（物理化学专业论文）磁性纳米人工内切酶的研制和应用.pdf

上海师范丈学理学硕士论文 摘要 摘要 化学小分子与生物大分子的相互作用，尤其是人工核酸定位切断试剂对d n a 的切断在 d 默序列测定、染色体分析、基因治疗以及d n a 重组方面有着广泛的用途，因此进行人工合 成限制性内切核酸酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。同时，随着纳米技术向生命科 学领域的不断渗透，利用纳米技术研究和解决生命科学领域中的重大问题，推动纳米生物技 术的发展，正成为当前重要的前沿研究领域之一。本论文在这两者的交叉领域进行了较为系 统的研究，并取得了以下几个有意义的结果。 ( 1 ) 一般人工核酸定位切断试剂由识别和切割系统两个系统构成。本文中，我们采用 p n a 作为识别系统，c e ( i v ) 配合物切割系统，合成了p n a - c e ( i v ) 配合物人工核酸定位切 断试剂( 人：i j 核酸酶) ，并用m a l d - t o f 质谱对其进行了表征，运用荧光光谱法研究了该 识别系统p n a 与其部分互补的靶标2 6m e r s 单链d n a ( s s d n a ) 的杂交，用p n a c e ( i v ) 配台物人工核酸酶在生理条件下对靶标2 6m e r ss s d n a 进行了定位切断，并用离子对反相高 效液相色谱对反应产物进行了分析，试验结果表明该试剂对靶标s s d n a 的定位切断取得了 满意的效果。 ( 2 ) 其后，我们通过共价键含的方法将将p n a 探针连接到磁性纳米粒子表面( m n p s ) ， 并将其与靶标d n a 进行了杂交。同时，建立了一种基于表面增强拉曼光谱对p n a 在磁性纳 米粒子表面的键合及其与靶标d n a 的杂交过程进行检测的方法。实验结果表明：建立的方 法是有效的：p n a 探针已成功地键合到磁性纳米粒子的表面并且仍然有很好的生物活性。 ( 3 ) 将以寡聚核苷酸( o d n ) 为识别系统的人工核酸定位切断试剂共价键合到磁性纳米 的表面，得到了基于磁性纳米粒子的o d n 人工核酸切割试剂( 即o d n 磁性纳米人工内切 酶) ，其后我雷1 利翻其对靶标d n a 进行了定位切断实验，实验结果表明该o d n 磁性纳米 人工内切酶在合适的条件下，能够迅速有效的对靶标d n a 进行切断，且切断位点与理论预期 的一致。随后，我们尝试以类似的方法将p n a 核酸定位切割试剂连接到磁性纳米粒子上 制成了基于磁性纳米粒子的p n a 人工核酸切割试剂( 即p n a 磁性纳米人工内切酶) 。并对 其初步进行了定位切断实验，实验结果表明，合成的p n a 磁性纳米人工内切酶能够对靶标 d n a 进行定位切断，切割后产物是预期的产物。 关键词：肽核酸( p n a ) ；磁性纳米粒子( m l 岬) ；磁性纳米人工内切酶：水解切断；离子 对反相高效液相色谱( i p - r p - h p l c ) ；增强拉曼光谱( s e r s ) ! ! 塑堑苎查兰些堂堡圭堡塞塑! ! 一 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o no fc h e m i c a lm o l e c u l e sa n db i o l o g i c a lo n e s ，e s p e c i a l l ys e q u e n c es p e c i f i c r e c o g n i to na n ds i t e - s p e c i f i cc l e a v a g eo fd n a h a v em a n ya p p l i c a t i o n ss u c ha si nd n as e q u e n c e d e t e r m i n a t i o n s ，e l o m o s o m ea n a l y s e s ，g e n et h e r a p e u t i c s ，a n dr e c o m b i n a n td n am a n i p u l a t i o n s o i t i ss i g n i f i c a n tt od e v e l o ps e q u e n c e s p e c i f i cd n ac l e a v a g er e g e n t ( a r t i f i c i a lr e s t r i c t i o ne n z y m e s ) f o rt h es c i s s i o no fn u c l e i ca c i dw i t hh i g ha c t i v i t ya n ds e l e c t i v i t ya tn o r m a lc o n d i t i o n m e a n w h i l e ， w i t ht h en a n o p a r t i c l ep e r v a d i n gi n t ot h eb i o l o g i c a ls c i e n c e s ，u s i n gt h en a n o t a c h n o l o g yt os t u d y a n dr e s o l v et h ep r o b l e mo f l i f es c i e n c e si sb e c o m i n go n eo f t h em o s ta d v a n c e df i e l d s i nt h i st h e s i s ， w e 女a ds y s t e m a t i c a l b s t u d ；, c dt h e s ei t e m sa n do b t a i n e ds e v e r a lc o n c l u s i o n sb e l o w ( 1 ) f i r s t l y , w ep r e p a r e dan o v e la r t i f i c i a ls e q u e n c e - s p e c i f i cc l e a v a g er e a g e n t ，w h i c hc o n s i s t e d o fp e p f i d en u c l e i ca c i d ( p n a ) a ss e q u e n c e - r e c o g n i z i n gm o i e t ya n dr a r ee a r t hm e t a li o n sc e r i u m ( ) a s “s c i s s o r s ”s u b s e q u e n t l y ，i tw a sa p p l i e di nt h ec l e a v a g eo f2 6 - m e rs i n g l e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) t a r g e t , w h i c hh a s1 0 - m e rs e q u e n c ec o m p l e m e n t a r yw i t hp n ar e c o g n i z e ri nt h eh y b r i d s ， u n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s i o n - p a i rr e v e r s e d - p h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( i p r p - h p l c ) e x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tt h ep n a - b a s e ds i t es p e c i f i cc l e a v a g er e a g e n tc o u l d c l e a v et h et a r g e ts s d n as p e c i f i c a l l y ( 2 ) s e q u e n t i a l l yw ep r e p a r e dp e p t i d en u c l e i ca c i d - f u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( p m n p s ) b ya t t a c h i n gt h e4 - p y r i d y l d i t h i o l d e r i v a t i v e dp e p t i d en u c l e i ca c i d ( p n a ) w h i c hw e r e d e s i g n e d t o r e c o g n i z es p e c i a lg e n e t ot h e 3 - m e r c a p r o p r o p y l o x y s i l a n e c o a t e d m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) v i at h i o l - d i s u l f i d ee x c h a n g er e a c t i o n t h e nt h ep m n p sw e r ec h a l l e n g e d w i t hn o n c o m p l e m e n t a r ya n dp e r f e c t - m a t c hd n at a r g e t s t h ew h o l ep r o c e d u r em e n t i o n e da b o v e w a sm o n i t o r e dv i as u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) m e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ep m n p sw e r ea b l et oe f f i c i e n t l yh y b r i d i z ew i t ht h ep e r f e c t - m a t c hs s d n at a r g e ta n ds h o w e dn o a f f i n i t yt o w a r d sn o n c o m p l e m e n t a r yd n a ( 3 ) t h e n w ed e v e l o p e dm n p s - b a s e da r t i f i c i a l s e q u e n c e s p e c i f i cc l e a v a g er e a g e n t s ( m n p s - b a s e da a i f i c i a r e s t r i c t i o ne n z y m e s ) ，w h i c hc o n s i s to fo l i g o n u c l e o t i d e ( o d n ) o rp n a 觞 s e q u e n c e - r e c o g n i z i n gm o i e t y , t h er a r ee a r t hm e t a li o nc e ( i v ) e d t ac o m p l e xa s s c i s s o r s ”f o r c l e a v i n gt a r g e td n aa n dm n p sa sc a r r i e r s u b s e q u e n t l y ，w ei n v e s t i g a t e dt h e i ra b i l i t yt o s e q u e n c e - s p e c i f i ch y d r o l y z et a r g e ts i n g l e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) u n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sr e v e a l e dt h a tm n p s - b a s e da r t i f i c i a l c l e a v a g er e a g e n tc o u l d s e q u e n c e - s p e c i f i c a l l yh y d r o l y z et h et a r g e ts s d n aa tt h ep r i n c i p a lc l e a v a g es i t e s k e y w o r d s ：p c p t i d en u c l e i ca c i d s ( p n a ) ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) ；m n p s - b a s e da r t i f i c i a l r e s t r i c t i o ne n z y m e s ；h y d r o l y s i s ；i o n 。p a i rr e v e r s e d 。p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( i p - r p - h p l c ) ；s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g s ( s e r s ) 2 i ：海师范人学理学硕士论文 第一章 第一章文献综述 一研究意义 核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。它在生物的生长、发育、 繁殖等正常生命活动中具有十分重要的作用，但另一方面，核酸与生命的异常情 况，如肿瘤的发生、放射损伤和遗传疾病等也密切相关。所以，对核酸的研究已 成为现代分子生物学、医学和化学生物学研究的重要课题。选择性的切断( 也就 是定点切断) 核酸中的磷酸二酯键是基因工程的重要问题【1 4j ，但是，在生理条件 及非酶存在的情况下，核酸具有很高的稳定性。如在p h = 7 及温度为2 5 。c 的环境 中，d n a 和r n a 中磷酸二酯键的半衰期分别为8 亿年和2 亿年1 6 j 。目前，水解 切断核酸除用天然酶外还没有其它有效的办法，但天然酶识别序列短，一般仅为 4 - - 8 个碱基，切割碎片非常多，很难进一步利用。而定点切割试剂的识别系统 能识别的核菅酸序列可以远远大于8 个碱基，因而其专性非常高。所以开发出 高效的人工核酸切割试剂具有非常重要的理论意义和应用价值【7j 。 至今为止，人们已经研制出多种人工核酸切割试剂，在体外环境中切断目标 d n a 时，其均显示出了良好的切断效果和非常高的效率。但由于大部分此类人 工核酸切割试剂在切断目标核酸时，反应都在均相体系中进行，一方面，反应的 过程无法操控，另一方面，反应后，人工核酸切割试剂与切断产物混合在一起， 常常需要繁琐的分离纯化过程后，才能对反应后产物进行分析；同时，由于采用 的寡聚核苷酸识别系统极易为体内或细胞环境中存在的各种酶降解。而且，此类 人工核酸切割试剂不具有被动靶向性，不能定向分布到特定细胞或组织，因此在 将其用作基因药物时可能会有较大的副作用。纳米技术是8 0 年代束逐步发展起 来的新技术，在材料、环境、生物医学、化学等方面有广泛的应用前景。随着纳 米技术向生命科学领域的不断渗透，利用纳米技术研究和解决生命科学领域中的 重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成为当前重要的前沿研究领域之一。目 前，纳米材料，尤其是磁性纳米材料，在生物医药领域已得到了广泛的应用，例 如，磁性纳米粒子用于细胞及d n a 的分离【8 - i ，将磁性纳米粒子应用于临床磁 共振成像 1 ”，利用磁性纳米粒子构建新型材料 1 2 】，利用磁性纳米粒子作为药物 的主要载体进行靶向给药等 ”】。近来，将磁性纳米粒子表面功能化，并用其作为 作基因载体材料也屡有报道。这是由于：一，磁性纳米粒子具有比表面积效应， 上海师范大学理学硕士论文 箱一蕈 在其表面可吸附大量，利用磁性纳米粒子提高基因检测的灵敏度和最低检测限； 二，磁性纳米粒子具有超顺磁性，在外加磁场的作用下，可具有靶向性，利用磁 性纳米颗粒作为载体，在外磁场作用下可以将药物或基因定位于靶区，并使药物 或基因以受控的方式从载体中释放，从而达到有效化疗并降低药物对全身的毒副 作用【1 4 】。三，磁性纳米粒子对细胞无毒，具有为生物相容性；此外，磁性纳米粒 子还可保护连接于其表面的基因免受酶的降解【l ”。 基于以上所述的几个原因，将磁性纳米粒子与常规的人工核酸切割试荆连 接，可望得到一种新型的磁性纳米人工内切酶。该磁性纳米人工内切酶能够识别 和定位水解切断靶标d n a ，这样在很大程度上简化了对人工内切酶切割后碎片 的分离，且对于进行分子设计、丰富分子生物学中工具酶具有很重要的意义，同 时，还可以成为一种对于癌细胞更具疗效的基因药物。总之，磁性纳米人工内切 酶不仅可以推动生命科学的发展，同时还将促进纳米技术和化学方法的发展，在 生物科学和医药科学领域具有重要的意义。 二研究进展 限制性内切酶之所以能特异切割核酸分子，是因为其中的酶蛋白能够识别特 殊的核营酸序列且与之结合，并由酶分子中的化学基团切断核酸分子中的磷酸二 酯键。化学合成的人工核酸切割试剂也由两部分组成：一是断裂系统s ( s p l i t ) ， 为某种核酸切割试剂，主要包括金属及其化合物，非金属，多胺和抗生素等；二 是识别系统r ( r e c o g n i z a t i o n ) ，它能识别核苷酸上的序列并与之结合，主要包 括寡聚脱氧核苷酸( 0 d n ) ，肽核酸( p n a ) ，多酰胺等物质。所以人工内切酶 可以简写为r - s ，理论上它可以在核酸底物的特定部位将其断裂。显示出与限制 性内切酶类似的生物功能，因此人工核酸切割试剂也被称为人工内切酶。 1 断裂系统 核酸的化学断裂系统主要是通过一定的方式实现对核苷酸的断裂，它在人工 合成的核酸定位断裂工具中起着重要的作用。化学断裂系统按其切割机理可以分 为自由基机理、消去机理和酯水解机理三大类。按自由基机理氧化切割核酸的试 剂主要包括过渡金属配合物和一些抗生素类药物。此类试剂主要是过渡金属配合 物体系2 5 1 促使h 2 0 2 还原生成o h 自由基作用于d n a 的脱氧核糖或磷酸的碱 基，从而导致d n a 链的断裂，其机理如图1 1 a 口这种断裂核酸的方式存在较多 上海帅范大学理学硕士论文 第一章 的缺点：首先，严重破坏核酸链上碱基和脱氧核糖环，最终产物往往为3 和5 磷酸末端、游离碱基及其它一些碎片，切割产生的末端不同于酶解产生的末端， 因此不能再用连接酶重新连接。其次，由于这类试剂产生的自由基很容易扩散， 会造成多个位点切割，用这类切割系统的定位切割试剂很难进行真正的定位切 割。第三，自由基对生物活体有毒副作用，无论是用于进行细胞内研究或作为药 物都是不利的。最后，此类切割试剂往往需要氧化还原活性的辅助因子，增加体 系的复杂性。以消除机理切割核酸的试剂并不多见，目前只有1 9 8 1 年h e l e n e 和 l a v a l 的研究小组发现的赖色赖三肽噼w k ) ，该试剂不仅可以识别d n a 中的脱 碱基部位，并且可以在该部位产生切口，其原因可能是由于色氨酸残基与核酸之 间的碱基堆积作用而占据了脱碱基部位附近的位置，从而使赖氨酸残基接近脱碱 基部位，而脱碱基的核糖存在半缩醛和开环的醛的互变异构，因而该点非常容易 被切断。对比三种切割机理来说，水解型切割试剂使用较为方便同时还具有很多 的优点：首先，生成的碎片具有3 或5 磷酸末端，且碱基和核糖环不会被破坏， 因此可以用连接酶重新连接；其次这类试剂不产生易扩散的自由基，因此有利于 合成高度序列专一性的定位切割试剂：第三，该体系无需还原性的辅助因子，对 生物体的毒害较小。鉴于以上这些原因，此类切割试剂，包括稀土金属离子及其 配合物，铁、铜、钴、锌和镁的配合物，可以作为定位切割试剂的最佳切割系统 之一【2 5 3 2 1 。按酯水解机理切割核酸的试剂主要通过水解核酸中磷酸二酯键而导致 核酸的断裂，其水解机理如图1 i b 所示。这类试剂不仅可以与直链单链d n a 、 双链d n a 作用，而且可以对p b r 3 2 2 质粒d n a 作用，这些试剂与核酸中的磷 酸二酯键的作用机制虽然不尽相同，但是产生的磷酸末端均可以进一步利用。因 此目前此类核酸切断试剂备受关注，研究较多。 2 化学识别系统 化学识别系统能够识别核酸上某段核苷酸序列，并与之特异结合，常用的主 要有寡聚脱氧核苷酸( o l i g o n u e l e o t i d e ，o d n ) 、肽核酸( p e p t i d en u c l e i ca c i d s ， p n a ) 、蛋白质口7 1 3 8 1 【4 1 1 、多肽【3 9 】、抗生素【4 2 1 、d n a 结合药物h 矾、毗啶眯唑多 酰胺【4 训等。它们通过共价键或非共价键与核酸分子上的特定碱基序列、d n a 和 r n a 的二级结构特定区域识别结合，形成超级体系，由此确定对d n a 和r n a 的 断裂位点和断裂产物。尽管蛋白质，多肽或抗生素等作为化学识别系统或多或少 的具备了一些优势，但要将其进一步应用，则仍有很多的限制，如蛋白质对d n a l 海师范大学理学硕士论文 旃章 a b 图1 1 核酸切断试剂对核酸切断作用机理 a 氧化切断b 水解切断 f i g1 1t h es c i s s i o no fd n ab ya r t i f i c i a lc l e a v a g er e a g e n t a o x i d a t i v ec l e a v a g eb h y d r o l y s i s 的识别较为复杂，目前已认识到，不存在能用于描述所有蛋白质对d n a 的识别 规律，而抗生素等则需要在与d n a 结合之前，经一还原活化过程。因此，至今 研究最多的仍是寡聚核苷酸及其结构类似物。 2 1 寡聚脱氧核苷酸 最常使用的核酸识别系统是寡聚核苷酸，尤其是寡聚脱氧核菅酸( o d n ) 。 它的识别原则是核酸中的碱基互补配对，寡聚脱氧核替酸通过与单链d n a 或 r n a 杂交形成双链，或以h o o g s t e e n 或反h o o g s t e e n 氢键结合到有特定序列的双 链d n a ( d s d n a ) 大沟处，形成三股螺旋，完成对它们的特异识别。随着寡聚核 昔酸合成技术的不断发展，人们可以根据需要合成任意序列的寡聚核苷酸识别系 统，在预先设计的位点切断d n a 。m o s e r t 3 3 1 等利用寡聚脱氧核苷酸e d t a f e ( i i ) 配合物，通过形成三螺旋结构，对双链的质粒p d m a g l 0d n a 片断成功进行了 断裂反应。s i g m a n l 3 4 1 研究小组将 c u ( p h e n ) 2 + 与一段r n a 相连后用于切割单 链或双链的d n a 。k o m i y a m a 3 s - 3 6 1 等则提出了一种制各带有1 9 个碱基片断的寡 聚脱氧核苷酸的c e ( i v ) 配合物( d n ai d a c e o v ) ) 的简单程序，该程序对寡聚脱氧 洲一 ， $ p 一书山 ，耳+ 斟 叮o n 铽i 0 上海师范大学理学硕士论文 第一常 核苷酸碱基序列及长度无任何限制，在p h = 7 5 ，3 0 c 时，用制备的d n a i d a - c e 0 v ) 去t ； 断一个含4 0 个碱基的单链d n a ，d n a i d a 中的1 9 个碱基与底 物d n a 中互补的1 9 个碱基配位，而连接在d n a i d a 端的c e ( i v ) 离子定位在底 物的a 3 1 和c 3 2 闻，对其进行切割。电泳图显示切割正好发生在a 3 1 与c 3 2 间， 切割效率为6 0 。 2 2p n a 一种新的识别系统 天然o d n 有最好的识别特异性和亲和性，但在实际应用上仍存在缺陷，主 要是生物稳定性差易被核酶降解。因此，必须对天然o d n 进行结构修饰，过 去2 0 年人们合成了大量修饰结构的寡核苷酸，这些修饰方法包括磷酸二酯骨架 修饰、碱基修饰、核糖环修饰以及将一些嵌入分子共价连接在寡聚核酸的末端。 但就生物稳定性、溶解度、药代动力学性质及合成的难易程度等因素综合衡量， 这些寡聚核酸类似物仍不够理想，所以为了加强杂交能力，提高对核酸酶的抗性 及膜通透性，许多新的寡核营酸类似物相继被研制出来，例如：p h o n a l 4 5 | ，p n a ( p e p t i d en u c l e i ca c i d ，肽核酸) 4 6 1 ，其中，肽核酸是一种结构变化较大的d n a 模拟物，它是9 0 年代初丹麦科学家n i e l s e n p t e 发明的一种全新的d n a 类似物， 即以中性的肽链酰胺2 一氨基乙基甘氨酸键取代了d n a 中的戊糖磷酸二酯键骨架 ( 结构式如图1 2 ) ，其余的与d n a 相同。 2 2 1p n a 的物理性质 由于p n a 的中性骨架和其合适的碱基间距，p n a 可以通过w a t s o n - c r i c k 碱 基配对的形式识别并结合d n a 或r n a 序列，形成稳定的双螺旋结构。p n a 能 以平行或反平行的方式与互补链结合，且反向平行方式居多。n m r 研究表明， p n a 与r n a 形成的复合物类似于一个a 型螺旋，而p n a d n a 双螺旋同时具有 a 型及b 型结构。x 射线晶体成像结果显示，p n a 2 d n a 复合物形成了独特的 三股螺旋结构【4 7 1 。 p n a 也能够与双螺旋d n a 结合，这种p n a 必须具有由7 个以上含有相同 嘧啶的单体，p n a 与双链d n a 的结合是通过置换出的非互补链，而与互补链形 成的( p n a ) 2 仍n a 三螺旋结构，其中一个是p n a 与d n a 以w a t s o n - c r i c k 碱基配 对的形式结合的，另一个是以h o o g s t e e n 的形式结合的，三螺旋d n a 中 w a t s o n 。c r i c k 和h o o g s t e e n 的碱基配对形式见下图，被置换出的d n a 链形成d 环。d - 环的形成方式可能通过三种途径( 如图1 - 3 示) 。这种机制对于在转录水 上海师范大学理学硕士论文 第一章 c n 图1 2p n a 结构示意图 f i g1 , 2t h es t r u c t u r eo f p n a 平上研究基因的表达和调控是很有意义的。值得注意的是能形成( p n a ) 2 d n a 结 构的p n a 才能完成链置换，并且置换反应只能在p hs 7 范围内进行，同时也 最好在低盐浓度下进行。 由于p n a 不带负电荷，与d n a 和r n a 之间不存在静电斥力，因而结合的 稳定性和特异性都大为提高，这主要表现在p n a d n a 碱基对错配杂交分子的不 稳定性比d n a d n a 碱基对错配杂交分子的不稳定性更高。p n a - d n a 间出现一 个碱基错配其结合效率就会明显下降，出现两个碱基锚配，则完全不能杂交。可 利用这一点来检测d n a 在p c r 扩增时的单碱基对的变异。不同于d n a 与d n a 或r n a 间的杂交，p n a 与d n a 或r n a 的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响， 与d n a 或r n a 分子的杂交能力远优于d n a d n a 或d n a r n a ，表现了很高 的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力。 p n a 不易被核酸酶和蛋白酶水解，使得p n a 在血清及细胞提取物中的生物 稳定性都大为提高。某些蛋白质与d n a 或r n a 有亲和力，能与它们发生相互 作用，而p n a 几乎不能以序列特异性或以其它方式与这些蛋白质作用，这样就 提高了p n a 在细胞内选择性结合靶序列的能力。鉴于上述诸多d n a 分子不具 备的优点，近十年来，人们为p n a 在许多高技术领域找到了用途。 2 2 2p n a 的应用 斟 上海师范大学理学硕h 论文 第一章 。气“， ” p 、v 一喃 。融再。 。黝、。缸z 。，? c w i 舯卜c r k t 嘲 一 图1 3 三螺旋中w a t s o n c r i c k 和h o o g s t e e n 的碱基配对形式及p 一环稳定结构的形成 f i g 1 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f ap - l o o pi nw h i c hav e r ys t a b l e ，i n t e r n a lp n a 2 一d n at r i p l e xi s f o r m e dw 砒1t h ec o m p l e m e n t a r yh o m o p u r _ n ed n as t r a n dv i ao o n , ，e n t i o n a w a t s o n - c r i c ka n d h o o g s t e e nb a s ep a i r i n g 2 2 2 1 在p c r 反应中的应用 p c r 发夹( p c rc l a m p i n g ) ：p n a 与d n a 配对的特异性高于d n a 或r n a ， 此特性可用来检出点突变，以代替传统的d n a 测序法。方法是将p n a ( 与野生 型配对的) 和一对引物( 其中一个与突变型基因配对，另一个是正常的反向引物) 共同加入反应体系中。p c r 反应中，野生型p n a 与突变的寡聚核苷酸竞争引物 位点。如果出现突变，则有突交产物，反之，p n a 就结合在引物位点上阻碍复 制，刘无扩增反应产物出现1 4 钔。 同时，由于阻断了链内与链间的相互作用，p n a 与模板链的结合还可减少退 火过程中引物的错配，从而减少了相似产物和梯形产物的产生。另外采用p c r 方法合成的d n a 链的长度是有限的，用p n a 可改善这一情况【49 1 。 2 2 2 2 对转录过程的调节 ，ii卜卜bn“弘卜hn肛肛o卜“=：ni 、b卜心卜卜咚卜卜卜卜 上海师范大学理学硕士论文 第一章 p n a 插入双链d n a 形成稳定的杂含体后，对基因的转录既可起抑制作用， 亦可起促进作用。例如：由链置换而形成的d 一环可作为一个人造的转录启动子， 而与p n a 互补的链则可以抑制其下游的转录而增强其上游的转录 们。总之p n a 对转录的影响很复杂，随条件的变化还可能出现其它一些情况。由于p n a 具有 这种能够在双链d n a 水平上抑制转录和复制的性质，所以可以作为反基因药物。 此外，p n a 与r n a 结合可抑制逆转录垆“。 2 2 2 3p n a 对端粒酶活性的抑制作用 近来n o r t o n 等研究了p n a 作用的一个新靶一端粒酶。端粒酶是负责维持复 制过程中端粒长度的酶，它具有的r n a 起模板的作用，使染色体末端延伸。体 外实验结果表明，与r n a 模板序列互补的p n a 能以序列特异性方式有效地抑制 端粒酶活性。通过比较p n a 和硫代寡核苷酸对端粒酶的抑制作用，发现p n a 优 势明显，低浓度的p n a 即可做到特异抑制，而硫代寡核苷酸以非特异性方式起 作用【52 1 ，此外，端粒酶中的r n a 靶序列由于与蛋白质相连而呈现一定的构象， 但p n a 仍能识别它。与一般的体细胞不同，大多数肿瘤细胞具端粒酶活性，故 端粒酶可作为肿瘤细胞中的个有效靶位。 2 2 2 4p n a 对逆转录酶的作用 对所有的逆转录病毒来说，将其基因组r n a 进行逆转录是在细胞内复制的 第一步，故导向e d n a 合成过程显然是抗逆转录病毒治疗的一种策略。针对h i v - 1 g a g 基因r n a 不同靶位的p n a 均能有效抑制h i v - 1 ，m m l v 和a m v 逆转录酶 的作用，通过分析r n a 序列，发现逆转录酶的作用被p n a r n a 复合物在预定 位点抑制，r n a 并未被降解，故p n a 是通过空间位阻起作用的，并未活化逆转 录酶的r n a 酶h 活性。当6 i f p n a l g a gr n a 的摩尔比为6 ：1 时，能完全抑制 逆转录酶的活性，g a gr n a 的体外翻译过程不受影响【5 3 】。可见病毒r n a 基因组 能作为p n a 的靶基因。只要p n a 能在体内到达病毒基因组，即可开发为有效的 抗病毒药。 2 2 2 5p n a 的体内活性 p n a 没有整体毒性，没有非特异性蛋白结合作用及其在人血清和细胞提取物 中的稳定性是将其作为基因靶向药物的潜在优势，目前p n a 体内应用的难点在 于如何使之有效地进入细胞并且使其在细胞内的分布方式能保证它与靶m r n a 或d n a 结合，体外实验表明，p n a 与硫代寡核苷酸显示同样的低细胞摄入率， 上海师范大学理学硕士论文 第一章 但硫代寡核苷酸在体内有较好的药代动力学行为，且在一些动物模型中也显示了 有效性，因此，需进行p n a 在整体水平摄入方面的研究，获得p n a 行为学上更 真切的描述。不过，p n a 的低摄入可以通过连接一个载体分子或以脂质体包裹 而改善【5 4 】。 p n a 这一新的识别系统的出现，丰富了反义及反基因技术的手段。l o h s e 5 5 】 等人曾将次氨基三乙酸共价连接到一段p n a 上，连接后所得的试剂与d n a 底 物形成三螺旋结构而产生识别作用。b i g e y t 5 6 1 等人则将卟啉和m n 的络合物连接 到一段p n a 上，进行了切断双链d n a 的尝试。另外，j e r o e nc v e r h e i j e d 5 7 1 等 人还利用p n a 二乙烯基三胺连接物进行了定位切断r n a 的研究。 总之，p n a 有许多独特的性质，已经成为了分子生物学和化学生物学研究 中一个有力的工具，并在肿瘤、艾滋病、病毒感染和其它难治性疾病的治疗方面 有着广泛的应用前景。 2 3 磁性纳米粒子 2 3 1 核壳型磁性纳米粒子的合成及分类 铁的氧化物有着多种组成形式，不同的组成形式有着不同的磁性，y - f e ：o ， 和f 。3 0 。是最常见的具有良好磁性的铁氧体，它们都是表现为亚铁磁性 5 8 】。它们 不仅在工业上具有重要的用途( 如磁性记录材料等) ，而且在生物医疗等方面也 具有重要的应用前景( 如核酸和蛋白质的分离、磁共振成像造影剂等) 。然而， 尽管它们具有优良的磁性，但由于裸露的y - f e 2 0 3 和f e 3 - 0 4 的磁性很容易受到环 境的影响( 尤其在生物体系中) 并且个体容易团聚等，这使得它们的应用受到限 制a 因此，对磁性纳米粒子进行表面修饰使其具有更好的分散性和生物相容性的 研究具有重要的意义。 根据在磁性核表面修饰的主要成分，核壳型磁性纳米粒子可分为有机物高分 子磁性纳米粒子和无机物磁性纳米粒子。有机物高分子磁性纳米粒子有着多种合 成方法，例如单体聚合法洲、活性溶胀法 6 2 1 等。其原理一般都是利用高分 子有机物的长链缠绕在磁性核的外围而形成，其优点在于容易引进多种活性基团 ( 如o h 、c o o h 以及- n 8 2 等) ，有利于生物分子的连接；其缺点在于磁核容易 泄漏以及在合成过程中引进的杂质难于除去等。无机物磁性纳米粒子一般是由二 氧化硅或金等无机物基体与磁性核纳米粒子组成，其中二氧化硅包裹的磁性纳米 粒子通常是经过芷硅酸乙酯在碱性条件下水解而形成。二氧化硅包裹的磁性纳米 上海师范火学理学硕士论文 第一章 粒子因其良好的稳定性和与核酸键合时具有的特殊性质，近年来，受到科学家们 的广泛关注。此外，由于二氧化硅层非常致密，使得磁性核不容易泄漏而能够得 到磁含量较高的磁性纳米粒子，同时二氧化硅的表面非常容易功能化，因此经过 表面改性的二氧化硅包裹的磁性纳米粒子在生物分离、超声成像和生化合成及催 化等方面有广泛的应用 6 m 6 1 。 2 3 2 核壳型磁性纳米粒子的应用 2 3 2 1 核壳型磁性纳米粒子在生物大分子分离和纯化中的应用 表面功能化的核壳型磁性纳米粒子能够高效地偶联目标产物，因而利用其优 良的磁性，在外磁场的作用下，能够方便地对目标生物大分子进行分离和纯化。 与传统的电泳、层析以及离心等方法相比较，磁性分离操作程序上简单而且适合 大量生物分子的分离和纯化，因而在核酸细胞蛋白质的分离和提纯中有着广泛的 应用。 在核酸的分离纯化中，传统方法有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等，例如 目前纯化质粒d n a 最常用的是氯化艳密度梯度平衡超离心法，分离提纯r n a 和d n a 通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。然而这些方法操作 程序比较复杂、需要较长的时间而且成本也较高。如果采用磁性分离，能够节省 大量时间而且操作也非常方便，例如偶联有o l i g o ( d t ) z 5 的磁性纳米粒子可以快 速、高效地对m r n a 进行纯化，且纯化后的m r n a 可以直接用来建立c d n a 库 和r t p c r 扩增【67 1 。s m i t h t 6 8 1 等人发明了一种用磁性二氧化硅纳米粒子分离生物 目标物质的方法，利用此法可以从混合溶液中分离出目标生物大分子( 例如核酸， 包括d n a 和r n a ) 。在该方法中二氧化硅磁性纳米粒子与生物目标物质在一定 的环境中形成一种复合物，用外加磁场从混合体系中分离该复合物。最佳状态时， 二氧化硅磁性纳米粒子和目标物质能形成2 m g 值的复合物，在洗涤步骤中，至少 能得蛩j6 0 的目标物质。b o s e 和王柯敏等人分鄹通过抗生素与生物素的特定相 互亲和作用【6 9 - 删，把与目标d n a 互补的探针d n a 连接到磁性底物上，并利用 磁性纳米粒子的磁性对目标单链d n a 进行富集和分离。 核壳型磁性纳米粒子在细胞和蛋白质的分离方面的应用，也取得了一系列的 进展。例如j o s e p h s o n 【7 1 】和u g e l s t a 等人【倒分别用磁性纳米粒子分离出人血中的 淋巴细胞和嗜碱细胞；c h e n 等人用万古霉素修饰的磁性纳米粒子对革兰氏阳性 上海师范大学理学硕七论文 饕一章 病原体进行了成功地分离，并用质谱技术对这一过程进行了验证f 副；与传统分离 方法相比较，蛋白质的磁性分离技术具有速度快、纯度高、回收率高等优点。此 外，表面功能化的核壳型磁性纳米粒子在靶向药物和磁共振成像造影剂等方面的 应用也受到了广泛地关注。 2 3 2 2 核壳型磁性纳米粒子在生物分子检测中的应用 迅速高效的检测和测定特异基因序列是现代医学和生物技术的基本要求。过 去，核酸的检测主要是通过放射性标记来进行，尽管这种方法精确有效，但因为 放射性物质可能带来的各种危害，人们随后又发展了其他一些方法。其中，使用 光敏性基团标记就是一种比较常用的手段，这种方法的主要原理就是首先将荧光 团口4 1 ，金纳米粒予口5 或化学发光标记【7 6 1 等光敏性物质修饰到核酸探针上，然后 将这些修饰过的探针与目标核酸或蛋白质分子反应，通过观察反应引起的荧光强 度变化或光的色度的变化来判断目标物的存在与否以及目标物数量的多少。与以 往的方法相比较，这种方法显然更为安全，但同时也要求我们对核酸探针进行繁 琐的修饰，因此，这样的方法于实际应用方面仍有限制。人们迫切的需要建立拥 有更大的检测通量，更简洁的样品制备过程，以及更有效的监测复杂体系能力的 方法。近年发展起来的基因芯片技术虽然可以部分满足以上条件，但该技术主要 是通过检测电化学标记过的核酸因氧化还原产生的电流来进行基因分析 7 7 1 。表面 功能化的核壳型磁性纳米粒子的出现，为我们提供了新的基因分析方法。l e e j o s e p h s o n 等人通过过硫键交换反应r 7 ”，将两条不同序列的寡聚核苷酸探针分别 键合到磁性纳米粒子的表面，而后将待检测单链d n a 加入到含有这两种修饰过 的磁性纳米粒子的胶体溶液中。若待检测单链d n a 含有与纳米粒子表面的核酸 探针的互补序列，在一定条件下它们便会杂交，并形成比重较大的磁性纳米粒子 d n a 的纳米构建物快速沉降下来。这样，通过观测纳米粒子的沉降，我们便能 直观而迅速的进行基因分析。 三研究方法 由于人工核酸定位切断试剂以及纳米材料在生命科学中的应用的研究已经 引起了人们的广泛兴趣，越来越多的研究方法和技术正被引入此领域。例如：离 子对反相高效液相色谱( i p - r p - h p l c ) 、核磁共振法( n m r ) 、凝胶电泳法、电 化学石英晶体微天平技术、拉曼光谱技术、荧光光谱、紫外光谱等波谱技术以及 上海师范大学理学硕士论文 第一章 聚合酶链式反应( p c r ) 和电化学方法，这里仅就本论文所涉及到的部分研究方 法作简要综述。 1 荧光光谱法 当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的 可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也很快消失，这种光线称为“荧光”。 荧光是