（高分子化学与物理专业论文）红外和拉曼光谱对再生桑蚕丝素蛋白构象转变的研究.pdf

摘要 硕士学位论文摘要 红外和拉曼光谱对再生桑蚕丝素蛋白构象转变的研究 硕士生：周文 系( 所) ：高分子科学系 学号：0 4 2 0 4 4 0 1 8 专业：高分子化学与物理 指导教师：陈新副教授 本论文主要通过红外和拉曼光谱表征了不同因素对丝蛋白构象转变的作用 首先考察了f e 和m n 两种金属元素在丝腺体各个部分以及蚕茧丝中的含量，并 着重研究了金属离子f e ( i i i ) 和i n ( i d 对再生桑蚕丝蛋白浓溶液构象转变的影响； 另一方面，研究了多元醇诱导再生桑蚕丝蛋白膜以及再生桑蚕丝蛋白溶液构象转 变的动力学。同时在上述研究的基础上分析了f e ( i i d 和多元醇诱导桑蚕丝蛋白构 象由无规线团和或螺旋结构转变为b 折叠结构的机理，希望通过对这些诱导丝 蛋白构象转变因素的研究指导再生丝蛋白的人工纺丝，优化纺丝条件从而获得与 天然蚕丝性能相媲美甚至更好的再生丝纤维，同时进一步完善桑蚕吐丝机理的研 究。 本论文首先采用电感耦合等离子体质谱( i c p - m s ) 和原子吸收光谱( a a s ) 两 种元素分析技术，考察了桑蚕体内丝腺体和蚕茧丝中金属元素f e 、m n 的含量， 然后根据元素分析结果通过拉曼光谱研究了f e ( i i i ) 和i ( i d 对桑蚕丝蛋白构 象转变的作用。研究结果表明：f e 在丝纤维中的含量大于其在丝腺体中的含量， 而m n 则相反：f e 和大多数其他金属元素( c u 、z n 等) 一样，从丝腺体的后部到 前部( 靠近吐丝口) 其含量不断增加；m n 的含量变化则没有规律性，在丝腺体的 中部含量最低。采用拉曼光谱对金属离子影响下再生丝蛋白溶液的构象进行研究 发现：f e ( i i i ) 能够诱导丝蛋白的构象由无规线团和或螺旋向b 折叠转变，但是 m n ( 1 i ) 对丝蛋白构象没有明显的影响。f e ( i i i ) 通过与丝蛋白上的酪氨酸残基发生 络合，从而诱导丝蛋白发生向6 折叠的构象转变。首先少量的f e ( 1 1 1 ) 先与丝蛋白 中1 1 个y v a h ( n ) g g y s 和9 个g y e y a w s s 基序中的酪氨酸、组氨酸( 或天门冬 酰胺) 、色氨酸和丝氨酸等氨基酸残基发生络合作用，使原先在溶液中无序伸展 的丝蛋白分子链转向、发生一定程度的折叠，从而拉近分子链中包含。结晶区” 基序的链段之间的距离，为b 哳叠晶体的成核作用做准备。由于桑蚕丝蛋白中酪 氨酸残基的含量高达5 3 ，因此当f e ( i m 含量不断增加时，不仅以上基序中的 履算大学 硕士论文作者：周文 摘要 酪氨酸残基被络合，大量存在于g x “结晶区”基序中的酪氨酸残基也被络合， 因此出现明显的显色反应井在拉曼光谱中出现强烈的指纹识别峰。在这种络合 中，f e ( u i ) 将在包含“结晶区”基序的链段之间通过t y r - f e ( i i i f t y r 起到桥梁的 作用，进步拉近这些链段之间的距离，从而诱导丝蛋白分子链发生由无规线团 和或螺旋向b 折叠的构象转变。m n ( i i ) 对丝蛋白的构象几乎没有影响，m n 在桑 蚕吐丝过程中可能不像其他金属元素一样直接参与蚕丝的成纤过程，而只是参与 桑蚕的其他生理活动。 本论文另一方面的研究是通过时间分辨红外光谱研究了再生桑蚕丝蛋白膜 及蛋白溶液在多元醇( 乙二醇、丙二醇、丁二醇，丙三醇) 的作用下其构象的转 变情况。研究结果表明：无论是再生丝蛋白膜还是再生丝蛋白溶液在定浓度范 围内多元醇的处理下均能发生由无规线团和或螺旋向b 折叠的构象转变，通过 分析其动力学曲线发现多元醇诱导丝蛋白膜及丝蛋白溶液构象转变可分为三个 阶段。首先是b 折叠结构的成核过程，这个过程所需时间可长可短，主要由多元 醇的浓度和种类所决定，多元醇浓度越高，成核过程所需时间越短；同一浓度条 件下，不同种类的多元醇其成核时间由长至短依次为：丙三醇、乙二醇、丁二醇、 丙二醇。其原因可能由于多元醇分子本身的大小及分子的立体构型的共同作用。 其次是b 哳叠结构的快速生长过程，这个过程一般在5m i n 内完成，且与多元醇 的浓度及种类关系不大；最后是一个1 3 折叠结构的缓慢完善过程，这个过程主要 是丝蛋白分子通过链段的进一步调整而获得更加有序排列的b 哳叠结构 关键词：丝素蛋白，构象转变，红外光谱，拉曼光谱 棋算戈学 硬士论文 “ 作者：周文 a b s 订a e t a b s t r a c t0 fm s ，t h e s i s c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o ns t u d i e so fr e g e n e r a t e db o m b y xm o r i s i l kf i b r o i nw i t hi n f r a r e da n dr a m a ns p e c t r o s c o p y m s c a n d i d a m ：w e nz h o u s t u d e n tid：042044018 d 印a 血t ( i n s t i t u t e ) ：d e p a r t m e n to f m a c r o m o l c c u l a xs c i c n majot：polymerc h e m i s t r ya n dp h y s i c s a c a d e m i cs u p e r v i s o r a s s o c i a t ep r o f o s s o r x mc h c m i nt h i st h e s i s ，t h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no fr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i ni n d u c e db y d i f f e r e n tk i n d so ff a c t sw a si n v e s t i g a t e db ym e a n so ff t i ra n dr a m a ns p e c t r o s c o p y f i r s t , t h ec o n t e n to ft w om e t a le l e m e n t s ( v ea n dm _ n ) i nb o t hs i l k # a n d sa n dc o c o o n s i l k so f b o m b y xm o r is i l k w o r m sw a sr e p o r t e d a n dt h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no ft h e c o n c e n t r a t e dr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i ns o l u t i o n sw a sf o c u s e do n , w h i c hw e r et r e a t e db y t h et w om e t a li o n s ，f e ( i 毋a n dm n ( i i ) s e c o n d ，t i m e r e s o l v e df t i r a n a l y s i sw a su s e d t om o n i t o rt l l ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o na n dt os h o wt i l ek i n e t i g so ft h et r a n s i t i o nf o r b o t hf i l m sa n d6 b f o i n l 砸o n s w h i c hw e r et r e a t e dw i 伽d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f p o l y a l c o h o l s b yt h ei n v e s t i g a t i o no ft h em e c h a n i s mo ft h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n f r o mr a n d o mc o i la n d o rh e l i xt oi n - s h e e ti n d u c e db yt h et r e a t m e n to f t h ef c ( i i i ) o rt h e p o l y a l c o h o ls o l u t i o n s ，w ea r el o o k i n gf o r w a r dt od e v e l o p i n gab i o - m i m e t i es p i n n i n g m e t h o da n do p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o n st op r o d u c et h ea r t i f i c i a ls i l kf i b e r s , w h i c ha r e g o o d a so re v e nb e t t e rt h a nt h en a t u r a ls i l kf i b e r s i nt h ef i r s tp a r to ft h i st h e s i s ，i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m am a s ss p e c t r o s c o p y ( i c p - m s ) a n da t o m i ca d s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ( a a s ) w e r ea p p l i e dt od e t e r m i n et h e f ea n dm nc o n t e n t si nb o t hs i l kg l a n d sa n dc o c o o ns i l k so f b o m b y xm o r is i l k w o r m s a n dg a m a ns p e c t r o s c o p yw a sa l s ou s e dt om o n i t o rt h ee f f e c to ff f i r ) a n dm n ( n ) o i l t h ec o n f o r m a t i o nc h a n g e so fs i l kp r o t e i ni nt h ec o n c e n t r a t e dr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n s o l u t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef ec o n t e n ti nc o g 0 0 1 1s i l kw a sh i s h e rt h a nt h a t i nt h es i l kg l a n d , b u tt h em nc o n t e n tw a so nt h eo t h e rw a yr o u n d i na d d i t i o n , t h ef e c o n t e n tw a s g r a d u a l l yi n c r e a s e df r o mt h ep o s t e r i o rp a r tt ot h ea n t e r i o rp a r to ft h es i l k g l a n d h o w e v e r t h em nc o n t e n td i d n te x h i b i tt h es a m et e n d e n c ya sf ed i d b u t 棋要大擎硕士论文 作者：周文 a b s w a e t s h o w e dt h el o w e s tv a l u ei nt h em i d d l ep a no ft h es i l kg l a n d t os t u d yt h ee f f e c to f f e ( m 3a n dm n ( n ) i o n s0 1 1t h ec o n f o r m a t i o nc h a n g e so ft h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n s o l u t i o n s ，t h er a m a ns p e c t r ai n d i c a t e dt h a tf e ( m ) i o n sw e r ea b l et oi n d u c et h e c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no fs i l kf i b r o i nf r o mr a n d o mc o i la n d o rh e l i xt o1 3 - s h e e tb u t m n ( n ) d i d n ts e b * a m h a v i n gs u c ha l le f f e c t f e ( m ) i o ni n d u c e dt h ec o n f o r m a t i o no fs i l k p r o t e i nc h a n g i n gf r o mr a n d o mc o i l a n d o rh e l i xt op s h e e tb yc o o r d i n a t i o nw i t h t y r o s i n er e s i d u e so ft h es i l kp r o t e i nc h a i n f i r s t , nf e wf e 皿i ) i o n sc o o r d i n a t e d 诵吐l t y r o s i n e , h i s t i d i n e ( o ra s p a r a g i n e ) , t r y p t o p h a na n ds e r i n er e s i d u e s ，w h i c hw e r e c o n t a i n e di ne l e v e n y v a h o 町g g y s 】p e p f i d e sa n dn i n e 【g y e y a w s s 】p e p t i d e so f t h es i l kp r o t e i nc h a i n s ot h a tt h eo r i g i n a l l yd i s o r d e r l ys i l kp r o t e i nc h a i n si ns o l u t i o n o c c m r e ds o m es w i t c h i n ga n df o l d i n g , t od e c r e a s et h ed i s t a n c eo ft h ec h a i ns e g m e n t s c o n t a i n i n gp e p t i d es e q u e n c eo f “c r y s t a l l i n er e g i o n s ”a n dt op r e p a r ef o r t h e n u c l e a t i o n o ft h e1 3 - s h e e t a st h ec o n t e n to ft y r o s i n er e s i d u e si nb o m b y xm o r is i l kp r o t e i ni sa s h i g ha s53 ，n o to n l yt h et y r o s i n er e s i d u e si n 【y v a h ( n ) ( 硒y s 】a n d 【g y e y a w s s 】 p e p t i d e sb u ta l s ot h eo n e si nt h eg xc r y s t a l l i n er e g i o n sw e r ec o o r d i n a t e dw i t hf e ( i n ) i o n sw h i l et h ef e ( m ) i o n sw e r ei n c r e a s i n g , w h i c hm a d et h es i l kf i b r o i ns o l u t i o n sh a v e ac o l o rr e a c t i o na n ds h o ws t r o n gf i n g e r p r i n t i d e n t i f i c a t i o np e a k si nt h er a m a ns p e c t r a i nt h i sc o m p l e x , t h er e ( i n ) i o n sp l a y e dt h er o l eo f m a k i n gt h ea d j a c e n tp e p t i d ec h a i n s e v e nc l o s e rb yf o r m i n ga l li n t e r m o l e e u l a rt y r - f e ( i i o - t y rb r i d g e ，w h i c hi n d u c e dt h e c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no fs i l kp r o t e i nf r o mr a n d o mc o i la n d o rh e l i xt o1 3 - s h e e t t h e m n ( mi o n sa l m o s ti n d u c e dn om a r k e dc o n f o r m a t i o nc h a n g eo fs i l kp r o t e i n n o ta s o t h e r m e t a le l e m e n t s ，m nw a sn o td i r e c t l yi n v o l v e di nt h es p i n n i n gp r o c e s s ，b u to n l y i n v o l v e di no t h e rp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e so f b o m b y xm o r is i l k w o r m s t h es e c o n dp a no ft h i st h e s i si sa b o u tt h ec o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o no f r e g e n e r a t e d b o m b y xm o r is i l kf i b r o i nf i l m sa n ds o l u t i o n st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f p o l y a l c o h o l s ( g l y c o l ，p r o p a n e d i o l ，b u t a n e d i o la n dg l y c e r 0 1 ) ，w h i c hw e r ec h a r a c t e r i z e d b yt h et i m e - r e s o l v e df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e df f t i r ) s p e o t r o s c o p y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ec o n f o r m a f i 0 1 1t r a n s i t i o nf r o mr a n d o mc o i la n d o rh e l i xt o1 3 - s h e e tf o r b o t hf i l m sa n df i b r o i ns o l u t i o n sw a si n d u c e db yp o l y a l c o h o l sa t a p p r o p r i a t e 援曼土荸硕士论文 作者：周文 a b s m 圮 t c o n c e n t r a t i o n s t h er e s u l t i n gc b r v 船i n d i c a t e dt h a tt h ek i n e f f c so f 血ec o n f o r m a t i o n t r a n s i t i o nf o rb o t hf i l m sa n df i b r o i ns o l u t i o n sw a sat h r e es t e pp r o c e s s t h ef i r s ts t e pi s t h ei n i t i a t i o no f 3 - s h e e ts t r u c t u r e ( n u c l e a t i o n ) t h en u c l e a t i o ns t e pc a nb ev e r yf a s to r r e l a t i v e l y5 1 0 w , h i g i l yd e p e n d i n go nf a c t o r st h a ti n f l u e n c ep r o t e i nc h a i nm o b i l i t ya n d i n t e r m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n df b n n a t i o n t l l es o l a n dc o n c e n t r a t i o no ft h e p o l y a l c o h o l s t h eh i 【g h e rt h ec o n c e n t r a t i o nw a s ，t h el e s st i m eo ft h ef i r s ts t e pn e e d e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep o l y a l c o h o l sw a st h es a m e ，t h et i m ef o rt h ef i r s ts t e p w a sd e c r e a s e db yt h es e q u e n c eo fg l y c e r o l ，g l y c o l ，b u t a n e d i o la n dp r o p a n e d i 0 1 t h e r e a s o nf o rt h i sc a nb et h em o l e c u l a rs i z e sa n ds t e r i cs t i u c r l r e $ o fd i f f e r e n tk i n d so f p o l y a l c o h o l s t h es e c o n ds t e pi s af a s tg r o w t ho f1 3 - s h e e t , w h i c hi s g e n e r a l l y c o m p l e t e dw i t h i n5r a i na n dh a sl i t t l ec h a n g ew i t hd i f f e r e n tp o l y a l c o h o l s t h e i r d s t e pr e p r e s e n t sa s l o wp e r f e c t i o no fp r e v i o u s l yf o r m e d 肛s h e e ts t r u c t u r eb yf t l r t h e r a d j u s t m e n t so f t h ec h a i ns e g m e n to f s i l kp r o t e i nm o l e c u l e s k e yw o r d s ：s i l kf i b r o i n , c o n f o r m a t i o nt r a n s i t i o n ，i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , r a n l a n s p e c t r o s c o p y ；f 曼大学硬士论文 作者：周文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写 过的研究成果其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确 的声明并表示了谢意 作者签名 皿喃率 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的觌定即：学校有权保 留送交论文的复印伴允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容，可l ( 采用影印、缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在解密后 。 ， 遵守此规定 作者签名 第一章综述 1 1 天然动物丝的研究 第一章综述 大自然中存在着极为丰富且可再生的天然生物大分子材料，在石油、煤炭和 天然气等日趋紧张的当今世界，对可再生资源进行开发和利用极其重要。其中动 物丝，主要是指蚕丝和蜘蛛丝，就是自然界所提供的最好例证之一：蚕和蜘蛛通 过自身生物合成在其体内制备了丝蛋白；而丝蛋白则在常温常压的水性环境下， 由体内微环境的影响下导致构象转变等过程组装成具有优异综合力学性能的丝 纤维，这些丝纤维可生物降解成完全无害的组分。基于动物丝和丝蛋白所具有的 特点，上个世纪六七十年代科学家们就展开了对它们探索和研究，取得了一系列 的成绩，但仍在不懈努力深入研究，期望最终可以在常温、常压、无污染的条件 下，通过人工合成的方法大规模地制备具有动物丝般优秀综合力学性能，且具有 良好生物相容性和或生物降解性的人工丝纤维材料。目前，对动物丝和丝蛋白 的研究主要集中于以下几个方面：动物丝的结构与性能之间的关系、动物丝蛋白 的模拟合成、丝蛋白分子链构象转变及其成丝机理、人工纺丝以及动物丝和丝蛋 白在生物医药、组织工程领域中的应用等【。 虽然蜘蛛丝蛋白和蚕丝蛋白没有任何同源性，其氨基酸组成和序列亦完全不 同，但由于蜘蛛和蚕的天然纺丝机理极为相似，且丝纤维的结构和性能也具有一 定的相似性，因此，科学家们往往将两者结合起来进行比较和分析，以便对这类 型的结构蛋白进行更深入研究。 本章主要以动物丝和丝蛋白中构象研究的进展作一简要的阐述。 1 1 1 动物丝素蛋白的氨基酸组成 蚕腺体产生单一蚕茧丝，由丝胶( s 耐c i n ) 和丝素蛋白( s i l kf i b r o i n , 简称s f ) 两部分组成，亲水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占总重量的2 5 ，而疏水 性的丝素蛋白约占7 0 ，此外蚕丝中还有5 左右的杂质，丝胶和丝素形成皮芯 结构，甜。丝胶可以通过脱胶过程与丝素蛋白分离，一般认为它不具有力学强度， 对蚕丝的力学性能有最直接贡献的是由丝素蛋白所形成的分级结构：丝素蛋白以 棋粤上擎 硕士论文作者：周文 第一章综述 反平行p 折叠链构象( p s h e c t ) 为基础门，形成直径大约为1 0 岫的微纤维，无数微 纤维密切结合组成直径大约为l “m 的细纤维，大约1 0 0 根细纤维沿长轴排列构 成直径大约为1 0 1 8 岫的单纤维，即蚕丝蛋白纤维p 1 。 丝素蛋白除了含有c 、h 、0 、n 元素外，还含有k 、n a 、c a 、s i 、s r 、p 、 c u 、f e 、m n 等金属元素【9 1 2 1 。和蚕腺体所产生的单一丝蛋白不同，蜘蛛体内一 般都具有多套高度分化的腺体，能产生多种不同用途的丝n 3 ，每一种丝的氨基 酸组成，序列以及功能特性都不同n 5 1 。蜘蛛的主腺体_ 缝( m a j o ra m p u l l a t es i l k ) l 扫 其出色的综合力学性能可以与最好的合成纤维k e v l a r 相媲美( 如表l 所示) ，若 无特别说明本章所表述的蜘蛛丝和蜘蛛丝蛋白分别为蜘蛛的主腺体丝及其相对 应的蛋白质。 表1 动物丝及其他材料的力学性能比较1 町 t a b l e1t h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e so f a n i m a ls i l k sa n do t h e rm a t e r i a l s m a t e r i a l s t r e n g t h ( n m 2 ) s i b i l i t y ( ) h 。篙；) 触 s i l k w o r ms i l k 0 8xl o 3 0 4 l 扩 m a j o r a m p u l l a t e 1 2 1 0 9 3 5lx1 0 5 f l a g e l l i f o r ms i l k lx1 0 9 2 0 0 1 1 0 5 m i n o ra m p u l l a t e1 1 0 4 0 5 0 3 1 0 4 k e v l a r 4x 1 0 9 5 3x 1 0 4 r a b b e t 1 1 0 6 6 0 0 8 1 0 4 l q y l o n ( t y p e 6 1 7 1 0 2 0 0 6 l o 。 h i g h t e n s i ls t e e l 2 1 0 9 i 8 1 0 4 动物丝蛋白由2 0 种左右的氨基酸组成( 如表2 所示) ，丙氨酸( a ) 和甘氨酸 ( g i y ) 是动物丝蛋白的主要组成。在蚕丝蛋白中大致含有4 4 的甘氨酸( g l y ) 、2 8 的丙氨酸( a l a ) 【r 兀，蜘蛛主腺体丝蛋白中两者共占蜘蛛丝蛋白氨基酸总含量的 6 2 左右。两者之间氨基酸组成的主要不同在于：蜘蛛主腺体丝蛋白中丝氨酸( s 盯) 含量明显少于蚕丝蛋白，而谷氨酸谷氨酰胺( g l u g l n ) 、脯氨酸( p f o ) 的含量则比 蚕丝蛋白高得多。 在动物丝的研究，特别是丝蛋白构象研究中，通常用再生丝素蛋白【珏3 1 i 代替 天然丝素蛋白进行研究。再生丝素蛋白是通过将动物丝经过无机盐溶解透析得到 类似动物丝腺体内的丝素蛋白【3 2 弓8 1 的生物大分子物质。表2 说明无论是桑蚕丝、 蜘蛛丝、还是柞蚕丝，采用各自适合的“再生”方法，其再生丝素蛋白的氨基酸 组成和天然动物丝腺体丝素蛋白的氨基酸组成都几乎一致。 棋旦上攀 硕士论文 2 作者：周文 第一章综述 表2 动物丝的氨基酸组成1 ”l t a b l e2a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f v a r i o u sa n i m a ls i l kf i b r o i n s 4 n o t d e t e m m e t6 t r a c e , 。n o d a t a i r e f e r e n c e 丝蛋白的分子量很大，由于其分子结构和分子间作用力极其复杂，采用不同 方法测定的分子量有所差别，所以各研究小组的结果都不尽相同。但是随着基因 技术和测试技术的发展，近来比较统一的结论是：桑蚕丝蛋白由三个亚单元组成 1 7 3 9 - 4 2 i ：( 1 ) 重链( h 链) 蛋白亚单元，由5 , 2 3 6 个氨基酸残基组成，平均分子量为 3 9 1k d a ；( 2 ) 轻链皿链) 蛋白亚单元，由2 6 6 个氨基酸残基组成，平均分子量为 2 8k d a ，与h 链以一个二硫共价键相结合；( 3 ) p 2 5 蛋白，分子量为2 5k d a ，与l 链大小相近，但氨基酸组成则完全不同，作为丝蛋白的微量成分存在，通过疏水 相互作用与重链和轻链相连【”，4 0 , i 。在桑蚕丝蛋白的结晶区域中，存在有高度 重复的六肽氨基酸重复序列( a y 舢a a y a l a - c d y s e r ) 7 r 槔4 7 1 ；而非晶区则主要由 ( g l y - a l a - g l y a i a - g i y - y ) 贡献，y 主指t y r 等其它氨基酸1 4 “a 络新妇蜘蛛的主腺体丝现在被认为是两种蛋白亚单元组成的复。， 4 9 5 0 l ：( 1 ) s p i d r o i nl ( s p l ) ，其分子量经s d s p a g e 测定大约为2 7 5k d a ；( 2 ) s p i d r o i n2 棋曼j 七拳 硬士论文 作者：周文 第一章综述 ( s p 2 ) ，除了脯氨酸( p r o l i n e ) 含量比s p l 更高外，其氨基酸组成和序列与s p l 都很 接近。s p l 与s p 2 都带有被认为与维持蛋白质在腺体内的溶解状态有关的c 端氨 基酸序列，两者十分相似。s p i 和s p 2 的氨基酸结构序列重复单元主要有两种： 一是丙氨酸残基重复序列( a l a ) 4 9 ，主要处于蜘蛛丝蛋白的结晶区；另一个是 富含甘氨酸的序列( 如g l y - c d y - g l n ，g l y a l a - g l y , g l y g l y x ) 主要处于非结晶区 1 5 1 - 5 3 1 。 柞蚕丝的氨基酸序列结构【蜘与桑蚕丝素氨基酸序列结构相比，更接近蜘蛛 丝的氨基酸序列结构( a k 陬5 3 , 5 5 , 靳1 。柞蚕丝素蛋白( a p f i b r o i n ) 基因由两段外显 - 子( e x o n ) t 叫组成。外显子l ( f i r s tc x o n ) 表达了4 0 个氨基酸( 1 2 0 个碱基对) ：外显子 2 ( s e c o n de x o n ) 较长，表达了2 6 2 5 个氨基酸。除了氨基终止端( a m i n o t e r m i n u s ) 所包含的1 5 5 个氨基酸之外。柞蚕丝素蛋白分子由8 0 个含聚丙氨酸结构单元 ( p o l y a l a n i n e - c o n t a i n i n gu n i t s ) 首尾相接而成。每个结构单元由两个链段组成，其一 为聚丙氨酸链段( p o l y a l a n i n eb l o c k , 简称p a b ) ，其二为非聚丙氨酸链段 ( n o n p o l y a l a n i n eb l o c k , 简称n p a b ) 。柞蚕丝素蛋白结构单元中，有7 8 个聚丙氨 酸链段的氨基酸数在1 0 1 5 之间，即p ：蛆链段( a t 如中，1 0 ，对蜘蛛 丝( n e p l t i l ae d u l i s ) 中p 折叠的取向分布进行了定量分析1 1 1 8 1 。 相比与拉曼光谱的研究，红外光谱对于蜘蛛丝研究的报道更少。j e l i n s k i 等在 1 9 9 4 年首次报道了将蜘蛛( n e p h i l ae l a v i p e s ) 的丝腺体直接夹在两片氯化钠盐片中 所测的红外光谱，发现其酰胺i 的吸收在1 6 4 8c i i l 1 附近，介于典型的a 螺旋和b 折叠的特征吸收峰之间【1 1 卿。当时它们没能给出很好的归属，现在看来其原因可 能首先是它们红外图谱的质量较差，其次是在用两片盐片夹丝腺体时可能使丝蛋 白受到剪切作用，从而产生了部分1 3 折叠的构象。除了j e l i n s k i 课题组的报道， 本课题组在用红外光谱( 包括拉曼光谱) 研究钾离子诱导蜘蛛( n e p h i l as e n e g l a e n s i s ) 蛋白膜构象转变中做了较为系统的工作。首先我们用红外光谱和拉曼光谱表征了 从蜘蛛丝蛋白稀溶液浇铸的丝蛋白膜构象，发现其红外吸收峰在1 6 5 9 ( 酰胺d ， 1 5 3 8 ( 酰胺) 和1 2 3 7c m 。1 ( 酰胺) 处，其拉曼特征峰在1 6 5 4 ( 酰胺i ) 和1 2 5 9c i i l d 喊 胺i m 处，因此我们将其归属于无规线团和或a 螺旋的构象【1 2 0 l 。经过氯化钾溶液 的处理，蜘蛛丝蛋白膜的红外吸收位移到1 6 2 4 ( 酰胺i ) ，1 5 2 9 ( 酰胺) 和1 2 3 3 锄d ( 酰胺) 处，其拉曼特征峰位移到1 6 6 6 ( 酰胺i ) 和1 2 3 3o l l l 4 僦胺) 处，表明 其构象发生了向b - 折叠的转变。接着我们用时间分辨红外光谱研究了蜘蛛丝蛋白 膜在氯化钾重水溶液中的构象转变动力学，发现1 6 5 0c n l “处代表无规线团和或 a 螺旋特征峰的吸收强度随时间的增加而减弱，而1 6 2 0o m 4 处代表b 折叠特征 峰的吸收强度则随时间的增加而增耐1 2 1 ，1 2 2 1 。随后我们又用二维相关光谱技术 对时间分辨红外光谱的数据进行处型1 2 扪，发现红外吸收在1 6 5 8c l n 1 处的旺螺旋 结构先于红外吸收在1 6 4 2c m 4 处的无规线团转变为b 折叠结构。同时我们还发 现出现在1 6 9 0c m - 1 附近的吸收峰其动力学参数及构象转变的快慢均与b 折叠结 构有所不同，因此它不应该是1 3 折叠结构的高频吸收峰，而更可能是与p - 折叠结 构有关的b - 转角( 1 3 - t u r n ) 或1 3 - 弯d t ( 1 3 b c n d ) 的吸收峰。 损呈大肇 硬士论文 1 4 作者：周文 第一章综述 1 3 本课题研究目的和研究内容 对于天然动物丝、人工丝纤维以及其他相应的丝蛋白材料而言，它们的许多 性能( 特别是力学性能) 与丝蛋白的二级结构密切相关，因此运用红外光谱和拉曼 光谱这两种分析测试方法，研究丝蛋白的二级结构和由其所形成的各种材料性能 之间的关系，对于开发和利用高强度人工丝纤维以及绿色环保、具有良好生物相 容性的各种丝蛋白材料，无疑具有重要的作用。 近年来，人们对桑蚕、蜘蛛吐丝机理的理解不断加深，认为桑蚕、蜘蛛的吐 丝过程是一个液晶纺丝过程，并且尝试用不同方法对再生或重组丝蛋白溶液进行 人工模拟纺丝，但是得到的人工丝的力学性能几乎都无法与天然丝相比。由此可 见，天然丝的吐丝过程和一般的工业纺丝过程有所不同，并非单纯提高丝蛋白浓 度、改进纺丝设备和后拉伸条件就可以轻易获得性能与天然丝相仿的人工丝基 于天然丝的吐丝过程是一个与动物生命活动密切相关的复杂过程，要了解天然丝 的形成过程，就必须充分考虑动物体内的生物环境。绝大多数科学家都同意天然 的纺丝过程是一个在应力作用下丝蛋白的构象转