（动物学专业论文）牙鲆mx基因的克隆、序列分析及在毕氏酵母中的表达.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名 谇栏淼 导师签字 学位论文版权使用授权书 印谓 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权趁可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：许挞淼 签字日期：2 0 06 年年月咫日 导师签字 , 4 -1 w 签字日期：2 0 0 年4 月偌日 山东师范大学硕士论文 摘要 m x 蛋白是干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一，具有广谱的抗病毒 效应，能使细胞进入抗病毒状态。哺乳动物( 包括人) 、鸟类以及鱼类体内都发现有 m x 蛋白。9 0 年代起，m x 蛋白的研究逐渐引起人们的重视。本研究以牙鲆为材料，t 通过 逆转录一聚合酶链式反应( r t p c r ) 扩增得到其m x 基因的c d n a 序列，构建p p i c 9 k m x 表 达载体，并在毕氏酵母中实现了牙鲆m x 蛋白的真核表达，为以后进一步研究牙鲆m x 蛋 白的抗病毒机制打下了良好的基础。 我们首先提取了牙鲆( p a r a l i c h t h y sl e t h o s t i g m a ) 肾脏的总r n a ，反转录得c d n a 。 我们在n c b ig e n b a n k 网站搜索目前已知的m x 蛋白基因家族各成员的蛋白和核酸序列， 用d n a s t a r 软件编辑所得的序列，并对m x 基因家族各成员的氨基酸序列进行m e g a l i g n 比, 较，找出各成员同源性最高、保守性最强的片段，以设计性引物，进行逆转录一聚合酶 链式反应( r t p c r ) 扩增。将r t p c r 产物纯化并连接至p e m t 载体，转化大肠杆菌d h 5 a 菌株进行克隆测序。测序结果表明，r t p c r 所得的c d n a 片段全长1 9 8 0 b p ，其中编码区 长1 8 9 0 b p ，编码6 2 9 个氨基酸残基，推测蛋白质分子量大小为7 1 7 k d a 。随后，我们在 n c b i 网站对r t p c r 所得的基因序列进行比较分析，b l a s t 比较以及m e g a l i g n 软件分析的 结果表明此e d n a 片段具有脊椎动物m x 蛋白共有的结构特征：一个三联体g t p 结合区域 ( g x x x s g k s t 、d x x g 、t n k x d ) ；一个发动蛋白家族的典型结构特征序列 ( l p r g s k g i v t r ) ：以及c 端高度保守的l e u 拉链结构区。至此，我们获得了牙鲆m x 基 因的全长c d n a 片段。进一步的序列比较与进化分析结果表明，牙鲆m x 基因与r 本比目 鱼等鱼类的同源性较高，在7 5 1 9 8 7 之间：而与哺乳动物的同源性相对较低， 在5 0 3 5 5 1 之间。 我们选择能够在毕氏酵母中特异表达的载体p p i c 9 k ，构建了可以在ec o i l 和毕氏酵 母g s l1 5 中表达的穿梭质粒p p i c 9 k m x ，氯化钙法转化ec o l i 后，提取p p i c 9 k m x 质粒 并用s a c i 限制性内切酶线性化，电击转化毕氏酵母。在m g y ( m i n i m a lg l y c e r o lm e d i u m ) 培养基上筛选得到转m x 基因的酵母菌，然后通过p c r 力- 法进行鉴定，结果显示牙鲆m x 基因己整合进入酵母基因组中。转化后酵母菌株经甲醇诱导后能够表达m x 蛋白并分泌 到细胞外，经5 0 的硫酸铵沉淀后，s d s p a g e 电泳可以检测到表达的m x 蛋白。 山东师范大学硕士论文 关键词：牙鲆；r t p c r ；m x 蛋白；序列分析；毕氏酵母；真核表达 分类号：0 7 4 山东师范大学硕士论文 a b s t r a c t m xp r o t e i n ，o n eo ft h ea n t i v i r a lp r o t e i n si n d u c e db yt y p eii n t e r f e r o n s ( i f n ) ， c a r li n d u c et h ea n t i v i m ss t a t eo ft h ec e l l sa n dt h u sh a sab r o a d s p e c t r u m a n t i v i r u se f f e c t s m xp r o t e i n sh a sb e e ni d e n t i f i e di nm a m m a l si n c l u d i n gh u m a n ， a v a i n sa n ds o m ek i n d s o ff i s h e s m u c ha t t e n t i o nh a sb e e np u tt ot h em x p r o t e i n se v e r s c i e n c e19 9 0 s i nt h i sp a p e r ，e d n as e q u e n c eo fs o u t h e r n f l o u n d e rm xg e n ew a si s o l a t e db yt h em e t h o d so fr e v e r s et r a n s c r i p t i o n a l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) t h e nap p i c 9 k - m xe x p r e s s i o nv e c t o r w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t op i c h i ag s115s t r a i n i na d d i t i o n ，t h em x p r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nt h ey e a s ts t r a i nu n d e rt h ei n d u c t i o no f m e t h a n 0 1 t h er e s u l t sw i l lp r o v i d es o m ei m p o r t a n ta n db a s a ld a t af o rt h e f u r t h e rs t u d i e so nt h ea n t i v i r u sm e c h n i s m so ff i s hm x p r o t e i n s f i r s tt o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mt h ek i d n e yo fs o u t h e r nf l o u n d e rw i t h t r i z o la g e n ta n dc d n a sw e r es u b s q u e n t l ys y t h e s i z e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n w es e a r c h e df o rt h ed n aa n dp r o t e i ns e q u e n c e so fm xp r o t e i nf a m i l y m e m b e r se v e rr e p o r t e dw i t h i nt h ew e b s i t eo ft h eg e n b a n ko fn c b i t h e na l l t h es e q u e n c e sw e r ee d i t e da n dm e g a l i g n e db yt h ec l u s t a lm e t h o d si nt h e d n a s t a rs o f t w a r ep a c k a g e p r i m e r sf o ra m p l i f i c a t i n gt h ec d n as e q u e n c eo f s o u t h e r nf l o u n d e rm xg e n ew e r et h e nd e s i g n e da c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f a l i g n i n g r t p c rw a st h e np e r f o r m e da n dac d n af r a g m e n to b t a i n e d a s e x p e c t e d t h ep u r i f i e dr t p c rp r o d u c tw a sl i g a t e di n t op e m - t v e c t o ra n d 山东师范大学| f l j 士论文 t r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 as t r a i nf o rs e q u e n c i n g s e q u e n c ea n a l y s i sr e s u k s s h o w e dt h a tt h ef r a g m e n ta m p l i f i e dw a s1 9 8 0b p si nl e n g t hw i t ha no r fo f 18 9 0 b p sw h i c hc o d e df o r6 2 9a m i n oa c i d s t h ed e d u c e dm o l e c u l a rw e i g h to f t h ep r e d i c t e dp r o t e i nw a sa b o u t7 1 7 k d a t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e w a ss u b m i t t e da n db l a s t e da n da l i g n e dw i t ht h e h o m o l o g sd e p o s i t e d i n g e n b a n k r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e d u c e ds o u t h e mf l o u n d e rm xp r o t e i n c o n t a i n e da l lt h r e ef e a t u r e st h a ta r eh i g h l yc o n s e r v e di na l li f n i n d u c e dm x p r o t e i n so fv e r t e b r a t e s ，t h a ti s at r i p a r i t i t eg u a n o s i n e 5 一t r i p h o s p h a t e ( g t p ) - b i n d i n gm o t i f ( g x x x s g k s t ，d x x g ，t ，n k x d ) ，as i g n a t u r eo f t h ed y n a m i n f a m i l y ( l p r g s k g i v t r ) ，a n dah i g h l yc o n s e r v e dl e u c i n ez i p p e rm o t i fi nt h e c t e r m i n a lr e g i o no ft h ep r o t e i n s t h u st h ef u l l l e n g t hc d n as e q u e n c eo f s o u t h e r nf l o u n d e rw a si s o l a t e di no u re x p e r i m e n t s m e g a l i g nr e s u l t ss h o w e d t h a tt h ep e r c e n to fa m i n oa c i di d e n t i t i e sb e t w e e ns o u t h e mf l o u n d e rm x p r o t e i n a n do t h e rf a m i l ym e m b e r sv a r i e df r o m7 5 1 t o9 8 7 i nf i s h e sa n d5 0 3 t o 5 5 1 i nm a m m a l s t oe x p r e s st h em xp r o t e i no fs o u t h e r nf l o u d e ri np i c h i a ，as h u t t l ev e c t o r p p i c 9 kw a sc h o s e n w h i c hc a ne x p r e s sf u s i o np r o t e i nb o t hi np i c h i aa n de c o l i a f t e rt r a n s f o r m a t i o ni nec o l i t h ec o n s t r u c t e dp l a s m i dp p i c 9 k - m xw a s e x t r a c t e da n dl i n e a r i z e dw i t ht h er e s t r i c te n z y m es a c i ，t h e nt r a n s f o r m e di n t o p i c h i av i ae l e c t r o p o r a t i o nu n d e r7 5 0 v 4 3 m sc o n d i t i o n s t h et r a n s f o r m e dc l o n e w a sp l a t e do nm g ym e d i u m ，a n dt h ep r o p e r t yo fg s115e n a b l e do n l yt h e t r a n s f o r m e do n ec o u l dg r o wo nt h es e l e c t i v em e d i u m t h ei n t e g r a t i v es t a t eo f 6 山东师范大学硕士论文 m xc d n aw i t h i nt h ep i c h i ag e n o m ew a sa l s oc o n f i r m e db yp c ra m p l i f i c a t i o n a n ds u b s e q u e n ts e q u e n c i n g t h er e s u l t so fs d s p a g es h o w e dt h a ts o u t h e r n m x p r o t e i nw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di np i c h i au n d e rm e t h a n o li n d u c t i o na n d t h e ns e c r e t e di n t oc u l t u r e ds u p e r n a t a n t k e yw o r d s ：s o u t h e r nf l o u n d e r ；m xp r o t e i n ；r t - p c r ；s e q u e n c ea n a l y s i s ； p i c h i a ；e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n c a t e g o r yn u m b e r ：q 7 7 山东师范大学倾士论文 鱼类m x 蛋白研究进展综述 在脊椎动物中，干扰素诱导产生m x 蛋白，能使细胞进入抗病毒状态。m x 基因是 l i n d e n m a n n 研究a 。g 小鼠对流感病毒具有天然抵抗力这一现象时，发现这种特性是从小 鼠1 6 号染色体上单一显性等位基因遗传获得的，因此能抵抗粘液病毒而命名为 m x ( m y x o v i r u sr e s i s t a n t ) 基因，即抗粘液病毒基因。m x 蛋白是一类大小为7 0 8 0 k d 的蛋白质，在肽链n 端有一个三联体a t p g t p 结合区域，其氨基酸序列在m x 蛋白家族高 度保守。m x 蛋白具有广谱的抗病毒效应，是继共同完成i f n2 5 - 寡腺苷酸合成酶和p 8 6 蛋白激酶之后发现的又一种抗病毒蛋白，并与前二者的抗病毒生物学效应。i 型干扰素 通过与其受体的结合，引发j a k s t a t 信号转导途径的激活，导致了m x 蛋白及其他抗 病毒蛋白的表达。m x 蛋白具有典型的结构特征，包括三联体a t p g t p 结合区、发动蛋 白家族结构的特征序列，以及亮氨酸拉链结构和定位信号。9 0 年代起，鱼类m x 蛋白的 研究逐渐引起人们的重视，并且发现p o l y l ：c 诱导表达的m x 蛋白具有部分抗病毒活性。 本文从m x 蛋白的发现及不同动物的m x 蛋白，m x 蛋白结构特征及其作用机制、鱼类m x 蛋白的表达和活性以及其在鱼类天然免疫研究中的意义等几个方面对鱼类m x 蛋白进行 了综述。 1m x 蛋白的发现及不同动物的m x 蛋白 1 9 6 2 年，l i n d e nm a n n 发现有一近交小鼠品系a ：g 小鼠能耐受对其它随机交配小 白鼠致死剂量的流感病毒的感染，这种特性受1 6 号染色体上的一个显性基因m x 控制， 因能抵抗粘液病毒( 流感) 而命名为m x 基因“1 。在此之后h o r i s b e r g e r 等发现m x + 细胞 经i f nq 诱导后与m x 一细胞的差别是多出一条7 5 k d 的多肽，而且这种多肽也只是在 i f nn b 诱导后产生的，i f n y 不能产生，将这种多肽统一命名为m x 蛋白0 1 m x 基因 主要有m x l 、m x 2 两类，也有m x 3 的报告，但只有位于细胞核内的分子量为7 5 k d 的m x l 蛋白具有抗病毒作用，能在体内外抵抗流感病毒的感染。m x 2 、m x 3 在实验鼠中未发现 有抗病毒功能0 1 。m e i e r e 等“1 1 9 8 8 年发现了大鼠的m x 蛋白基因。 a e b im 等”3 首次发现人的m x 蛋白。人的m x 蛋白根据等电点( p i ) 的不同分为 m x a ( p i 7 ) ，该基因位于人2 l 号染色体长臂上，经i f na b 处理可诱导产 生分子量为7 8 k d 、分布于细胞浆内的m x a 蛋白。m x a 与小鼠m x l 的功能类似，且其抗病 山东师范大学烦士论文 毒谱更广，可直接发挥对流感病毒和水泡性口炎病毒( v s v ) 的抗病毒效应，而m x b 蛋白则 无抗病毒活性。继发现小鼠、大鼠、人的m x 蛋白后，m u l l a rm 等”3 发现猪细胞经i f n a 或双股r n h 诱导后可产生大小分别为7 6 k d 的m x l 蛋白和7 3 k d 的m x 2 蛋白，其中m x l 蛋白有抗流感病毒和v s v 的活性，而m x 2 蛋白则无抗病毒活性。羊的m x 蛋白含6 5 3 个 氨基酸，与m x a 有8 0 的同源性，且检测到羊在怀孕l3 2 0 天时m x 蛋白的表达量最高”1 。 c h e s t e r spm 等”11 9 9 7 年首次从马外周血淋巴细胞中克隆了马的m x 基因。马的m x 蛋白o r f 编码6 6 0 个氨基酸，该氨基酸序列与人的m x a 呈高度同源性。之后e l l i n w o o dn m 等”3 克隆了牛的两个m x 等位基因m x l 和m x l a ，分别编码6 5 4 和6 4 8 个氨基酸，与人、 鼠、绵羊的m x 蛋白相比，分别有7 3 ，6 3 ，9 3 的同源性。g e r a r d i n j 等“”克隆了牛的 m x l 基因及自启动子5 。端上游约l k b 的片断，分析发现牛的m x l 基因由1 5 个外显子组成， 但在自启动子5 端上游约l k b 的片断内不含t a t a 或c c a a t 基序( m o t i f ) ，存在一个n f 、 k a a p p a b 、2 个白介素6 结合位点、2 个s p l 酶切位点及5 个g cr i c h 盒，在推测的转录 起始位点上游的1 1 8 到1 0 7 之间存在一个对干扰素反应敏感的g a a a n ( 12 ) g a a a ( c g ) 基序，这些特征均为干扰素诱导基因所特有的特征。说明牛的m x l 基因和启动孑区与已 发现的虹鳟、小鼠、人的m x 具有相似的结构和功能特征。 除哺乳动物外，1 9 8 9 年，s t a e h e l ip 等首次检测到鱼类m x 基因，表明在生物界 广泛存在m x 蛋白家族。在禽类，b a z z h i g e rl 等“”( 1 9 9 2 ) 首次发现了鸭的m x 蛋白。 随后鸡的m x 蛋白基因也被克隆，但均未检测到鸭和鸡m x 蛋白的抗病毒活性“”。然而k o jh 等“”2 0 0 2 年通过对不同品系鸡m x 蛋白的研究发现了不同的结果。 m x 蛋白的结构在不同种的生物中高度保守，m x 基因可以在多种组织中存在。 r t h m a n5h 等“”发现在酵母中存在类似m x 蛋白的v p s l ，可能与蛋白质转运途径的中间 细胞器有关，即参与液泡蛋白的分送。这说明m x 蛋白家族具有基本的细胞功能。 2m x 蛋白结构和功能概述 在人和其他哺乳动物中，干扰素是一类介导天然免疫的细胞因子，能保护机体免 于病毒感染。由干扰素诱导生成的抗病毒蛋白有多种“，主要包括双链r n a 依赖性蛋 白激酶( p k r ，常称为p 1 e i f 一2a ) 、2 5 腺苷酸合成酶( o a s ) 、腺苷脱氨酶i ( a d a r l ) 、 m x 蛋白以及氮氧化物合成酶( n o s ) 。其中，m x 蛋白是干扰素诱导产生的一种具有g t p 酶活性的蛋白，人和不同动物m x 蛋白的大小在7 0 k d 8 0 k d 之间。比较不同m x 蛋白的 9 山东师范大学硕士论文 氨基酸序列发现，在其肽链氨基端有1 个氨基酸序列高度保守的三联g t p 结合区域 ( t r i p a r t i t eg t pb i n d i n gc o n s e n s u sm o t i f ) ，该区域是m x 蛋白抗病毒作用所必须的 结构。在肽链羧基端存在有亮氨酸( l e u ) 拉链( 1 e u c i n ez i p p e rm o t i f ) 区域，介导m x 聚 合形成二聚体或三聚体结构。对人m x a 、小鼠m x 和大鼠m x 蛋白来说，m x 的优势构象是 三聚体。此外，肽链c 端还存在与m x 蛋白定位在细胞质或细胞核部位有关的定位信号。 人的m x a 蛋白具有三磷酸鸟苷酸酶( g t p a s e ) 的活性”。m x a 基因、m x l 基因及鸭， 鸡等的m x 基因均具有与g t p 结构中g x x x s g k s t ，d x x g 和t 州k x d ) ( x 代表任何氨基酸) 3 个相一致的结合位点。如果m x l 和m x a 蛋白的g t p 结合区顺序发生突变，则失去抵抗病 毒和体外水解g t p 的能力。推测m x 蛋白与病毒的相互作用可能是一个g t p 依赖的过程。 m x a 蛋白有两种构型：非活性的g d p 结合形式和有活性的g t p 结合形式。m x a 蛋白 与病毒的核糖核蛋白体( r n p ) 中的n p ( 核蛋白) 紧密结合后，m x a 的构型发生改变并被活 化，活化的m x a 发挥对病毒核衣壳的水解作用。发挥水解作用后的g t p 可转换成非活化 的g d p 形式，即m x a 的g t p 酶抗病毒活性呈现g t p g d p g t p 重复转换效率，且具放大 效应，g t p g d p 的转换率约为4 0 次m i n ，k m 值约为7 0 0 m m o l l 。m x a 蛋白的羧基端氨基 酸对g t p 发挥水解起主要作用“。m x 蛋白详细的抗病毒机理尚未完全清楚。通过突变 分析发现，具有功能性的三联g t p 结合区域是m x 发挥抗病毒作用所必须的结构。对人 m x a 蛋白进一步研究发现位于羧基未端附近的氨基酸决定了其抗病毒的特异性，当m x a 蛋白的第6 4 5 位的氨基酸由谷氨酸变为精氨酸时，表达b t x a 蛋白的小鼠3 t 3 细胞失去了 对v s v 的抵抗力，但却继续保持了对流感病毒和t h o g o t o 病毒的抵抗力“。m x 蛋白对多 种负链r n a 病毒有抑制作用。不同的m x 蛋白有不同的抗病毒特异性，在抗病毒机理上 也稍有不同。细胞核内m x 蛋白可以选择性地抑制正粘病毒的最初转录，而细胞质内m x 蛋白除可抑制正粘病毒的复制外，还可抑制棒状病毒、副粘病毒及布尼病毒的复制o ”。 如对鼠而言，位于核内的m x l 蛋白可以抑制流感病毒的复制，而位于细胞质内的m x 2 蛋 白只抗v s v 病毒但不抗流感病毒。对人m x 蛋白而言，细胞质内的m x h 蛋白可抵抗流感 病毒、v s v 、麻疹病毒，但同样位于细胞质内的m x b 和小鼠m x 3 则无抗病毒活性。m x a 蛋白对流感病毒的抗病毒效应及其机理是通过在胞浆内阻止病毒核衣壳进入核内，从 而阻止病毒在核内的复制。而m x a 蛋白抗v s v 的机理主要是通过抑制病毒转录的起始 阶段，抑制v s v 的r n a 引物及m r n a 合成来发挥抗v s v 作用o “。早期，仅人类和鼠类m x 蛋白有直接抗病毒作用的报道较多，在其他哺乳动物、鸭和鱼类相关报道较少。目前相 山东师范大学硕士论文 继在多种鱼类中发现了具有部分抗病毒活性的m x 蛋白，如：日本比目鱼( p a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s ) 。”黄点鲶鱼( 印i n e p h e l u sc o i o i d e 曲、大菱鲆”、虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u s m y k i s 曲”、大西洋鲑鱼( s a l m o a ，厶) “1 、沟鲶( 如妇，“mp u n c t a t u s ) ”等。 哺乳动物分泌的干扰素能够诱导细胞进入抗病毒状态，其i 型干扰素通过 i f nyq b 和受体之间的结合引发j a k s t a t 信号转导途径的激活，导致了m x 蛋白以 及其它抗病毒蛋白的表达”，因是干扰素重要的下游效应因子，可以通过干扰素被单一 的激活。干扰素的激活应答元件定位在m x 蛋白基因的启动子区域，m x 基因的转录激活 依赖于该启动子区域的激活”。用基因芯片的方法研究发现，受i f n 刺激的基因有3 0 0 多种，包括4 个肿瘤抑制基因、8 个抗病毒基因、1 2 个激素基因、1 6 个受体基因、1 9 个程序死亡基因及3 9 个免疫调节基因等。其中8 个受i f n 刺激的抗病毒基因分别是 i f n a r l ，i f n a r 2 ，p r k r ，g b p 2 ，m x l ，m x 2 ，s c y a 5 和o a s 2 ( 表1 ) ”“ 表1受i f n 刺激的抗病毒基因及其性质 基因，蛋白，作用靶位， 活性或效用 i f n a r i i f n a 和i f n p 的受体 i f n a r 2 i f n a 和i f n p 的受体 p r k r 蛋白激酶 g b p 2 鸟苷酸结台蛋白 m x l 抗g t p 一结合蛋白m x a m x 2 ，抗g t p 结台蛋白m x b ， s c y a 5 趋化因子的 ( c c 基序) 配体5 j a k s t y k 2 s 1 a t i f n - r 和6 t y r 激酶( j a k l ) s 1 a t ls 玑m 催化e l f 2 的a 亚单位磷酸化 g t p g d p 和g m p g t p g t p m 单核细胞，记忆t 辅助细胞， 嗜酸性盘胞 o a s 22 。，5 寡腺苷酸合成酶2a t p 酪氨陵磷酸化作用 信号传导 受双链r n a 活化 抑制蛋白合成的启动 结合作用 抗流感病毒和v s v l 弹状病毒属、 抑制r n a 病毒的转录 靶细胞的化学引诱物，引起组胺释 放h i v 和s i v 的抑制剂 聚合作用以裂解单链的r n a 山东师范大学硕士论文 在这8 个由i f n 激活的抗病毒基因中，m x 蛋白能够抑制不同种类的r n a 病毒的转 录，而对d n a 病毒的作用极小”“。 3 鱼类m x 蛋白的研究进展 鱼类是低等的脊椎动物，与哺乳动物相比其特异性免疫机制尚不完善，但是其天 然免疫较为发达。近年来，相继在多种鱼类中发现了具有部分抗病毒活性的m x 蛋白， 如：黄点鲶鱼( e p i n e p h e j u sc o i o i d e 句。、大菱鲆1 、虹鳟鱼( o n o o r h y n o h u s m y k i s 曲。“、 大西洋鲑鱼( s a j m o 船，a ，) 1 、沟鲶( 乃t a p u n c t a t u s ) ”1 等等。与哺乳动物相 比，鱼类的m x 蛋白与之具有许多共同特征，但是在某些方面还存在差异，而且，鱼类 的免疫应答受到温度的影响较大。对鱼类m x 蛋白及其作用机制的深入了解将有助于人 们进一步理解鱼类的天然免疫机制并将其应用于鱼类的病害防治中。 3 1 不同诱导条件下鱼类m ) 【蛋白表达及其活性的研究 人工双链r n a ( p o l y i ：c ) 是最常用的干扰素诱导剂，利用p o l y i ：c 和病毒能够在 多种鱼类以及鱼类的细胞系中成功诱导m x 表达。天然野天村病毒感染鲶鱼可以显著的 上调m xm r n a 在所有组织中的表达，肌肉注射野田村病毒6 小时后m x 基因的转录水平 增加，到7 2 小时在其脑中数量达到峰值。对基因5 侧翼区序列的分析表明，鲶鱼启动 子包含两个潜在的干扰素诱导应答元件，在p o l y l ：c 诱导时产生应答。g f p 瞬时转染 鲶鱼细胞发现p o l y i ：c 诱导的m x 启动子片断激活足以使绿色荧光蛋白表达。对日 本比目鱼m x 蛋白的研究发现，其m x 蛋白具有部分抗棒状病毒活性。实验采用抗比目 鱼m x 蛋白片断的多克隆抗体检测天然比目鱼鱼卵，结果得到了一个分子量约7 1 k d a 的 蛋白，该蛋白在与干扰素诱导子p o l y i ：c 一起培养的细胞中可以得到，但是在未激活 的细胞中就不存在。通过免疫荧光标记的方法还发现，日本比目鱼m x 蛋白定位于细胞 质中，海勒姆棒状病毒激活的m x 蛋白表达只局限于感染细胞内，m x 蛋白和病毒蛋白具 有共定位的特征。1 。 即使是对d n a 病毒，鱼类m x 蛋白也具有一定的活性，并且，其m x 的产生受温度 影响，这与鱼类整个免疫系统受温度调控的特点是相一致的。a c o s t af 等向虹鳟鱼肌 肉注射v h s v 糖蛋白基因的d n a 疫苗，1 4 。c 下注射1 1 周，观察m x 蛋白m r n a 的持续应 答。在第7 天时可以检测到m x 蛋白的应答，1 4 天时达到峰值，2 1 天及2 1 天以后应答 山东师范大学硕士论文 回到预处理水平。而在质粒对照中并没有检测到m x 蛋白的表达增加。实验进一步对比 研究了虹鳟鱼和大西洋鲑鱼m x 蛋白的应答动力学变化，大西洋鲑鱼饲养在l o 下并注 射人工合成的双链r n a ( p o i y l ：c ) 以及d n a 疫苗。结果发现，两种鱼对p o l y i ：c 都有 快速应答，从第1 天时就可以检测到应答，第3 天到第9 天达到最大值，并在第1 2 天 时降低到本底水平。大西洋鲑鱼的应答过程相对延迟一些。而两种鱼对v h s d n a 疫苗 的应答开始的都要晚于对p o l y l ：c 的应答。虹鳟鱼对v h s d n a 疫苗的应答动力学特征 与这一物种注射疫苗后抗v h s 的早期非特异性保护相关。据推测，大西洋鲑鱼中对d n a 疫苗的m x 应答很大程度上也与其对v h s 的天然抗性有关。“。p u r c e l lm k 等研制出一株 极为有效的抗病毒d n a 疫苗，该疫苗既可以诱导早期的非特异性抗病毒免疫应答，也 可以诱导长期的特异性免疫保护。研究利用了实时定量r t p c r 技术比较了注射 p o l y l ：c 、活体i h n v 、i h n v 的d n a 疫苗以及编码非抗原性荧光素酶基因的质粒对照的 虹鳟鱼脾脏中一系列细胞因子以及细胞因子相关基因的表达变化。这些目标基因包括 m x l ，病毒血红素败血病病毒诱导的基因8 ( v i g - - 8 ) ，t n f a ，t n f 一2 ，自介素一1b ， 白介素一8 ，t g f b 以及h s p 7 0 。p o l y l ：c 刺激诱导多个基因的表达，但是表达最强烈， 、 应答最显著的是m x 一1 和v i g 一8 基因。活体i h n v 病毒在除了t g f b 以外的所有检测基 因中都能诱导产生显著的应答。“。 j 。 在鱼类中，干扰素c l 和干扰素b 都能够抑制感染i p n v 病毒的复制，并且也已经 观察到i p n v 抑制和m x 蛋白表达之间的相关性。l a r s e nr 等为了检测大西洋鲑鱼m x l 蛋白是否具有抗i p n v 的活性，构建了能够组成性表达a s m x l 的c h s e 一2 1 4 细胞系。a s m x l 定位在细胞质中，a s m x l 选择性表达克隆的i p n v 诱导细胞病理效应显著降低，病毒产 量降低5 0 0 倍“”。b e r g a nv 等通过免疫印记的方式研究了鱼类不同器官中m x 蛋白的 表达。注射双链r n ap o l yi ：c 及感染传染性胰腺坏死病毒后进行免疫印记分析。肝 脏、肾脏、心脏、脾脏、鳃以及肠中p o l y l ：c 激活m x 蛋白表达量都有所增加。肝脏 中m x 蛋白表达量在第3 天达到峰值，并且在注射处理后的第1 4 天依然保持上升。i p n v 感染导致肝脏中从第4 天起直到第3 5 天时m x 蛋白的增加”。t a f a l i ac 等也测定了 n o d a v i r u s 病毒和p o l y l ：c 诱导的海鲷鱼中m x 蛋白在头肾、肝脏、脾脏、一t l , 脏、鳃、 肌肉和健康海鲷头中的表达情况。结果发现，肌肉内注射p o l y l ：c 能够上调其肝脏、 头肾、脾脏和肌肉中的m x ，而且在构建的海鲷细胞系s a f - i 中，m x 蛋白并不能组成性 表达，但是p o l y l ：c 和n o d a v i r u s 在细胞系中能够诱导m x 表达。在分离的头肾巨噬细 山东师范人学硕士论文 胞和血液淋巴细胞中也发现了组成性表达的m x 蛋白。5 1 。单纯的p o l y i ：c 转染细胞也 不能表达m x 蛋白。实验表明鲑鱼胚胎细胞在干扰素诱导系统中具有缺陷，因为双链的 p o l y i ：c 不能诱导细胞中的抗病毒状态。j e n s e ni 等采用c h s e 一2 1 4 细胞用p o l y i ：c 转 染以及与不带有转染试剂的p o l y i ：c 孵育。然后分析这些细胞中m x 蛋白的表达，以及 对传染性胰腺坏死病毒感染的保护性。结果表明，用p o l y i ：c 转染的细胞能保护不受 i p n v 的感染，同时与不带有转染试剂的p o l y i ：c 孵育的c h s e 一2 1 4 细胞并没有受到保护。 实验还发现，双链d n a 和p o l y i ：c 转染的细胞也不能受到保护m 1 。 关于鱼类的干扰素活性与m x 蛋白之问的关系也已有相关报道。j e n s e ni 等对大西 洋鲑鱼干扰素样活性和p o l y i ：c 对m x 蛋白表达以及抗i s a v 病毒和i p n v 病毒的活性 进行了研究，实验采用的是大西洋鲑鱼细胞系s h k l 和t 0 。实验同样是选择双链r n a p o l y i ：c 作为i 型干扰素的诱导子，并且进行了细胞毒性实验和病毒量的检验，以测 定细胞对抗病毒感染的保护性的强弱。在注射p o l y i ：c4 8 小时以及a s i f n 激活2 4 小时后t 0 和s h k 一1 细胞中m x 蛋白达到最大诱导量。但是，大西洋鲑鱼的m x 蛋白不能 抑制i s a v 的复制”。n y g a a r dr 等通过实验发现，如同在哺乳动物中一样，鱼类中d s r n a 诱导m x 蛋白主要是通过i 型干扰素诱导的。首先，i 型干扰素样活性诱导c h s e 一2 1 4 中m x 蛋白的表达，在对p o l y i ：c 应答时，这些细胞几乎没有产生i f n 的能力。其次， i f n 诱导的m x 蛋白最大量出现在4 8 小时，比a s 细胞中p o l y i ：c 诱导要早。第三，p o l y i ： c 诱导的巨噬细胞中m x 蛋白的峰值表达出现在4 8 小时后，然而干扰素样活性峰值是在 加入p o l y i ：c2 4 小时后。因此，他认为m x 蛋白可以作为鱼类中产生i 型干扰素的分 子标志1 。 3 2 不同鱼类m x 蛋白基因结构的研究 近两年来，对不同鱼类的m x 蛋白基因的研究相继开展起来。包括河豚例、鲶鱼。、 欧洲鲫鱼1 、海鲷嘲斑马鱼1 、河鲈1 。虹鳟“4 “。大西洋鲑( s a l m o 阳甜) “7 等。对上述鱼类m x 蛋白基因的研究表明，m x 基因调控的分子机制在鱼类和哺乳动物中 都是保守的。 y a pw h 等克隆了河豚的m x 基因，得到m x 基因长度为8 0 k b 。该m x 基因从转录起始位 点到多聚腺苷酸信号的总长度3 4 k b ，由1 2 个外显子和1 1 个内含子组成。由m x 基因编码 的蛋白序列与鳟鱼m x l ，鸡m x 和鼠的m x l 基因的序列同源性分别是7 7 、4 8 和5 1 。 山东帅范大学硕士论文 该m x 基因在不同的组织中都能表达，并且在心脏、鳃、头肾，肠和脑中都具有高表达。 该m x 启动子受到人肝细胞( h u h 7 ) i f n b 和鲤科小鱼顶端肝细胞聚肌胞p o l y c y t i d i l i c 酸( p l h c i ) 诱导。启动子清除实验分析表明i s r e s 对其诱导性也有影响“。p l a n tk p 等利用r a c e 的方法在鲶鱼中获得了一个2 5 k b 的m x 全长c d n a 。对其进行分析表明，该基 因由一个编码6 3 5 个氨基酸的1 9 0 5 个核苷酸组成了开放阅读框，推测该蛋白的分子量是 7 2 5 k d a ，并且具有发动蛋白家族的标志，具有三个g t p 结合基序( m o t i f ) 和一个亮氨 酸拉链，这些都完全符合已知的m x 蛋白的特征。鲶鱼m x 蛋白与河鲈m x 表现出7 9 的同 源性，与大西洋鲑鱼以及虹鳟鱼的m x 的同源性是7 1 和7 4 z 7 az h a n gy b 等在一种欧 洲鲫鱼囊胚胚细胞c a b 细胞中得到了两种m x 基因的全长e d n a ，分别称为c a b l x l 和c a m x 2 ， 分别进行克隆和测序，发现其对应的两种蛋白与哺乳动物干扰素诱导的m ) ( 蛋白的特征 性结构相一致，包括g t p 结合基序，发动蛋白家族特征性结构和亮氨酸拉链基序。c a m x l 与斑马鱼的m x a 表现出8 5 的序列一致性，与三种大西洋鲑鱼表现出7 2 一7 4 的序列 一致性。c a m x 2 与斑马鱼的m x e 极为相似，具有8 0 的一致性，继而是虹鳟鱼m x 3 ，为5 2 。，在正常的g c h v 感染的c a b 细胞中调节c a m x l 和c a m x 2 时具有相互独立的完全不同的机 制? 1 。t a f a l l ac 等通过r a c ep c r 克隆了海鲷m x 蛋白全长c d n a ，长度2 1 8 2 b p ，含有一个 编码6 1 8 氨基酸的1 8 5 7 b p 的开放阅读框。在编码序列的内部，发现了m x 蛋白的特征性的 序列( g x x x s g k s t ，d x x g 和t n k x d ) ，发动蛋白家族的