（动物学专业论文）光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究.pdf

中英文缩略词表p s b ( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a )a o b ( a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a )n o b ( n i t r i t e - o x i d i z i n gb a c t e r i a )t a n ( t o t a la m m o n i an i t r o g e n )n 0 3 - - n ( n i t r a t en i t r o g e n )n 0 2 - - n ( n i t r i t en i t r o g e n )d o ( d i s s o l v e do x y g e n )o d ( o p t i c a ld e n s i t y )m p n ( m o s tp r o b a b l yn a m b e r )p p m ( p a r t sp e rm i l l i o m )l d 5 0 ( m e d i a l l e t h a d o s e )d ( d i l u t i o nr a t e )光合细菌亚硝化细菌硝化细菌氨氮硝态氮亚硝态氮溶氧吸光值最大可能数百万分之几半数致死量稀释度理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究学科专业：动物学指导教师：魏泓研究方向：动物微生物工程研究生l 万海龙( 2 0 0 0 2 6 0 )内容擅要针对目前光台细菌、硝化细菌产品中普遍存在的高效配方少、规模化生产技术不成熟等问题，本文对光合细菌、硝化细菌的菌株分离、鉴定、产品配方及其生物反应器进行了研究，获得了生产性能较好的产品配方，设计出了相应的生物反应器，从而为两类微生物制剂的开发莫定了良好的理论与实验基础。研究结果如下：1 从7 个不同环境中的样品富集分离并初步鉴定了2 7 株光合细菌4 株亚硝化细菌和2 株硝化细菌。2 筛选获得了生产性能较好的光合细菌菌群配方a 、硝化细菌配方e 及其生产培养基配方其有效性、安全性评价实验表明：( 1 ) 配方a 、e 和a e 等比例混合物( a + e ) 安全无毒，并且对非离子氨急性毒性具有不同程度的解毒作用。在l d 5 0 剂量下作用2 4 小时上述三种配方8 剂量培养物可以使食蚊鱼死亡率由5 0 分别降低到2 8 3 、8 3 和1 0 。( 2 ) 促生长模拟实验表明，三个配方培养物在饲料污染亚适状态下能不同程度地促进鱼类生长及降低死亡率，体长为3 5 r a m 的鲤鱼苗在15 p p m 的a 、e 、a + e 浓度下体长增长率为2 6 3 、2 2 、3 2 5 ，均在不同程度上高于四个对照产品。( 3 ) 配方中试效果表明，配方具有良好的水质改良和净化作用。( 4 ) 经过筛选的光合细菌培养基在生产性能不变的情况下，其生产成本得到有效降低。经过筛选的硝化细菌培养基使硝化细菌培养液o d 5 2 0 提高到1 1 以上。3 初步设计出全新的光生物反应器和硝化细菌生物反应器。理学硕士学位论文：光台细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的韧步研究( 1 ) 应用闪光效应，将平均光饱和原理引入光反应器，采用机械办法消除光合细胞的附壁遮光现象设计出的清刷搅拌光生物反应器的面积体积比下降到1 0 m 1 ，显著低于现有文献报道值。初步实验结果表明：该反应器在培养光合细菌4 8 小时后，o d 6 6 0达1 7 5 8 ，而对照( 静置培养) 几乎未生长：清刷比不清刷培养效率高约2 倍；反应器连续培养时，最佳d 值为o 4 1 6 7 h 获得良好的培养效果。本实验为规模化、自动化光生物反应器的研究提供了实验依据。( 2 ) 初步确定了硝化细菌生物反应器参数，提出并初步验证了悬浮粘附态气升式硝化细菌生物反应器。结果表明，培养1 0 天后的硝化细菌反应器中的硝化细菌o d 5 2 0可达较高水平j ，臼6 4 1 ) 培养效果良好。本实验为硝化细菌生物反应器的研究提供了实验依据。7关键词：光善细旨硝化茹彳鉴定水产赛螽7 生物羞盈器x2里芏堡主兰堡垒兰! 垄鱼塑堕：塑些塑堕箜坌壹些塞墨苎兰曼塑塑垄堕墨t h ep r i m a r ys t u d yo i lt h ei s o l a t i o n ，d e t e r m i n a t i o na n dp r o d u c to fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n dn i t r i f y i n gb a c t e r i am a j o r ：z o o l o g ys p e c i a l i t y ：a n i m a lm i c r o b i o l o g i c a le n g i n e e r i n gt u t o r ：w e ih o n ga u t h o r ：w a nh a il o n ga b s t r a c ta i m i n gd i r e c t l ya tt h er e c e n tw i d e s p r e a dp r o b l e m si nt h ep r o d u c to fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u ma n dn i t r i f y i n gb a c t e r i u ms u c ha sf e wh i g hp r o d u c t i v ef l o r aa n di m m a t u r et e c h n o l o g yo fa u t o m a t i cc u l t i v a t i o n ，w ei n v e s t i g a t e dt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h es t r a i n sa n dt h eb i o r e a c t o r , c o n s e q u e n t l yw eg o tt h ef o r m u l ao fp r o d u c t i v es t r a i n sw i t hb e t t e rp r o p e r t ya n dd e s i g n e dt h eb i o r e a t o r s t h es t u d yp r o v i d e dg o o dt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lb a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to fp r o d u c ti nt h e s et w ok i n d so fm i c r o o r g a n i s m t h er e s u l t so ft h es t u d ya r ea sf c 1 l o w s ：1 2 7s t r a i n so fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m ，4s t r a i n so fs u b n i t r i f y i n gb a c t e r i u ma n d2s t r a i n so fn i t r i l y i n gb a c t e r i u mw e r ee n r i c h e da n di s o l a t e df r o ms e v e ns p e c i m e n si nd i f f e r e n tc i r c u m s t a n c e sa n di n i t i a l l yi d e n t i f i e d 2 t w of o r m u l a sw i t hb e r e rp r o d u c t i o np r o p e r t y , i e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u maa n dn i t r i f y i n gb a c t e r i u me ，w e r es e l e c t e da n do b t a i n e d t h ee f f i c i e n c ya n ds e c u r i t ye v a l u a t e dt e s ts h o w e dt h a t ：( 1 ) f o r m u l aa ，ea n da + e ( aa n dem i x e dw i t he q u a lr a i o ) w e r eo fn ot o x i c i t y ,f u r t h e r m o r e ，t h en o n - i r o na m m o n i aa c u t et o x i ct e s ts h o w e dt h a tt h e yh a dd e t o x i f l e a t i o ni nd i f f e r e n td e g r e e s i n2 4 h rl d 5 0 ，8p e r c e n to ff o r m u l aa ，ea n da + er e d u c e dt h em o r t a l i t yo fg a m b u s i aa 师n i sf r o m5 0 t o2 8 _ 3 ，8 _ 3 a n d1 0 0 r e s p e c t i v e l y ( 2 ) g r o w t hp r o m o t i o ns i m u l a t e dt e s ts h o w e dt h a tt h et h r e ef o r m u l a sc o u l dp r o m p tg r o w t ha n dd e c r e a s em o r t a l i t yi nd i f f e r e n td e g r e e sw h e nf e e dc o n t a m i n a t e dw a si ns u b - f a v o u r a b l es t a t e t h el e n g t hg r o w t hr a t e so ft h el a r v a lc a r p s ( 3 5 c m ) i n1 5 p p mc o n c e n t r a t i o no ff o r m u l aa ，ea n da + ew e r e2 6 3 ，2 2 蝴a n d3 2 5 r e s p e c t i v e l y , h i g h e rt h a n4c o n t r o l si nd i f f e r e n tg r a d e s ( 3 ) t h ee f f e c to ff o r m u l ai nm i d d l e - s c a l ep r o d u c t i o nm a n i f e s t e dt h a tf o r m u l a sh a do b v i o u sf u n d c t i o ni ni m p r o v i n ga n dp u r i f y i n gt h eq u a f f t yo fw a t e r ( 4 ) t h em a n u f a c t u r i n gc o s to ft h es e l e c t e d理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u mm e d i u mw a sr e d u c e de f f e c t i v e l yw i t h o u tc h a n g i n gp r o d u c t i o np r o p e r t ya n dt h es e l e c t e dn i t r i f y i n gb a c t e r i u mm e d i u mi n c r e a s e do d 5 2 0f r o mo 7 0 8t oo v e r1 1 3 t w on o v e lp h o t o b i o r e a c t o ra n dm m f y m gb a c t e r i u mb i o r e a c t o rw e r et e n t a t i v e l yd e s i g n e d ( 1 ) m a k i n gu s eo ft h ef l a s h i n gi i g h te f f e c t , a p p l i e dt h ep h e n o m e n o no fa v e r a g el i g h ts a t u r a t i o ni n t ot h ep h o t o b i o r e a c t o r , w eu t i l i z e dm e c h a n i c a lm e t h o dt oe l i m i n a t e dl i g h t - c o v e r e dp h e n o m e n o nc a u s e db yp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m sa t t a c h m e n tt ot h ew a l la n dd e s i g n e dc l e a n a n d s c r u bs t i r r e dt a n kp h o t o b i o r e a c t o rw h o s es u r f a c e - t o v o l u mr a t i o sw a s10 m - 1 , b e l o wo t h e rr e p o r t ss i g n i f i c a n t l y t h er e s u l ts h o w e dt h a tu s i n gp h o t o - b i o r e a c t o ri nf o r m u l aac o u l di n c r e a s eo d 6 6 0t o1 7 5 8a f t e rc u l t i v a t i o nf o r4 8 h i nc o n t r a s t ，g r o w t hr a t eo ff o r m u l aai ns t a t i cc u l t u r ew a se x t r e m e l ys l o w m o r e o v e ri nb a t c h e sc u l t u r e ，c l e a r - a n d s c r u bc u l t u r ec o u l di m p r o v eg r o w t hr a t e2t i m e st h a nt h a to fb a c t e r i u mc u l t u r e dw i t hn oc l e a r - a n d s c r u b i ns u c c e s s i v e l yc u l t u r ew i t hp h o t o - b i o r e a c t o r , t h ed i l u t i o nr a t ew a s0 0 4 1 6 7 h t h ee f r e c tw a ss a t i s f i e d t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sp r o v i d e de x p e r i m e n t a lb a s i si nt h er e s e a r c ho fp h o t o b i o r e a c t o rf o rl a r g e s c a l ea n da u t o m a t i cc u l t i v a t i o no fp h o t o s y n t h e t i cc e l l s ( 2 ) w ed e t e r m i n e dt h ep a r a m e t e r so fn i t r i f y i n gb a c t e r i u mr e a c t o r , d e s i g n e da i r - l i f tn i t r i f y i n gb a c t e r i u mb i o r e a c t o ra n dt e s t e di t se f f e c t ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo d 5 2 0o fn i t r i f y i n gb a c t e r i u mc u l t u r e di nb i o r e a c t o ra f t e r10d a y sc o u l da r r i v eah i g hl e v e l ( 1 6 4 1 ) t h er e s u l tp r o v i d e db a s i sf o rn i t r i f y i n gb a c t e r i u m si n t e r m i t t e n t - f l o w i n ga d d i n ga n dm i x e ds e r i e sf e l i 1 1 e n r a t i o n k e yw o r d s ：p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i an i t r i f y i n gb a c t e r i ad e t e r m i n a t i o na q u a c u l t u r eb i o r e a c t o l 4理学硕士学位论文：光台细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究1 前言养殖水体的有机污染是困扰当今水产养殖业的主要问题之一。传统解决方法有三种：用机械方法将残饵、粪便等颗粒废物及时排出养殖水体，但处理价格昂贵。换水。效果最好然而极易造成环境污染。化学疗法。该法见效快，却易引起水生微生态环境失衡、化学药物的大量残留及二次污染。如何安全、高效、低成本的解决这一问题已经引起了众多学者的重视1 。5 1 。而近年来微生物制剂在这些方面已愈来愈显示出广阔的应用前景。以光合细菌、硝化细菌为主的水产微生物制剂，以其高效、安全、无污染、低成本的特点地对养殖水体的水质改良及有效控制鱼病的发生而逐渐受到人们的关注。1 1 光合细菌及其在水产养殖上的应用光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 是指一类能进行光合作用但不释放氧的细菌。它是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物广泛分布于土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处的光照缺氧区域。( b e r g e y sm a n u a lo f d e t e r m i n a t i v eb a c t e f i a o l o g y 在传统分类的基础上根据1 6 s r r n a 系列分类结果将光台细菌划分为7 个亚群，2 8 个属，1 0 8种【6 1 。光合细菌菌体蛋白质含量高，富含叶酸、辅酶q l o 、类胡萝卜素等多种生理活性物质7 。1 1 。同时，由于其特有的新陈代谢方式( 固氮、脱氢、固碳、硫化物的氧化) 因而具有去除养殖水体中氨氮、亚硝态氮、硝态氮、硫化氢等有毒有害物质，增加溶氧，促进水产动物生长，培育浮游生物，提高水产动物抗病能力等重要作用。自2 0 世纪7 0 年代日本琉球大学比嘉昭夫教授等开发的以光合细菌为主的微生物制剂e m ( e f f e c t i v em i c r o o r g a n i s m s ) 以来，大量学者对光合细菌在水产养殖中的作用机制、使用效果进行了深入研究，取得了丰硕成果 9 - 3 2 】。目前在水产养殖业上使用较多的菌种有沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d o t o o l , l a g p a l u s t r i s ) 、深红红螺菌( r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m ) 、类球红细菌( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ) 、荚膜红细菌( r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s ) 等。1 2 硝化细蕾及其在水产养殖上的应用硝化细菌( n i t r o f y i n gb a c t e d a ) 遍布于陆地和水生生态系统，是一类具有硝化作用的化能自氧细菌，包括亚硝化细菌钟i n _ 0 s o m 淞) 和硝化细菌( n i 蜘b a c t e r ) 两个生理亚群【3 3 1 。( b e r g e y sm a n u a lo fd a t e r m i n a t i o nb a c t e r i o l o g y 中硝化杆菌科( n i t r o b a e t e r a c e a e ) 包括九个属，1 3 个种【6 j 。近年来还有一些硝化细菌新种被发现，如已描述的n i t r o b a c t e r a l k a l i u ss p n o v 和n i t r o s p i r am o s c o v i e n s i ss p n o v 等口4 j 5 】。理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究硝化细菌具有独特的代谢方式。它们通过硝化作用氧化无机化合物获取能量来满足自身的代谢需求，并且以c 0 2 作为唯一的碳源，是典型的化能无机营养菌。硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 指的是硝化细菌在好氧条件下将n h 3 氯化为n 0 2 - 并进一步氧化为n 0 3 ，从中获得生长所需能源的过程，可分为两个相对独立而又紧密联系的阶段。前一阶段n h 3氧化为n 0 2 ，称为亚硝化作用或氨氧化作用，由亚硝化细菌完成；后一阶段是n 0 2 。氧化为n o r 的过程，称为硝化作用，由硝化细菌完成。以上步骤可以用如下反应式表述驯：2 n h 3 + 3 0 2 垩堕些塑堕，2 n 0 2 + 4 h + + 3 5 2 k j2 n c h 。+ 0 2 韭l 壬隧班蓖2 n 0 3 + + 4 h + + 2 h 2 0 + 7 5 k j总反应式为：2 n h 3 + 4 0 2 2 n o 】+ + 4 h + + 4 2 7 k j1 克n h 3 n 氧化成n 0 3 + - n 需要氧气4 7 5 克，碱度7 1 5 克( 以c a c 0 3 计) 。由于这一作用放能少，因此硝化细菌的生长速度慢。据文献报道f 3 捌，亚硝化菌产率为0 0 4 0 2 9 m g ( v s s ) m g ( n h 3 - n ) ，硝化菌产率为o 0 2 0 0 8 4 m g ( v s s y m g ( n h 3 - n ) 。硝化细菌能将分子态氮( n h 3 n ) 转化为硝酸盐和少量的菌体蛋白，在生物氮素循环中具有重要意义3 引。随着人类活动的加剧，水环境的主要污染之一氮污染问题已越来越突出，因而硝化细菌治理环境、改造环境的功能也越来越受到人们的重视 3 8 , 3 9 - 4 2 1 。目前硝化细菌不但应用于含氮废水治理、污染环境修复，而且还运用于水产养殖水质改良【4 1 4 3 i 弓1 】和环境监钡1 j 3 7 , 4 3 , 5 2 , 5 3 1 等领域。1 3 光合细曹、硝化细蕾产品开发现状及问题国外对于光合细菌的开发应用研究得较早，尤其是日本。目前日本已经开发出了e m 、p s b i o 、a k a k i n 等已经商品化的产品。光合细菌制剂剂型逐渐由液体向粉剂和片剂发展，菌种配方逐渐由单一菌种走向混合菌种配伍，其运用已经扩展到包括水产养殖在内的养殖、种植、环保等领域。在我国，中国农大、沈阳应用生态研究所、武汉水生所于9 0 年代初开始对光合细菌应用进行研究，同时引进国外先进技术，因而我国光合细菌的推广应用也逐渐发展起来。根据市场调查结果，至2 0 0 2 年底，全国已经商品化的光合细菌产品已经达到3 0 多个，但是，这些厂家基本上还是作坊式的生产，未能规模化生产。对于硝化细菌，目前国内已有一些用于观赏鱼养殖的水剂产品上市，但售价昂贵。6理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究目前，光合细菌、硝化细菌产品普遍存在以下三个急需解决的问题：其一，国内菌种保藏中心还没有相关菌种出售，给相关研究带来了困难，因此各地使用的光合细菌在使用效果、生产性能、遗传稳定性等方面存在较大差异，具有良好生产运用价值的菌种比较少。虽然早在1 8 9 1 年硝化细菌就被著名土壤微生物学家v i n o g r a d s k y 成功分离得到，但时至今日还很少有人能够获得硝化细菌的纯培养并且长期保存它。因此分离、鉴定、选育、保藏一批具有应用价值的菌种是开发光合细菌、硝化细菌产品急需的基础工作。其二，没有建立标准的配方筛选流程，高效配方还很少。目前大部分研究对配方的筛选侧重于使用效果的某一方面很少有人从生产性能到使用效果进行综合筛选。其三，规模化生产技术不成熟生产成本普遍较高。光生物反应器的体积还比较小放大困难，因而光合细菌的规模化、自动化生产无法实现，生产成本上升。光生物反应器( p h o t o b i o r e a c t o r ) ，是指用于光合微生物和具有光合能力的组织或细胞培养的一类装置【5 5 】。光生物反应器的类型主要有板式光生物反应器i - 6 2 1 、管式光生物反应器【6 3 - 6 8 、光导纤维光生物反应器 6 9 - 7 1 】三种。这三类生物反应器的设计参数主要集中于以下几个方面：最大表面积与体积之比、最有效的光源系统、光能传递到光合细胞的最短通路、最有效的混合循环及气液传质等。光照是影响光生物反应器设计的最大限制，而气液传质性能和体积两个参数又受光照的极大限制，因此设计光生物反应器首先要解决光照问题。据此，众多学者对如何提高光生物反应器的光照效率进行了大量研究，认为光通路长度较小( 4 6 c m ) 时，光生物反应器的生产效率比较好【5 6 , 6 3 , 6 8 , 7 0 , 7 1 - 7 5 】。但光通路长度较小给光生物反应器的规模化设计带来了很大障碍。因此，光生物反应器的设计急需技术突破和新设计原理的引入。闪光效应与平均光饱和点现象在光生物反应器设计上具有独特的用途。闪光效应( f l a s h i n g - l i g h t e 瓜c t ) 是指在相同光照强度下，光合生物在一定频率的闪光下的生长得率与连续光照条件下的一致，故具有提高光合作用效率的作用【7 6 , 7 7 。外部闪光光源的获得目前尚存在困难，因此将外部闪光改为在剪切损伤范围内的内部搅拌成为解决这一问题的有效途径 7 8 , 7 9 1 。但据现有文献资料，通过搅拌以增加光合得率的报道很岁络7 9 ，而且基本没有涉及到理论分析。光合作用是一个光生物化学反应光合速率在一定的范围内随着光照强度的增加而加快，但超过一定范围之后，光合速率的增加转慢，甚至不再增加，这种现象称为光饱理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及茸产品的初步研究和现象( p h e n o m e n o no f l i 曲ts a t u r a t i o n ) ，此时的光照强度称为光饱和点( 1 i g h ts a t u r a t i o np o i n t ) 。过强的光照将使光合作用受到抑制，即光抑制现象，如果强光作用时间过长甚至会出现光氧化现象，使光合色素和光台膜结构受到破坏。在植物群体中，群体的光饱点往往高于单叶的光饱和点，这是由于枝叶繁茂的植物外部叶片出现光饱和点时，而遮荫群体内部的光照还在光饱和点以下，即植物整体还未达到光饱和点【8 0 】，一般称此为植物的平均光饱和点现象( p h e n o m e n o no fa v e r a g el i g h ts a t u r a t i o np o i n t ) 。光生物反应器是多细胞的组合整体，在特征上和植物群体具有相似性，其光合作用可能也存在平均光饱和点现象。因此我们认为利用平均光饱和点现象增加流动培养状态下光生物反应器光照强度是解决上述问题的另一有效途径。应用闪光效应和平均光饱和点现象设计的光生物反应器将以突破常规出现，在反应器容积上将获得更自由的空间，因而更加适应工业放大和自动化生产光合细胞的需求。关于硝化细菌生产方面国外已经有人申请了专利，其中一些已经形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且只用于污水处理中，需要经常性的投加硝化细菌。同时由于硝化细菌的生长代时比较长，培养较为困难，国内尚无人研究开发生产硝化细菌的生物反应器，而且从某种程度来看，其培养方式还是对传统活性污泥驯化方式的模仿和沿用。另外用于生产养殖用硝化细菌的生物反应器的报道还未见到。因此设计生产硝化细菌的反应器是硝化细菌推广应用亟待解决的问题。1 4 本研究的内容及意义本研究针对目前光合细菌、硝化细菌产品中普遍存在的高效配方少，规模化生产技术不成熟等问题从以下几个方面进行了研究为两类微生物制剂的开发奠定良好的理论与实验基础。分离并初步鉴定一些具有生产应用价值的光合细菌和硝化细菌菌株，为进一步研究提供材料。进行配方筛选方法的初步研究，筛选适用于淡水水产养殖的光合细菌、硝化细菌配方，获得具有自主知识产权的光合细菌、硝化细菌配方，同时对光合细菌和硝化细菌的联合作用进行探讨。初步确定光合细菌、硝化细菌生产工艺参数。将闪光效应、平均光饱和点现象引入光生物反应器的设计之中，采用机械搅拌的方法消除光合细胞的贴壁遮光效应，设计出全新的光生物反应器，对其进行效果评价：初步确定硝化细菌生物反应器的参数，设计和制造出硝化细菌生物反应器，并进行初步验证。8理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究2 材料2 1 标准曹株类球红细菌( r h o d o b a c t e rs p a e r o i d e si l l 0 6 ) ，m a t s u z a k i 博士惠赠。深红红螺菌( r h o d o s p i r i l u mr u b r u m ) d o n o h u e 博士惠赠。2 2 实验用鱼及渔具鲤鱼苗( c y p r i n u sc a r p i o ) 2 0 0 2 年5 月由九龙坡区金风镇黄事渔业提供：食蚊鱼( g a m u s i a a f f i n i s ) ，第三军医大学鱼池捕捉。鱼缸( 规格：长宽高= 5 0 0 r a i n 3 5 0 m m3 5 0m m ) 、充氧泵、r 匣温加热棒、水蚯蚓、金鱼饲料由季节水族馆提供。2 3 对照实验产品大开光宝( 2 0 0 2 0 3 1 9 ) 重庆市白市驿购买：水仙优( 2 0 0 2 0 3 1 3 ) 广东湛江地区购买；生命力硝化细菌( 2 0 0 2 1 ) ，润宝硝化细菌( 2 0 0 2 2 ) 由季节水族馆提供。2 4 中试基地歇马银兴甲鱼养殖场，沙坪坝季节水族馆，江合生物科技公司。2 5 玻璃制品m 6 0m m 、巾11 0m m 玻璃管和2 5 l 广口试剂瓶重庆北碚玻璃仪器有限公司提供；中1 6 0m m 、中2 0 0 m l n 、0 4 0 0m m 的有机玻璃管件由河北雄县水处理设备有限公司制作。3 方法3 1 目的菌株的分离与韧步鉴定样品采集参照文献 2 9 , 3 3 , 8 1 ，样品采集情况见表1 。光合细菌富集、分离参照文献 2 9 , 3 3 , 8 1 ，富集采用v a nn e i l 紫色非硫细菌培养基( 附录1 ) 。鉴定参照文献 6 , 8 2 - 8 3 。选择g _ 和7 0 0 7 5 5 m n 、7 8 0 - - 7 9 0n t r n 或7 9 0 1 0 3 0n m 任一波段有吸收峰，两项合格者作进一步鉴赳洲。样品0 4 w 0 1 0 9 1 2 用3 0 o 的海水晶替换n a c l 。硝化细菌富集、分离方法参照文献 6 , 3 3 , 5 4 , gj , 8 5 8 8 j 。g f i s s 试剂检验n o z - - n ，二苯胺试剂检验n 0 3 - - n 【33 1 。鉴定参照文献 8 4 - 8 8 1 。表1 样品秉秉记采表t a b l e1s a m p l i a gn o t e s理学硬士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究注：采自北碚污水处理厂出水口( 粱滩河与嘉陵江交汇处) 污泥3 2 配方筛选配方筛选流程：筛选路线指标田1 毫方连泣租田p l o w c h a r tf o rt h es e l e c 廿o no f a q u a c u l t u r ep r o b i o t i c s1 0理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离整定及其产品的韧步研究3 2 1 曹株生长条件、受试一液翩鲁硬实验用盘辅化光合细菌的生长条件：照度为1 5 0 0 l x ，温度2 8 ，p h7 0 ，培养周期4 8 h ，厌氧培养。培养基和基础培养基采用紫色非硫细菌培养基( 附录1 ) 。硝化细菌的生长条件：1 2 0 r r a i n 摇床培养，温度2 8 c ，p h7 0 ，好氧，培养周期l o d 。培养基和基础培养基采用硝化杆菌、亚硝化单胞菌、混合硝化细菌培养基( 附录1 ) 。接种量为2 0 种龄小于1 5 天。菌液细胞含量折算为6 0 1 0 9 个m l 。受试菌液：光合细菌单菌菌液的制备参鼎明1 ，硝化细菌单菌菌液制备方法参照 矧。混合发酵、规模化实验菌液为按比例混合单菌液扩培至第四代的菌液。净水、毒性、非离子氨的影响、促生长、中试等受试菌液为混合培养后的第五次传代菌种，a + e 为配方a 、e 菌液等比混合。实验用鱼为食蚊鱼( g a m u s i aa f f i n i s ) 及鲤鱼苗( c y p r i n u sc a r p i o ) 。选择健康食蚊鱼( 体长1 6 1 8 r a m ) 于2 5 驯化5 7 d ，驯化期间投饲水蚯蚓。选择健康鲤鱼苗( 体长3 0 3 4 m m ，体重o 8 0 9 9 ) ，驯养3 4 d 适量投饲磨碎的金鱼饲料。除特别注明外，实验条件为均2 4 h 光照，照度5 0 0 l x 温度2 5 0 5 。鱼缸实验容积5 0 l 。3 2 2 曹株初选结合文献资料，根据分离和初步鉴定结果选择适当数量的分离菌株作为进一步研究菌株。3 2 2 1 菌种生长特性比较光合细菌的生长特性测定参照文献t 眦，2 9 ，8 1 ，1 。9 6 1 ，分别测定温度、初始p h 、光照、盐度、硫化物对光合细菌生长的影响，因子水平见表2 。硝化细菌生长特性测定参照文献【”，5 4 8 1 ，8 5 8 引，分别测定温度、初始p h 、有机物、光照、盐度对硝化细菌生长的影响( 丙酸钠、乙酸钠、丁二酸钠含量皆为3 0 0 0 m g ，i ) ，因子水平见表3 。表2 光合知曹主长特性研究日子水平囊t a b l e2f a c t o r sa n dl e v e lo f g r o w t hc h a r a c t e ro f p s b注：硫化物为n a z s 、n a 2 s 2 0 3 浓度分别为1 0 0 m g m l 。理学硕士学位论文：光台细菌、硝化细菌的分离签定及其产品的初步研究注：丙酸钠、乙酸钠、t - - 酸钠含量皆为3 0 0 0 m g l3 2 2 2 两曹互抑实验用供选菌株培养液分别浸润一定数量的无菌中性圆滤纸( 直径中1 5 r a m ) ，鼍0 9 0 m m无菌培养皿盖内在开启的洁净工作台上洁净风吹至基本干燥( 2 0 r a i n ) 。采用涂布平板法将a 菌涂于中9 0 m m 的平板紫色非硫细菌固体培养基表面，将上述滤纸片b 贴于其上培养。结果记录方法为：a 向滤纸b 扩散计为0 ，b 向a 扩散计为1 ，二者之间出现明显的抑菌圈计为1 。硝化细菌不用两菌互抑实验筛选。3 。2 2 3 蛆成韧步配方根据生长特性测定、两菌互抑实验结果，以对生长最适温度、光照、p h 、盐度等因子适应范围广，主要菌株生长得率高、不被其它组成菌抑制等为标准组成a 、b 、c 、d四个光合细菌供选配方；组成一个硝化细菌配方e 以供研究。3 2 2 4 混合发酵产率筛选检验a 、b 、c 、d 四个配方混合发酵产率与单菌发酵产率比较淘汰混台发酵产率低、培养后颜色不鲜艳的配方；比较e 与硝化细菌单菌、富集培养物l 1 e r b o b + i1 e r a o b 混合发酵产率，低于组成菌产率则重新进行配伍。3 2 2 5 水质调控活性筛选对配方的氨氮去除活性进行比较。人造养殖污水配方( 表4 ) 参照【9 7 】。实验温度2 5，7 0 01 0 0 0 l x 全天光照实验周期2 4 小时。选择氨氮去除效果最好的一个光合细菌配方。如配方e 氨氮去除能力低于8 0 则重新进行配伍，直至去除能力超过8 0 。受试配方使用剂量为5 ( 体积比) 。三次重复，结果以平均值计。袁4 人造养殖汗水的衄组成浓度( m h l )功用理学硕士学位论文：光合细菌、硝化细菌的分离鉴定及其产品的初步研究3 2 3 配方评价3 2 3 1 配方毒性实验静态直接接触致毒毒性试验法，致毒时间2 4 h 。设0 、5 、1 0 、1 5 、2 0 五个梯度( 体积比) ，重复三次。测定a 、e 、a + e 对食蚊鱼的毒性。3 2 3 2 非离子氨对蚊盘的急性毒性实验用静态直接接触致毒毒性试验法测定急性毒性剂量。水温用加热棒维持在2 5 o 5。试验前，做预备试验然后按等对数间距法贝1 j 1 9 8 , 9 9 1 确定正式试验所用的浓度梯度。设置浓度均以未离解氨计，设5 个梯度( 见表2 1 ) ，三个平行。非离子氨浓度计算方法参照 1 0 0 1 。3 2 3 3 配方对非膏子氨急性毒性的影响按等对数间距法则设定0 、2 、4 、8 四个浓度梯度，分别测定不同浓度的a 、e 、a + e 对非离子氨急性毒性的影响，每个处理设三个重复。非离子氮浓度调至l d s o ，即1 6 0 7 m g 1 实验周期2 4 h 。3 2 3 4 配方对皇盘的促生长作用模报实验在0 p p m 、5 p p m 、l o p p m 、1 5 p p m 四个浓度梯度分别测定a 、e 、a + e 对鲤鱼的促生长作用，重复两次，同时设1 5 p p m 的产品为对照。每缸随机分配受试鲤鱼2 0 尾，实验周期1 0 d 。水温2 5 0 5 全天光照照度3 0 0 5 0 0l x 。实验期间每天上午8 ：3 0 和下午4 ：3 0 投饲，每缸每次定量投饲1 5 9 金鱼饲料粉。不除残饵、粪便，不换水，不捞死鱼。测定初始氨氮，实验期间每4 8 h 测定一次氨氮。初始体长以3 0 尾鱼苗平均体长作为初始平均体长( 3 5 4 4 - 3 1 m m ) 计。测定体长的鱼苗不用于促生长模拟实验。实验结束时测定所有鱼体长。3 2 4 配方水质调控效果中试评价中试评价于北碚甲鱼养殖场进行，面积2 0 i n 2 的甲鱼养殖池8 个，分别测定配方a 、e 、a + e 的水质改良效果使用浓度均为l p p m ，重复两次，设对照，实验周期2 0 d 。每天测定氨氮的变化。实验方法参照【l2 】。季节水族馆金鱼饲养中试评价：金鱼养殖鱼缸8 个，正常饲养，配方a 、e 、a + e的使用浓度均为l p p m ，设对照，两次重复。3 2 5 配方生产性培养基的筛选配方a 生产培养基的筛选，采用正交实验法分两次进行。先采用l 1 6 ( 3 5 ) i e 交实验表对n a 2 s9 i - 1 2 0 、n a 2 s 2 0 3 、酵母膏三个因素及交互作用进行选择并验证，因子水平见表6 。在以上因子的最佳水平下采用l 1 6 ( 3 5 ) 对碳源乙酸钠、硫化钠、丙酸钠三个因素进行理学硕士学位论文：光合细菌、鞘化细菌的分离鉴定及奠产品的初步研究3 3 光台细蕾规模化生产装置的研期3 3 1 设计参数研究3 3 1 1 光照强度、光通路长度、培养状态对光合速率的影响分静置、搅拌( 3 0 r r a i n ，以下所用转速相同) 两个培养组，每组使用1 0 0 m l 、5 0 0 m l 、1 0 ( 0 m l 、2 0 0 0 m ! 、3 0 0 0 m l 的三角瓶各1 0 个，分别测定5 0 0 l x 、1 5 0 0 l x 、2 0 0 0 l x 、3 5 0 0 l x 、8 0 0 0 l x 四个光照强度下配方a4 8 h 的生长情况，以比较不同条件下配方a 的生长速率。检测指标为o d 6 6 0 。实验处理见表1 0 ：表】o 先舍闪光坩量效应，平均光饱和点璃证实玲t a b l e1 0c o n f i r m a t i o ne x p e r i m e n to nf l a s h i n g l i g h te f f e c ta n dp h e n o m e n o no fl i g h ts a t u r a t i o np o i n to f p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a注：表中同列1 1 0 为相同体积1 0 三角瓶的编号3 3 1 2 培养警径和搅拌对光合细蕾生长的影响3 5 0 0 6 0 0 0 l x 光照条件下测定不同管径对配方静置培养效果的影响，培养管径为0 6 0 m m 、0 li o m m 、0 1 6 0 r a m 、0 2 0 0 m m 、0 4 0 0 r a m ，玻璃管长度为2 0 0 0 m m ，实验重复6 次。结果以各次实验平均值计。测定0 4 0 0 m m ( 装置见附录2 图2 ) ，3 0 r m i n 搅拌培养条件下测