（植物病理学专业论文）克百威降解菌的筛选及降解特性研究.pdf

摘要 克百威( c a r b o f u r a n ) 是一种常用的高效广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂和杀螨剂，由于 长期大量不合理的的使用，在土壤和河流及地下水中形成了残留，对人类和其他生物 的生存造成了严重的影响。为了有效治理克百威农药污染，本研究开展了利用微生物 降解克百威残留的研究，主要研究结果如下： 1 以克百威为唯一碳源，利用富集培养法从山东某农药厂活性污泥中筛选出了 2 0 0 余株克百威降解菌，进一步筛选获得2 株高效降解菌菌株c y w - 3 2 和c y w - 4 4 ， 通过生理生化特征分析，1 6 sr d n a 序列的同源性比较和a p i 试剂条鉴定结果，确定 菌株c y w - 3 2 为嗜有机甲基杆菌( m e t h y l o b a c t e r i u mo r g a n o p h i l u m ) ，c y w - 4 4 鉴定为枯 草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，并未见有相关报道该两种菌能够降解克百威。通过 高效液相色谱法检测到菌株c y w - 3 2 和c y w - 4 4 对克百威的降解率分别为8 9 1 5 和 1 0 0 。菌株c y w - 3 2 和c y w - 4 4 对克百威污染土壤( 克百威浓度为5 8 m g l ) 的降 解率分别为0 8 和1 0 0 ，而对废水中克百威( 其浓度为l o o m g l ) 的降解率分别为 5 3 7 3 和4 1 3 8 。 2 菌株接种到克百威浓度为1 0 0 m g l 的l b 培养基中，培养7 天至克百威含量最 低时，检测到p h 值和温度分别对菌株c y w - 3 2 的生长降解影响较大，接种量对其没 有影响。p h 值、温度和接种量对菌株c y w - 4 对克百威的生长降解都没有明显影响。 高效液相色谱法分析表明，菌株c y w - 4 4 在对克百威的降解过程中会产生呋喃酚等代 谢产物，并且确定了呋喃酚及其他代谢产物在降解过程中不产生累积现象。菌株 c y w - 4 4 在克百威浓度为1 0 0 m g l 的l b 培养基的生长过程中，在胞内外均能产生降 解酶，并通过s d s p a g e 电泳技术在在克百威降解过程检测到一条新的蛋白带，分 析认为该蛋白是菌株通过克百威诱导产生的，可能与降解酶相关。 3 通过单因子实验和正交实验，确定了菌株c y w - 3 2 发酵的最佳碳源为甲醇，最 佳氮源为硝酸铵，最佳发酵条件为：p h ：7 o ；温度：3 2 ；转速：1 5 0 r m i r a 装液 量：5 0 m l 2 5 0 m l ；菌株c y w - 4 4 发酵的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为豆饼粉，最 佳发酵条件为：p h ：6 0 ；温度：2 8 ；转速为1 8 0 f r a i n ；装液量：2 5 m l 2 5 0 m l 。 4 菌株c y w - 3 2 和菌株c y w - 4 4 在降解克百威的同时，还兼具多种生物学功能。 菌株c y w - 3 2 能够高效降解甲醇，2 0 小时内对5 0 0 m g l 的甲醇降解率为9 7 7 5 。并 能利用甲醇作碳源，产生单细胞蛋白，其菌体蛋白得率为3 8 5 ，粗蛋白含量为 8 9 2 6 ，菌体蛋白内含有各类氨基酸。平板对峙法发现菌株c y w - 4 4 对多种植物病 原菌有抑菌作用。 关键词：克百威；降解；降解酶；发酵；单细胞蛋白；抑菌 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc a r b o f u r a n - d e g r a d i n gb a c t e r i a m a j o r ：p l a n tp a t h o l o g y g r a d u a t e ：l ib a o q i n g s u p e r v i s o r ：p r o f m ap i n g p r o f l i ud a q u n a b s t r a c t c a r b o f u r a n ( c 1 2 h l s n 0 3 ) i sac a r b a m a t ei n s e c t i c i d ea n dn e m a t o c i d eu s e df o r t h ec o n t r o lo f av a r i e t yo fs o i l d w e l l i n ga n df o l i a r - f e e d i n gp e s t so nm a n yf r u i ta n dv e g e t a b l ec r o p s c a r b o f u r a ni sk n o w nt ob eam o r ep e r s i s t e n ti n s e c t i c i d et h a no t h e rc a r b a m a t eo r o r g a n o p h o s p h o r u si n s e c t i c i d e s c o n t i n u e du s e o ft h ei n s e c t i c i d ea ts i n g l ef i e l ds i t e sh a s l e dt ot h ep r o b l e mo fe n h a n c e dd e g r a d a t i o nh e n c e ，t h ee x p e r i m e n to f c a r b o f u r a n d e g r a d i n gb yu s i n gm i c r o o r g a n i s m sw a sc o n d u c t e di no u i l a b 1 c a r b o f u r a n d e g r a d i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o ma c t i v a t e ds l u d g es a m p l e so ft h e a g r i - c h e m i s t r yf a c t o r yi ns h a n d o n gp r o v i n c et h r o u g ht h eb a t c hc u l t u r ee n r i c h m e n t t e c h n i q u e a b o u t2 0 0c a r b o f u r a n d e g r a d i n go r g a n i s m sw e r ei s o l a t e df o rm e i ra b i l i t yt o d e g r a d ep e s t i c i d e b a c t e r i a ls t r a i n sc y w - 3 2a n dc y w - 4 4w e r es e l e c t e dd u et ot h e i r e f f c i e n td e g a r d a t i o no fc a r b o f u r a n t h e16 sr r n aa n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i s o l a t e sb e l o n gt ot h eg e n u so fm e t h y l o b a c t e r i u ma n db a c i l l u sr e s p e c t i v e l l y c o m b i n e d p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t s ，s t r a i nc y w - 3 2w a si d e n t i f i e da sam e t h y l o b a c t e r i u m o r g a n o p h i l i u m ，a n ds t r a i nc y w - 4 4w a si d e n t i f i e da sab a c i l l u ss u b i t i l i s b ya p is t r i pt e s t a d d i t i o n a l l y , t h i si st h ef i r s tr e p o r tt h a tc a r b o f u r a nw a sd e g r a d e db ym e t h y l o b a c t e r i u m o r g a n o p h i l i u m a n db a c i l l u ss u b i t i l i s 1o o m g lc a r b o f u r a nw a sd e g r a d e db ys t r a i n c y w - 4 4u pt 09 7 7 2 w i t h i n5d a y s w h e nt i m e - c o u r s ed e g r a d a t i o no fc a r b o f u r a nw a s e x a m i n e db yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s ，a l m o s tn oa c c u m u l a t i o no fc a r b o f u r a nw a s o b s e r v e dw i t h i n6d a y s 5 8 m g lc a r b o f u r a ni nc o n t a m i n a t e ds o i lw a sc o m p l e t e l y d e g r a d e db ys t r a i nc y w - 4 4w h i l es t r a i nc y w - 3 2 c a s tap a l lo nd e g r a d a t i o n 1o o m g l c a r b o f u r a ni ns i m u l a t e dw a s t e w a t e rw a sd e 乒a d e du pt 05 3 7 3 a n d4 1 38 b ys t r a i n c y w - 3 2a n ds t r a i nc y w - 4 4 r e s p e c t i v e l y 2 h p l ca n a l y s i sr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r ew a sn oa c c u m u l a t i o no fc a r b o f u r a n p h e n o la n dt h eo t h e rm e t a b o l i ci n t e r m e d i a t ed u r i n gt h ed e g r a d a t i o no fe a r b o f u r a nb ys t r a i n c y w - 4 4 ，w h i l ec a r b o f u r a np h e n o lw a sf o u n da c c u m u l a t e dd u r i n gd e g r a d a t i o nb ys t r a i n c y w - 3 2 a f t e r7d a y sg r o w t ha n dd e g r a d a t i o ni nc a r b o f u r a n , t h eo p t i m a l c a r b o f u r a n - d e g r a d a t i o nb ys t r a i nc y w - 3 2w a s o b t a i n e da tp h7 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 - 3 2 ， a n di n o c u l a t i o nq u a n t i t yh a dn os i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo ng r o w t ho fa n dd e g r a d a t i o no f c a r b o f u r a nr e s p e c t i v e l y g r o w t ho fs t r a i nc y w - 4 4a n dd e g r a d a t i o no fc a r b o f u r a nw e r e n o ta f f e c t e ds i g n i f i c a n t l yb yp nv a l u e ，t e m p e r a t u r ea n di n o c u l a t i o nq u a n t i t y 8 9 6 c a i b o 矗l r a nw a sd e g r a d e de v e na tp h5 p r e l i m i n a r ym e c h a n i s mo fd e g r a d a t i o nw a s i n v e s t i g a t e d b o t he c t o e n z y m ea n de n d o e n z y m eo fs t r a i nc y w - 4 4p l a y e ds i g n i f i c a n t r o l e sd u r i n gc a r b o f u r a nd e g r a d a t i o n s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tan e w p r o t e i n b a n dw a sf o u n dw h e ns t r a i nc y w - 4 4 伊o w e do nt h ec a r b o f u r a nm e d i u m i ti n d i c a t e d t h a td e g r a d a t i o na c t i v i t i e so fs o m ee n z y m e sc o u l db ei n d u c e db yc a r b o 血r a n 3 b yu s i n gs i n 百e - f a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a lc o m b i n a t i o ne x p e r i m e n t ，f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw a so p t i m i z e d ：o p t i m a lc o n d i t i o n so fs t r a i nc y w - 3 2a st h em e d i u mw a s c o m p o s e do fm e t h a n o l2 0 9 ，n h 4 n 0 32 0 9 ，k 2 h p 0 47 5 9 ，k h 2 p 0 42 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 ，c a c l 2 2 h 2 015 m g ，n a c io 5 9 ，h 2 010 0 0 m l ；t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n f o r t h es t r a i n c y w - 3 2 ：p h7 0 ；t e m p e r a t u r e3 2 。c ；r o t a t i o ns p e e d15 0 r m i n ；v o l u m e 5 0 m y 2 5 0 m 1 o p t i m a lc o n d i t i o n so fs t r a i nc y w - 4 4 o , st h em e d i u m ( ) w a sc o m p o s e do f g l u c o s e2 ，s o y b e a np o w d e r2 ，n a c l2 ，k h 2 p 0 43 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 3 t h e r e l a t i v ep a r a m e t e r si n c l u d i n g ：c u l t u r ep h6 0 ，t e m p e r a t u r e2 8 。c ，r o t a t i o ns p e e d18 0 r m i n , v o l u m e2 5 m l 2 5 0 m 1 4 b o t hs t r a i n se x h i b i t e de x t r ab i o l o g i c a lf u n c t i o n sb e s i d e sd e g r a d i n go fc a r b o 血r a n 5 0 0 m e c lm e t h a n o lw a se f f i c i e n t l yd e g r a d e dw i t h i n2 0 hi nm i n e r a ls a l t sm e d i u mb ys t r a i n c y w - 3 2 s i n g l ec e l lp r o t e i nw a sp r o d u c e dw i t hah i l g l ly i e l do f8 9 2 6 b yu t i l i z a t i o no f m e t h a n o l 嬲s o u r c eo fc a r b o na n de n e r g y t h eb a c t e r i u mw a sa l s or i c hi nv a r i o u sk i n d so f a m i n oa c i d i tw a sf o u n dt h a tt h eb a c t e r i a ls t r a i nc y w - 4 4p r o v i d e da l li n h i b i te f f e c t a g a i n s t k e yw o r d s ：c a r b o f u r a n ；d e g r a d e ；d e g r a d i n g - e n z y m e ；f e r m e n t a t i o n ；s i n g l ec e l lp r o t e i n ( s c p ) ； b a c t e r i o s t a s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 套苏 签字日期：萨揖矿6 月，7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 杏盟哀 导师签名： 签字日期： 弦g 年。l ，月少日签字日期：。黟年f 月胁日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 克百威降解菌的筛选及降解特性研究 1 引言 1 1 克百威的使用及其微生物降解 克百威为高毒性农药，国家已经规定在蔬菜、水果、茶叶、药材上限用克百威，但是从目前 的情况来看，克百威的使用量还是相当大，并且还伴随着一些不当的使用方法，导致了土壤和农 产品中大量的农药残留，对人体和动物已经造成了严重威胁1 1 。因此，如何解决克百威在自然界 中的残留和污染显得越来越重要。利用微生物降解农药残留是一种快速有效的途径2 引。 1 1 1 克百威使用情况 克百威( c a r b o f u r a n ) 是一种常用的高效广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂和杀螨剂，1 9 6 7 年由美国 f m c 公司首次合成，1 9 6 8 年注册使用【3 1 ，在生产上一般使用的是克百威颗粒剂。基本性质如表 1 表1 克百威的基本性质 t a b l e 1b a s i cp r o p e r t i e so f c a r b o f u r a n 名称克百威 分子式 结构式 分子量 物理状态 熔点 蒸汽压 水中溶解度 易燃程度 有机溶剂 稳定性 半衰期 c 1 2 h i s n 0 3 6 尔嚣 2 2 1 3 8 纯品为白色结晶，原药为淡黄褐色 1 5 3 1 5 4 3 3 时2 7 1 0 0 p a 2 5 c 时7 0 0 m g l 不易燃，但可点燃 可溶于多种有机溶剂，难溶于二甲苯、石油 醚、煤油 碱性介质中易分解 p h 为6 ，7 ，8 时，降解半衰期分别为6 9 0 周， 8 2 周，1 0 周( h e a l t ha n dw e l f a r e c a n a d a ，1 9 9 1 ) 土壤中降解半衰期为2 6 11 0 d 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 克百威具有触杀、内吸与胃毒作用，兼有杀虫、杀螨和杀线虫生物活性，对多种害虫有效， 目前己在四十多种作物的近二百种害虫的防治上注册使用【3 】。可用于棉花、玉米、甘蔗、水稻、 花生、大豆、谷子等作物上害虫的防治，对棉蚜、蓟马、线虫、蚜虫、叶蝉、地老虎等害虫均有 特效。 克百威用量大、毒性高、难降解。原药对大鼠急性口服l d 5 0 为8 1 4 m g k g ，对禽鸟类的经 口急性毒性l c 5 0 在t m g k g 以下【4 1 。鸟类摄食克百威颗粒染毒的植物，捕食或摄食昆虫、土壤无 脊椎动物的染毒活体或尸体，及饮用受污染的水，均可造成中毒致瘫和死亡。因此，克百威对野 生动物几乎无安全剂量可言 7 1 。1 9 9 5 年对我国东北地区克百威使用情况及其对鸟类潜在危害性的 初步调查分析结果表明，该地区共有国家一、二级重点保护鸟类8 6 种或亚种其中有8 5 的鸟类 将有可能受到克百威的危害影响i 引。 克百威对地下水资源的污染十分严重，据国家环保局南京环科所的研究报道，克百威、涕灭 威等农药施用后，在一些地下水位较高、沙性重的土壤地区，农药极易进入地下水中，农药一旦 进入地下水，极难降解，降解半衰期常在一年以上。由于地下水被污染后难以进行处理，并进入 水井、河流等饮用水源，对人类的生存环境造成了极大的威胁【6 7 ，1 8 , 1 9 2 0 2 1 2 3 1 。然而，克百威又 有其不可忽视的农业杀虫作用，据加拿大农业部门和制造商分析，使用克百威具有高效、价廉的 优点，若用其他替代品，不仅效果逊色，价格也高，而且会使害虫对替代品的抗药性进一步增强， 最终将导致成灾面积扩大，用药成本增加。鉴于此，目前国外也尚未全部禁止克百威的使用【4 】。 2 0 0 5 年，美国路易斯安那州农业和林业部向e p a 提出了紧急例外申请，允许使用f m c 公司的 杀虫剂产品3 克百威颗粒剂防治水稻稻水象甲1 6 3 | 。 我国的农药的使用情况十分复杂，长期不合理、超剂量使用化学农药，使得害虫抗药性逐年 增强，抗药性的增强又迫使农业生产者不断加大农药的用量和使用次数，农药的浓度越用越大， 高残留农药和剧毒农药的使用也越来越广，甚至有人将克百威施用于蔬菜产品上，使农产品的残 留严重超标，大大降低了农产品的质量。我国出口的农副产品由于残留量超标被拒收、退货、销 毁的现象常有发生，每年因残留量超标造成的外贸损失高达7 0 亿美元 9 , 1 0 , 1 i l 。同时，农药厂排出 的污水和施入农田的农药也对环境造成严重的污染，破坏了生态平衡，影响了农业的可持续发展。 农药的不合理使用给人类及生态环境造成了越来越严重的不良后果，农药的污染问题已成为 全球关注的热点。因此，农业生产上在规范使用这农药的同时，必须加强促进农药残留的降解研 究和应用。由于氨基甲酸酯杀虫剂的酯结构相对有机磷杀虫剂而言较为稳定，除了传统的化学降 解和物理降解，微生物降解以其成本低廉，施用方便的优点，成为目前最具前景的一种方法1 1 2 1 6 , 2 2 1 。 1 1 2 克百威降解途径 1 1 2 1 水解：克百威在水分子作用下生成氨基甲酸和酚，氨基甲酸很快分解成甲胺和二氧化碳， 而酚则被氧化成多羟基衍生物，再发生环断裂，最终生成c 0 2 、n 2 、h 2 0 等简单化合物【3 引。 1 1 2 2 光解：克百威对光稳定，光照下克百威只发生轻微的氧化反应。 2 克百威降解菌的筛选及降解特性研究 1 1 2 3 微生物降解：由于长期使用克百威，土壤中的微生物群体也会随之发生变化，逐渐会产生 一些能够利用克百威作为能量和氮源的个别微生物，这些微生物在对克百威的降解中发挥了巨大 的作用。微生物降解农药分为矿化和共代谢作用【8 l 。矿化作用是微生物能够利用农药作为碳源或 氮源生长，最终使农药降解为无毒的无机物，二氧化碳和水，是最理想的降解方式。共代谢作用 是指微生物不能降解农药，但是在添加了辅助营养物的时候，可将农药部分降解【2 4 1 。虽然共代 谢不能够彻底降解污染物，但通过共代谢的转化，可能使得污染物更容易被其他的降解菌所降解， 从而加快农药从环境中的降解速度。 1 1 3 降解克百威的微生物 农药降解菌有细菌、真菌、放线菌和一些海洋微生物，细菌由于其生化上的多种适应能力和 容易诱发突变菌株，从而在农药降解中占有主要地位【2 5 , 5 4 】。 氨基甲酸酯类农药较难被微生物降解，目前已报道的克百威降解菌仅有：p s e u d o m o n a s 、 f l a v o b a c t e r i u m ，、a c h r o m o b a c t e r i u m 、s p h i n g o m o n a s 和彳，抽厂d 6 口c f p r 等。 f e l s o t 分离到一株p s e u d o m o n a s ，不能以克百威作为唯一氮源，在肉汤培养基中降解5 0 0 m g l 的克百威，完全降解需要4 0 d a ) ，s 【2 6 】。 k a m s 通过两个月的富集培养，分离到一株彳幽r d m d 6 口c 灯，以浓度为2 0 0 m g l 的克百威作唯 一氮源，在4 8 h 内就可以完全将其降解1 2 丌。 c h a u d h r y 等人从长期使用克百威的土壤中分离出十五株能够降解克百威的细菌，经鉴定多属 于p s e u d o m o n a s 和只a v d 6 卵幼妇m 【2 引。其中6 株是以克百威作唯一氮源，7 株以克百威作唯一碳 源，2 株既可以以克百威作氮源，又可以作碳源。 r a m a n a n d 通过2 个月的驯化培养，从土壤中分离出一株降解菌a r t h r o b a c t e r 在3 5 条件下， 1 2 0 h 内降解率达到8 0 ，并且可以同时降解西维因四】。 h e a d 筛选出一株降解菌f l a v o b a c t e r i u m ，4 8 h 内基本能完全降解0 2 5 r a m 的克百威，并且在 2 0 0 n m - - 3 0 0 n m 之间检测不到代谢产物的积累 3 0 1 。 f e n g 等从土壤中分离出十五株降解菌，但是只有两株可以降解克百威结构中的苯环，其中 一株s p h i n g o m o n a ss p c f 0 6 在以克百威作唯一碳源的时候，培养4 8 h 后培养基中会产生红色物 质，继续培养3 0 d 后，颜色变成微黄色【3 。三年后，o g r a m 和f e n g 等人再次分离到两株高效降 解菌s p h i n g o m o n a ss p a t 和s p h i n g o m o n a ss p c d 。这两株菌的活性要比先前的菌株c f 0 6 高的多， c f 0 6 要在培养几天后才能达到指数增长期，而菌株a t 和c d 在2 d 内就可以达到同样的水平p 2 。 k i m 等人同样分离出一株s p h i n g o m o n a ss p s b 5 ，但与s p h i n g o m o n a ss p c f 0 6 没有任何同源 性。菌株s b 5 在接种2 4 h 达到最大生长菌量，1 2 h 几乎能够完全降解克百威，4 8 h 能够完全降解 克百威的初级降解产物呋喃酚【3 引。 国内对克百威的微生物降解研究比较少，刘宪华等人从河北卢龙县长期受农药污染的土壤中 分离到西p “如小d 刀甜s p a e b l 3 该菌具有较长的生长延滞期，可长达4 8 h ，随着菌株生长的开始， 克百威开始被降解，1 2 0 h 降解率为9 6 2 【3 4 3 5 1 。同时还进行了受污染土壤的生物修复试验。 南京农大李顺鹏和武俊等人从活性污泥中筛选出一株高效降解菌s p h i n g o m o n a ss p c d s 1 ，降 解1 0 0 m g l 的克百威仅需要1 4 个h ，降解2 0 0 m g l 的克百威t g r 需7 2 h 3 6 1 。该菌株已经申请专利， 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 并投入生产用以消除土壤中的农药残留，取得了良好的经济效益。 近几年，研究者分离到的克百威降解菌降解效果越来越显著，打破了氨基甲酸酯类农药难以 降解的传统说法，为氨基甲酸酯类农药的微生物降解研究奠定了基础。 1 1 4 微生物降解克百威代谢途径 微生物能够利用农药作为碳源或者氮源维持自身生长，通过产生降解酶使农药发生水解和氧 化等作用，微生物降解农药的主要方式是酶促降解，即化合物通过一定的方式进入细菌体内，然 后在各种酶的作用下，经过一系列的生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的 无毒或毒性较小的化合物的过程p 丌。 c h a u d h r y 等人研究了氨基甲酸酯农药呋喃丹在细菌中的代谢机制随北5 3 1 。他们从有呋喃丹杀 虫剂施用历史的土壤样品中分离出来十五株能够降解呋喃丹的细菌。这些菌株经鉴定属于假单胞 杆菌和产黄杆菌属。其中有两株细菌可利用呋喃丹作为唯一的碳源。它们能迅速降解呋喃丹，经 过放射性标记，大于4 0 的呋喃丹能够在数h 内降解为二氧化碳释放出来。这个结果表明这两种菌 株通过氧化途径降解呋喃丹。 o g r a m 3 2 提出微生物降解克百威的降解途为： 一，叹刃 c h ， ( = ：a r b o r u g m l r i p h e n o l+ n “，c i l m h y | m ij n _ 4 - 但是随后l ( i m 等人提出呋喃酚降解的下一步产物可能不是2 - h y d r o x y c a r b o f u m up h e n o l ，而是 2 - h y d r o x y - 3 - ( 3 - m e t h y l p r o p a n - 2 - 0 1 ) p h e n o l l 3 3 1 。同样，南京农大武俊通过g c m s 方法也测得了呋喃 酚的代谢产物为：2 羟基3 叔丁醇基苯酚。并确定了降解后期产生的刺激性气味的化合物为为藏 茴香酮p 引。 克百威降解过程中一般会产生一种红色物质，但对于这种红色物质的成分还没有具体的报 道，只有武俊等人提i t 2 , 4 二叔丁基苯醌可能是导致红色产生的一种物质【3 引。 1 1 5 降解菌的基因克隆表达 细菌抗药性基因基本上都在质粒上，质粒是染色体外的遗传因子，它的基本特性之一是能寄生 在寄主细胞内，并和寄主细菌进行同步复制，在细菌细胞分裂时，它能稳定地传给后代细胞。也有少 数编码细菌降解功能的基因位于染色体上。 农药降解菌研究最为详细的是2 ，4 - d 降解菌彳f c 口，i l ，研嚣翻舰脚心瓜但1 3 4 椎删。克百威降解菌 4 克百威降解菌的筛选及降解特性研究 的分子研究还不是太多，t o m a s e k 从克百威降解菌a c h r o m o b a c t e rs p w m ll l 克隆出一段1 4 k b 的水 解酶基因m c d ，并通过酶切进一步定位n 3 k b ，证实此段基因位于一个l o o k b 的质粒p p d l ll 上【4 。 m c 瑾因在p s e u d o m d 嬲p u t i d a , a l c a l i g e n e se u t r o p h u s , a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e 如l l s , a n d a c h r o m o b a c t e r p e s t i f e r 都很难表达，而转到大肠杆菌中后，没有任何表达。可能是因为这些阴性 菌的r n a 聚合酶不能识j b l j m c d 的启动区或者不能有效地完成翻译。 但是m e d 并不是在每一株克百威降解菌上都存在，s t e p h a n ed e s a i n t 等人对1 2 8 株克百威降解菌 进行分析，只监澳y n 5 8 株含有m c 4 引：n i s h a 对5 5 株降解菌的质粒用 l c d 进行杂交，发现只有2 2 株与m c d j 善有同源性【4 9 , 5 0 。 h e a d 发现降解菌f l a v o b a c t e r i u m 在没有克百威选择压力的条件下，其降解呋喃酚的能力会急 剧下降，在用a w 6 口c 幼彳“m 中检测到一个大于1 9 9 k b 的质粒p l h 3 ，证实了此质粒与克百威降解产物 呋喃酚的进一步降解有关 3 0 1 。 f e n g 等检测到c f 0 6 含有5 个质粒，p c f o l ，p c f 0 2 ，p c f 0 3 ，p c f 0 4 ，p c f 0 5 。质粒消除实 验表明这些质粒与降解有关，但是具体是哪一个或多个质粒还不清楚。向p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s m 4 8 0 r 中导入这些质粒能够赋于该菌株利用克百威作为唯一生长和能量所需碳源的能力。通过 t n 5 转座子插入寻找降解酶基因，但是由于包含的质粒太多，t n 5 对质粒进行了重排，删除和缺 失等作用，产生了多种类型的突变体，难以确定降解酶基因的位置。这些质粒大都富含插入序列， 测定了i s l 4 1 2 的碱基序列，长度为1 6 5 6 b p ，末端有一段反向重复序列，并且有一个开放型阅读 框架。4 2 下热处理菌株，检测到一个突变体但是这株均却没有缺失任何质粒，s o u t h e n 杂交表 明是由于一段i s 序列从p c f 0 2 , p c f 0 3 上移动到p c f 0 4 上，同时p c f 0 4 被删除了一段【3 ”2 5 1 】。 1 1 6 克百威微生物降解研究前景 1 1 6 1 降解真菌的研究：目前利用微生物降解氨基甲酸酯类农药的研究还相对较少，尤其是克百 威，分子量大，化学结构复杂，可降解性差，目前的研究还主要集中在细菌上，真菌对克百威的 降解研究较少。但是真菌自身稳定性好，在应用中更有实际价值，因此分离研究克百威降解真菌 是一个很有前景的方向【5 6 , 5 7 , 5 9 。 1 1 6 2 菌株联合降解：一般实验室研究多是集中到某一特定菌株上，但是克百威化学结构复杂， 在其代谢过程中会产生积累新的有毒物质呋喃酚等，仅靠单一菌株很难完全降解，而且单一的菌 株在投放到自然界后很容易丧失优势。实际上在自然界中农药的降解都是靠多种菌株共同作用， 一种微生物降解一部分，数种微生物相互协同作，经过多步反应将农药完全矿化【5 钔。因此研究菌 株的联合降解更具有实际意义。 1 1 6 3 降解基因的克隆：微生物降解克百威的途径还不明确，可能存在多种降解途径，控制降解 作用的基因也可能存在多个。目前已经克隆到了一种水解酶基因m c d t 4 刀，还没有发现其他控制降 解的基因。分子生物学技术的应用，大大缩短和简化了研究时间和过程。利用现代分子技术，将 多个降解基因整合到一种降解菌上，并得到表达，构建超级降解菌是现在研究的热点。 5 霹= l 艺农业大学硬士学位( 毕业) 论文 1 2 研究目的及意义 本研究黧在能够筛选崮高效降解克吾威的微生物菰株，剩爝徽生物蘩株加快克孬威残容的降 解，降低农药残留对生物和环境的危害。 6 克百威降解菌的筛选及降解特性研究 2 1 材料与仪器 2 1 1 菌株来源 2 试验材料 样品采自山东华阳农药厂废水处理池污泥，排污口废水，附近农田土壤及河北卢龙县长期受 克百威污染的土壤。 2 1 2 试剂与药品 p c r 产物回收试剂盒 a p i5 0 c h b 细菌鉴定试剂条。 9 8 克百威原药由河北科绿丰农药公司赠送，用甲醇或二甲基亚砜配成5 0 ，0 0 0 m g l 的母液。 双缩脲试剂：1 5 9c u s 0 4 5 h 2 0 和6 0 9 酒石酸钾钠溶于5 0 0 m l 蒸馏水中，在搅拌的情况下加 入3 0 0 r o l l 0 的n a o h ，加水至1 0 0 0 m l 。 2 1 3 主要仪器 紫外可见光光度计，高效液相色谱( a k t ap u r i f i e r1 0 0 ) ，p c r 仪，电泳仪，凝胶成像系统， 电子天平，生化培养箱，恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，超声波破碎仪，超声波清洗仪， 细菌过滤器，真空泵，p u 计。 2 2 培养基与缓冲液 克百威基础培养基：k 2 h p 0 47 5 9 ；k h 2 p 0 42 0 9 ；m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ；c a c l 2 2 h 2 01 5 m g , n a c l0 5 9 ；( n h 4 ) 2 s 0 42 0 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l 。1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。冷却后加入克百威原药。 甲醇基础培养基：k 2 h p o , 7 5 9 ；k h 2 p 0 42 0 9 ；m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ；c a c h 2 h 2 01 5 r a g ；n a c l 0 5 9 ；( n h 4 ) 2 s 0 42 0 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l 。1 2 1 灭菌2 0 r a i n ，冷却后加入甲醇。 l b ：胰蛋白胨1 0 0 9 ；酵母粉5 0 9 ；n a c l5 0 9 ：蒸馏水1 0 0 0 m l 。 固体培养基在上述液体培养基中加入1 2 的琼脂。 p b s 缓冲液：称取8 0 9n a c i 、o 2 9k c i 、2 9 9n a 2 h p 0 4 和o 2 9k h 2 p 0 4 ，溶于8 0 0 m l 蒸馏水 中，用h c i 调节溶液的p h 值至7 4 ，最后加蒸馏水定容至l l 即可。高压下蒸气灭菌。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 3 试验方法 3 1 克百威降解菌的筛选与鉴定 3 1 1 克百威降解菌的分离 样品分别采集于山东华阳农药厂活性污泥，排污i z l 废水，工厂附近玉米田，河北卢龙县污染 土壤。取样品1 0 9 接种于1 0 0 m l 基础培养基中，克百威浓度为1 0 0 m g l ，于2 8 c ，1 8 0 r m i n 摇 床培养l 周，以l 的接种量转接入2 0 0 m g l 的新鲜培养基中继续培养，以后每周转接一次，克 百威浓度逐步提高，克百威浓度保持在5 0 0 m g , l 培养驯化2 周，最后在固体基础培养基上稀释涂 板，挑取单菌落。 3 1 2 克百威降解菌的生理生化鉴定 菌株c y w 3 2 生理生化鉴定参照常见细菌系统鉴定手册进行【6 0 1 ；菌株c y w - 4 4 生理生 化鉴定参照a p i5 0 c h b 试剂条说明书进行。 3 1 3 克百威降解菌的分子生物学鉴定 3 1 3 1 细菌基因组d n a 的小量提取：挑取细菌单菌落，接入到5 m l 液体l b 中培养过夜，采用 碱裂法【6 1 1 提取细菌染色体总d n a ，操作如下： ( 1 ) 取1 5 m l 对数生长期细菌，1 2 0 0 0 r m i n 离心l m i n ，弃上清。 ( 2 ) 加入5 0 0 lt e ，颠倒混匀，使沉淀充分悬浮。 ( 3 ) 加入3 0 止1 0 的s d s ，3 止蛋白酶k ，充分混匀，3 7 水浴l h 。 ( 4 ) 加入l o o 此5 m 的n a c l ，充分混匀。 ( 5 ) 加入8 0 止c t a b n a c i 液，充分混匀，6 5 水浴保温2 0 m i n 。 ( 6 ) 加入等体积酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 混匀，1 2 0 0 0 r r a i n 离心。 ( 7 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 混