（生物化学与分子生物学专业论文）人参低聚糖对蛋糕品质的影响.pdf

摘要 人参是我国丰富的药用资源，具有多种有效成分，如人参皂甙、人参多肽和人参多 糖等。已有文献报道人参多糖具有提高免疫力、降血糖、抗衰老、抗肿瘤等活性，而人 参低聚糖开发成药物的研究较少，更缺乏在食品应用中的报道。本文拟通过水煮醇沉， 旋转蒸发的方法获得人参寡糖和皂甙的混合物，然后应用大孔树脂分离得到人参寡糖。 将人参寡糖作为添加剂应用于蛋糕中，探索其对蛋糕品质的影响，从而提出合理的添加 量，为开发功能性蛋糕产品奠定基础。 本文以新鲜人参为原料，1 0 0 热水煮提，醇沉获取上清，经大孔树脂过滤得到人 参低聚糖6 r 0 ，得率为1 8 7 。6 r o 总糖含量为7 6 3 ，其中还原糖含量为3 6 3 ，6 r 0 蛋白含量0 4 ，未检测到酸性糖，分子量约为1 0 0 0d a 。 将人参低聚糖g r o 按不同添加量加入到蛋糕中，采用称重法测定其对蛋糕糊膨松性 的影响；采用感官评分法和感官评述法评价人参低聚糖对蛋糕芯部结构和蛋糕口感的影 响；采用单因素方差分析测定不同人参低聚糖添加量对蛋糕保湿性的影响。结果表明在 蛋糕生产中原有配方( 面粉1 0 0 ：鸡蛋1 5 0 ；糖1 2 0 ；水8 ) 的基础上添加人参低聚糖 1 5 ，可以明显改善蛋糕糊的膨松性和蛋糕的芯部结构状态，而且口感更加绵软，甜味 更加柔和，蛋糕保湿性得到显著增强。 关键词：人参；人参低聚糖；蛋糕；保湿性 a b s t r a c t p a n a xg i n s e n gc a m e y e r ( eg i n s e n g ) h a sb e e ng e n e r a l l yu s e da st r a d i t i o n a lm e d i c i n e f o rm a n yy e a r s p g i n s e n gh a sm a n ya c t i v ec o m p o n e n t si n c l u d i n gg i n s e n o s i d e s ，g i n s e n g p e p t i d e sa n dg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e s i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tg i n s e n gp o l y s a c c h a r i d e s h a v e i m m u n o m o d u l a t i n g ，a n t i a g i n g ，h y p o g l y c e m i ca n da n t i t u m o ra c t i v i t i e s u pt on o w , t h e r ea r e s o m ep a p e r so nt h eu s eo fo l i g o s a c c h a r i d e so nm e d i c i n eb u tn e a r l yn or e f e r e n c e sa v a i l a b l eo n f o o d i nt h i sp a p e r , t h eg i n s e n gr o o t sw e r ee x t r a c t e d 谢t 1 1h o tw a t e ra n dt h ep o l y s a c c h a r i d e s w e r ep r e c i p i t a t e dw i t he t h a n o la n dt h es u p e r n a t a n tc o n t a i n i n gg i n s e n o s i d e s a n d o l i g o s a c c h a r i d e sw a so b t a i n e d t h es u p e m a t a n tw e r et h e na p p l i e do n t om a c r o p o r o u sr e s i n a n dt h eo l i g o s a c c h a r i d e sw e r eg o t t h ea i mo ft h i sp a p e rw a st ou s eo l i g o s a c c h a r i d e so n t o c a k e sa sa d d i t i v e sa n di n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fd i f f e r e n ta m o u n t so fo l i g o s a c c h a r i d e so nt h e p r o p e r t i e so fc a k e f r e s hg i n s e n gr o o t sw e r ee x t r a c t e dw i t hh o tw a t e r , a n dt h e nt h ep o l y s a c c h a r i d e sw e r e p r e c i p i t a t e dw i t he t h a n 0 1 t h ee t h a n o li nt h es u p e r n a t a n t sw a se v a p o r a t e dw i t hr o t a r y e v a p o r a t o r sa n dt h er e m a i n i n gm a t e r i a l sw e r ea p p l i e do n t om a c r o p o r o u sr e s i nt o g e tt h e g i n s e n go l i g o s a c c h a r i d e ( g r o ) w i t hay i e l do f 18 7 g r oc o n t a i n e d7 6 3 o ft o t a ls u g a r , i n c l u d i n g3 6 3 r e d u c i n gs u g a r s ，o 4 p r o t e i na n dn ou r o n i ca c i dw e r ed e t e r m i n e d t h e m o l e c u l a rw e i g h to fg r ow a sa b o u t10 0 0d a o l i g o s a c c h a r i d e ( g r o ) w a sa d d e dt oc a k e si nd i f f e r e n ta m o u n t s t h ee f f e c to fa d d i t i o n o fv a r i o u so l i g o s a c c h a r i d e so nt h ef l u t yw a sd e t e r m i n e db yw e i g h tm e t h o d ，t h ec o r es t r u c t u r e a n dt h ef l a v o ro ft h ec a k ew a se v a l u a t e db ys e n s o r ya n ds e n s o r ys c o r er e v i e wa c t ，t h ee f f e c to f t h ea d d i t i o no fo l i g o s a c c h a r i d e so nt h em o i s t u r ew a sd e t e r m i n e db yo n e w a ya n o v a t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef l u t ya n dt h ec o r es t r u c t u r eo ft h ec a k ec o u l db ea l t e r e ds i g n i f i c a n t l y a n dt h ef l a v o rs e e m sm o r em e l t e da n ds o f tb ya d d i t i o no f1 5 o fo l i g o s a c c h a r i d e s i n a d d i t i o n ，t h ec a k em o i s t u r ew a ss i g n i f i c a n t l yc h a n g e d k e yw o r d s ：g i n s e n g ；g i n s e n go l i g o s a c c h a r i d e s ；c a k e ；m o i s t u r e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：缘 指导教师签名： 日期：趁垒2 厶夕 日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 0 4 3 1 8 2 9 6 0 4 1 8 1 3 0 0 5 2 1 1 低聚糖的研究概况 第一章引言 糖是存在于自然界中的一大类具有广谱化学结构和生物功能的有机化合物，主要由 碳、氢、氧三种元素构成，是含有多羟基的醛类或酮类化合物n ，。糖类化合物广泛存在 于细胞质以及细胞外被之中，具有种类繁多的生物活性。作为生命物质的重要组成部分， 它不仅为生命有机体提供了能量来源和碳骨架结构，还参与到细胞的生理过程调节及各 种生命现象中，是自然界中不可缺少的高分子有机化合物。 糖类化合物主要包括：单糖、双糖、寡糖( 低聚糖) 、多糖及糖缀合物。其中单糖 的结构最简单，是组成寡糖和多糖等复杂碳水化合物的基本单位【2 】。而寡糖、多糖和糖 缀合物的结构及组成较复杂，具有多种生理活性，是现在研究的热点领域。 1 1 1 低聚糖的定义 低聚糖又称寡糖，是指由2 - 1 0 个单糖通过糖苷键连接而成的化合物，糖苷键由一 个单糖的苷羟基和另一单糖的某一羟基缩水而成b 3 。低聚糖常与脂类或蛋白质共价结合 形成糖脂或糖蛋白，以糖缀合物的形式存在。通常低聚糖是2 - - 4 个单糖通过糖苷键连 接而成的小聚体，包括功能性低聚糖和普通低聚糖。构成低聚糖的单糖主要是5 碳糖和6 碳糖，如阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖等，这些单糖以直链或分支 结构形成低聚糖比。 1 1 2 低聚糖的分类呻3 根据不同的标准，可以对低聚糖进行不同方式的分类。根据所含单糖种类的不同， 可以将低聚糖分为均寡糖和杂寡糖两种，由一种单糖结合而成的为均寡糖，由两种或两 种以上单糖结合而成的为杂寡糖：根据所具有的不同生物学功能，又可以将低聚糖分为 普通寡糖( 如蔗糖等) 和功能性寡糖( 如水苏糖和异麦芽低聚糖等) 两大类；而在生产 应用上低聚糖也可以分为两类： 一类是被称为“双歧因子 的异麦芽低聚糖。这类糖进入大肠后可以作为双歧杆菌 的增殖因子，有效地促进人体内有益的双歧杆菌生长繁殖，抑制腐败菌生长。长期食用 异麦芽低聚糖具有减缓衰老、促进排便、减轻肝脏负担、防癌、抗癌、抑菌、提高营养 1 ( 特别是铁、锌、钙离子) 吸收率、改善乳制品中乳糖消化性和脂质代谢等功效，对人 体的营养保健作用随低聚糖的含量增加而提高。 另一类是低聚麦芽糖。它易消化、甜度低、具有低渗透特性，能够延长供能时间、 增强肌体耐力、提高抗疲劳能力。人体在经过重体力消耗或进行长时间剧烈运动后很容 易出现体温升高、脱水、血糖下降、能源储备过度消耗、肌肉神经传导受影响和脑功能 紊乱等一系列的生理变化和症状。在食用低聚麦芽糖后，不仅能够减少血乳酸的产生、 保持正常血糖水平，且胰岛素反应平衡。人体试验证明，食用低聚麦芽糖对疲劳恢复具 有非常明显的功效，可以使耐力和能力增加3 0 以上。 1 1 3 低聚糖的生物保健作用 大多数低聚糖都具有很好的生物保健作用，它类似水溶性植物纤维，能降低血液中 甘油三酯和胆固醇的含量并改善血脂代谢m 3 。低聚糖不会使血糖升高，属于非胰岛素依 赖，适合于糖尿病人和高血糖人群食用。由于其难被唾液酶和小肠消化酶水解，所以产 生的热量很少，转化的脂肪也很少h ，。 低聚糖可以活化肠道内有益的双歧杆菌，促进其生长繁殖拍州。双歧杆菌是存在于人 体肠道内的有益菌，随人年龄的增大菌数逐渐减少，肠道内双歧杆菌的数量可以作为衡 量人体健康情况的指标之一。随着医学科技的迅猛发展，广谱和强力的抗生素被广泛应 用于各种疾病的治疗。在杀灭有害菌的同时，大量的抗生素也使人体肠道内正常的菌群 平衡受到不同程度的破坏，因而有目的地恢复菌群、增加肠道内有益菌数量就显得十分 必要。摄取双歧杆菌制品群是最简便可靠的方法，但这类产品从生产到销售都受到许多 条件的制约，不易实施。通过摄入功能性低聚糖来促进肠道内双歧杆菌自然增殖则更具 有现实的操作性，它改善人体内微生态环境，有利于双歧杆菌和其它有益菌的增殖。功 能性低聚糖经过代谢产生的有机酸降低了肠内p h 值，能够抑制肠内沙门氏菌和腐败菌 的生长，调节胃肠功能，并增加维生素的合成，从而提高人体免疫能力。 低聚糖能够有效抑制腐败产物在肠内的生成，人体肠道内的腐败细菌( 如大肠杆菌 等) 会将氨基酸转化成氨和吲哚等腐败产物，对人体产生损害。通过每日食用1 0 克大 豆低聚糖粉不仅能明显减少腐败产物的生成，还可以抑制1 3 一葡萄甙酸酶和偶氮还原 酶，它们与肠内生成致癌物质有关。人体在代谢过程中会产生大量难以消化的低聚糖， 大肠中的低聚糖积累过多，会引起腹泻、腹胀和便秘等症状。摄入功能性低聚糖后，肠 道内增殖的双歧杆菌通过发酵将低聚糖分解转化为大量的短链脂肪酸，它们能刺激肠道 蠕动、提高粪便湿润度并保持一定的渗透性，从而对肠道内环境进行双向调节以防止腹 泻和便秘的发生。 低聚糖不会引起龋齿，利于维护口腔卫生啼3 。各种口腔微生物特别是突变链球菌的 侵蚀是龋齿发生的原因，而功能性低聚糖不是这些口腔微生物的合适作用物，不利于其 生长，不会引起牙齿龋变。 除此以外，低聚糖还有许多与生物保健相关的功能和活性有待开发n 町。如低聚糖不 2 但被发现存在于维生素、生长素、抗体、激素和各种生物大分子中，也存在于细胞膜中， 寡糖链在细胞膜的表面向外凸出，使低聚糖覆盖整个细胞外层。这些低聚糖在细胞的识 别过程中具有重要的作用，如低聚糖决定受体与配体的识别及酶与底物的识别等。通过 对低聚糖在这些生理过程及反应中作用机制的研究，其在医疗保健方面所具有的更多功 能也会被不断的开发出来。 1 1 4 低聚糖的应用n _ 町 低聚糖的获得方法大体上可分为以下4 种：从天然原料中分离提取、酶水解法、酸 碱转化法和微波固相合成法。作为一种具有广泛应用前景和适用范围的新产品，其近年 来在国际上非常流行，美国、欧洲以及日本等地都已形成了规模化生产。低聚糖具有良 好的保健功能，在谷物食品、乳酸菌饮料、双歧杆菌酸奶和保健食品尤其是婴幼儿和老 年人食品中，作为一种食物配料得到广泛的应用。在保健食品生产中，可单独以低聚糖 为原料制作口服液和胶囊，并直接服用来提高免疫、调节血脂、调节肠道菌群、润肠通 便等。 目前已经开发出了一系列的功能性低聚糖，如：大豆低聚糖、海藻糖、龙胆糖、低 聚果糖等，广泛应用于保健品、食品及农牧业生产中。此外，研究人员还根据低聚糖在 生物体内的生理功能对其在生物体内的医学与生物学应用进行研究，如开发无毒无害 的、能够提高植物抗病能力的生物农药。随着生物技术的不断发展，对低聚糖结构与功 能的研究也不断加深，其在生物体内的各项重要生物功能将被人们逐步的发现，低聚糖 产品的开发和应用将拥有更加广阔的市场空间。我国从9 0 年代中期开始对其进行开发 和应用研究，最近几年取得了飞速的发展。 1 2 人参的研究概况n 7 。2 功 人参又名地精、人衔、神草，五加科人参属多年生草本植物。它作为中国传统的名 贵中药，一直被国人所推崇，具有止咳平喘、活血化瘀、滋补养气和延年益寿等功效。 人参的化学组成非常复杂，含有皂苷类、多肽类和糖类( 总糖含量为4 - - 6 ) 等多种活 性成分，糖类又可分为单糖、多糖和低聚糖。在各种主要活性成分中，对人参皂苷和人 参多糖的研究较多，人参低聚糖的研究报道比较少见。研究表明：人参皂甙能够提高人 的脑力和体力、提升思维能力、抵抗疲劳、保护心脏、改善心肌代谢、降低血糖及延缓 衰老；人参多糖则能够有效提高肌体免疫力、增强肌体对有害刺激的防御能力并具有较 强的抗肿瘤能力。 近年来虽然对人参多糖进行了大量的研究，包括提取、纯化、分析和活性研究等， 但对人参低聚糖的提取、分析及应用研究较少。而人参作为传统名贵中药，其所含低聚 糖具有多种多样的生物学功能，具有良好的应用前景。 我国拥有丰富的人参资源，长白山地区人参的人工种植产量非常可观，人参低聚糖 生产原料供应充足。如果用提取人参皂苷后的残渣作为低聚糖的提取原料可进一步降低 其生产成本，具有极高的实用价值和市场潜力。随着癌症等恶性疾病的不断泛滥和年轻 化，使人们治病、防病的愿望和需求大幅度增长，人参低聚糖能够提高人体免疫力，拥 有极高的市场需求和发展前景。 1 3 蛋糕概述 在现代生活中，蛋糕已经成为了人们生活中不可缺少的一部分，人们不仅把它当作 一种日常的点心或食物，还赋予了它不同寻常的意义。在生活中的各种快乐时光，如生 日、婚礼、庆典等时刻，都不能缺少它的陪伴。 1 3 1 蛋糕的概念2 6 。2 7 3 蛋糕是常见面食的一种，味道通常是甜的，典型的制作方法是烤制。其以面粉、甜 味剂( 通常是蔗糖) 和鸡蛋( 如是素食主义者也可用面筋和淀粉代替) 为主要原料，辅以各 种配料，如起酥油( 一般是牛油或人造牛油，制作低脂肪蛋糕也可以浓缩果汁代替) 、 液体( 牛奶、水或果汁，在实际生产中也可不加) 、香精和发酵剂( 如酵母或发酵粉) 等烤制而成。 蛋糕是在加入面粉、食糖、鸡蛋及一些配料后，经搅打充气，利用气蒸或烘烤的方 式使组织松发而成的。其营养丰富，富含脂肪、蛋白质、碳水化合物和维生素等，并含 有钙、磷、钾、钠、硒、镁等多种矿物质，食用方便，是人们日常生活中最常见的糕点 之一。新出炉的蛋糕香味浓郁、富有弹性、质地柔软，其组织软似海绵、细腻多孔、易 于消化、口味极佳。 1 3 2 蛋糕的分类8 3 蛋糕的种类很多，归纳起来可分为三大类： 一、乳沫类 乳沫类蛋糕主要有海绵类和蛋白类两种类型：海绵类蛋糕，在以面粉、砂糖和全蛋 为主要原料的基础上，又添加了蛋糕油和液体油，具有结构绵软、富有弹性、口感清香、 油脂轻的特点；蛋白类蛋糕又称天使蛋糕，主要原料是面粉、砂糖和蛋白，具有洁白、 口感稍粗糙、味道一般、蛋腥味脓，但外观漂亮的特点。 二、戚风类 随着台资烘焙企业在九十年代初进入大陆市场，其制作的戚风蛋糕也随之逐渐流行 起来。 4 戚风蛋糕至少已经拥有三、四十年的历史，其称谓戚风，来源于英文c h i f f o n 译音， 该单词原是法文，是拌制的馅料象打发的蛋白那样柔软的意思。戚风蛋糕的打发正是对 蛋黄和蛋白分别进行搅拌，先对蛋白部分进行搅拌，使其蓬松、柔软，再拌入蛋黄面糊， 这类蛋糕因此而得名。由于搅拌充分，它的面糊更加蓬松稀软，具有蛋香、油香浓郁， 结构绵软，富有弹性，有回味，组织细密紧韧等特点。 三、面糊类 属于重油蛋糕，主要原料是面粉、食糖、鸡蛋和黄油，是在搅拌过程中利用固体油 脂拌入空气，在烤炉内使面糊受热膨胀而成。它的面糊呈现出浓稠、膨松的状态，具有 结构较为紧密，有一定的弹性，油香浓郁，有回味的特点。其又被称为奶油蛋糕，因为 油的用量很高，与面粉的比例达到了1 ：1 。 1 3 3 蛋糕加工的现状啪3 现在市场上的蛋糕品种很多，但大多数产品的保质期很短。多数的低档蛋糕在出炉 一两天后就会因为失水而变得脆硬，口感粗糙，品质下降极为明显。导致这一结果的 因素很多，如蛋糕配方、搅打过程等，但蛋糕的保湿性差是其保质期短的最主要因素。 1 3 4 蛋糕加工的发展趋势陋3 1 3 随着生活水平的不断提高，蛋糕从少见的贵重糕点，变成了人们餐桌上的常见食品 之一，随之而来的是人们对蛋糕提出了更高的要求。从目前蛋糕制作来说，已经形成了 一种中式蛋糕的加工方法与品种和西式蛋糕的加工方法与品种的融合，中、西式蛋糕已 经很难区分。通过多年的实践，我国中式蛋糕的加工方法中不断的加入了西式蛋糕的加 工技术，使我国蛋糕的加工水平得到了显著的提高，西式蛋糕加工技术对中式蛋糕发展 起到了良好的推动和提高作用。 未来的蛋糕产业应该在进一步提高加工水平，改善蛋糕品种、品质的基础上，脱离 加工工艺的局限，对蛋糕的功能进行开发。特别是在保健功能上，如可作为糖尿病人食 品的无糖蛋糕等。其次是延长保质期，受到保质期短的限制，目前蛋糕基本上属于作坊 式的地产地销，限制了企业发展，不利于蛋糕企业做大做强。 1 4 研究的意义与目的 改革开放以来，随着我国经济发展水平的不断提高，人们的生活水平也呈现出快速 上升的趋势，食品种类日益丰富，饮食也日趋精细。但是经济的高速发展也导致了生活 节奏的加快，随之而来的是生活压力的大幅增加以及运动和户外活动时间的显著减少。 处于亚健康状态的人群数量不断增加，各种疾病特别是富贵病( 如心血管病、便秘、肠 道病、糖尿病及肥胖等) 和癌症越来越普遍，且有年轻化的趋势，病前预防甚于病后施 治的道理深入人心。中国自古以来就有食补的传统，通过食物来提高身体的健康水平具 有悠久的历史，保健型的各种功能食品为人们的食补提供了一条良好的途径。因此人们 对食品的消费观念也发生了变化，不仅仅局限于要求食品的口味和品种，而且越来越重 视食品的功能性，渴望通过食品的各种保健功能帮助自己提高健康水平，延长寿命。从 2 0 世纪9 0 年代开始，研究植物低聚糖的热潮在全世界范围内掀起，各种植物低聚糖因 其突出的保健功能越来越受到人们的重视。不同领域的科学家，如与食品法规和营养教 育相关的科学决策者、营养学家、生物化学家以及医生都对其进行了大量的研究。以往 不被人们重视的植物低聚糖特别是药用植物低聚糖，成为像氨基酸、维生素一样被人们 所谈论的重要话题。随着人们对植物低聚糖增进人体健康各种功能的逐渐认识，一些低 聚糖类的保健食品越来越受到青睐。在现代的食品工业生产中，以植物低聚糖为原料， 经过一系列的加工和包装，既能生产出可以直接口服的各种食疗型保健食品，又可作为 品质改良剂等食品添加剂添加到糕点、面包等焙烤食品中。人参低聚糖作为一种药用植 物中提取出的低聚糖，具有提高人体非特异性免疫力、降血糖、调节胃肠菌群等一系列 医疗保健方面的功能，是亚健康人群、癌症患者、糖尿病患者等适用的保健食品的一种 理想原料。其经毒理实验证实无毒副作用，并且具有改变食品性状的加工特性，作为保 健食品原料及食品添加剂拥有广阔的开发和应用前景。 目前国内外对人参低聚糖在传统食品中的应用研究很少，本研究拟从新鲜人参中提 取人参低聚糖，再把所提取的人参低聚糖应用于蛋糕生产。通过改变蛋糕的配方，在蛋 糕生产中添加人参低聚糖，探索人参低聚糖对蛋糕保湿性等品质的影响，从而提出合理 的添加量，为开发人参低聚糖功能性蛋糕奠定基础。 6 第二章材料与方法 2 1 实验材料、试剂与仪器设备 2 1 1 材料 人参： 鸡蛋： 面粉： 白砂糖： 2 1 2 试剂 四年生人参，采集于吉林省通化地区； 市售本地产新鲜鸡蛋； 市售低筋面粉； 市售优质白砂糖。 结晶牛血清白蛋白 8 5 磷酸 考马斯亮蓝6 - 2 5 0 m - h y d r o x y b i p h e n y l s u l f a m i ca c i d 乙醚 苯酚 无水乙醇 9 5 乙醇 氢氧化钠 氢氧化钾 氯化钠 3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 浓硫酸 7 宝泰克生物科技公司 长春宏达精细化工厂 北京鼎国生物技术发展中心 s i g m ac o 国药集团 天津天泰精细化学品有限公司 天津天泰精细化学品有限公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 2 1 3 仪器 r e - 5 2 a a 旋转蒸发仪 t d l - 5 a 低速离心机 d g s y - i h 电热恒温水浴锅 冰箱 b a t 电动磁力搅拌器 d t - 5 0 0 电子天平 d 一1 0 1 型非极性大孔树脂( 净品级) 大孔树脂层析柱( 巾6 x 6 0 a m ) 循环水式真空泵 酒精计 真空干燥箱 7 2 3 可见分光光度计 2 2 实验方法 2 2 1 人参水提物醇沉上清的制备口州3 上海亚荣生化仪器厂 上海菲恰尔分析仪器有限公司 北京市意成科技开发公司 河南新飞电器有限公司 金坛国华仪器厂 江苏常熟双杰测试仪器厂 天津海光试剂有限公司 长春化玻 郑州长城科工贸有限公司 河南市黎民居玻璃仪表厂 上海一恒科学仪器有限公司 山东高密彩虹分析仪器有限公司 称取干燥人参5 0 0 9 ，蒸馏水快速冲洗三遍，浸泡过夜。8 l 蒸馏水不断搅拌下沸水煮 提4 小时，重复2 次，4 层纱布过滤，合并滤液。6 0 。c 水浴，将滤液浓缩至7 0 0 m l 。加入浓 度为9 5 的乙醇，边加边充分搅拌，至醇浓度达到8 0 ( 用酒精计测定溶液醇浓度) ，停 止加醇，容器封口，静置过夜。过夜后，4 5 0 0 r m i n 离, 心8 m i n ，分别收集沉淀和上清。 沉淀进行常规干燥，备用，获得人参多糖。上清旋转蒸发蒸除乙醇，得人参上清。上清 液浓缩，真空冷冻干燥，获得人参寡糖和皂甙的混合物。 2 2 2 寡糖的分离3 蝌3 2 2 2 1 分离原理 大孔吸附树脂是具有立体结构的多孔性聚合物，由苯乙烯型共聚体和添加剂如致孔 剂、交联剂和分散剂等经聚合反应制备而成。其比表面积较大，利用此巨大的比表面积， 根据相似相吸的原理，大孔吸附树脂依靠与被吸附分子间的范德华力对物质进行物理吸 附。在溶液中，一般极性化合物易被极性树脂吸附，非极性化合物易被非极性树脂吸附。 8 物质在溶剂中的溶解度越小，树脂对此物质的吸附力就越大，反之就越小。非极性大孔 吸附树脂与分子量小、极性小的化合物之间的吸附作用强，极性大孔吸附树脂与分子量 大、极性大的化合物之间吸附作用强。 d - i o 型非极性大孔树脂属于广谱性树脂，净品级，具有热稳定好、机械强度高、 交换速度快、常温下耐酸碱、抗污染能力强、在水溶液和非水溶液中都能使用、能够反 复利用的特点，适用于萜类、黄酮、皂甙和生物碱等的纯化。本实验就是利用非极性大 孔树脂在水溶液中对皂甙进行吸附，然后先用水将寡糖洗脱，再利用梯度乙醇对皂甙进 行解析，从而达到分离寡糖和皂甙的目的。 2 2 2 2 实验操作瑚。： 称取3 0 0g 大孔树脂( d 一1 0 1 型) ，用2 0 的乙醇2l 浸泡2 h ，然后湿法装入6 6 0 a m 玻璃层析柱中，用蒸馏水淋洗至无醇味。 首先称取适量人参上清冻干样品5 0 0m g 溶于5 0m l 蒸馏水中，充分溶解。然后用长 滴管吸取溶液，沿柱壁绕圈上样，上样完毕，用少量的蒸馏水冲洗柱壁，直至无样品粘 附。最后用保鲜膜封住柱口，静置过夜，使树脂尽量将皂甙完全吸附。 先用蒸馏水进行洗脱，每瓶收集1 0 0m l ，同时进行薄层层析法( t l c ) 检测晦3 ，直到 点板不显色为止，即为无糖类出现。如要提取总皂甙，可以梯度乙醇对树脂上吸附的皂 甙进行洗脱，制备人参总皂甙。 采用t l c 法对洗脱样品进行鉴定的方法：用毛细管分别沾取葡萄糖等标准糖对照品 和收集到的洗脱液在硅胶薄板上进行点样，边点边吹干固定。点样完成后，将薄板置于 加入了正丁醇：甲酸：水= 4 ：6 ：l ( v v ) 展层剂的层析缸中，斜上行展开，当展层剂 上行至薄板前沿时取出，吹干。浸于盛有以5 硫酸乙醇( v v ) 为显色剂的广口瓶中约5 秒钟，取出，吹干，1 0 0 。c 烘箱中加热显色。将对照品显色点与样品点对比，直至样品点 无显色，则证明洗脱完毕，即再无寡糖洗脱。 2 2 3 总寡糖6 r o 的获取 将大孔树脂分离得到的粗寡糖水溶液水浴浓缩至适当体积，于一8 0 c 的无水乙醇中 进行预冻，- 5 0 c 真空冷冻干燥，即可得到总寡糖g r o 的干品，将其密封保存，放入真空 干燥器备用。 2 2 4g r o 理化性质的研究 2 2 4 1g r o 总糖含量的测定 采用苯酚一硫酸法b 蝴进行糖含量测定，其原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的 糠醛或羟甲基糠醛，再与苯酚缩合成一种橙红色化合物。在2 0 0n g 1 0 0m g 范围内 其颜色深浅与糖的含量成正比，且在4 9 0r l i i l 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此 波长下测定。苯酚法可用于戊糖、己糖、甲基化的糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏 度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定1 6 0m i n 以上。 9 6 0 苯酚储备液：称取6 0g 苯酚，溶解于4 0 札蒸馏水中，4 。c 避光保存，用时加 蒸馏水稀释至6 。 0 1g l 糖标准溶液：准确称取葡萄糖0 0 1 0 0g ，溶于5i i l l 蒸馏水中，定容于1 0 0 m l 容量瓶。 以葡萄糖为标准单糖绘制标准曲线：移液管分别量取0 1g l 标准溶液om 1 、0 1 5 m l 、0 3 0m 1 、0 4 5m 1 、0 6 0m 1 、o 7 5m 1 、o 9 0m 1 ，依次补加蒸馏水至lm 1 。以蒸 馏水作对照，分别向其中依次加入o 5m 16 的苯酚，2 5m l 浓硫酸，充分振荡摇匀后， 冷至室温。4 9 0n m 处测吸光值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制糖含量 的标准曲线。 样品中糖含量测定：取l o m g 的g r o 溶于l o o m l 蒸馏水中，配制成浓度为0 1 m g m l 的样品溶液。分别取3 个试管各加入l m l 的样品溶液，按绘制标准曲线时的方法向各试 管中依次加入苯酚和硫酸，振荡，静置3 0m i n 后测定4 9 0 n m 波长处的吸光值。取3 次 测定结果的平均值，对照标准曲线确定粗寡糖中的糖含量。 2 2 4 2g r o u p 糖醛酸含量的测定h 们 采用间羟基联苯法测定糖醛酸的含量阳3 ，其原理是：糖醛酸与浓硫酸在1 0 0 条件 下加热后，可与间羟基联苯发生颜色反应。在o 5 1 5 | lg 范围内其颜色深浅与糖醛 酸的含量成正比，且在5 2 5r i m 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 此法简单，灵敏度高，实验时基本不受中性糖存在的影响。 0 5 氢氧化钠( w v ) ：称取o 1g 固体氢氧化钠，溶于2 0m l 蒸馏水中。 间羟基联苯试剂：称取6 0m g 间羟基联苯，溶于8m l0 5 氢氧化钠水溶液中，并 定容至2 0m l ，4 避光保存。 饱和氢氧化钾：称取1 0g 氢氧化钾，加入4m l 蒸馏水，充分搅拌溶解，上部清液 即为饱和氢氧化钾。 氨基磺酸试剂：称取3 9g 氨基磺酸，加蒸馏水5l i l l ，滴加饱和氢氧化钾水溶液， 充分振荡至氨基磺酸完全溶解，冷却至室温。再继续滴加饱和氢氧化钾水溶液至p h2 5 ， 补加蒸馏水至体积为1 0m l ，室温保存备用。 0 1g ld 一半乳糖醛酸标准溶液：称取l om gd 一半乳糖醛酸，溶解于蒸馏水中，并 定容到1 0 0m l 。 标准曲线的制作：用移液器分别量取o 1g ld 一半乳糖醛酸标准溶液0m 1 、o 0 5 m 1 、0 1m 1 、0 2m 1 、0 3m 1 、0 4m l ，依次补加蒸馏水至o 4m 1 。以蒸馏水作对照， 分别向其中加入0 0 4m 1 氨基磺酸试剂，2 4m l 浓硫酸，充分振荡摇匀后，沸水浴2 0m i n ， 迅速冷至室温后，加入4 0ul 间羟基联苯试剂，摇匀后1 5m i n 至4 5m i n 内，于5 2 5n m 处 测其吸光值。以糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，作测定糖醛酸含量的标准曲线。 样品糖醛酸的测定：将样品配制成浓度为0 1 m g m l 的溶液，取0 4 m l 样品溶液加入 试管，不加蒸馏水，其余操作均与制作标准曲线时相同，做3 个平行。测定5 2 5 n m 处吸光 值后，取测定平均值，根据该数值在标准曲线上计算样品中相应的糖醛酸含量( 计算时 注意此值为0 4 m 样品溶液中所含的糖醛酸量) ，根据样品浓度换算成糖醛酸含量。 1 0 2 2 - 4 3g r o 中蛋白含量的测定h q b r a d f o r d 法( 考马斯亮蓝法) 测定蛋白质含量n 妇是利用蛋白质一染料结合的原理， 定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝g - 2 5 0 在游离状态下呈红色， 最大光吸收在4 8 8 n m ，此染料与蛋白质通过范德华力结合后变为蓝色，最大光吸收由 4 8 8 n m 变成5 9 5 n m 。通过测定5 9 5 n m 处光吸收的增加量可知与其结合的蛋白质的量，因 此可用于蛋白质含量的测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 m i n 左右的时间达到平衡， 反应十分迅速，其结合物在1h 内保持稳定。 考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝2 0m g ，溶解于1 0f i l l 的9 5 乙醇中，加入2 0m l 的8 5 磷酸，用蒸馏水稀释至2 0 0m l ，滤纸过滤备用。最终试剂中含0 0 1 考马斯亮蓝 6 - 2 5 0 ( w v ) ，4 。7 乙醇( w v ) 。 蛋白质标准溶液：储备液为5m g m l 牛血清白蛋白，用时加水稀释至5 0ug m l 。 标准曲线的制作：移液管分别量取5 0ug m e 蛋白质标准溶液o m l 、0 2m l 、0 4m l 、 0 6m 1 、0 8 m 1 、1 0m l ，补加蒸馏水至1 0m 1 。然后分别加入4m 1 考马斯亮蓝试液， 迅速混匀，5m i n 后在5 9 5n m 处测吸光值。以蛋白质量为横坐标，吸光值为纵坐标，制 作标准曲线。 多糖样品的蛋白含量测定：准确称取适量多糖样品，配成一定浓度的溶液，取样品 溶液1 om l 进行测定，操作与标准曲线的制作方法相同。取样品的吸光值对照标准曲线 即可得出多糖样品的蛋白质含量。 2 2 4 4g r o 中还原糖含量的测定h 2 1 在碱性条件下，还原糖与3 ，5 一二硝基水杨酸试剂发生反应，其中3 ，5 一二硝基水 杨酸被还原为棕红色的氨基化合物而还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。还原糖的量与 棕红色产物的色值在一定范围内成线性关系。运用分光光度计，在5 1 0 h m 处测定吸光值， 与标准曲线作比对，求出还原糖的含量。 3 ，5 - - - 硝基水杨酸的配制：取3 ，5 一二硝基水杨酸5 9 ，加入2 m o l l 氢氧化钠溶液 l o o m l ，将3 ，5 一二硝基水杨酸溶解，然后加入酒石酸钾钠1 5 0 9 。待其完全溶解，用去 离子水稀释至1 0 0 0 m l ，棕色瓶保存。 制作葡萄糖标准曲线：向各试管中分别加入o m l 、0 2 m 1 、0 4 m l 、0 6 m i 、0 8 m 1 、 1 o m l 的0 1 m g m l 标准葡萄糖溶液，补加蒸馏水至体积为1 5 m l ，再分别向每个试管中 加入d n s 溶液l m l 。利用流水对试管进行冷却，冷却后，向试管中加入蒸馏水2 5 m l ， 混合均匀后，5 1 0 h m 处测定吸光值。每组做3 个平行，根据测定吸光值的平均值作出标 准曲线。 样品还原糖含量的测定：将样品配制成浓度为0 1 m g m l 的溶液，取3 个试管各加 入1 o m l 样品溶液，按上述绘制标准曲线的方法，对样品进行还原糖含量的检测。 2 2 56 r o 分子量的测定 2 2 5 1 色谱条件m 叫习 填充材料：s e p h a d e xg - 7 5 葡聚糖凝胶( s i g m a ， f i n e ) 色谱柱型号：2 c r u x1 0 0c l n 装柱速率为：0 1 7 m l m i n 洗脱速率为：0 1 5 m l m i n 收集时间：每管2 0 m i n 收集体积：约3 o m l 管 洗脱液：0 1 5m o l ln a c l 溶液 2 2 5 2s e p h a d e xg - 7 5 层析柱的标定 s e p h a d e xg 一7 5 柱的有效分离范围为分子量1 0 0 0 - 5 0 0 0 0 之间。 用已知分子量为2 0 0 万左右的蓝葡聚糖、分子量为1 0 0 0 0 的糖和葡萄糖标准品对该分 析柱进行标定，确定分离上限即外水体积v 。，和分离下限即总体积v 。以测定每管溶液 4 9 0 n m 处吸光值的方法，检测3 种糖的洗脱体积，确定有效分离范围。 2 2 5 3 样品的洗脱 将l o m gg r o 溶于l m l 蒸馏水中，旋涡震荡使完全溶解，1 0 0 0 0 r m i n 离，心5 m i n 。离心后 取其上层清液进行上样，0 15m o l l 的n a c i 溶液连续洗脱，并用自动部分收集器对洗 脱液进行收集。收集完成后，在凡。处将各管洗脱液进行苯酚一硫酸反应，检测其中的糖 含量分布。以洗脱体积为横坐标，4 9 0 n m 处光吸收值为纵坐标绘制洗脱曲线。 2 2 6 人参低聚糖蛋糕的制作 2 2 6 1 蛋糕生产的工艺流程h 6 1 打浆一调糊一入模一烘烤一冷却一成品 2 2 6 2 人参低聚糖蛋糕的基本配方h 6 3 面粉1 0 0 ：鸡蛋1 5 0 ：糖1 2 0 ：水8 ： 人参低聚糖按0 5 、1 0 、1 5 三个水平添加。 2 2 6 3 蛋糕生产的操作要点h 纠明 打浆：将鸡蛋、白糖、水和一定量的人参低聚糖加入搅拌机高速打发，使其体积 增大到原来的3 倍左右，蛋液呈乳白色蓬松泡沫状。以2 5 0 9 鸡蛋进行试验，确定打发 时间为5 m i n ，为进行观察比较，实验中所有打发时间均设定为5 m i n 。 调糊：将面粉过筛，均匀加入到搅拌机内已打发的蛋液中，慢速搅拌i m i n ，使其 与蛋液混合均匀，取部分蛋糕糊测定其比重，剩余蛋糕糊入模。 入模：调糊后将其浇注入圆形烤模盘，浇模前先将植物油均匀涂抹到烤模内壁， 浇模量约为烤模体积的2 3 。 烘烤：浇模后立即进行烘烤，在炉温1 8 0 条件下烘烤2 0m i n 。 成品冷却至室温，放置观察，测定品质及保湿性。 2 2 6 4 蛋糕保湿性测定方法：h 钔 将制成的蛋糕贮存于阴凉处，在完全相同的条件下室温自然放置5 天，之后用称重 1 2 法测出蛋糕失水率。 蛋糕失水率= ( 贮存前蛋糕重量一贮存后蛋糕重量) 贮存前蛋糕重量1 0 0 2 2 6 5 蛋糕感官质量评定方法： 采用2 0 分制对蛋糕的芯部结构进行评分并采用2 5 分制对蛋糕的口感进行评分 唧3 ，请1 0 位同学进行品尝，根据评分标准各自打分后汇总计算平均值。 表1 蛋糕芯部结构评分标准 指标 孔泡细密( 巾o 3 o 5 r a m ) 、均匀，孔壁薄 孔泡细密( 由0 3 o 5 m m ) 、均匀，孔壁稍厚 孔泡基本细密、略有不均，孔壁稍厚 孔泡稍粗( 巾o 6 0 8r a m ) 、均匀，孔壁稍厚 孔泡粗细和不均匀较明显，孔壁较厚，或孔泡很粗( 中1 0 咖左右) ， 略有不均匀，孔壁较厚，或较致密 孔泡粗细不均匀或致密，孔壁厚 得分 19 20 l7 l8 15 16 13 15 1o 13 5 9 表2 蛋糕口感评分标准 指标 绵软、细腻 绵软、略有坚实或粗糙感 尚绵软但略有坚韧感 绵软性稍差，坚实、坚韧，粗糙感稍较明显或柔软而略有松散发干感，或有粘牙感 绵软性差，有明显坚实、坚韧、或粗糙感，或柔软而松散发干感较明显、 柔软但很松散发干 得分 2 4 2 5 2 2 2 3 1 9 2 1 1 5 1 9 1 0 1 4 5 9 1 3 第三章结果 3 1 人参水提物8 0 醇沉上清中寡糖的分离 表3g r o 的提取 根据表3 数据可知，5 0 0g 干燥人参根经热水煮提，8 0 乙醇沉淀，离心得醇沉上清， 上清旋转蒸发除去乙醇后，得到寡糖和皂甙的混合物1 2 6 9g ( 收率y - , j 2 5 4 ) 。经大孔 树脂对皂甙和寡糖进行分离，并冷冻干燥后，得到寡糖g r o 约9 3 6 9 ，收率为1 8 7 。g r o 经冷冻干燥的的冻干品为黄白色蓬松粉末，味微甜带酸，极易吸水。 3 2g r o 理化性质的研究 3 2 1g r o 总糖含量的测定： 表。4 葡萄糖标准溶液4 9 0 n t o 吸光值 根据表4 数据，以糖浓度为横坐标，舡帅为纵坐标绘制标准曲线( 图1 ) ，求得回归 方程为：y = 1 5 1 6 2 x - 0 0 0 5 3 r 2 = 0 9 9 7 9 1 4 1 4 1 2 1 0 8 索 0 6 0 4 o 2 0 02 04 06 08 01 0 0 浓度( u g m 1 ) 图1 糖含量标准曲线 g r o 在4 9