点。 王雪松等【2 5 】采用h e - n e 激光诱变茁芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 原生质 体获取短梗霉多糖( p u l u l a n ) 高产菌即普鲁兰高产菌，为国内普鲁兰工业化生产提供 了具有应用价值的菌株。张智维等【2 6 】用h e - n e 激光作为诱变光源照射啤酒酵母细 胞，在合适的时间和剂量下，得到一一株优良菌株。用该菌株酿造的啤酒，其双乙 酰值为0 1 2 5 3m g l ，比原菌株下降了3 0 ，此方法可缩短啤酒发酵周期，从而降 低工业生产成本。周蓬蓬等 2 7 】应用y a g 激光照射高山被孢霉( m o r t i e r e l l a a l p i n a ) 获得 了花生四稀酸和油脂含量分别提高2 4 5 倍和1 7 1 倍的高产菌株。 激光诱变育种在环境微生物领域中的研究与应用鲜见报道。如果尝试在现有研 究基础上将激光诱变生物技术应用于难降解有机污染物的处理，培育出具有超代谢 能力的激光诱变菌株，则极有可能成为环境微生物育种技术的突破口，进而为生物 处理技术的发展提供新的技术平台。目前有姜岩等【2 8 】运用h e _ n e 激光辐照热带假 4 丝酵母( c a n d i d at r o p i e a l i s ) 对激光诱变参数进行优化，考察了突变株的遗传稳定性和 降酚特性。结果表明：经过激光辐照处理的热带假丝酵母c t 4 3 降解2 0 0 0 m g l 的苯酚 仅需要5 4 5 h ，降解效率显著提高，最终获得一株性能优良的高活力苯酚降解菌。这 为生物法应用于含酚废水的处理提供了现实依据，表明h e 一n e 激光诱变育种技术有 可能应用于环境微生物领域。 1 5 微波育种 微波( m i c r o w a v e ) 耳p 指波长从l 肌n 1 m ，频率从3 0 0 m h z 3 0 0g h z 的超高频电 磁波微波在生物学上主要用于杀菌，刺激植物种子发芽生长。微波辐照诱变微生 物菌种，有着传统诱变法不具备的优势，具有清洁、高效、设备简单、方法易行、正 突变率高、突变菌株性状稳定等优点【2 9 】，克服了紫外诱变易产生光修复现象的缺点 对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从 而引起生理生化反应；非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生 理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效趔3 0 挪】。 张兴等【3 2 】在低功率微波条件下，采用水循环冷却器，对干酪乳杆菌鼠李糖亚种 x 1 1 2 进行诱变处理，得到l - - 孚l 酸产量为l1 5 8 叽的突变株w 3 9 ，比原始菌株x 1 1 2 提 高了5 7 9 8 ，连续遗传8 代，产酸性状稳定。潘明，周永进【3 3 】以微波辐射技术对啤酒酵 母菌进行诱变，以发酵液中双乙酰含量为主要指标筛选获得1 株优良的啤酒酵母菌 株，此菌株发酵液中的双乙酰含量比原始菌株降低了3 6 ；其发酵液保持了亲株的 优良风味和凝聚性。该菌株经多次传代，双乙酰含量保持了较低的水平。宋丽等【3 4 】 经过微波( 低火) 物理诱变产氢菌h 8 得到一株高产氢突变株h w 7 、h w 3 3 、h w l 8 1 、 h w l 8 4 和h w l 9 5 ，多次传代实验表明，h w l 9 5 是稳定的高产突变株。突变株h w l 9 5 具有较好的耐酸性，在p h 值为2 8 时仍能生长。通过间歇发酵实验，其最大产氢 量和最大产氢速率分别达至l j 2 4 6 0 m l l 培养基和3 4 0 m l l - 1 h - 1 ，比原始菌分别提高了 5 0 7 和4 1 7 。 微波诱变在工业微生物育种中的报道不是很多，在环境微生物育种中更是鲜见， 因此，在环境微生物育种中可以尝试用才方法，或许可以得到比较理想的效果。 1 6 其他物理诱变方法 物理诱变方法除以上几种外，还有航天育种。航天育种主要是利用空间环境因 素，如微重力，空间辐射，以及其它诱变因素如交变磁场，超真空环境等交互作用影响， 导致生物系统遗传物的损伤，使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异 常等。但是，到目前为止，关于微生物航天育种的报道非常少见。另外，航天育种 较其它育种方法特殊，是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高，成本 高，个体研究者或一般研究单位都难以实现，只能与航天技术相结合，由国家来完成 【9 1 。 2 化学诱变 化学诱变始于2 0 世纪初。1 9 4 3 年o e h l k e r s 用脲脘处理月见草以后，化学药剂的 诱变作用得到肯定。1 9 4 8 年g u s t a f s s o n 等用芥子气处理大麦获得突变体，开创了化 学诱变在农作物育种上应用的先河，5 0 年代末得到广泛的研究并逐渐取得成果【3 5 1 。 化学诱变具有成本低、使用方便、诱变作用专一性强等特点，是一种迅速发展的育 种途径。 化学诱变剂种类很多，常用的化学诱变剂有烷化剂、碱基类似物、抗生素、叠氮 化物、亚硝酸、羟胺和吖啶等。按其诱变机制则可分为3 类：( 1 ) 碱基类似物诱变剂， 如5 溴尿嘧啶( 5 b 、2 氨基嘌呤( a p ) ；( 2 ) 直接诱变d n a 结构的诱变剂，如烷化剂、 亚硝酸；( 3 ) 诱发移码突变的诱变剂，如吖啶类、抗生素。 2 1 碱基类似物诱变剂 碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到d n a 分子中导致d n a 复制时 产生错配, m r n a 转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱 变率很高，往往不易得到好的突变体【9 】。用此种诱变剂进行微生物诱变育种的报道较 少，目前有程世清等【3 6 】用5 b u 对产色素菌( 分枝杆菌t 1 7 2 3 9 ) 细胞进行诱变，生物量 平均提高2 2 5 。 2 2 直接改变d n a 结构的诱变剂 此类诱变剂在生物育种中应用比较广泛，尤其是烷化剂中的甲基磺酸乙酯、亚硝 基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等，它们能与一个或几个核酸碱基反应，引起d n a 复制 时碱基配对的转换而发生遗传变异。烷化剂诱变率高，诱变效果好，但大部分有比 较高的毒性，操作时要注意安全；亚硝酸诱变效果一般，且易分解，所以要现配现 用。 2 2 1 甲基磺酸乙酯( e t h y l m e t h a n es u l p h o n a t e ，e m s ) 是最常用的烷化剂，它诱导的突变株大多数是点突变，首先是鸟嘌呤的0 6 位置 被烷基化，在d n a 的复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基的替换， 即g ：c 变为a ：一3 7 1 。e m s 的诱变效应可用两高一广来评价，即：效率高、频率高和 范围广【3 8 】。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5 硫代硫酸钠作为终止剂和解毒 剂。 唐晓达等【3 9 】通过e m s 诱变，从啤酒酿造生产菌株啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c a r l s b e r g e n s i s ) f b 中筛选分离得到一株发酵液中双乙酰含量优于亲株的新菌株 f b e l 。以1 2 0 b x 麦芽汁为培养基，用内装3 0 0 m l 麦芽汁的5 0 0 m l - - 角瓶于1 2 。c 下 发酵，发酵8 d 后发酵液中双乙酰含量比亲株降低了4 2 7 。该菌株的其它发酵性能 的测定结果表明其保持了亲株的优良性状，且遗传性状稳定。安秀林，李庆忠等1 4 叫 以黄色短杆菌为出发菌株，经过甲基磺酸乙酯化学诱变处理，最后得到l 株变异株 6 c a w - 1 。经初筛、复筛和传代实验，表明其是稳定的变异株。其谷氨酰胺的产量由 诱变前的2 8 6 提高到4 5 8 ，提高了6 0 1 。 2 2 2 亚硝基胍( n t g ) n t g 是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应该注意。在碱性条件 下，n t g 会形成重氮甲烷( c h 2 n 2 ) ，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可 能是c h 2 n 2 对d n a 的烷化作用引起的【4 l 】。刘文玉等4 2 诱变选育低温d 半乳糖苷 酶高产菌以野生低温p 半乳糖苷酶产生菌水生拉恩菌( r a h n e l l aa q u a t i l i s ) 1 4 1 为 出发菌株，通过亚硝基胍( n t g ) 诱变及低温驯化，采用选择性平板初筛和摇瓶复 筛，筛选出一株产酶活力比原始菌株提高5 4 的突变株，该突变株经传5 代培养， 产酶特性稳定。黄洁，浦跃武【4 3 】采用亚硝基胍辅以鼠李糖对铜绿假单胞茵m i g i a 6 菌株进行诱变，结合蓝色凝胶平板、油平板和发酵培养测定的选育方法，获得了鼠 李糖脂产量达2 1 2 7 0 9 l 且遗传性质稳定的菌株，产量比原菌株提高3 6 1 o 。 2 2 3乙烯亚胺和硫酸二乙酯 硫酸二乙酯( d m s ) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺生产的 较少，很难买到。使用浓度0 0 0 0 1 , 4 ) 1 ，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。 2 3 诱发移码突变的诱变剂 此类诱变剂主要包括吖啶类和抗生素类，在微生物育种中应用较少，在此就不 一一列举了。 3 复合诱变 复合诱变是指利用物理方法或化学方法对微生物进行重复处理，或者用物理方 法、化学方法交叉处理，从而取两种或两种以上诱变方法之长，获得理想菌株的诱 变方法。其原理就是各种诱变方法的优化配置。此种方法在微生物诱变中应用广泛， 并得到了非常好的效果，在此就不再赘述了。 分析总结了以上各种诱变方法，结合实验室条件以及方法的可行性，本研究决 定采用紫外诱变和离子注入诱变进行诱变选种。 7 出l o m g k g 的毒死蜱在未灭菌和灭菌土壤中的半衰期分别为7 9 2 d 和2 1o d i s 4 刘新 等( 2 0 0 3 ) 从土壤中分离得到1 株可降解毒死蜱的真菌曲霉，并对其降解效能进行 了测定，表明微生物对其降解起着重要作用【5 习；花日茂等( 2 0 0 6 ) 研究报道所筛选 出两种降解毒死蜱的高效菌株玫瑰红红球菌和水螺菌【i j 。 1 。农药的微生物降解途径 农药微生物降解途径经过大量研究，综合来说，农药微生物降解的途径通常包 括：( 1 ) 主要为氧化、水解和还原的反应，使原来的分子有更大的极性；( 2 ) 分子的极 性基团与内源分子如蔗糖、葡糖醛酸和谷肤甘肤结合，成为水溶性的分子，被排出 体外5 6 1 。 在哺乳动物中，生物转化的主要部位是肝细胞的内质网、线粒体。微生物能够 利用自然界中存在的许多物质作为碳源和能源生长，人们最为感兴趣的是微生物对 于异生物质的降解。异生物质是对于生物系统而言外来的物质，通常指人工合成的 化合物，如：高分子材料、塑料、农药等，也包括某些天然物质，如：石油、天然气。 它们一般比较稳定，难以被生物降解，有的甚至完全不能被降解【5 7 】。另外，如农药、 合成染料、洗涤剂，石油及其化工产品不但难以降解，而且还会带来严重的污染问 题。在长期的研究中，人们发现许多微生物能够降解某些或某类异生物质。 2 农药降解酶 按降解农药的情况，将微生物分为两类：一类是通过其产生的降解酶直接作用于 农药；另一类是通过改变物理、化学环境而直接作用于农药。一般所说的残留农药微 生物降解多指前者。 共生或单一微生物对农药的降解作用都是酶的参与下完成，这些降解酶有的是微 生物固有，有的是由于变异而产生。有机磷农药在土壤中比较容易分解正是由于土壤 中存在分泌磷酸酯结构的微生物而且降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能耐 受异常环境条件，如对硫磷水解酶在1 0 的无机盐、l 的有机溶剂、5 0 c 都能保持 活性，而产生该酶假单胞菌在同样的条件下不能生长【5 8 ，5 9 1 。并且，酶的降解效果远胜 于微生物本身，特别是对低浓度目标农药，因为在这种情况下，降解菌可以利用其它 碳源而不能有效地利用目标农药为碳源 硎。因此人们设想利用降解酶作为净化农药污 染的有效手段，有关农药降解酶的研究受到泛关注。 d e r b y s h i r e 6 l 】于1 9 8 7 年从无色杆菌提取呋喃丹酯键水解酶，纯化后的水解酶对低 浓度的吠喃丹有较好的降解效果。m u l l i l e e k e 【6 2 6 3 】从混合菌( f l u o r e s c e n t p s e u d o m o n a s 、 b r e v i b a c t e r i u m 、a z o t o m o n u s 、x a n t h o m o n u s ) 提取了对硫磷水解酶，2 2 水解对硫磷的 速度比化学水解( o 1 m o l ln a o h ，4 0 。c ) 快2 4 5 0 倍，对其它七种有机磷酸酯类杀虫剂( 甲 基对硫磷、二嗪农、毒死蜱、三唑磷、杀螟松、杀螟腈、对氧磷) 的水解比化学水解 快4 0 - 1 0 0 0 倍，且该酶不能为农药及农药制剂中的溶剂所抑制。p o h l e m 等报道了对除 草剂氨基甲酸苯酯类有催化作用的降解酶及其基因畔】。s t e i e r t 等将对硫磷水解酶基因 转入工业生产菌株灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e sl i v i d i a n s ) 并得到了表达 6 5 1 ，这使得工业化 大量生产酶制剂有了可能。 m u b l r y 等【6 6 】，从3 支g 。阴性细菌中提取到对硫磷水解酶并测定了分子量和基质特 异性，三种酶存在差异。h 亿n n e c k e o 【6 7 6 8 】从混合菌提取了对硫磷水解酶，并将对硫 磷水解酶固定于多孔玻璃微粒制成固化酶，固化酶对对硫磷的k m 为1 0 9 m l ，净化率达 9 0 。两种固化酶在大于5 0 。c ，p h 1 0 0 和p h p h 8 0 p h 9 0 p h 6 0 p h 5 0 a 5 在不同的温度下，三株菌的生长量均在温度为3 0 c 时达到最大。具体生长量 均为3 0 3 5 ( 2 2 5 ( 2 4 0 c 2 0 * c 。 6 在不同的加菌量下，三株菌的降解过程符合降一级降解动力学方程，相关性 较好。 7 在加菌量相同的情况下，不同的降解时间内，三株菌的降解过程符合一级降 解动力学方程。速率常数分别为o 1 3 1 0d 、o 1 4 0 0d 、o 1 6 4 2d - 1 ，半衰期分别为 5 1 5 d 、4 7 2 d 、4 3 1 d 。 8 从出发菌株与突变菌株酶的电泳条带分析来看，突变菌株与出发菌株的胞外 酶酶带没有区别，这说明降解酶不是胞外酶。胞内酶存在差异，说明降解酶可能存 在细胞内。 参考文献 【1 】吴祥为，花日茂， 操海群等毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定环境科学学报， 2 0 0 6 ，2 6 ( 9 ) ：1 4 3 3 - 1 4 3 9 【2 】李莹莹，李文，张琛等甲基对硫磷降解菌l l 的分离、鉴定及降解酶基因的克隆【j 】生物技术通 报2 0 0 8 ，6 ：1 2 8 1 3 1 3 】陈巧莲降解甲胺磷菌株的筛选及其特性的研究： 硕士学位论文】北京：中国农业大学2 0 0 3 【4 】周群英，高廷耀境工程微生物学【m 】- 北京：高等教育出版社，2 0 0 0 7 ：1 7 5 1 7 6 【5 】曹友声，刘仲敏现代工业微生物学【m 】长沙：湖南科学技术出版社，1 9 9 8 【6 车可舒，王相晶，向志丹多杀菌素高产菌株的选育 j 】东北农业大学学报报2 0 0 8 3 9 ( 8 ) ：7 4 - 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