（作物遗传育种专业论文）黄萎病菌诱导下棉花抗病品种冀棉20+SSH文库的构建.pdf

摘要 黄萎病( v e r t i c i l i i u mw i l t ) 是世界性的棉花重大病害，严重威胁和阻碍着棉花生产 的发展。我国是世界上的产棉大国，棉花生产对国民经济的发展具有重要的影响，而 我国棉花生产一直受枯、黄萎病的制约，尤其是黄萎病对棉花生产的影响最为严重。 因此，如何防治棉花黄萎病成为我国棉花生产上亟待解决的一个问题。利用抗病品种 无疑是一种经济、有效、环保的措施，而培育抗病品种首先要明确抗痫机制和寻找高 抗黄萎病的基因。日益发展的分子生物技术为研究棉花抗病基因提供了有力的工具， 也为棉花抗黄萎病分子育种提供了新的基因来源。 在本研究中，为了研究陆地棉接种黄萎病菌后抗病相关基因的表达情况，我们利 用抑制差减杂交的方法构建了陆地棉抗病品种冀棉2 0 在黄萎病菌诱导下的c d n a 文 库。以接种黄萎病菌后8 h 、1 2 h 、2 4 h 和4 8 h 的材料为试验方，以不接菌的对照材料 为驱动方构建s s h 文库。所构建s s h 文库中共保存了8 0 0 个阳性克隆，片段大小平 均为4 0 0 b p 。随机挑选2 0 个阳性克隆进行测序，将获得的e s t 在g e n b a n k 上用 b l a s t n 和b l a s t x 软件对其进行序列同源性比对。结果表明2 0 条e s t 都可以找到 功能己知的同源序列，其中在b l a s t n 比较结果中，功能已知的有1 2 条，占全部e s t 的6 0 ，b l a s t x 的比较结果中有1 4 条功能己知，占全部e s t 的7 0 。将序列与 g e n b a n kd b e s t 库进行比对，发现绝大多数e s t 都可找到同源性较高的c d n a 。而 且这些c d n a 都来自于植物在生物与非生物胁追条件下特异表达的c d n a 文库。 在可以找到同源序列的e s t 中根据b l a s t x 和b l a s t h 的结果以及b e a v n 对拟 南芥的分类标准进行了功能的分类。在所获得的棉花黄萎病菌诱导表达的基因中，已 知功能的同源基因涉及到多种抗病防御反应的代谢物质及信号传导途径。如：b 9 号 序列和a 2 1 号序列与丝氨酸苏氨酸蛋白激酶同源，4 号序列与谷胱甘肽s 转移酶同 源，1 6 号序列与a c c 氧化酶同源，1 0 号序列与抗病反应相关基因家族蛋白同源等。 这些同源基因涉及到r 基因介导的信号传导途径，水杨酸介导的信号传导途径，茉 莉酸和乙烯信号传导途径，植物保卫素的合成与细胞壁修饰等。通过对本试验中的基 因表达分析可以看出，一些信号传导类，转录因子类，次生代谢类，以及细胞结构类 基因在多种植物材料和多种胁迫诱导中均有表达。这表明了植物对于外界环境胁迫的 基础防御机制的一致性。最后，针对本研究中筛选出的部分抗病基因，对棉花抗黄萎 病可能的分子机制进行了初步的探讨。 关键词：棉花；黄萎病：s s h 文库；基因表达分析 c o s t r u c t i o no f as s hl i b r a r yo f r e s i s t a n tc u “i v a rj i m i a n 2 0 i n d u c e dh v 跆心f c 洲w 妇 髓” a u 出o r = 曩a r ih 剐v a n m a i o r ：c m pg e n e t i c sa n db f e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o m az h i y i n g p r o fz h a n 2g u i v j n a b s t r a c t v e r t i c i l l i u mw i l ti saw o r l d w i d es e r i o u sd i s e a s ei nc o t t o n i tr c s t r i c t st h ed e v e l o d m e n t o fc o t t o ny i e l d ，i nc h i n a ，t h ep r o d u c t i o no fc o t t o np l a ya ni m p o n a l l tr o l ei ne c o n o m y ，b u t t h ey i e i di sr e s t r i c t e db yf u s a r i u ma n dv c r c i c i l i i u m 、i l t s ，e s p e c i a l l yv e r t i c i l i i u mw i l t ss o h o wt op r e v e n ta n dc o n 仃o lv e n i c i l l i u mw i l ti sap r o b l e mt ob es o l v 嗣u s i n gr e s i s t a l l t c u l t i v a r si sa ne 虢c t i v ea n de c o n o m i c a lm e t h o df o rc o 嘶o l l i n gv e r t i c i l l i u m 、v i l t t 0b r e e d r e s i s t a n tc u l t i v a r s 6 r s tw em u s tk n o wt h em e c h a l l i s mo ft h ed i s e a s ea n ds e a r c hr e s i s t 髓c e g e n e s d e v e l o p m e mo fm o l e c u l a rb i o i o g i c a lt e c h n i q u ep r o v i d e sap o 、v e r f u lt o o lf o r s t u d y i n gd i s e a s er e s i s t a i l tg e n e sa 1 1 d an e wg e n es o m c ef o rm 0 1 e c u l a rb r e e d i n go f v e n i c i l l i 啪w i l tr e s i s t a n tc u l t i v a r s i nt h i sp a p e r ，t os t u d yt 1 1 ee x p r e s s i o no fd i s e 丑s er e s j s 协c eg e n e so fu p l a n dc o t t o n i n d u c e d b y跆r f f c 肼m m 如向，胁e ，ac d n ai i b r a r y w a sc o n s t r u c t e d b ys u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) b a s e do nt h em a t e r i a li n d l 】c e db y 舱r ，f c 珊f “埘幽 ，抽8a f t e r 8 王1 ，1 2 h ，2 4 ha n d4 8 ha sa 把s t l 强n l em a t c r i a lo f c o n i o ja sad r i v e r e i g h th u d d r e dc l o n s 、砖r es t o r e da n dp i a s m i dd n a sw e r ee x 打a t e dr a n d o m i yt oe x 姗i n ei n s e r ts i z e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea v e r a g ei n s e r ts i z ei sa b o u tf o l l rh u n d r e db a s ep a i r s t w e n t yc l o n sw h i c h 、v e r es e l e c t e dr a n d o m l yw e r es u b s e q u e mt ob es e q u e n c e d e s t ss i m i l a r i t ya n a l y s i sv i a b l a s t xa n db l a s t ns o f t w a r es h o w e dt h a t 也et w e n t ye s t sa l lh a v eh o m o l o g yt o s e q u e n c e sw i t hk n o w n c t i 叩s w i t ht h e r e s u l to fb l a s t n ，t w e i v ee s t sh a v e h o m o l o g yt os e q u e n c e sw i t hk n o w nf u n c t i o n ，t h er a t i oi s6 0 w i t ht h er e s u l to f b l a s t xf b u n e e ne s t sh a v eh o m o l o g yt os e q u e n e e sw i t hk n o u 强lf u n c t i o n ，t h er a t i oi s 7 0 q u e r y i n gt h ed b e s to fg e n b a l l k ，t h er e s u l t sr e v e a l e dm a tm o s to ft 1 1 e s ee s t sh a v e h i g hh o m 0 1 0 9 yw i t h 恤ec d n a si n d u c e db ya b i o t i co r b i o t i cs t r e s s e si np l a n t s b a s e do nt h er c s u i to fb l a s t x ，b l a s t na 1 1 db e a v n s ( 19 9 8 ) c l a s s i f ys t a n d a r d ，t h e e s t sw e r ec l a s s m e da c c o 坩i n 叠t ot 1 1 e i r 缸l c t i o n t h eg e n e s0 b t a i n e df r o mj i m i a n 2 0 i n d u c e db y 跆r 玎c f f “m 如向，f 口p ，r e l a t et os e v e r a lk i n do fd i s e a s er e s i s t a i l c er e l a t e dg e n e s a j l d s i g n a l t m n d u c t i o n f o r e x 眦p l e ， s a n l p l e 3a 1 1 da 2 1h a v e h o m o l o g yw i m s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e ，s a n l p l e4h a sh o m o l o g yw i t h9 1 u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，s a l n p l e16 h a sh o m o l o g y谢t ha c co x i d a s e ，a 工l ds 锄p l e1 0h a sh o m o l o g yw i md i s e a s e r e s i s t a n c e r e p o n s i v e 硒i l yp r o t e i n t h e s eh d m 0 1 0 9 yg e n e si n v 0 1 v e di nrg e n er e l a t e d s i 田1 a lt r a n s d u c t i o n ，s ar e l a t e ds i g m a l 订a 1 1 s d u c t i o na n ds oo n a c c o r d i n gt oo u rr e s e a r c h ，al o to fg e n e s ( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，i n t r a c e l l u l a rt r a 伍c ， t r a n s c r i p t i o n ，c e i ls t r l l c t l l r e 矗m c t i o n ) h a v e 血ea n a i o g o u sm e c h a n i s mi nt h er e s i s t a i l c e p r o c e s sw h e np 1 趴tf a c e sa i lk i n d so fe n v i r o m e n t a ls t r e s s e s a t1 a s t ，b a s i n go nt h ed i s e a s e r e s i s t a n c eg e n e ss c r e e n e do u tf b mo u rr e s e a r c h ，w ed i s c u s st h ep o s s i b l em o l e c u l e r m e c h 觚i s mo fc o t t o nv e n i c i l l i u mw i hr e s i s t a n c e k e yw o r d s ：c o t t o n ；v e m c i l l i u mw i l t ；s s hl i b r a r y ；g e n ee x p r e s s i o na 1 1 a i y s i s 简写符号 d n t p 英文全称 缩略词表 d e o x y n u c i e o s i d et r i p h o s p h a t e o d 2 6 0a b s o r b t i o na t2 6 0 n m 0 d 2 8 0a b s o r b t i o na t2 8 0 n m d e p c i p t g l b p c r x g a l a m p d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e i s o p r o p y l t l l i o p - d g a l a c t o s i d e l u r i a - b e r t a n i p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 中文全称 脱氧核苷三磷酸 2 6 0 n r n 处吸光值 2 8 0 n m 处吸光值 焦碳酸二乙酯 异丙基硫代- b d 一半乳糖苷 l b 培养基 聚合酶链式反应 5 b r o m o 4 一c i d o r o 3 一i n d 0 1 y 1 b d g a l a c t o s i d e5 一溴一4 一氯一3 吲哚一p d 半乳糖苷 a m p i c i l l i n 氨卞青霉素 b l a s tb a s i cl o c a la l i g 砌e n ts e a r c ht o o l局部比对基本检索工具 d sc d n ad o u b l es 仃a n dc o m p l e m e n t a r yd n a双链互补d n a e s t s s h s a s a r p o d h r e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g 表达序列标签 s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 抑制性差减杂交 s a l i c v l i ca c i d水杨酸 s y s t e m a t i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e 系统获得性抗性 p e m x i d a s o过氧化物酶 h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e 过敏反应 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得煎i 垦壅些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：) 司汤壶 签字日期：泐，辞月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i b 盛些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：l 刁国国巨 新豁知 签字目期：夕仍辟占月口日 签字日期；弘矽多年多月乃矿日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位； 通讯地址： 电话： 邮编： 黄萎病菌诱导f 棉花抗病品种j i m i a n 2 0s s h 文库的构建 1 引言 棉花黄萎病( v e r t i c i l i i u mw i l t ) 是一种土传性病害，特点是分布广、危害重，是世 界性危害棉花的第一病害。我国是世界上的产棉大国，棉花生产对国民经济的发展具 有重要影响，而我国棉花生产一直受枯、黄萎病的制约，尤其是黄萎病对棉花生产的 影响最为严重。因此如何防治棉花黄萎病成为我国棉花生产上亟待解决的一个问题。 利用抗病品种无疑是一种经济、有效、环保的措施，而培育抗病品种首先要明确抗病 机制和寻找高抗黄萎病的基因川。 自从= 十世纪8 0 年代开始，国际上一些著名的实验室就开始设计不同的技术路 线进行基因克隆，随着生物技术、基因组学和生物信息学的飞速发展，目前已发展出 一系列基因克隆的方法 2 l ，包括基于d n a 水平上的抗病基因克隆技术和基于m r n a 水平上的差异表达克隆技术。 基于d n a 水平上的抗病基因克隆技术主要有转座子标签法、图位克隆、抗病基 因同源序列法等几种p ”。由于抗病基因都存在一种保守区域( l r r ，n b s ，l z 和蛋 白激酶等) ，因此同源序列法是目前应用比较广泛的一种抗病基因克隆方法。它所依 据的原理就是根据这些保守序列设计引物，对基因组进行扩增，得到抗病基因类似序 列，检测这些序列与抗病性的共分离情况，若它们与抗病基因紧密连锁或带有抗病基 因的同源序列，可以用探针筛选基因组文库，获得候选抗病基因。最近，利用己知抗 病基因的保守序列设计引物进行p c r 扩增己经在棉花、大豆、马铃薯、水稻、大麦、 小麦和番茄睁1 2 】中分离到了许多与已知抗病基因同源的d n a 序列。 基于m r n a 水平上分离差异表达基因主要有四种基本方法：差异显示技术 ( d i 船r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r & n s c f i p t a s ep c r ，d dr 1 二p c r ) 、代表性序列差别分析 ( r e p r e s e m a t i o n a id i 鼠r e n c ea n a l y s i s ，甜) a ) 、c d n a a f l p 差异显示技术( c d n a a f l p d i m r e n t i a ld i s p l a y ) 和抑制性差减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ， s s h ) 1 2 】。真核植物基因组中只有1 5 左右的基因得到表达，从m r n a 表达水平寻找 抗病基因或抗病相关基因将会简化分析背景，使目标序列相对富集，便于克隆，而且 一次可以得到许多与抗病相关的差异表达基因。b e n i t 等i l 副利用d d r l ：p c r 技术研究 了植物病原菌互作中基因的表达。张桂寅1 1 】采用c d 时a a f l p 技术研究了棉花黄萎病 菌诱导下抗病相关基因的差异表达。肖月华1 1 4 】从棉花胚珠的c d n a a f l p 片断中选取 了一个与拟南芥类l r r 抗病蛋白( l f 湛r l ) 序列相似的片断。 s s h 即抑制消减杂交技术是由d i 砒c h e n k o 等【1 5 1 于1 9 9 6 年以m r n a 差异显示技 术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。该技术因其具有假阳性率低的 突出优点已被广泛应用于差异表达基因的克隆。 s s h 技术的原理是：将驱动方和试验方样品m r n a 分别反转录成c d n a 并用船口 i 或觑z p i i i 酶切，然后将试验方c d n a 分成两份，分别加接头1 和接头2 并与驱动方 c q a 进行两次差减杂交。第一次杂交时用过量的驱动方c d n a 与两种不同接头的试 验方c d n a 分别杂交，相同部分杂交形成双链而有差别部分以单链形式保留。第一次 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 杂交是使试验方单链c d n a 均等化，使原来有丰度差别的单链c d n a 的相对含量基 本达到一致。这种均等化是依据杂交二级动力学原理实现的，即丰度高的单链c d n a 在退火时产生双链的速度要快于低丰度的单链c d n a ，杂交的结果使试验方c d n a 中 的差异表达基因得到富集。第二次差减杂交是将上述试验方的两部分杂交产物混合并 加入新制备的驱动方c d n a ，试验方中带不同接头的同源c d n a 片段可杂交形成双链， 利用两端含有引物序列的双链接头充当引物模板进行p c r 扩增。非目标序列由于其 接头带有设计的反向重复序列，所以杂交退火时形成锅柄状结构而无法扩增受到抑制 作用16 1 。 s s h 具有快速、灵敏、高效、假阳性率低且所需m r n a 量较少等优点。采用该 技术在较短时间内即可获得差异表达基因的c d n a 片段。在标准体系中，运用s s h 进行一轮消减杂交，可富集稀有序列1 0 0 0 倍以上【1 5 】，使某些低丰度表达的m r n a 有 望被检出。v o ns t e i n 1 7 】等的研究表明，s s h 的阳性率达9 4 ，可同时分离出上百个 差异表达基因。所需m r n a 为5 0 n g 1 g ，并可在m r n a 总量较少的情况下，通过预 扩增而获得足够高质量的c d n a 【1 8 】。消减后的c d n a 混合物可被用作杂交探针，并且 消减过程不需c d n a 单、双链分离的物理过程。此外，通过调整第一次差减杂交中 d r i v e rc d n a 的含量，并在第二次差减杂交中不加入d r i v e rc d n a ，则有望反映出基因 表达量的差异【”】。 尽管s s h 有上面所提及的的优点。但一个新技术的产生不可避免的存在些缺点 和不足，如非酶切位点区域内的点突变，小缺失或插入均不能有效被发现；得到的片 段尚需扩增其全长；依赖于p c r 技术，如预扩增可能导致一些序列的丢失。此外， 对材料要求较高，不能同时进行数个材料间或不同处理材料间的比较，材料间不能存 在过多差异【2 0 1 。 目前s s h 方法己成功应用于细胞分化、发育、再生、衰老等的研究中和分离不 同器官组织之间、个体不同发育阶段以及受外界因子作用而差异表达的基因等方面。 但主要集中在动物和人的研究上。尽管该方法在植物上应用起步较晚，但自从1 9 9 9 年首次应用以来，己涉及到小麦、玉米、棉花、水稻、大麦、马铃薯、拟南芥1 2 ”驯 等近2 0 种植物。 骆蒙等阻2 8 】以抗白粉病品系“百农3 2 1 7 m a r d l e r ”b c 5 f 4 为材料，构建了白粉病 菌诱导的普通c d n a 文库和抑制消减杂交c d n a 文库。分别对两文库进行了一定规 模的测序，获得普通c d n a 文库不重复e s t s 3 8 7 条和s s hc d n a 文库e s t s 7 6 0 条。 将获得的e s t s 与g e n b a n k 序列进行了b l a s t n 、b l a s t x 同源性分析。结果表明获 得的普通c d n a 文库中，一些参与光合作用与核糖体构成等的基因出现频率较高，而 获得的抗病相关基因则较少。而在抑制消减c d n a 文库中获得的抗病相关基因的数量 和种类要远远高于普通c d n a 文库。 王转等f 2 9 l 利用抑制差减杂交和高密度点阵膜技术研究小麦2 叶幼苗期水分胁迫 诱导表达基因。通过筛选具有1 5 3 0 个克隆的s s h 文库，获得1 8 1 个阳性克隆。序列 同源性比较和功能查询结果发现，8 3 2 的水分胁迫诱导表达基因分别与不同逆境胁 迫条件下表达的基因具有较高的同源性，这些基因在生物体内的功能都是直接或间接 黄萎病菌诱导下棉花抗病品种j i m i a n 2 0s s h 文库的构建 对细胞遭受逆境胁迫起保护作用。用反向n o n l l e m 、r t p c r 和n o r n l e m 进一步检验 所获得的功能已知e s t ，初步建立了小麦幼苗期水分胁迫诱导的基因表达谱。 朱龙付等 叫以海岛棉p i m a 9 0 为材料，构建了黄萎病菌侵染后2 h 、4 h 、8 h 、1 2 h 、 2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 和9 6 h 的抑制差减文库，将获得的5 3 4 个克隆分别以病原菌诱导前后 的总c d n a 为探针进行反向n o n h e r n 杂交，对7 8 个在海岛棉的抗病反应中呈上升表 达的克隆进行了测序，结果表明了大部分阳性克隆与拟南芥等多个物种不同逆境条件 下诱导的相关基因或表达序列相同或同源，如棉花病程相关蛋白家族1 0 ，拟南芥抗 病反应家族蛋白等。 目前，s s h 方法在植物上的应用主要是两个方面，( 1 ) 植物的生长发育及其组织 特异性研究，如辣椒素生物合成相关基因的分离【3 ”，水稻幼穗发育早期特异表达基因 的分离等【2 ”。( 2 ) 生物及非生物逆境对植物的影响及引起的基因差异表达研究，如玉 米幼苗淹水诱导基因表达【2 2 】，小麦幼苗水分胁迫诱导基因表达等 3 2 l 。而在其他方面， 如表达调控、衰老、调亡则涉及较少。 随着分子生物学技术的不断发展和完善，将会涌现出越来越多的新技术和新方 法。s s h 与其它新技术和新方法的有机结合将不失为一种分离和鉴定差异表达基因的 良策。如s s h 与c d n a 微阵列技术口3 】及m o s 【3 4 】方法相结合对阳性差减产物进行快速、 有效的筛选等己经显示出其优越性。总之，随着s s h 技术的进一步改进和提高，它 将在新基因的分离和克隆及研究基因的表达调控和植物的生长发育等方面发挥更大 的作用【3 5 3 。 分子生物技术的发展为研究棉花基因表达提供了有力的工具。朱龙付等以海岛棉 p i m a 9 0 为材料，构建了黄萎病菌侵染后s s h 文库，本研究拟通过s s h 技术研究陆地 棉抗黄萎病品种冀棉2 0 在抗黄萎病过程中的基因表达情况，筛选与陆地棉抗病相关 基因。研究结果将为阐明棉花抗黄萎病机制提供依据，为迸一步克隆抗黄萎病相关基 因，进行棉花抗黄萎病分子育种提供新的基因来源。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 试验材料 2 1 1 供试棉花品种 2 材料方法 供试棉花品种为陆地棉抗黄萎病品种冀棉2 0 ，由河北农业大学棉花遗传育种研 究室提供。 2 1 2 供试菌系 供试菌系为从p i m a 9 0 5 3 中分离得到的经鉴定为强致病力的菌系，由河北农业大 学棉花遗传育种研究室提供。 2 2 试验方法 2 2 1 试验材料的处理 将棉花种子用清水浸泡8 h 后置于干净湿润的纱布上，于2 7 3 0 催芽，选择发 芽整齐一致的种子播种于装有蛭石的营养钵中，在培养室内( 昼温2 5 2 6 ，夜温 2 0 2 2 ) 培养，定期浇h o a g l a i l d 营养液和水。待生长至第一片真叶展开时，接种棉 花黄萎病菌孢子悬浮液。将菌液用纱布过滤，在显微镜下统计滤液孢子数，用无菌水 配制成浓度为0 9 4 1 0 7 1 1 07 个孢子m l 的孢子悬浮液，现用现配。将孢子悬浮液从 底部注入塑料钵中，每钵接种1 5 m 1 。对照组浇灌相同量的水，以保持环境条件一致。 接种后保持温度在2 5 2 6 ，湿度8 0 左右以利于发病。在接种后8 h 、1 2 h 、2 4 h 和 4 8 h 分别提取根部各时段处理组及对照组总r n a 。 2 2 2 总r n a 提取 本实验采用c 1 1 a b l i c l 沉淀法提取棉花根部总r n a ，具体步骤如下： 1 1 在4 m l 提取液中加入2 终体积的b 巯基乙醇后置于6 5 温育。 2 ) 取l g 左右的棉花根部组织，用无r n a s e 的水冲洗干净，置于液氮中充分研磨后 转入到预热的提取液中，剧烈振荡混匀，6 5 温育2 0 m i n 。 3 ) 加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提1 2 次，4 ，1 0 ，o o o r p m 离心1 5 m i n 。 4 ) 上清加入l 4 体积的1 0 i n o l ll i c l 混匀。4 沉淀过夜。 4 黄萎病菌诱导下棉花抗病品种j f m j a n 2 0s s h 文库的构建 5 ) 4 ，l o ，o o o f p ：m 离心1 5 m i n 后，将沉淀溶于2 0 0 u ld e p c 水中，然后加入l 1 0 体 积的3 m o l l 的醋酸钠( p h 5 2 ) 和2 5 倍体积的无水乙醇，一7 0 沉淀3 0 m i n 。 6 ) 4 ，1 0 ，0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，用7 0 乙醇洗沉淀1 2 次。 7 ) 沉淀干燥后，溶于6 0 “ld e p c 水中，一7 0 保存备用。 8 ) 紫外分光光度计测定r n a 浓度及纯度。 9 ) 用1 2 的琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 质量。 r n a 提取过程中所用器材都经过去除r n a s e 的处理，所用水皆用o 1 d e p c 处 理，所用溶液都用d e p c 水配制，再高压灭菌5 0 m i n 。一次性使用的离心管和枪头基 本上无r n a s e ，可以不经处理直接高压灭菌后使用，玻璃器皿、研钵、钥匙等用前需 用0 i 的d e p c 水浸泡过夜，高压灭菌后使用；镊子等需在1 8 0 烘烤8 h 。 2 2 3 m r n a 的分离 m r n a 的分离依照p r o m e g a 公司p o l y a t r a c tm r n ai s o l a t i o ns y s t e m s 方法进行 并稍有改动。 1 ) 在一个无r n a s e 的1 5 m 1 离心管中，取0 1 1 o m g 的总i 矾a 用水定容到终体积 5 0 0 u l 。放置在6 5 水浴中温育l o m i n 。 2 ) 在此期间配制o 5 s s c 和o 2 s s c 。 a ) 1 2 m 1o 5 s s c ：在无菌、无r n a s e 的1 5 m l 离心管中混合3 0 u l2 0 x s s c 和 1 1 7 0 u 1 无r n a s e 水。 b ) 1 4 m 10 2 s s c ：在无菌、无r n a s e 的1 5 m 1 离心管中混合1 4 h l2 0 s s c 和 1 3 8 6 u l 无r n a s e 水。 3 ) r n a 在6 5 水浴中温育l o m i n 后，迅速加入3 山生物素标记的0 1 i g o ( d t ) 探针及 1 3 u l2 0 s s c ，轻轻混匀，室温放置至完全冷却( 约需1 0 m i n ) ，在此期间进行下一 步。 4 ) 轻弹离心管管底直至磁珠完全悬浮起来，放到磁架上收集( 约需3 0 s ) ，小心移去上 清，用o 5 s s c 洗磁珠3 次，每次3 0 0 h 1 ，每次用磁架收集。小心移去上清，洗 好的磁珠用1 0 0 u lo 5 x s s c 重悬。 5 ) 将步骤3 冷却的反应混合物全部加入到洗过的s a p m p s 的管中。轻轻混匀后， 室温放置1 0 m i n 。每隔1 2 m i n 轻轻颠倒混匀。用磁架吸集磁珠，小心移去上清， 注意不要触到磁珠( 从这一步开始要保留上清，直至确保得到m r n a ) 。用o 2 s s c 洗磁珠4 次，每次用3 0 0 l ，且保证磁珠全部悬浮起来，最后一次洗完后，要尽 量吸净上清。 6 ) 加入1 0 0 l 无r n a s e 的灭菌水，轻弹使磁珠充分悬浮，用磁架吸附磁珠，将洗脱 下来的m r n a 移至一无菌无r n a s e 的新管中。再加入1 5 0 “l 无r n a s e 灭菌水重 复洗脱步骤，洗脱下来的m r n a 与第一次的混合，共2 5 0 p l 。 7 ) 加入1 1 0 体积3 m o i l 的醋酸钠h 5 2 ) 和3 倍体积的无水乙醇，轻混后，一2 0 沉淀过夜。1 2 ，o o o g 离心1 0 m i n ，弃上清，加入lr n l 7 5 乙醇洗涤沉淀。重新离心， 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 自然晾干。根据总i a 1 估算m r n a 的量，加入适量无r n a s e 灭菌水溶解沉 淀，一7 0 保存备用。 8 ) m r n a 的纯度、浓度和完整性检测同总i 州a 。 2 3s s h 文库的构建 按照c l o n t e c h 公司的差减试剂盒b dp c r s e l e c t 丁mc d n as u b t r a c t i o nk i t 中的程序 进行。 2 _ 3 1 第一链c d n a 的合成 1 1对于t e s t e r 和d r i v e rc d n a ， m r n a ( 2 曲 各按以下组分混合于一个o 5 m 1 离心管中。 c d n a s y n t h c s i sp r i m e r ( 1 0 “m ) 2 ) p c r 仪上7 0 2 m i n ，冰浴2 m i n ，瞬时离心。 3 ) 每管加入下列组分，轻弹混匀并瞬时离心。 5 f i r s t s 廿a n db u f r e r d n t pm i x ( 1 0 m m ) s t e r i l rh 2 0 a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 2 0 u n i t s 仙1 ) 4 ) 置于空气浴温箱中4 2 温育1 5 h 。 5 ) 将反应混合液置于冰上，终止第一条链的合成 2 3 2 第二链c d n a 的合成 2 u 1 l u l l u l 1 u l 4 u l l u l 并立即进入下一个程序。 1 ) 加入以下组分到第一链c d n a 合成的反应管中，总共8 0 肛l 体系，混匀并瞬时离 心。 s t e r i l eh 2 04 8 4 l 5 s e c o n d s t r a n db u 妇陪r1 6 o u l d n t pm i x ( 1 0m m ) 1 6 “l 2 0 s e c o n d s t r a n de n z y m ec o c k t a i l 4 o “l 2 ) 于1 6 温育( 水浴或p c r 仪) 2 h 。 3 ) 加入2 “lt 4 d n a p o l y m e r a s e ，混匀，1 6 温育3 0 m i n 。 4 )加入4 “l2 0 e d l g 1 y c o g e n m i x 终止第二链的合成。 5 ) 加入1 0 0 l 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分振荡混匀。室温1 4 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 小心转移上清至一新离心管中。 6 ) 加入l o o “l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 至上清中，充分振荡混匀。室温1 4 ，0 0 0 i p m 离心 6 黄萎病菌诱导下棉花抗病品种j i m j a n 2 0s s h 文库的构建 1 0 m i n ，小心转移上清至一新离心管中。 7 )加入4 0 斗14 mn h 4 0 a c 和3 0 0 l9 5 乙醇，充分振荡混匀。室温1 4 ，o o o r p m 离也 2 0 m i n ，弃上清。 8 ) 加入5 0 0 l8 0 乙醇洗沉淀。室温1 4 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。 9 ) 空气中干燥1 0 m i n ，加入5 0 u l 无菌水溶解。 1 0 ) 分装6 u l 于一新管中，于一2 0 保存，用于检测合成的双链c d n a 的质量。 2 3 3 双链c d n a 的r s d i 酶切 1 1 加入下列组分到一离心管中，振荡混匀并瞬时离心。 d sc d n a4 3 5 “l l o x r s 4 ir e s t r i c t i o nb u 仃e r5 0 u 1 月s 口i ( 1o u n i t “1 ) 1 5 肛l 2 ) 3 7 温育2 h 。留出5 l 酶切产物检测船口i 的酶切效率。 3 ) 加入2 5 肛12 0 e d m v g l y c o g e n m i x 终止反应。 4 ) 加入5 0 l 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分振荡混匀，室温1 4 ，o o o r p m 离心1 0 m i n 。 5 ) 转移上清于另一新o 5 m l 离心管中，加入5 0 1 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，充分振荡混匀。 室温1 4 ，0 0 0 r p m 离心i o m i n 。 6 ) 转移上清于一新0 5 m l 离心管中，加入2 5 ”l4 mn h 4 0 a c 和1 8 7 5 肛l9 5 乙醇，充 分振荡混匀。 7 ) 室温1 4 ，o o o r p m 离心2 0 m i n ，弃上清。 8 ) 用2 0 0 扯l8 0 乙醇洗涤沉淀。室温1 4 ，0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清。 9 1 空气中干燥5 1 0 m i n 。 1 0 ) 溶于5 5 l 无菌水，保存于2 0 。 将留出的5 u l 酶切产物与上一步骤存留的双链c d n a 用1 2 琼脂糖电泳检测。 到此步为止，d r i v e rc d n a 已准备好，t e s t e r c d n a 继续下砸的步骤。 2 3 4 接头的连接 1 )取1 u lr s 日i 酶切好的t e s t e rc d n a ，加入5 h l 无菌水a 2 ) 将接头连接的混合液( m a s t e r1 l l i x ) 放入一个o 5 m 】离心管中。 c o m d o n e m p e rr x n s t e r i l eh 2 0 3 肛l 5 l i 叠a t i o nb u 丘打2 斗l t 4d 骨叮al i g a s e ( 4 0 0 u n i t s p 1 )1 l 3 1 连接体系的建立。取稀释后的酶切t e s t e rc d n a 分为两管，建立加入不同接头的 两个连接体系。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 c o m p o n e m d i l u t e dt e s t e rc d n a a d a p t o r l ( 10 “m ) a d a p t o r 2 r ( 1 0 h m ) m a s t e r m i x f i i l a lv 0 1 u m e 4 ) 在一个新管中混合2 h l t e s t e r l 一l 和2 斗lt e s t e r l 一2 ( 作为未差减对照) 。 5 ) 将以上各管混匀并瞬时离心后置于1 6 温育过夜。 6 )加1 “l e d t a g 1 y c o g e n m i x 终止反应，7 2 温育5 m i n 使连接酶失活。 7 ) 瞬时离心，取u n s u b t r a c t i o nc d n a c o n t r o l1 斗i 稀释于1 m lh 2 0 中，用于后面的p c r 扩增，保存样品于一2 0 。 2 3 5 接头连接效率检测 1 ) 稀释连接产物( t e s t e r l 1a 1 1 d t e s t e r l 2 ) ，各取l p l 分别加入到2 0 0 l 无菌水中。 2 ) 混合以下试剂于4 个离心管中，充分振荡混匀并瞬时离心。 c o m p o n e m r e s t e r l 一l ( 1 i g a t e dt oa d a p t o r l ) t e s t e r l - 1 ( 1 i g a t e dt oa d a p t o r 2 r ) a c t i n3 ，p r i m e r ( 1 0 耻m ) a