（生物化学与分子生物学专业论文）大鼠基因组文库的构建及其初步鉴定.pdf

学位论文原刽性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是浅个人在导师指导下独立进行研 究工作墩得的研究成果。除了文中特别加以檬注引用的内容和致谢的 地方夕 ，论文中不包含任何其他个人残集体已经发表或撰写过豹研宠 戒祭，与我麓工作酶圈志对本罨犟究瓣傲戆任 罨贡献均己在论文中作 了明确静说明并装示了谢意。 学位论文作者签名：鏊塞离期：崩年届，目 学位论文版权使用授权书 本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规寇，即： 学接有权憋学位论文豹全部或部分走容编入毒关数据库进行检紫，并 采糟影帮、缩印或扫捧等复铡手後保存、汇编以彳挂查溺和借阗。离惫 学校向国家有关部f 1 或机构送交论文，并编入有关数据库。 作者签名：址导师签名：泓哟魄渺# 年f 月，目 天津医科大学硕士论文 中文摘要 基因组d n a 文库( g e n o m i cd n a1 i b r a r y ) 是含有某种生物体全部基因的随机 片段的重组d n a 克隆群体。这个文库中将含有基因组内全部基因片段，它像一个贮 存有基因组全部序列的信息库，故称为基因组文库。 我们从特定大鼠的肝脏细胞中提取基因组d n a ，选择合适的限制性内切酶 ( s a u 3 a i ) 进行部分酶切使之成为一定大小的片段，应用蔗糖密度梯度离心法分 离大小在9 2 3 k b 之间的片段。将此回收的大小合适的外源d n a 片段与载体d n a ( 噬菌体载体， g e m 1 1 ) 进行连接，经体外包装，转染细菌，得到一组含有不同 d n a 片段的重组噬菌体颗粒。通过倒平板测定包装的噬菌体滴度，计算出噬菌斑 形成率) 1 0 6 p f u u g ，说明所建立的基因组文库是完整的。挑取数个噬菌斑，提取 重组 噬菌体d n a ，酶切检查插入片段的大小，其插入片段在9 2 3 k b 之间。同时 用高倍数感染法大规模制备 噬菌体，提取基因组文库d n a ，通过p c r 方法检查基 因组文库的完整性，通过琼脂糖凝胶电泳知p c r 扩增产物与预期大小一致。 关键词：基因组文库重组d n a 噬菌体载体重组噬菌体 噬菌斑形成率 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 哭滓麒科大学硕士论文 a b s t r a c t 0 鼢。礁i c 溅矗l i b r a r yi s e o l l e e t i o r e o o 酶i n a 鞋t 渊& e l o 髓sw h i c h c o n t a i nt h ec o m p l e t eg e n e sr a n d o mf r a g m e n t s i ti 8c a l l e dg e n o m i cl i b r a r y b e e 8 硅s 8i th a v ee o # 蛩1 8 毫毋弧矗f r 8 9 m e n t so f 七h eg e n o f 糖，li k i 娃gad 8 t a 基a n k o fa l l 孽e n o 糯i cs e q 鞋e n e e t h eg e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o mas p o c i a lr a t s1i v e ra n dp a r ti a l c l e a v a g e dw i t 廷8f o 娃r b a s ec 鞋t t e rr e s t r i e t i o ne 砖建o n u e i e a s e ( s 8 驻3 矗i ) t og e t s u i t a b l es i z e 蹦af m g m e n t s + 轷ei s o l 鞋t e dt h ef r 8 辨姑n t sb e t 辩e e ng 一2 3 如u s i n g s u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na n dg o tr e c o m b i n a n tp h a g e so f v a r i o u sd n af r 8 9 m e n t sb yl i 9 8 t i n gt b ed n 矗f r 8 9 蕊e n t sw i t h 七h ov e e t o r 器黻 ( 1 a m b d ag e 麓一1 1 ) ，p a c k a g i n gl i 9 8 t i o np r o d u e ti nv i t r 。a n 畦 t r a n s f o r 掰8 t i n g c o m p e t e n tec 0 1 ic e l l s ，t i t e r i n gp a c k 8 9 e dp h a g eo nl bp l a t e s ，w ec a l c u l a t e d t h ep a c k a g i n ge f f i c i e n e yw a sl f u u g d n aa n d 娃e 难。n s t r 8 t e 畦t h eg e n o 氆i e 1i b r a r y si n t e g r it y ，t h e nw es e l e e t 鬯ds e v e r a lp l a q u e s ，e x t r a c t e dt h ep h 8 9 e d n aa n de x a m i n a t e dt h es i z eo ft h ei n s e r t e df r a g m e n t sw e r eb e t w e e n9 2 3 k b b yr e s t r i c t i o nd i g e s t i o n a tl a s tw em a n i p u l 8 t e dl a m b d ap h a 嚣ei nl a r g e 8 e a l ew i t hh i g hi n f e e t i o nt e c h n i q u ea n de x t r a c t e dg e n o m i ch b r a r y s 酬a a n de x 鑫糯i n a t e dt h ei n t e g r i t yo fg e n o m i el i b r a r yb yp e 技舶e t h o d t h ep e r p r o d u c t s s i z ew e r ei na c e o r d a n c ew i t ha n t i c i p a t 。nb yu s i n g8 9 a r 。s eg e l e l e c t r o d h o r o s i s k e y 拍r d 8 ：g e n o 】1 1 i c1i b r 剁y r e e o 瑶b i n a n t 静h a g e 国家自然辩学萋垒器助项鞫( n o 。3 0 2 7 l 5 4 ) r e c 渊b i n a n t 矾a1 a m b d ap h 8 9 ev e c t o r p a e k a g i n ge f f i e i e n c y 2 天津医科大学硕士论文 中英对照 t r i st r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e s 转ss o d j h 拯d o d e c y ls u l f 基t e p e gp o l y e t h y l e n eg l y c o l e b e t h i d i u mb r o m i d e e d t ae t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ea e i d d 鞭、d i t h i o t h r e i t o l b s ab o vi n es e r u ma l b u f 【l i n d m s od e m e 七h y ls u l f o x i d e s u c r o s ed e n s i t yg r d i e n t m a l t o s e麦棼糖 g e l a t i n 明胶 a 9 8 r 。s e i 墓鬻糖 s u c r o s e蔗糖 t r y p t o n e 胰骚自胨 v e a s te x t r 8 e t藓鼙凝取耪 a g a r 琼脂 t o pa g a r 上腰琼脂 g l u 。s e 甍蘩糖 圈寒自然科学基盘贽助项且( n o 3 0 2 7 1 5 4 ) 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠 聚乙二醇 澳化乙锭 乙二胺靼乙酸 二硫苏糖醇 牛舭清白蛋白 二甲基亚砜 蔗糖密度梯度离心 3 天津医科大学硕士论文 前言 基因工程技术的迅速发展使人们对生物体基因的结构、功能、表达及其调控 的研究深入到分子水平，而对特定基因片段的分离和获得是上述研究的基础。完 整的基因组文库的构建使任何d n a 片段的筛选和获得成为可能。基因组文库 ( g e n o m i c1 i b r a r y ) 指用分子克隆手段，将提取的某种生物基因组d n a 经随机酶 切或机械剪切为一定长度的片段，再与适当的载体d n a 连接后转移至受体细胞中 而形成的各种片段的重组子克隆的总和。又称人工构建的基因“活期储蓄所” ( g e n eb a n k ) ”1 。基因组文库是本世纪7 0 年代末发展起来的一种分离基因组内基因 的技术。个完整的基因文库应囊括该牛物基因组上的所有基因，可保持数年而 不改变其生物学特性，是进行遗传和分子生物学研究的重要手段。 本实验室自7 0 年代以来一直在研究甲状腺激素受体( t h y r o i dh o r m o n e r e c e p t o r s ，t r s ) ，并取得了一些成就。”。甲状腺激素是十分重要的激素，主要 是调节新陈代谢、生长发育等基本的生理过程。甲状腺激素的作用几乎遍及全身， 范围十分广泛，作用缓慢而持久。这些作用的发挥是依靠甲状腺激素与其相应的 核受体结合而实现的。甲状腺激素受体分布广泛，主要有t rn1 、t r n2 、t r a3 、 t r bl 、t r b2 和t r b3 六种亚型，另外还有t r q1 、t r a2 和t r b3 三种截 短型“。每个亚型的表达各具阶段特异性和组织特异性。因此，对甲状腺激素受 体的研究是非常艰巨而有意义的工作。 本室在以只大鼠的肝脏组织为原料进行甲状腺激素b1 受体( t rb1 ) 的克 隆实验时，意外的发现了一种新亚型的甲状腺激素受体同功体( i s 。f o r m ) ，它的 c d n a 是在相当于t rb1 基因c d n a 的第3 和第4 步 显子序列之间多1 0 8 b p 碱基片段，这 种受体亚型国内外未见报道。我们已经成功的将此新的受体同功体在n c b i g e n e b a n k 登记注册并获命名为t r b ( 登记号为：d q l 9 1 1 6 5 ) 。由于这种受体形 式是首次发现，国内外没有与其相关的文献，并且以别的鼠的组织为原料没有克 固家自然科学基金资助项目( n o3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学碗士论文 隆裂这嵇受铬，搿数我们攉测这种新登的受体是在这其鬣自身特殊静诵控方式下 形成数。为壹唆此l o 秘p 转来源、产生方式娃及是否存在一个耨酌井显子，我稻决 定用这只鼠的肛脏组织( 其他组织和搬标本已相巨混潺) 必原糕橡建基因缀酬a 文库，以对奠基因的结构、功能、表达及其调控进行深入的研究。 d n a 保存方式包括d m 分予保存、基因组文库保存、c d n a 文库保存和特殊基因 片段保存等”。由于基因组文库理论上含有某种生物体的全部摹因，姐易于长期 裸存，构建基函组文库也就成为一种傈存物种摹翻组d n a 的有效途径。构建完整的 基阂维文瘁，藏对也是分予生物学研究的一个摹磷技术平台，可以角来分离和筛 选爨标旗医及摹爨旗子，或炎珐憝基嚣疆究黥毒效手段之一“。建立蒸强鬃文痒 还娜以大量生产舍照极少的基因，有利于对这类基因的结构珐能髑调控规毽进牙 研究。 这些年来，我们实验室直进行着甲状腺激素受体基因的研究。由于甲状腺 激素受体分布广泛，我们的研究涉及到了大鼠肝脏组织“、脑组织“1 1 、骨组织和 戒帮缅藏“。8 3 以及赢中酌甲狄腺激素受体。我们阻前的实验主要集中谯不同碘状 态( 茏茭是跤臻状态) 下越绣绞中甲获豫激素受体豹改变“3 。现在戳殷将来，我 们会难甲状艨激素受传基因麴表达强调控擞爨多懿骚究，这裁菠褥梅建这只特撩 大鼠的基因组文库鼹得尤为璧要。 构建基因组文麾的目的在于保存并克隆熬因，耳蘸克隆慕因主要蠢c d 姒壳隆 和基因组d n a 毙隆两种方法，基因组d n a 克隆这种方法能克隆到基因的非编码区 调藏序列和内含子搿列，便于研究基因调控序列的结构和功能，这是c d n a 克隆无 法满足的“。许多研究资料表明，在真核细胞中表达外源真核基因时，一些含有 疮含予亭秘的蘑困簧毙经c 赫a 克隆的不含肉含予净弼的基因表达效率商“”4 3 ，而 且出其转最来躲含鸯蠢含子序列鼹r 黼不易降解“8 ，因此，巢些情况下需要克隆 含蠢盎含子序列的基因就只鸯选撵基因缀d 臌宠隆。另终，对予蘩些甄丰度m r 黻 基因通过c d n a 克隆怒很困难的，选择基因组d n a 克隆更为台适。 目前构建基因组d n a 文库通常采用 噬菌体载体、粘粒载体和酵母人工染色体 罾家自然科学基金资助项礴( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科太学礤七论文 ( ￥媳) 载体。构建慕因爨k a 文瘁瓣主要步骤惫摇：蒺蠢缝鞭a 静到各纛蕊困组 d n a 的部分酶切；载体d n a 的酶切和纯化；慕因组d n a 的酶切片段与载体d n a 的 连接；重组d n a 的体外包装和转化；蒺因组n n a 文库的鉴定。 本文就以这只姆殊鼠豹爨脏缀织为联趱，以天g 翻一l l 为载髂，按照以上步骤 建立了大鼠的基因组文库。这只特定大鼠基因组文库的构建为甲状腺激素受体的 分子生物学磷究提供了物震基础，为我们迸一步探讨冀基因络构与功能的关系、 表达、调控机制，以及生产如对科学、医学都极其震要魏生物分子等磐具套卡分 重要的意义。 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 必津医科大学硕士论义 实验流程 l 特定丈鬣静j 搿驻维织募困缀 i、d n a 的提取 模援酶甥反应薅系 小量酶甥确定酶聂应条馋 i i大量d n a 的部分酶切 i 连接条件的确定 1 熏组 噬菌体d n a 的提取及 l酶切鉴定 i i 基因组文库噬菌体d n a 的提 l取及p c r 鉴定 l i基因组文庠的初步鉴定。 警家鑫熬耩学基金赉鼙瑷嚣( 3 8 2 7 1 1 5 4 ) 必津医科大学硕士论文 一、材料及试剂： 1 菌种和载体： 实验材料 大强挺墓k 嚣2 5 l 蘩椿、载睡磐xs e l l lb a 蛾la r s 葶 l 毽装蛋叁p a k a g e # e s y s t e m 均购自p r 。m e g a 公司；质粒p u c l 8 为本室保存。 c o s 位点 g e 鲢一l l 载体 c o s 位点 2 工具酶及分子量标志物： 限制憾榱酸内切酶s a u 3 a i 为p r o m e g a 公司产品：核酸分予爨标志物d l l 5 ，0 0 0 嚣o l 2 ，0 购垂大连宝生物公司；黻镱l 往菝酸肉塌酶8 a m 珏i 、援陵分子量标志物 xd n a h i n d i i im a r k e r 、 m i xm a r k e r 、t 4d n a 谶接酶为m b i 公司产品。 嚣家塞熬零 学蒸金嚣酸壤嚣( n o 。3 镗7 l 鞋) 无津医科大学硕士论文 3 主要化学试剂： t r i s 购自博大泰克公司；s d s 和p e g 一8 0 0 0 为a m r e s c o 公司产品；阴、m a l t o s e 和g e l a t i n 为s i g m a 产品；胰r n a 酶、t a q d n a 聚合酶、1 0 m m 。l 几d n t p 购自晶美公司i t r i s 饱和酚、胰d n a s e i 购自联星公司；e d t a 、a g ”o s e 、d t t 、b s a 、s u c r o s e 、 t r y p t o n e 、y e a s te x t r a c t 、甘油、 a g a r 分别为u s b 、m e r c k 、p r o m e g a 、r e s e a r c h o r g a n i c s 、o x 。i d 、i n v i t r o g e n 、g i b c o 公司产品；其他试剂均为进口或国产分析 纯。 4 引物： 引物设计采用g e n e r u n n e r 软件设计，每一条引物序列均经b l a s t 进行同源性 比较，无显著同源性。所有引物由北京奥科生物公司合成。 1 ) t r a 序列： 上游引物：5 一a c c a a g c t t a t g t a t a t c c c c a g c t a t c t a g 一3 下游引物：5 一c t g c t t t a g t c c c c c t g g g c a g c c a g a g g c c a t t 一3 扩增片段长度：2 3 6 b p 。 扩增产物为：t rb1 基因外显予3 ( 1 0 1 b p ) 及其后内含子1 3 5 b p 。 2 ) t r b 序列： 上游引物：5 一g c c t c t g g c t g c c c a c c g g c c c a g g c t a a g g g c c 一3 下游引物：5 一a g a c c t a g g a g t c t g t t g c c a t g c c a a c a t 一3 扩增片段长度：2 8 6 b p 。 扩增产物为：t rbl 基因外显了4 ( 1 4 8 b p ) 及其前内含予1 3 8 b p 。 3 ) t r c 序列： 上游引物：5 一g c c t c t g g c t g c c c a g g g g g a c t a a a g c a g a a g g g 一3 下游引物：5 一a g a c c t a g g a c t c a g g g t c c c a c t g c c t t g 一3 扩增片段长度：2 7 4 b p 。 扩增产物为：t rb1 基因内含子3 4 中变为外显子的1 0 8 b p 及其前1 6 6 b p 。 国家自然科学基盎资助项目( n o3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 二、仪器： g e n e a m pp c rs y s t e m9 6 0 0 扩增仪和d n at h e r m a lc y c l e r4 8 0 扩增仪为美国 p e r k i ne 1 m e rc e t u s 公司产品；s o r v a l i 。e v o l u t i o nr c 高速冷冻离心机购自美国 k e n d r o 公司；搿压电源、层析柜、甄室溘恒温水浴及紫外透射仪为瑞典l k b 公司产 品：u v 一2 5 0 i p g 型紫外分光光度订为日本岛津产品；电静转化仪为e p p e n d 。r f 公司 产酗；电溶仪为大连竟遥公司产品：凝黢成豫系统旃舀g e n e 公罚；强循环东港 为n e s l a 8 公司产品。 三、液体的配制： 1 组织裂解液： 1 0 m m o l lt r i s c l ( p h 8 8 ) ， l o o h u n o l 几e d t a ( p h 8 o ) o 5 s d s 2 1 0 s a u 3 a ib u f f e r ： 3 4 5 6 6 0 啦m o l l 6 0 辩强o l l t n e ： l o m m 0 1 l l o m m o l l t e ： p h 7 6 善r i s e l ( p 疆7 ) 蜒g c i2 ， 5 m m o i 0n a g l 1 0 舰 。l ld t l t r i s c l 、( p h8 _ o ) ，l 彻o l 儿e d t a ( p h 8 0 ) n a c l 1 0 黼o l 屈静i s e l ( p h 7 ，6 ) ， b 舞8 0 l o 蹦o l 儿t r i s e l ( p h 8 。o ) ， 噬菌体稀释波： 1 0 m m o l lt r i 8 一c l ( p h 7 5 ) ， x 噬菌休缓冲液： 謇象鑫然科举基金强黪瑗是 融3 噼l l 譬) l m m o l le 酐a ( p h 8 o ) 1 l l o l le d t a p h 8 。o ) 8 m m o l lm g s 0 。 捣 天津医科大学硕十论文 2 0 m m o l lt r i s c 1 ( p h 7 4 ) 1 0 m m o l lm g s 0 4 7 s m 液： 5 0 m m o l 几t r i s c l ( p h 7 5 ) 8 i i i i o l 几m g s 0 4 ， 8 t m 缓冲液： 5 0 o l 几t r i s c 1 ( p h 7 5 ) 9 l b 液体培养基( p h 7 o ) ： 1 0 0 m o l ln a c l 1 0 0 m m 0 1 ln a c l 0 0 1 g e l a t i n 1 t r y p t o n e ，o 5 y e a s te x t r a c t 1 0 l b 固体培养基( p h 7 0 ) ： 1 t r y p t o n e ，0 5 y e a s te x t r a c t 1 n a c l ，1 2 a g a r 1 1 s o c 液体培养基( p h 7 0 ) ： 2 t r y p t o n e ，o 5 y e a s te x t r a c t 2 5 i i l l n o l lk c l ， 2 0 衄o l 几m g c l ：， 1 2 t o pa g a r ： 1 t r y p t o n e ，o 8 n a c l ， 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 8 m m o l 几m g s 0 4 1 n a c l o 0 5 n a c l 2 0 m m 0 1 几9 1 u c o s e 0 6 a g a r 天津版科大学硕十论文 实验方法 一、基因组总d 卧的提取： 1 基因组总d n a 的提取： 1 ) 取冻存的大鼠肝脏组织约1 0 0 m g ( 绿豆粒大小即可) ，加入l m l 组织裂解液以内 切式组织匀浆器充分匀浆1 分钟。5 0 水浴2 小时。 2 ) 加入r n a s e ( 1 0 m g m 1 ) 4ul ，3 7 静置3 0 分钟。 3 ) 加入等体积的t r i s 饱和酚，颠倒混匀，5o o o g 离心l o 分钟。 4 ) 吸上层水相至另一离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：l ( v v ) ) 溶液剧烈混匀，5o o o g 离心l o 分钟。 5 ) 取上层水相至另一离心管中，加入2 5 倍体积冰预冷的无水乙醇，50 0 0 g 离 心3 分钟。 6 ) 弃上清，以7 0 乙醇清洗沉淀，再次50 0 0 g 离心3 分钟。 7 ) 弃上清，3 7 放置3 0 分钟，使沉淀完全干燥：以5 0 0ult e 溶解沉淀。 8 ) 取一部分测定o d m ，和o d 。，以计算所提d n a 的浓度和纯度，其余基因组总d n a 于4 保存。 2 基因组总d n a 的完整性鉴定： 1 ) 电泳鉴定： 以核酸分子量标志物 m i xm a r k e r 为标准( m i xm a r k e r 的准备：8u1 d d h 2 0 、 1ul1 0 a d i n g 和1uld n am a r k e r 混匀，6 5 ，5 m i n ，0 ，3 m i n ) ，取1 0ul 所提 基因组总d n a 溶液在4 、3 v c m 下，经o 6 琼脂糖凝胶电泳观察，推算所提基因 组总d n a 分子量大小。 2 ) p c r 方法鉴定 国家自然科学基金资助项目( n o3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 p c r 反应体系： 用t r c 引物进行p c r 扩增 表1p c r 反应体系 反应体系组成加样体积 1 0 p c r 缓冲液 m g c l2 1 0 m m o l ld n t p 基因组d n a 稀释1 0 0 倍 上游引物( 5um o l l ) 下游引物( 5 um 0 1 几) t a q d n a 聚合酶 d d h 。o 2 5 “l 2 ou1 o 5u1 1 o ul 2 0 ul 2 oul 1 oul 1 4 oul 合计 2 5 ou 1 反应条件： 9 5 预变性5 m i n ；9 4 变性3 0s 、5 8 退火3o s 、7 2 延伸3 0 s ，共进 行3 0 个循环；最后7 2 延伸5 m i n 。 p c r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 以核酸分子量标志物d l 2 0 0 0 为标准，取4ul 扩增产物经2 o 琼脂糖凝胶 电泳观察，推算扩增产物分子量大小。 二、建立模拟酶切消化体系“”： 1 取l oul 基因组d n a 于一干净e p p e n d o r f 管中，加入2ull o s a u 3 a ib u f f e r ， 3 7 温育3 小时。 2 同时取基因组d n a l 0u1 ，不加1 0 s a u 3 a ib u f f e r ，3 7 温育3 小时。 3 以上两管各取1 0ul 与没有温育的基因组d n a l oul 跑o 6 琼脂糖凝胶电泳，观 察样品有无降解。 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 三、小量酶切确定酶反应条件： 1 取2 0 u g ( 3 0p1 ) 基因组总d n a 加4 0u11 0 s a u 3 a ib u f f e r ，4ulb s a ( 1 0 m g m 1 ) 至终浓度为1 0 0 u g m l ，加水至总体积为4 0 0ul ，称为溶液d ，冰浴放置。 表2 基因组d n a 的部分降解 2 取1 0 个o 5 l 的离心管，编号卜1 0 。l 号管加4 0 “l 溶液d ，其余各管加2 0 山溶液d 。 3 在1 号管中加2 单位s a u 3 a i ，混匀。吸取2 0 h 1 1 号管中的溶液至2 号管中，混匀， 然后依次转移2 0 斗l 溶液至下一管中，1 0 号管弃去2 0 肛i 溶液，使每管酶浓度依次 倍比下降。 4 同时将卜1 0 号管放入3 7 ，保温3 0 m i n ，立即放入冰浴中，加e d t a 至终浓度为 2 0 i i 1 1 0 l 儿终止反应。 5 以 d n a h i n d i i im a r k e r 为核酸分予量标志物( d n a h i n d i i im a r k e r 的准备： 8 山d d h 2 0 、1 “ll o a d i n g 和1 山d n am a r k e r 混匀，6 5 ，5 m i n ，o ，3 m i n ) ，于 0 6 琼脂糖凝胶中电泳，5 0 v 电泳2 h 6 根据分子量标准的大小分析照相结果，观察9 2 3 k b 范围内片段最多的反应管 号，得到最适酶浓度为0 0 0 8 u u g d n a ，选择此酶量作为大量酶切的反应浓度。 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 l l h ) 凡津腻科大学硕士论文 四、犬蹩d 的部分酶切： 1 根据小量酶切实骏所确定的合邋的酶浓度，对基因组总d n a 进行酶切。酶浓 密、菠应遗度、爱瘴对阕等条佟尽量窝，l 、量懿甥条终一致。 反成体系如下： 酶切浓度：o 0 0 8 u u g d n a 袭3 大量d n a 的部分酶切 熬韬体系秘礴薅爱 d n a ( 1 0 0 u g ) l o b u f f e r b s 蠡( 1 黼g 蕊i ) d d h 2 0 s a u 3 a i ( 1 0 u 1 ) 1 5 0u l 2 0 0 u l 2 0 扯l 1 6 3 0 u 1 o ，0 8 u l 反应条件：3 7 ，3 0 m i n 。 2 。反应继柬后，取5 # l 酶切样品行o 6 琼脂糖惫泳检查片断的大小。 3 蟊酶秘产物主要鬃中在9 2 3 蝻之阚，娴等体积鹣氯仿筹戎簿( 2 5 ：2 4 ：1 ) ， 轻轻颠倒混匀，1 20 0 0 g 离心5 m i n ，取上清，抽提两次：加1 1 0 体积的n a a c 和2 僚体积乙醇沉淀d n a ，4 ，1 2o o o g 离心l o 分锌；d n a 沉淀餍7 5 乙醇洗 一次，于澡君翻2 髑# 1 疆溶翳。 4 1 0 一4 0 ( w w ) 蔗糖密度梯度超遮离心纯化片段： 瀵制蔗糖密度梯度： 先霜吸警敬轴1i 隔藏凝滚滚翔入爨鬻，警中。霉蠲激蛰取5 氇l4 0 蔗糖溶液，将吸管的头部深入列l o 蔗糖溶液的底部( 即离心管底部) ，然 麟让液体缓慢的流入，此时控制流速，以不搅乱界面为盛。铺完后，将离 心餐直立，对巍疆察，蠡栗瑟瑟有嗳显豹交器瑟，剐镶搿魄较好；若无交 界面或交界面不太清楚，说明界面已搅乱，例去重铺。铺好后，在界面处 肇家基然辩学基袅燕劫磺霉( 融3 8 2 7 l l 拍) 天津医科大学硕士论文 用记号笔作记号，以便离心完成后取样时参考。 d n a 样品6 8 加热1 0 m i n ，笺漱冷却至2 0 ，轻轻地加到蔗糖密度梯度溶液 鹃上层。 2 0 ，6 】2 o g ，离心2 2 h 。 5 用较糨的吸头从蔗糖密度梯度溶液的上层开始收集溶液，每5 0 0ul 为个部 分势霾予一毅款粒p e n d o r f 管中，攘照取出的爱藤顺序鸯，l 、至l 丈编号。 g 每部分取2 0 hl ，戳 d n a h i n d i i im a r k e r 为拨酸分子量标惑物，于o 8 潦脂 糖凝胶中电泳，5 0 v 电泳1 h 。 ? ，根攒电泳结果，合并食有9 2 3 k b 大小片段夔部分。4 对2 ll e ( p h 8 。o ) 溶液逶 丰厅1 2 一1 6 小对，每扣6 小时换一次透析液。透掰袋要留出能使样品增加2 3 倍体 积的蹙。 8 。经 建逶橱的d n a 样品体积较大，瘸正丁醇进行按提。加等体积正丁醇，粥旋涡 混合器混匀：l6 g ，离心l m i n ；弃捧上滋正丁醇层。反复擒提至样晶体 积为0 5 m l 。 9 样品中期入l l o 体积3 m o l l 醋酸钠，2 倍体积乙醇沉淀d n a ，轻轻颠倒混匀， 塞溆敖鲎3 蕊i n 。 l o 4 ，1 20 0 0 g ，离心1 0 m i n 。沉淀用7 0 9 6 乙醇洗涤一次，干燥后，加t e 溶解。 测其浓度为7 0 n g “l 。 1 1 取l 弘l 叛玉掰a 珏i 州i i i 疆醚k e r 为核酸分子纛标志耪，予o ，褊琼警耱袋羧中 电泳，5 0 v 电泳l h 。检查片段的大小。 五、连接条辞的确宠： 1 连接条件： 垂家鑫然辩学萋金瓷霸矮霜( 。挝7 l l 辩) 犬津瞰科大学硕士论文 1 6 循环水浴连接1 6 小时。 2 连接产物酶俸外包装； 1 ) 取连接反成物总体积的1 4 ，即2 5u1 ，加入到5 0 ul 包装抽提物中，轻轻敲 打离心管瘫部使之混匀。 2 ) 2 2 像滠3 小时。 3 ) 加噬菌体缓冲液至5 0 0ul ，加2 5u1 氯仿。上下颠倒温和混匀，静鬣使氯仿沉 到管底。 3 感受态细胞的制备：电转化感受态细胞 1 ) 用无菌挑精环直接蘸取少量一8 0 冻襻的k w 2 5 1 菌液，在含有1 5 u g m l 四环素的 强国体培弊基表匿翊线，于3 7 壤莽l 刚、对。 2 ) 挑取单一荫落接种于5 m l 古有1 5 u g m 1 四环素的l b 液体培养基，3 7 振荡培养 1 6 小时。 3 ) 取l 瑶l 壤莽耱接静予1 0 冁l 丰富的强滚俸耀莠墓( 食0 ，2 麦芽穗释1 0 糊。l 锺 阐家自然科学基惫璇助项目( n o3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 m g s o 。) 中，3 7 ，3 0 0 r p m ，剧烈振荡3 4 小时至o d m o - 0 4 一o 5 。 4 ) 将菌液冰浴3 0 m i n ，其间缓慢摇晃数次，同时预冷5 0 m 1 离心管。 5 ) 将菌液分装到2 个5 0 m 1 离心管中，4 ，2 5 0 0 r p m 离心1 5 m i n 。 6 ) 弃掉培养液，离心管中加少量预冷d d h 。o ，重悬沉淀，再将水注满，4 ，2 5 0 0 r p m 离心2 0 m i n 。 7 ) 弃掉培养液，离心管中加少量预冷d d h 。o ，重悬沉淀，再将水注满，4 ，2 5 0 0 r p m 离心2 0 m i n 。 8 ) 小心弃掉上清，用2 m l 冰预冷的1 0 甘油重悬沉淀，4 ，2 5 0 0 r d m 离心2 0 m i n 。 9 ) 弃上清，并使壁上液体吸弃，加l m l 冰预冷的1 0 甘油重悬沉淀。 1 0 ) 稀释上述悬液后测o d 。值，两管的浓度分别为6 5 1 0 和1 6 5 1 0 “ c e l l m l ( 1 0 d 。为：2 5 1 0 “c e l l m 1 ) 。 1 1 ) 按1 0 0u1 管分装，液氮速冻，再存于一8 0 。 4 倒平板测定包装的噬菌体滴度： 1 ) 取一管新鲜制各( 或冻存) 的感受态细胞，与电转杯一起放在冰上冷却。 2 ) 把2 中包装好的噬菌体，每管均取4 2ul ( 含载体d n a l n g ) ，加入到1 0 0ul 感 受态细胞中混匀，置于冰上。 3 ) 调节电转仪，m o d e 设置为原核方式( p r o k a r y o t e s 0 ) ，电压设为2 5 k v 。 4 ) 将感受态细胞和噬菌体混合物转移至预冷的电转杯中，轻轻敲打电转杯底部 使混合物均匀进入电转杯的底部。 5 ) 将电转杯放入电转仪，按s t a r t 键，听到峰鸣声后，停止。立即向电转液中加 入1 m l 预热的s o c 液体培养基，重悬细胞后，转至摇菌管中。 6 ) 在3 7 摇床中，2 2 0 一2 5 0 r p m ，振荡复苏一小时。 7 ) 把上步复苏好的液体按1 0 倍系列稀释卜1 0 0 倍。 8 ) 取1 0 0ul 稀释液( 所含载体d n a 的量分别为o 1 n g 、o 0 1 n g 、o o o l n g ) ，加4 m l 融化的上层琼脂，立即颠倒混匀倒在含有1 5 u g m l 四环素的l b 平板上。待上层 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 2 7 1 1 5 4 ) 无津医科大学硕士论定 琼脂凝固后，3 7 倒置培养过彼。 9 ) 计算噬菌体的滴媵和包装效率： 噬藏馋溥度( p f u 厢1 ) = 噬莹爨数稀释镑数耩器屠怠装穆傣积 噬旃斑形成率( p f u u g ) = 噬菌体滴度包装反应中载体d n a 的浓度 根据l b 平板上的噬菌斑数，计算噬菌体滴度和噬菌斑形成率。噬菌体滴度 为1 0 5 p f u m l ；噬蘸褒形成率为1 0 8 p f u u g 以上，尤以l 、2 号连接管豹 为高，l 母管噬菌斑形成率可达到2 l 萨p f u 如g 。 注意：懑转杯的清淡 1 ) 粥清永将电转棒鞘j 孛一下。 2 ) 向电转杯中加入7 5 乙醇浸泡2 h 。 3 ) 弃去7 5 乙醇，用蒸馕水冲洗2 3 遮，然后眉l m l 的吸管吸取怒纯承反复吹打瞧 转糖i 0 速懿土。 4 ) 加入无水乙醇2 m l 于电转杯中，浸泡3 0 m i n 。 5 ) 弃去冤水乙醇，于通风橱中挥发乙醇。 6 ) 耨瀵洗荮酌电转豁救入一2 0 冰箱惠备露。 六、蹩缀 噬菌体d n a 的提取妲”； l 。 在离心管中秀n 入i 拂l s 辩滚，再蕊入一滴( 约5 0p1 ) 氧待。 2 用微缴移液器的吸头刺穿所选择的 噬菌体噬菌斑直到底下的硬琼脂，轻轻 一吸，将噬菌斑和下层琼脂一起吸入吸管中。 3 ， 觚蔽餐中浇下臻虢块，萋予含s 影越仿( 在步骤l 中麓备) 的离心管中，在整 温放鬣卜2 小时或4 放置4 6 小时，使噬菌体颗粒从琼脂块中洗脱下来。 4 ，接种大肠杆菌k w 2 5 l 至5 m l l b 液体螭莽液中，3 7 剧烈振荡培养过夜。 5 褥0 瓤l 逡蓥傣基浮液与0 。l m l 道凌培养缨藿混合，3 7 温育1 5 m i n 。 6 加入4 m l l b 培养液，3 7 剧烈振荡培养约9 小时。 嚣蜜盎然拳 举蒌盘舞霸瑗舞( 3 。2 7 l l 辩) 天漳暖科大学硕士论文 壤莠兹庭该莛滂亮豹，只戡觅裂极少鍪熬缨瑰薅冀。魏采裂惩没露发生或裂 解不完全，则加入等体积预热l b 液培，3 7 继续剧烈振荡培养2 3 小时。 7 细菌裂解后，在培养物中加入o 1 m 1 氯仿，3 7 继续剧烈振荡培养1 5 m i n 将裂 簿秘转移楚一褰心篱申，4 、40 0 0 g 离心l 黼i n 。 8 将上清转穆至一新鲜的离心管中，每1 0 m l 裂解液加1 0 0pll m o l 乙m g s 0 。，混 匀。 9 1 0 1 1 1 2 1 3 趣1 0 班lt 礁缓渖液、3 2 0 # l 薮鳝配置熬0 k a s e i 渡( 爝 糕缓 串液醚黧，浓度为 l m g m 1 ) ，濑和倒置离心管数次混匀，窳温放置1 5 m i n 。勿剧烈振荡，注意d s e 污染。 加孙1 蹦n 戚l ，2 。2 9 固体p 翳一8 0 0 0 ，搜p e g 完全溶勰，冰上放置l 融i n 。 4 、1 2o o o g 离心1 0 m i n 。 弃上清，用3 0 0ult m 缓冲液重悬噬菌体沉淀，移入1 5 m 1e p p e n d o r f 管中。 加3 0 0 * l 筑仿，充分浞匀，1 2 o x g 离心5 m i n 。取上层水相，斌筑傍再抽提 一次。注意；不要带岛水与氯仿两者器蕾闻的p e g 。 1 4 水相中加1 5u1o 5 me d t a 、3 0ul5 mn a c l ，混匀。 1 5 加3 5 0 “lt r i s 酚，剧烈振荡混匀，1 2 o g 离心5 m i n 。 1 8 。褥上层东稿转移至勇一凝1 5 m le p p e n d 。r f 臀中，瘸等体积氯仿抽提一次。 1 7 ，取上清，加两倍体积无水乙醇，冰浴2 0 m i n 。 1 8 。4 。c 、1 2o o o g 离心l o m i n 。 l 弃上瀵，惩7 蒜乙醇漂浚次。 2 0 4 、1 20 0 0 g 离心5 m i n 。弃乙醇，干燥。 2 1 加5 0 hlt e 溶解 噬菌体d n a 。此 噬菌体d n a 可用于酶切。 七、重组 燃菌体d m 的酶切鉴定； 1 酶切体系： 斓家自然科学基盎赞助项目( n o ，3 0 2 7 1 1 5 4 ) 天津医科大学硕士论文 表5 酶切体系 酶切体系加样体积 噬菌体d n a l o kb u f f e r b a m hi 8 u l l u l l 川 合计1 0 u l 2 酶切条件：3 7 3 小时 3 电泳鉴定：取5u1 以 d n a h i n d i i im a r k e r 为核酸分子量标志物，行o ，6 琼脂糖凝胶电泳，5 0 v ，l h 。 八、基因组文库d n a 的提取。”： 1 噬菌体的大规模制各：高倍数感染法 1 ) 接种大肠杆菌k w 2 5 1 单菌落至5 m l l b 液体培养基中，3 7 剧烈振荡培养过夜。 2 ) 取一5 0 0 m l 烧瓶，加入l o o m ll b 液培( 预热至3 7 ) ，接种l m l 过夜培养物，3 7 剧烈振荡培养至o d 6 。产0 5 ( 3 4 h ) 。 3 ) 烧瓶中加入2 管包装好的 噬菌体继续于3 7 剧烈振荡培养，直到完全裂解 ( 约3 5 h ) 。 4 ) 烧瓶中加入2 m l 氯仿，3 7 ，1 0 m i n 。 2 从大规模裂解液中制各 噬菌体颗粒： 1 ) 将裂解液冷却至室温，加入胰d n a s e i 和胰r n a s e 至终浓度各为l u g m 1 ，室温放 置3 0 m i n 。 2 ) 加入固体n a c l 至终浓度为1 m o l 几( 1 0 0 m l 裂解液加5 8 4 9 n a c l ) ，搅拌使其溶解。 将培养物冰浴1 h 。 3 ) 4 ，1 10 0 0 g (