（物理化学专业论文）氨基酸柱前衍生化hplc方法发展及应用.pdf

南京理工大学硕士学位论文 氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 摘要 氨基酸是蛋白质的基本单元，是人体完成生理功能的必须物质。发展普适性广、 灵敏度高、分离效能好、重复性优良的h p l c 分析方法，一直是分析化学领域探索的 重要课题。 分别以邻苯二甲醛( o p a ) 及2 , 4 二硝基氟苯( d n f b ) 为衍生化试剂，发展氨基酸的 柱前衍生h p l c 分析方法。考察了柱温、衍生试剂用量、反应时间及流动相p h 值等 因素对分析结果的影响。结果表明，柱温对分离选择性的影响很大，改变柱温甚至可 能影响到氨基酸d n f b 衍生产物( d n p a a ) 的出峰顺序；衍生反应时间对o p a 衍生氨 基酸的定量分析影响显著。 为弥补单一色谱填料分离选择性的不足，通过对d n p - a a 在6 种不同c 1 8 填料 上分离行为的考察，发展了“串联”和“混装”的色谱柱模式。采用c 1 8 b 与c 1 8 s a 串联的操作模式，可以使d n p - a a 的分离选择性得到较大改善。而以c 1 8 b 和c 1 8 s a 填料混合装填色谱柱进行d n p - a a 的分离，所得峰形、柱效等更佳。 基于发展的新方法，测定了啤酒、冬虫夏草等实际样品中的氨基酸，并对样品的 预处理方法加以改进。结果表明，方法具有很好的普适性。 关键词：氨基酸柱前衍生化邻苯二甲醛2 , 4 二硝基氟苯新型h p l c 柱 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 a b s t r a c t a m i n oa c i d , w h i c hi st h eb a s i cu n i to f p r o t e i n s ，i so n eo f t h ei m p o r t a n tc o m p o u n d st o h u m a nb e i n g t h u s ，i th a sa l w a y sb e e na l li m p o r t a n tt h e m ei nt h ef r o n t i e ro fa n a l y t i c a l c h e m i s t r yt od e v e l o pw i d e l y - s u i t e dh p l ca n a l y s i sm e t h o df o ra n l m oa c i d sw i t hh i g h s e n s i t i v i t y , g o o ds e p a r a t i o na sw e l la sg o o dr e p r o d u c i b i l i t y t h e h i pp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d sw i t h p r e - c o l u m n d e r i v a t i z a t i o nf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa m i n oa c i d sw e r ed e v e l o p e d ，w h i l eo p aa n dd n f b w e 北u s e da st h ed e r i v a t i z a t i o na g e n t s s e v e r a lf a c t o r s ，s u c ha sc o l u m nt e m p e r a t u r e ，t h e q u a n t i t yo fa g e n t s ，r e a c t i o nt i m ea n dt h ep ho fm o b i l ep h a s ew e r ei n v e s t i g a t e d , a l lo f w h i c hh a de f f e c to l lt h ea n a l y s i sr e s u l t s a st h er e s u l t s ：t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ec o u l d t a r g e l ya f f e c tt h es e l e c t i v i t yo fs e p a r a t i o n , a n ds o m e t i m e se v e nt h ep e a ko r d e ro fa m i n o a c i d sd n f bd e r i v a t e s ( d n p - a a ) ；w h i l e ，t h ee f f e c to fd e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o nt i m eh a do n t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f a m i n oa c i d so p a d e r i v a t e sw a sd r a m a t i c a l l y t oi m p r o v et h ep o o rs e l e c t i v i t yo fs o l o - p a c k i n gc o l u m n s ，t h el i n km o d e la n dt h e c o m b i n e dm o d e lo f t w od i f f e r e n tp a c k i n gm a t e r i a l sw e r ee s t a b l i s h e d , a f t e rt h es e p a r a t i o n b e h a v i o ro f5d i f f e r e n tc 1 8p a c k i n gm a t e r i a l si n v e s t i g a t e d 谢t hd n p - a a i tp r o v e dt h a t t h el i n km o d e lu s i n gc 1 8 - ba n dc 1 8 s ac o u l dg r e a t l yi m p r o v et h es e l e c t i v i t y , w h i l et h e c o m b i n e dm o d e lw i t ht h et w op a c k i n g sc o u l da c h i e v eb e t t e rp e a ks h a p ea n dc o l u m n e f f i c i e n c y b yt h ee s t a b l i s h e dm e t h o d sa b o v e ，t h ea m i n oa c i d so fs o m ea c t u a ls a m p l e s ，s u c ha s b e e ra n dc o r d y c e p ss i n e n s i s ，w e r em e a s u r e d m e a n w h i l e ，t h em e t h o d so fs a m p l e p r e t r e a t m e n tw e r ei m p r o v e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n a l y s i sm e t h o d sc o u l db ew i d e l y s u i t e d k e y w o r d s ：a m m oa c i d s ；p r e - c o l m u nd e r i v a t i z a t i o n ； o - p h t h a l d i a l d e l h y d e ； 2 ，4 - d i n i t r o f l u o r o b e n z e n e ； n e wh p l cc o l u m n 2 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：虚渣年月日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的全部我部分内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：年月日 南京理工大学硕士学位论文氧基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 l 绪论 1 1 氨基酸 1 1 1 氨基酸的定义 羧酸分子中烃基上的一个或几个氢原子被氨基取代的化合物叫做氨基酸，它是一 种小分子的两性化合物，相对分子量在7 5 - 2 0 0 之间，是构成蛋白质的基本单元，其 化学通式如图1 1 1 所示。 h r c e o o h n h 2 图1 1 1 氨基酸化学通式 1 1 2 氨基酸的分类 1 1 2 1 基本氨基酸 氨基酸的种类繁多，有成千上万种，其中与人类生活息息相关的基本氨基酸有 1 8 种，表1 1 2 1 列出了1 8 种基本氨基酸的种类及基本性质。 表1 1 2 1 基本氨基酸砷类及基本性质【1 1 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 6苏氨酸t h r e o n i n et h rt1 1 9 1 2 7 精氨酸 a r g i n m ea r g r1 7 4 2 0 8 丙氨酸 a l a n i n ea l aa8 9 0 9 y1 8 1 1 9 l o缬氨酸v a l i n ev a l v 1 1 7 1 5 m1 4 9 2 1 w2 0 4 2 2 1 3 异亮氨酸 i s o l e u c i n ei l ei1 3 1 1 7 1 4 苯丙氨酸p h e n y l a l a n i n e p h ep1 6 5 1 9 旧q 譬i 0 删 hh ”a c 一宁一f e h c h h 2 叩。8 一置霄洲 峙舻觜舻 ”乒一“c z - 占c 。- l c 。- - ：e o o h 岔盱p 1 5 亮氨酸l e 妇协l 1 3 1 1 7 峪1 宁n h 呻z 删 1 6 脯氨酸p r o l i n e p r op儿5 1 3 “2 6 、n ，i 一。o o h h 2 牛一9 1 7 赖氨酸 l y 。m cl y 。 k 1 4 6 1 9 喇一哥哥r 贯蛰 1 8 半胱氨酸c y 。钯i 。( ：y s c1 2 1 1 2 h s 一 謦。一 1 1 2 2 根据旋光性分类 分子旋光性一般分为两种，一种是左旋，l 型；一种是右旋，d 型。通常情况下， 2 附 删 如瑚 吨也 霄 ： h 严丫n 一： 一h 即尊r c 妒 。硝峪 南京理工大学硕士学位论文氨摹酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 在生物体内出现的氨基酸都是l 型，而d 型氨基酸仅在少数微生物来源的多肽中出 现 2 , 3 1 。 1 1 2 3 根据酸碱性分类 根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同，可以将其分为酸性氨基酸、中性 氨基酸、碱性氨基酸。酸性氨基酸主要包括g l u 、a s p ：碱性氨基酸主要有：l y s 、a r g 、 h i s ；其余基本氨基酸均为中性氨基酸。 1 1 2 4 从营养学角度分类 营养学上将氨基酸分为两大类，必需氨基酸和非必需氨基酸。对成人来说，必需 氨基酸有8 种，包括l y s 、m e t 、l e u 、i l e 、t h r 、v a l 、t r p 和p h e 。对婴儿来说，h i s 也是必需氨基酸。非必需氨基酸包括g l u 、a l a 、a r g 、g l y 、a s p 、c y s 、p r o 、s e t 和 t y r 1 1 3 氨基酸的应用【4 5 】 1 1 3 1 临床、医学方面的应用 氨基酸在医药上的应用很广，各种氨基酸及氨基酸衍生物达1 0 0 多种。例如，氨 基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。又如， a r g 药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；s e t 药物用作疲劳恢复剂；m e t 、c y s 用于 治疗脂肪肝；g l y 、o l u 用于调节胃液等。 1 1 3 2 农业方面的应用 农业上，一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但它们能干扰植物与病原菌之间的生 化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而达到杀菌的目的。例如，p h e 和 a l a 可用于治疗苹果疮痂病。l y s 、m e t 添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改 善肉的质量。 1 1 3 3 食品方面的应用 食品工业中，g l y 、a l a 具有甜味，a s p 、o l u 具有酸味，谷氨酸钠、a s p 具有鲜 味，它们都可用作食品添加剂。l y s 、m e t 等人体必需的氨基酸常作为食品添加剂， 用以提高食品的营养价值。 1 1 3 4 其它方面 此外，氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤p h 和保护皮肤的功 能，现已广泛用于配制各种化妆品。例如，c y s 用于护发素中，s e t 用于面霜中。又 3 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 如，g l u 、g l y 、a l a 与脂肪酸形成的表面活性剂，具有清洗、抗菌等功能。用于护肤 品、洗发剂中。 综上不难看出，氨基酸与人类生活密切相关。 1 2 氨基酸f i p l c 分析 由于氨基酸对人类生活的重要性，氨基酸分析也一直是分析领域研究的重要课题 之一 1 2 1 氨基酸分析的发展 1 9 5 4 年，h i t s 、m o o r 、s 画n 【6 川较早提出采用磺酸盐离子交换树脂分析氨基酸， 并在此后几年将此项技术进一步发展；1 9 5 8 年，s p a c k m a n 、m o o r 、s t e i n 合作嘲研制 出世界上第一台用离子交换树脂和柱后茚三酮衍生检测法的自动氨基酸分析仪，使氨 基酸定量分析进入一个崭新的阶段。2 0 世纪6 0 至8 0 年代，氨基酸分析的速度、灵 敏度、自动化程度均大大提高 9 - 1 4 1 。2 0 世纪8 0 年代中后期，柱前衍生h p l c 方法已 逐渐占据主导地位n 习。其中，激光诱导荧光检测器在h p l c 中的应用，使检测灵敏 度提高到一个新的台阶【1 6 1 。2 0 世纪9 0 年代戴安公司开发了a a a - d i r e e tt m 氨基酸分 析系统，采用积分脉冲安培检测器直接检测。近年来，质谱、核磁与h p l c 联用技术 引入氨基酸分析，大大提高了定性分析的准确性1 1 7 - 1 9 1 。 1 2 2 氨基酸h p l c 分析方法的分类 氨基酸h p l c 分析，按是否衍生可分为两大类：一类是直接分析法；另一类是衍 生化间接分析法刚。 1 2 2 1 直接分析法 近年来，氨基酸直接分析法得到迅速发展，基于离子交换色谱的氨基酸分析仪己 成为直接分析法的主流，戴安公司上世纪推出的氨基酸a a a - d i r e c t l m 系统就是此种 方法的代表，采用高效阴离子交换色谱积分脉冲安培捡n 法( h p a e c i p a d ) 。此法可 同时对一级和二级氨基酸进行检测，无需柱前、后衍生，直接进样；分离效果好、灵 敏度高、操作简单。但此类氨基酸分析仪专属性强，价格昂贵，大大限制其推广与应 用【2 1 2 2 1 。 l 2 2 2 衍生化间接分析法 由于氨基酸种类较多，结构相近，大部分没有紫外或荧光响应，为提高分析检测 的灵敏度和分离选择性，将氨基酸衍生化，接上发光或发色基团，再进行定性定量分 析，此种方法称为衍生化间接分析法。 4 南京理工大学硕士学位论文 氨基酸柱前斯生化i - i p l c 方法发展及应用 衍生化间接分析法按衍生时间的不同分为两大类：一种是柱前衍生法；另一种是 柱后衍生法。 在线柱后衍生是将样品组分先经色谱柱分离，再进行衍生化处理并检测的过程。 常用衍生试剂如茚三酮嗍、邻苯二甲醛】柱后衍生技术与柱前衍生技术相比叫掰l 有以下优点：反应重复性好；未被衍生的化合物若有吸收时，也可同时进行分离和检 测。其主要缺点：衍生化条件的自由度有所限制；由于衍生反应在特定反应器中进行， 常造成色谱峰展宽，使分离度降低；过量试剂或试剂的水解产物可能造成干扰；通常 需要特定的设备配件。 柱前衍生化，样品组分经过特定的化学反应，转变为发光或发色衍生物，再进行 色谱分离测定，该方法有以下优点：通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应 完全；为了使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可以任意选定衍生化条件；柱前衍 生化反应的溶剂不必与分离时的流动相相匹配；衍生化的副产物可进行预处理以降低 或消除其干扰。其主要缺点表现在：柱前衍生化反应形成的副产物可能对色谱分离造 成较大干扰，有时严重影响衍生化反应的重复性：衍生物的水解，反应溶剂的杂质组 分造成大量干扰峰。 相比之下，柱前衍生法对仪器要求相对更低，且优点更为突出，普适性广，应用 更为广泛。 1 2 3 氨基酸柱前衍生试剂 1 2 3 1 柱前衍生试剂的一般要求 常用柱前衍生试剂一般需要具备以下几个特点 2 7 - 2 9 1 ： 1 ) 摩尔吸光系数大； 良好的发光或发色性能，与被标示的生物基质结合后特性不减弱； 3 ) 可与被标示物通过物理或化学作用结合，未结合的标示剂及其水解产物易于 清除或分离； 4 ) 与背景对比明显，以避开杂质的干扰，提高检测灵敏度； 5 ) 标记反应条件温和，确保被标示的生物基质原有化学性质不被破坏： 6 ) 易于合成、保存，无毒； 7 ) 形成的衍生物在乙腈和甲醇中有足够的溶解度； 8 ) 衍生产物稳定性强。 1 2 3 2 主要柱前衍生试剂 1 2 3 2 1 荧光胺 荧光胺，f l u o r e s c a m i n e ( 简称f a ) 。1 9 7 2 年，u d e n f f i e n d ( 3 0 l 等人发现p h e 和茚三 5 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h t l c 方法发展及应用 酮的产物通过氧化脱羧后形成苯乙醛，在过量茚三酮的存在下能迅速与氨基酸形成强 荧光产物。随后鉴定这一中间体的结构并命名为荧光胺，荧光胺与氨基酸的反应方程 式如图1 2 - 3 2 1 所示。 o o 早 + h 2 n _ 昌_ e o o h r 图1 2 3 2 1f a 与氨基酸反应方程式 通常情况下，一、二级氨基酸、醇、水等都能与荧光胺起反应，但只有一级氨基 酸形成荧光衍生物。因此，该试剂具有一定选择性，能同一级氨基酸在p h = 9 和室温 条件下瞬时反应，衍生产物具有高荧光强度，而试剂本身则迅速水解成不带荧光的产 物，不影响分析，是一种理想的柱前衍生化试剂。其荧光激发波长3 9 0 r i m ，发射波长 4 7 5 t l m t 3 l , 3 2 1 。 1 2 3 2 2 异硫氰酸苯酯 异硫氰酸苯酯，p h e n y li s o t h i o e y a n a t e ，简称p i t c 。它早期主要是作为异硫氰酸 甲酯的替代出现【3 3 1 。随着p 1 t c 衍生氨基酸技术的不断完善，近年来，p i t c 法已成 为普遍用于r p h p l c 分析氨基酸的方法之一。室温下，p i t c 与氨基酸反应生成苯氨 基硫甲酞衍生物( p t a - a a ) ，在原有氨基酸结构中引入苯环，使氨基酸极性大大降低， 衍生反应可在5 m i n 1 0 m i n 内完成，反应方程式如图1 2 3 2 2 所示。由于试剂具有挥 发性，所以需用过量试剂进行反应，反应后剩余试剂通过减压蒸馏法去除，再进行色 谱分离。 岔蟛+ h 2 n p 。一岔 ；八h n 一洳r 一 图1 2 3 2 2p i t c 与氨基酸反应方程式 p i t c 可与一级和二级氨基酸同时反应；衍生产物单一、稳定，冻干的衍生产物 2 0 c 可贮存3 0 d ，4 c 水溶液中可贮存3 d ，色谱响应值无明显变化。但样品的制备较 为繁琐，需预先去除剩余试剂，而且虽然严格操作，但存在于样品中的痕量p i t c 试 剂也会缩短分析柱的寿命 3 4 - 3 6 。 1 2 3 2 3 氯甲酸芴甲酯 氯甲酸芴甲酯，9 - f l u o r e n y lm e t h y lc h l o f f o r m a t e ，简称f m o c c 1 。通常情况下， 南京理工大学硕士学位论文 氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 f m o c - c 1 与氨基酸反应，生成一种具有强荧光的产物f m o c - a a ，反应方程式如图 1 2 3 2 3 所示。可用荧光检测，激发波长为2 6 5 n m ，发射波长为3 1 0 r i m ；也可用紫外 检测。 ”声- o - ：a o + h 2 n 一8 一c o 。i r h 2 c 、o ， o 1 4 一 n 、g c o o r 图1 2 3 2 3f m o e - c l 与氨基酸反应方程式 f m o c - c 1 能够同时与一级和二级氨基酸反应，反应迅速，可在3 0 s 内完成；衍 生产物需迅速用戊烷萃取，萃取所得化合物稳定，在室温可稳定保存1 3 d ；试剂本身 及其水解产物( f m o c o h ) 有荧光，色谱分离中会产生一定干扰；与组氨酸形成的衍 生物不稳定，影响定量【1 5 3 7 - 3 9 1 。 1 2 3 2 46 - 氨基喹啉基琥珀酰亚胺基甲酸酯 6 氨基喹啉基i 琥珀酰亚胺基甲酸酯，6 - a m i n o q u i n o l y l - n - h y d r o x y s u c c i n i m i d y l c a r b a m a t e ，简称a q c 。a q c 是一种较新的柱前衍生试剂，也是近几年应用较为广泛 的氨基酸柱前衍生试剂之一。a q c 与氨基酸反应迅速，反应方程式如图1 2 3 2 4 所 示。衍生产物既可用紫外检测，检测波长2 5 4 衄；也可用荧光检测，激发波长2 5 0 n m 发射波长3 9 5 n m 。 “弼o + 掣一g 啪。h r hh飞 、n 、j ) h 芦、 琶f + 肛 o 图1 2 3 2 4a q c 与氨基酸反应方程式 a q c 可同时与一、二级氨基酸反应，实验操作简单、反应时间短；且衍生产物 稳定，定量准确；衍生缓冲液p h 适用范围宽，一般为8 2 - 9 7 ；但衍生试剂水解产物 影响分离；此外，当样品中存在羟基脯氨酸和羟基赖氨酸时，反应副产物会严重干扰 定量 4 0 - , 1 6 1 。 1 2 3 2 5 丹磺酰氯 丹磺酰氯，d a n s y l - c l ，也是近年来常用的氨基酸荧光衍生试剂之一。通常 d a n s y l c i 与氨基酸反应，形成单酞化衍生物具有很强的荧光，反应方程式如图 1 2 3 2 5 所示。衍生产物激发波长3 3 0 r i m ，发射波长5 5 0 n m ，也可以用紫外检测，检 测波长2 5 0 r i m 。 7 印 南京理工大学硕士学位论文氨基酸桂前衍生化h p l c 方法发展及应用 h 3 c 、n ，c h 3 s 0 2 c l + h 2 n 一9 h e o o h r h 3 c 、n ，c h 3 e 0 0 h 图1 2 3 2 5d a m y l - c 1 与氨基酸反应方程式 d a n s y l - c 1 可同时与一级和二级氨基酸反应；但衍生反应活性差，速度较慢，至 少需要3 5 m i n 才能达到最大产率；衍生产物的荧光易因缓冲液猝灭；衍生产物不太稳 定，需要在密闭和避光的条件下反应，并且衍生完成后需立即进样分析；易生成多级 衍生物，如组氨酸与d a n s y l c 1 的反应产物易形成双峰，重复性较差【4 7 5 0 1 。 1 2 3 2 6 邻苯二甲醛 1 1o p a 衍生氨基酸反应机理 邻苯二甲醛，o - p h t h a l d i a l d e l h y d e ，简称o p a 。o p a 能在还原剂巯基乙醇存在下 和一级氨基酸反应生成具有很强荧光的异吲哚衍生产物，反应迅速，在室温下l m i n 即可完成，反应产物的激发波长队0 3 2 0 n m - 3 6 0 n m ，发射波长( x = 0 4 5 0 n m ，具体反应 方程式如图1 2 3 2 6 所示【5 1 1 。 n 吨高一、昌冬一c o o h 2 2 h = o o 图1 2 3 2 6o p a 衍生氨基酸反应方程式 o p a 衍生氨基酸反应特点 优点：o p a 本身不发荧光，色谱分离中不会形成干扰峰；o p a 与硫醇试剂联用和 一级氨基酸的反应迅速，易于实现在线自动化；仪器设备简单，普通实验室均可满足 要求；衍生产物对柱损耗小 缺点：o p a 不能直接与二级氨基酸( 脯氨酸和羟基脯氨酸) 反应，需预先在n a c l o 等氧化剂作用下氧化开环，也可通过与f m o c - c 1 联用的方法衍生二级氨基酸；o p a 与氨基酸的衍生产物不稳定，衍生后需立即进样分析；胱氨酸衍生产物产量很低而不 能被检出。 3 1o p a 法分析氨基酸的发展 1 9 7 1 年，r 0 “5 2 1 提出o 队与氨基酸反应可作为传统的茚三酮法衍生氨基酸的一种 替代。1 9 7 9 年，l i n d r o t h 5 3 增对。队衍生氨基酸反应时间、缓冲盐浓度、流动相p h 值 8 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 等因素进行了较为系统地考察。1 9 8 0 年，h u r s t 等【“】应用o 队测定了可可粉中的游离 氨基酸。1 9 8 3 年，s t o b a u g h t 5 5 】等人对影响o p a 衍生产物荧光强度的因素进行了讨论。 1 9 8 4 ，e l k i a t 5 6 1 将0 p ：a 柱前衍生与传统的离子交换法进行对比，o p a 法灵敏度高、分离 度好、分析时间短。进入2 0 世纪9 0 年代，o p a 衍生氨基酸以其操作简便、反应迅速的 特点，得到广泛应用。如测定血浆、酒类中的游离氨基酸跚9 1 ，蛋白和饲料中的水解 氨基酸唧】。近年来，随着食品健康安全要求的不断提高，o p a 法也广泛应用于食品中 氨基酸的测定【6 “。此外，在动物细胞微观科学的研究中，也有所应用【6 2 l 。与此同时， 随着衍生试剂联用技术的发展，o p a 与f m o c c 1 联用也得到不断完善，弥补了o p a 不 能直接衍生二级氨基酸( 如脯氨酸、羟脯氨酸) 的缺陷，并且已在食品1 6 3 1 、烟草m 厨】、 血浆 6 6 1 ，中草药 6 7 1 等方面广泛应用。 1 2 3 2 72 二硝基氟苯 1 ) d n f b 衍生氨基酸反应机理 2 ，4 - 二硝基氟苯，2 ，l - d i n i t r o - f l u o r o b c n z e n e ，简称d n f b 。d n f b 在避光、6 0 c 条 件下，能与一、二级氨基酸同时反应生成一种稳定的衍生产物，紫外3 6 0 r i m 处有较 强吸收，反应方程式如图1 2 3 2 7 所示。 h r c - - - e o o h fj l h 2 h + h 2 n 一芒e o o h r 图1 2 3 2 7d n f b 与氨基酸的反应方程式 2 ) d n f b 衍生氨基酸反应特点 优点：可同时与一、二级氨基酸反应；衍生产物稳定，4 x 2 避光保存一个月响应 值无明显变化；反应灵敏度高，可达p m o l 。 缺点：衍生试剂毒性较大；过量衍生试剂对分析有一定影响。 3 ) d n f b 法分析氨基酸的发展 1 9 5 3 年，p r i n g l e 醯】较早的应用d n f b 作为衍生试剂，分析花粉蛋白中的氨基酸 成分。1 9 5 9 ，b l o e m e n d a l 等1 6 9 1 在纸色谱中尝试应用d n t b 分析g l u ，取得不错效果。 1 9 6 7 年，h u t z l e r 等【7 0 l 成功地采用d n f b 分析l y s 、a r g 、h i s 、t y r 。1 9 7 9 年，s h i r l e y 等【7 1 1 将d n f b 衍生氨基酸分析应用到聚丙烯酰胺凝胶色谱领域。1 9 8 6 年，f r e e m a n 等 7 2 1 采用d n f b ，在二维薄层色谱中，对氨基酸进行定量分析随着高效液相色谱的 迅猛发展，进入8 0 年代中后期，d n f b 已广泛应用于h p l c 柱前衍生分析氨基酸。 9 南京理工大学硕士学位论文 氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 9 0 年代，a d d o 掣7 3 1 将其应用到食品检测领域，医药方面的应用也有报道【7 4 7 5 1 进入 2 1 世纪，d n f b 法分析氨基酸得到不断完善，分析氨基酸种类增多，时间缩短。c h e m g 等【7 6n 提出采用微波进行加热的衍生方法，缩短了衍生反应时间。近年来，d n f b 法 在生命科学等领域得到广泛应用m 4 2 1 。 1 2 3 2 8 其它衍生试剂 除了以上介绍的几种主要衍生试剂之外，表1 2 3 2 8 还列出了具有代表性的氨基 酸柱前衍生试剂。 表1 2 3 2 8 常用柱前衍生试剂 l o 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前钎生化h p l c 方法发展及应用 1 3 本论文的主要工作 近年来，氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展迅速，可选择的衍生试剂种类繁多。 但由于氨基酸种类较多且结构相近，一种衍生试剂或衍生方法难以达到同时对多种氨 基酸进行分离分析的要求。发展普适性广、灵敏度高、分离效能好、重复性优良的 h p l c 分析方法，一直是分析化学领域探索的重要课题。基于此，本论文的主要工作 包括： 1 ) 以邻苯二甲醛( 0 p ：a ) 为衍生试剂，考察已有的一级氨基酸h p l c 分析方法，并 对其加以完善，使其成为普适、稳定的方法，并应用于氨基酸专用h p l c 分析仪器系 统： 2 ) 以2 ，4 _ 二硝基氟苯( d n f b ) 为衍生试剂，系统考察已有分析方法，发展其成为 1 1 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衙生化i - i p l c 方法发展及应用 普适、稳定的方法，并应用于氨基酸专用h p l c 分析仪器系统： 3 ) 考察不同c 1 8 填料对氨基酸2 , 4 一二硝基氟苯衍生产物( d n p a a ) 的不同选择 性，制各新型h p l c 色谱柱，建立新型氨基酸分析方法； 4 ) 采用发展的方法，通过对实际样品中氨基酸含量的测定，探讨方法的普适性、 稳定性以及可移植性。 1 2 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 2 邻苯二甲醛( o p a ) 衍生氨基酸h p l c 方法发展 自上世纪7 0 年代r o “5 2 1 提, q 4 0 p a , 衍生氨基酸反应替代茚三酮后，l i l l d r o t h 【5 3 1 、 i 弧4 卅、e l k i n 5 6 先后对o p a 衍生氨基酸进行了系统分析和考察，并与传统的离子交 换法进行了比较。近年来，o p a 衍生氨基酸以其反应迅速、设备要求低、操作简单的 特点得到广泛应用。但氨基酸的0 p a 衍生产物稳定性差，准确定量难，大大影响方法 的进一步发展。 为构建一个普适性广、稳定性强、重复性好的氨基酸h p l c 分析方法，本章对o p a 衍生氨基酸的反应与色谱条件进行了较为系统的研究。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器 j a s c of p - 1 5 2 0 荧光检测器( h i t a c h i ，t o k y o ，j a p a n ) ；p 2 3 0 高压恒流泵2 台，z w 色 谱柱恒温箱，e c 2 0 0 0 色谱数据处理工作站，d a d 2 3 0 - - 极管阵列检测器，0 4 5 p m 微孔 滤膜，e l i t e - a 从色谱柱2 5 0 r a m x 4 6 m m l d 5 p a n ，h y p e r s i lo d s 2 色谱柱2 5 0 m m 4 6 m i n i d 5 p m ( 大连依利特分析仪器有限公司) ；m e t t l e r 电子天平，m e t t l e r t o l e d o p h 计( 梅特勒托利多公司) ；六通进样阀( i d e x ) ；吉尔森移液枪( 法国吉尔森) ； 超声脱气机。 2 1 2 试剂 2 4 种氨基酸标准品( b d hc h e m i c a l sl i dp o o l ce n g l a n d ) ；1 8 种氨基酸标准品( 中国 生物药品检验所) ；邻苯二甲醛( 化学纯，中国医药上海化学试剂公司) ；巯基乙醇( 分 析纯，北京长城化学试剂厂) ；磷酸二氢钾、无水乙酸钠、冰乙酸、四氢呋喃，硼砂、 硼酸、氢氧化钠( 分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心) ；甲醇、乙腈( 色谱纯，f i s h e r s c i e n t i f i c ) ；水( m i n i q 制备) 。 2 1 3 溶液的配制 2 1 3 1p h 9 5 硼酸缓冲溶液 1 ) 0 0 5 m o l f f l 硼砂溶液：称取4 7 6 7 2 9 硼砂，用水溶解，定容至2 5 0 m l 容量瓶中， 备用； 2 ) 0 2 m o l l 氢氧化钠溶液：称取1 6 0 9 氢氧化钠，用水溶解，定容至2 0 0 m l 容量瓶 中，备用； 3 ) 准确移取5 0 m l 硼砂溶液与2 3 m l 氢氧化钠溶液到2 0 0 m l 容量瓶中，混合均匀， 并用水稀释到刻度线。 南京理工大学硕士学位论史氨基酸柱前衍生化i - i p l c 方法发展及应用 2 1 3 2 邻苯二甲醛( o p a ) 衍生化溶液 称取5 0 m g o p a 溶于0 1 m l 甲醇中，加, k 5 0 i _ t l 巯基乙醇，也可用巯基丙酸等代替 1 0 0 ，再用p h 9 5 的硼酸缓冲溶液稀释至1 0 m l 。 2 1 3 3 氨基酸标准溶液 称取氨基酸标准品各5 0 m g ，用p h 9 5 硼砂缓冲溶液定容于5 0 m l ，衍生反应时用 硼酸缓冲溶液稀释1 0 0 倍使用。 2 1 3 4o i m o l l 磷酸二氢钾溶液 称取0 6 8 0 5 9 磷酸二氢钾，用水溶解，定容至5 0 m l 容量瓶中。 2 1 3 5 梯度洗脱溶液 a 相：0 0 3 m o l l 乙酸钠溶液，含0 2 5 ( 0 2 5 ) 四氢呋喃，p n 7 2 。称取1 2 3 0 5 9 无 水乙酸钠，溶于约4 8 0 m l 水中，用冰乙酸调整p h 至7 2 ，加入1 5 m l 四氢呋喃，再用水 定容至5 0 0 m l ，用0 4 5 1 m a 的微孔滤膜过滤，并超声脱气1 0 m i n 1 5 r a i n 1 0 ，备用。 b 相：乙腈0 1 m o l l 乙酸钠( 4 ：l ，v ，、，) 。称取0 8 2 0 3 9 无水乙酸钠，溶于1 0 0 m l 水中， 用0 4 5 1 a n 的微孔滤膜过滤，再加入4 0 0 m _ l 乙腈，混合均匀，并超声脱气1 0 m i n 1 5 r a i n ， 备用。 2 1 4 衍生方法 移取2 0 0 p l 氨基酸标准溶液于i m l 离心管中，然后加入1 0 0 0 l o p a 衍生化溶液，混 合均匀，反应l m i n ，再加a 2 0 0 0 l 0 1 m o l l 磷酸二氢钾溶液，取2 0 吐反应液进行色谱 分析( 如图2 1 4 ) 。 o h 忡m 惜、缶丧刚i p h o s h e o o h 。 。 o 图2 1 4o p a 衍生氨基酸反应 2 1 5 色谱分析条件 色谱柱：e l i t e - a a a ，2 5 0 m i n x 4 6 m m i d 5 1 a m ； 流动相：a ：0 0 3 m o l l 7 唆钠溶液，含0 2 5 ( v ) 四氢呋喃，p h 7 2 ； b ：乙腈0 1 m o l l z , 酸钠( 4 ：1 ，v v ) ； 流量：l m l m i m 2 h 2 0 1 4 南京理工大学硕士学位论文氧基酸柱前衍生化i - i p l c 方法发展及应用 柱温：3 4 5 ； 检测器：荧光检测器，激发波长 曲3 5 0 m 【5 3 】，发射波长o 。) 4 5 0 咖； 梯度程序：如表2 1 5 、图2 1 5 所示。 7 0 曲 5 0 s 4 0 3 0 2 0 l o 0 表2 1 5 梯度曲线 2 03 04 0 t i m c m i n ) 图2 1 5 二元梯度程序示意图 2 2 结果与讨论 2 2 11 9 种氨基酸的典型分离谱图 采用e l i t e - a a a 柱，具体色谱条件如2 1 5 ，分析1 9 种氨基酸标准品。这1 9 种 氨基酸均为一级氨基酸，其中包括人体所需的1 6 种基本氨基酸。实验结果如图2 2 1 所示。 南京理工大学硕士学位论丈 氨墓酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 2 l o 柏 r f f n t i o n t i m c ( m i a ) 图2 2 1 1 9 种氨基酸标准品的分离谱图 i a s p 天冬氨酸；2 g l u 谷氨酸；3 s e r 丝氨酸；4 h i s 组氨酸：5 g l y 甘氨酸；6 t h r 苏氨酸； 7 a 曙精氨酸；8 a l a 丙氨酸；9 t y r 酪氨酸；1 0 f - a b 氨基丁酸； 1 1 v a l 缬氨 酸：1 2 m e t 蛋氨酸； 1 3 t r p 色氨酸； 1 4 n e 异亮氨酸；1 5 p h e 苯丙氨酸；1 6 l e u 亮氨 酸：1 7 n e u 正亮氨酸：1 8 o m 鸟氢酸； 1 9 l y s 赖氨酸 注：本章中的氢基酸谱图，峰号及名称与图2 2 1 一致下同。 分离度是衡量相邻谱峰分离质量的参数，用表示，计算公式如下： = 2 ( t 2 - - t 0 ( w l + w 2 )( 2 2 1 ) 式中，t 2 、t 1 分别为两相邻谱峰的保留时间；w l 、w 2 为它们的基线峰宽。当大小 类似的两谱峰大于1 5 ，称为基线分离。 根据式2 2 1 ，计算相邻氨基酸谱峰间的分离度，结果见表2 2 1 。 表2 2 11 9 种氧基酸谱峰间的分离度 峰号名称 凡 峰号名称 心 1 a s p 1 1v a l1 8 2 1 2g l u4 4 91 2m e t1 7 8 3s e r2 0 7 01 3 t r p 1 6 0 2 4h i s3 2 21 4n e2 8 3 5 g l y 1 0 2 l1 5p h e1 5 2 6n u 1 5 8 1 6l e u 3 0 8 7 a r g 1 0 0 71 7n 明 1 6 3 8 a l a 5 1 11 8 o m2 6 6 3 9 t y r 1 4 1 21 9 l y s 2 5 8 1 0 t - a b 8 2 5 1 6 (g一fls 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化h p l c 方法发展及应用 色谱分析中，两峰间分离度越大，表明分离越好，通过峰面积积分定量也就越准 确。从表中可以看出，1 9 种氨基酸中分离度最小的为1 1 e 与p h e ，1 5 2 ，也达到基线 分离的标准。可以认为，该系统中，1 9 种氨基酸均分离良好，为定量分析提供了有 利条件 2 2 2 分析系统重复性考察 分析系统重复性考察是评价系统稳定性的重要方法，通常采用样品保留时间和峰 面积的相对标准偏差( r s d 值) 作为考察参数。保留时间r s d 值小于1 ，峰面积r s d 值小于2 ，被视为理想的定性及定量指标。 为了保证实验条件的重复性，实验试剂均为当天配制，衍生反应时间均为9 0 s 。 一天之中，连续5 次平行实验，并将5 张谱图对比，结果如图2 2 2 1 。 5 *40 t m m m 嘞) 图2 2 2 1 氨基酸分析系统重复性考察 图2 2 2 2 保留时间重复性考察图2 2 2 3 峰面积重复性考察 1 7 9 目i 。- 卤 (1一日i暑s10正 南京理工大学硕士学位论文氨基酸柱前衍生化唧c 方法发展及应用 5 次实验分离谱图中，1 9 种氨基酸色谱峰一一对应，重合良好。利用e c 2 0 0 0 色 谱处理工