（微生物学专业论文）假单胞菌转化dlatc合成lcys相关酶的分离纯化.pdf

南开土学硕士学位论文 摘要 摘要 l 一半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及 饲料工业。本实验室从土壤中筛选获得了一株假单胞菌t s 一1 1 3 8 ，可转化d l - a t c 合成l 一半胱氨酸。本研究从产酶及酶促反应条件优化、关键酶的分离纯化、酶 学性质以及菌株的微胶囊固定化等方面进行了研究，研究结果如下： 在单因素实验的基础上应用正交实验确定出假单胞菌t s 1 1 3 8 最佳产酶培 养基配方为( g l ) ：葡萄糖3 0 ，d l a t c3 ，玉米浆2 ，尿素3 ，m n s 0 4 5 h 2 0 0 0 0 7 ， k 2 h p 0 43 ，f e s 0 4 7 h 2 00 o l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，n a c l1 5 ，p h7 5 ；于2 8 、 1 4 0 r r a i n 摇床培养1 6 1 1 后，细胞浓度和酶活力分别比优化前提高2 9 9 和2 3 8 。 建立了最佳酶促反应条件：完整细胞酶液( 细胞培养液5 倍浓缩) 在4 3 、 p u s 0 、d l - a t c 底物浓度6 9 l 时，进行酶促反应时转化率最高达到5 9 9 ；超 声波破壁后酶液( 5 倍浓缩) 在3 7 。c 、p h 8 0 、d l - a t c 底物浓度为6 9 m 时进行 酶促反应时转化率最高达到7 9 1 。 采用去除核酸、盐析、凝胶过滤和离子交换等手段分离纯化得到电泳纯的 l - a t c 水解酶、l s c c 酰胺水解酶和l c y s 脱巯基酶，分子量分别为3 7 5 、4 2 8 和5 3 0 k d a ，三个酶的最适反应温度均为3 5 ，最适反应p h 值分别为7 0 、8 0 和7 0 ，均为嗜中温型酶，在p h 6 0 p h 9 ，0 的范围内有较好的稳定性：三个酶的 k m 值分别为o 6 7m m o l l 、o 1 5m m o l l 和2 3 7 m m o f l ，最大反应速度分别为 o 3 9 x 1 0 一m m o l l r a i n 、o 4 2 x 1 0 3 m m o l l m i n 和o 1 l x l 0 m m o f l r a i n 。 应用非均相反应合成了微胶囊固定化材料n a c s ，并利用n a c s - p d m d a a c 微胶囊对t s 一1 1 3 8 菌株进行了固定化，培养1 3 2 h 后胶囊内的菌浓为游离培养细 胞的6 倍，催化活性为游离培养细胞的2 5 倍；微囊化细胞静态、动态转化d l a t c 合成l 一半胱氨酸的研究表明，静态转化比动态转化在d l a t c 的转化率、达到 l 一半胱氨酸最大量的积累所需的时间、反应装置的要求等方面均有一定的优势。 关键词：假单胞菌，l 半胱氨酸，d l a t c ，酶法转化，l a t c 水解酶，l s c c 酰胺水解酶，l c y s 脱巯基酶，酶纯化，n a c s p d m d a a c 微胶囊，固定化。 南开文学硕士学往论文a b s t r a c t a b s t r a c t l - c y s t e i n ei s a l le l e m e n t a r ys c o n t a i n i n ga m i n oa c i d w h i c hh a v eb e e nf o u n d u t i l i t ya sm e d i c i n e , r a wm a t e d a l sf o rm e d i c i n e , f o o da d d i t i v e ，a d d i t i v ef o rc o s m e t i c s a n df o d d e r i no u r1 a b ，as t r a i np s e u d o m o n a s s p t s 1 1 3 8t h a tc a l lc o n v e r td l a t c t o l c y s t e i n ew a ss e l e c t e d t h ec o n d i t i o n so fe n z y m ep r o d u c i n ga n de n z y m a t i cr e a c t i o n ， p u r i f i c a t i o no f c d i l c a le n z y m e sa n di m m o b i l i z a t i o no ft h es t r a i ni nm i c r o c a p s u l ew e r e s m d i e di nd e t a i l t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w t h e o p t i m i z e de n z y m ep r o d u c i n gm e d i u mc o n t a i n i n gg l u c o s e3 0 ，d l a t c3 ，c o r n e x t r a c t i o n 2 , u r e a3 ，m n s 0 4 5 h 2 0o ，0 0 7 ，k 2 i - i p 0 43 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ， m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 ，n a c l1 5 ，p h7 5w e r eo b t a i n e d b yo r t h o g o n a lt e s to nt h eb a s eo f s i n g l e - f a c t o rt e s t 弧es h a k ef l a s kc u l t i v a t i o n ss h o w e dt h a te e l lc o n c e n t r a t i o na n d e n z y m ea c t i v i t yw e r ei n e r e a s e d2 9 9 a n d2 3 8 r e s p e c t i v e l ya tt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n 强e e n z y m a t i c r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e i n v e s t i g a t e d 蚴e n5f o l d s c o n c e n t r a i l o ni n t a c tc e i l s 眦u s e d 船e n z y l n es o b r c e , o p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r e w e r e8 0a n d4 3 、7 l ，h 5f o l d sc o n c e n t r a t i o n8 0 h i ec r u s h e dc e l l sw e r eu s e da s e n z y m es o u r c e , o p t i m a l 口ha n dt e m p e r a t u r ew e r e 8 0a n d3 7 t h ec o n v e r s i o nr a t i o w a s5 9 9 a n d7 9 1 r e s p e c t i v e l yw h e nd l - a t cc o n c e n t r a t i o nw a s6 玑 t h el - a t ch y d r o l a s e l s c ca m i d o h y d r o l a s ea n dl - c y sd e s u l m y d r a s ew e r e p u r i f i e d t ob eah o m o g e n e o u sp r o t e i nd e m o n s t r a t e db ys d s - p a g et h r o u g ht h e m e t h o d s i n c l u d i n gn u c l e i ca c i d m a k i n go u t ，s a l t i n g - o u t ，g e lc h r o m a t o g r a p h y , i o n e x c h a n g e ，e t e t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t w e r ea b o u t3 7 5 ，4 2 8a n d5 3 0 k d a r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew e r ea 1 13 5 ，t h eo p t i m u m p h w e r e7 0 ，8 0a n d 7 0r e s p e c t i v e l y 1 1 l et h r e eg l l z y l l e $ w e r es t a b l ea tt h es i t u a t i o n o f p h 6 0 p h 9 0a n d m o d e r a t e t e m p e r a t u r e t h ek m o f t h et h r e ee n z y m e sw e r eo 6 7 ，0 1 5a n d2 3 7 m i n e 儿 a n dt h ev m “w e r e0 3 9 x 1 o ，0 4 2 1 0 a n d0 1 l x l 0 m m o l l r a i nr e s p e c t i v e l y b a s e do nt h eh e t e r o g e n e t i cr e a c t i o n ，ap r o c e s so f p r e p a r a t i o no fn a c sw a s p r o p o s e d p s e u d o m o n a ss p t s - 1 1 3 8 w a si m m o b f l i z e di nt h en a c s p d m d a a c m i c r o c a p s u l ea n dc u l t u r e dc o n t i n u o u s l y i n1 3 2h o u r s t h ed e n s i t yo f c e l l sc o u l db e6 f 0 i dt h a nt h a ti nf r e ec e l lc u l t u r ea tt h es a n l ec o n d i t i o n a n dt l l ee n z y m e a c t i v i t yf r o m d i a t ct o l c y s t e i n ew a s2 5 f o l d s i tt u r n e do u tt h a td i a 1 c o n v e r t i o nt o l - c y s t e i n et h r o u g ht h em e t h o do ft h es m i l er e a c t i o ni ss u p r i o rt ot h em e t h o do f c o n t i n u o u sr e a c t i o na tt h ea s p e c to f c o n v e n i o nr a t i oo f d l - a t c t h et i m e o f r e a c h i n g t h em a x i m a lc o n c e n t r a i l o n o f l c y s t e i n ea n dt h es c h e m er e q u i r e m e n t k e y w o r d s ：p s e u d o m o n a s ，l - c y s t e i n e ，d l - a t c ，e n z y m a t i cc o n v e r s i o n ，l a t c h y d r o l a s e ，l - s c ca m i d o h y d r o l a s e ，l c y sd e s u l f l a y d r a s e ，p u r i f i c a t i o no fe n z y m e ， n a c s - p d m d a a c m i c r o c a p s u l e ，i m m o b i l i z a t i o n 2 南开土学硕士学位论文前言 前言 1 1l 半胱氨酸的分子结构 l 半胱氨酸( l c y s t e i n e ) 是参与蛋白质的2 0 种氨基酸中的一种，属于脂肪 族氨基酸。在蛋白质中l 半胱氨酸常以其氧化型l 一胱氨酸形式存在，由两个l 一 半胱氨酸侧链上s h 基氧化成共价的二硫桥( d i s u l f i d eb d d g e ) 连接丽成。l - 半胱氨酸的化学名称为l a 氨基b 一巯基丙酸，最早是于1 8 1 0 年从膀胱结石中 以胱氨酸的形式发现，其结构式与立体结构式见圈1 1 和图1 2 。 0 h s 八刚 n h 2 l - c y s t 8 i n e 图i - ib 半胱氨酸的结构式 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo f l - c y s t e i n e 1 2l 半胱氨酸的理化性j 酵卜4 】 名称：l 半胱氨酸 化学名称； 分子式： 相对分子质量： 图1 - 2l 半胱氨酸的立体结构 f i g 1 - 2t h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f l - c y s t e i n e l - a 一氨基- b 巯基丙酸 c 3 h t n 0 2 s 1 2 1 1 2 比旋光度： 口】2 0 d ( h 2 0 ) = 一1 6 5 】2 0 d ( 5 m o l l h c l ) = + 6 5 颜色：白色结晶性粉末 呈味性：具异臭味酸 溶解性：易溶于水，在乙醇中极微溶解 熔点：1 7 乱1 7 8 c 稳定性： 对酸稳定，而在中性及碱性溶液中易被空气氧化为胱氨酸 微量铁及重金属可促使其氧化 南开大学硕士学位论文 前言 等电点( p i ) ：5 0 2 保存方式：l - 盐酸半胱氨酸水舍物( c 3 h 7 n 0 2 h c l h 2 0 ) 化学反应性：由于l 半胱氨酸侧链上的巯基( s h ) 极性很强，除具有所 有氨基酸能够发生的化学反应外，还有一些特殊的化学反 应： ( 1 ) 与卤化烷如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等迅速反应生成相 应的稳定烷基衍生物； ( 2 ) 巯基可以与各种金属离子形成稳定程度不等的络合物； ( 3 ) 可与二硫硝基苯甲酸( d i t h i o n i t r o b e n z o i ca c i d ，缩写为 d 诏) 或称e l l m a n 试剂发生硫醇二硫化物交换反应； ( 4 ) 两分子半胱氨酸自身氧化成一分子胱氨酸。 1 3l 半胱氨酸的应用 根据构型的不同，半胱氨酸有l 型、d 型和d l 型之分，而在体内具有生理 活性的为l 型的半胱氨酸。b 半胱氨酸是组成蛋白质的成分之一，是一种a 氨基 酸，它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多败链两个半胱氨酸残基 间以二硫键( s s ) 连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构【2 。l 半胱氨酸 是构成蛋白质的2 0 多种氨基酸中具有活性硫( 巯基) 的氨基酸，它在医药、食 品、饲料、化妆晶等行业具有广泛的用途。 1 3 1 在医药中的应用 在医药上眇】，l 半胱氨酸盐酸盐具有促使肝功能旺盛的作用，可用于治疗放 射性药物中毒、锑中毒、肝炎、血清瘸；n - 乙酰山半胱氨酸是糙液溶解性祛痰 剂，通过其分子中的- s h 能将痰液中粘蛋白的s s 穗断裂，粘度迅速下降，在几 分钟内，使痰液易于咳出或吸出，改善呼吸状况，适用于肺合并症的治疗及急慢 性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张、肺结核、臃炎、肺气肿等引起兹痰液稠 厚、咳痰困难、气管阻塞等。国外进行外科手术后的病人常使用此药，使支气管 浓稠的痰液化稀，防止咳嗽，以免振动伤口。此外，n 乙酰l 半胱氨酸的3 水 溶液( 国外称为“阿西丁”) 可治疗角膜炎，也可作为稳定裁用于氨基酸输液中。 l - 半胱氨酸乙醅盐酸盐可用于肝炎、肝硬化病人，增强肝功能、用于白血球减少 症、放射线所造成的损害。l - 半胱氨酸还具有消炎、止痛、抑制细菌和癌细胞生 4 南开大学硕士学位论文 前言 长等作用。 近年来的研究认为l 半胱氨酸具有以下几种生理功能： 1 、在生物体内。半胱氨酸对许多有害物质和毒索翔甲醛、乙醛、乙醇、氯仿、 四氯化碳、铅、镉、氯化汞、过氧化酯、河豚毒索等具有有效的解毒作用。 2 、用l 半胱氨酸可以有效地预防和改善放射性物质对机体的伤害； 3 、l 半虢氨酸在皮肤蛋白的角蛋白生成中具有维持巯基( - s h ) 酶的活性，并 且可以补充巯基，维持皮肤的正常代谢。还可以用于治疗人的多种皮肤病( 如通 常的痤疮、荨麻疹、中毒疹、湿疹及肝斑等等) ，另外对农药导致的皮肤炎、农 药中毒及病毒性肝炎等也都具有一定的疗效； 4 、当炎症、过敏时，机体内胆碱酯酶等巯基酶的活性降低，补充l 半胱氨酸 可维持巯基酶的活性，改善炎症和过敏的皮肤症状； 5 、由于王广半胱氨酸具有软化和溶解角质豹彳乍用，所以对角质肥厚的皮肤瘸也 有一定的疗效； 6 、l - 半胱氨酸还具有防止生物体衰老的功能。 1 3 2 在食品工业中的应用 1 食品增香剂与发色剂 l - 半胱氨酸与六碳糖共热进行m a f l a r d 反应可产生牛肉、猪肉的肉香味，用 作调昧羽；在玉米食品加工中加入少量l t 半胱氮酸霹使玉米香味增加1 0 , - 4 0 倍。 在肉食加工中加入l - 半胱氨酸其发色效果优于传统的亚硝酸盐，并可防止具有 致癌作用的二甲基亚硝胺( d m n a ) 的产生。猪肉香肠用l 半胱氨酸和氯化钙 混合浸渍处理后，发色效果优于亚硝酸盐嘲。 2 面包添加剂 l - 半胱氨酸的活性基团琉基( - s h ) 具有特殊的闭塞剂作用，可以使面 团形成立体网状结构。一般面团的成熬必须经过3 5 个小对的酵母发酵，才可使 面粉蛋白质中ss 基产生交换反应形成网状结构还原剂和氧化剂都可以促进面 筋一s s - 基的交换反应，利用l - 半胱氨酸的还原作用，可以促进面团谷蛋白的形 成及促迸发酵和出模，防止老化( 保鲜) 等啊，目前，美国、日本等均已采用。 3 油脂抗氧剂和保鲜剂 8 ，引 用l 胱氨酸、l - 半胱氨酸及l 一缬氨酸与葡萄糖共加热得到褐色物质，具有 南开土学硕士学位论文前言 供氢性与还原能力，并且能与铝和锌等离子发生螯合作用，从而封锁金属离子对 油脂氧化的触酶活性作用，有效地防止食品中油脂的氧化变质。例如，油脂中加 入o 0 5 胱氨酸在1 8 0 。c j j 口热3 0 分钟后能防止油脂氧化。l 半胱氨酸的添加可以 有效地防止和降低食品的褐变，保持维生素c 不受破坏。在压榨果汁时添加l 一 半胱氨酸，可防止维生素c 氧化、果胶沉淀，延长果汁的保存期；日本在奶粉 中使用l 一半胱氨酸，防止奶粉变质。 4 防止食品褐变 l 半胱氨酸可抑制褐色物的生成、变黑反应的中间体还原或者l 半胱氨酸 钝化褐变反应，以性质稳定的l 半胱氨酸作为添加剂可使产品的营养价值保持 稳定 1 0 】，可使食品的质量、味道、香味在短时间得到改善。另外l 一半胱氨酸对 含有硫化物的洋葱、大蒜等也有增强风味的效果。 1 3 3 在化妆品中的应用 最近，光医学、光生物学的研究表明：在表皮最下层的色素细胞可产生底层 黑色素造成黑色素沉着，使表皮出现黑斑。色素细胞中所含有的具巯基( 一s h ) 基 团的l - 半胱氨酸，可调节黑色素的生成，基于l - 半胱氨酸的巯基( 一s h ) 具有还原 能力和化学反应活性【l l 】，所以，用l 广半胱氨酸可以生产美白化妆品。 受到阳光照射后皮肤将会变黑，其原因是由于在日光的紫外线照射下表皮层 的。半胱氨酸被破坏，不能阻止黑色素的生成。另外，人的皮肤表面会产生肝 斑，也是由于肝功能病变，使皮肤的l - 半胱氨酸含量减少，不能阻止黑色素产 生的缘故。研究表明：l 半胱氨酸具有还原黑色素，消除已经沉着的黑色素的性 能。内服l - 半胱氨酸可以增加体内l 半胱氮酸的含量，而涂于表皮的l 半胱氨 酸也可以被表皮吸收，增加表皮最下层部分的l - 半胱氨酸含量。由于内服是全 身起作用，用量大并会引起副作用；而用于局部( 如脸部) 美白的外涂，则用量 很少。 l 半胱氨酸盐酸盐、l - 半胱氨酸酯盐酸盐、l - 半胱氨酸酯有机酸盐等均可用 于外涂美白化妆品的生产，效果具佳。尤其是l 半胱氨酸酯二羧酸盐，其美白 效果几乎达到百分之百。目前含l 半胱氨酸的美白化妆品已引起人们的重视， 着力进行商业研究和开发 1 1 , 1 扪。 烫发液的第一液以半胱氨酸为主要成分，起还原作用，切断人发中胱氨酸的 6 南开土学硕士学位论文 前言 二硫键，使头发具有可塑性。经人工卷曲赋形、氧化后又恢复到毛发角蛋白原来 的胱氨酸二硫键结构，外形却形成了种种波浪状。以往使用的还原剂以巯基乙酸 为主，但有恶臭味，并损伤发质及操作者的手指。目前高级卷发液多数改用半胱 氨酸，其优点是臭味低不伤发质，卷曲后发质柔润，颇受欢迎【i ”。 1 3 4 在饲料中的应用 1 4 , 1 5 】 在饲料添加剂方面，据德国莫勒斯公司( m o e l l e rc o ) 统计，除了赖氨酸、 谷氨酸与蛋氨酸以外，以l 。胱氨酸的用量为最大。但由于l 胱氨酸的溶解度太 小( 在室温时每l o 升水中只能溶解1 1 9 ) ，所以需制备成l 半胱氨酸才能添加 到饲料中予以使用 t 6 , t t 。 综上所述，l 半胱氨酸在改善机体的生理功能、医疗药物、食品和饮料工业、 化妆品行业、饲料添加剂行业具有广泛而实际的应用价值，对l 广半胱氨酸的研 究和制取已经引起人们极大的兴趣和关注。 1 4l - 半胱氨酸的生产方法 目前l 半胱氨酸的生产主要有毛发水解后还原法、酶法合成法、化学合成法 和发酵法等 1 8 】。我国对l 半胱氨酸的生产主要依靠毛发酸水解后提取胱氨酸， 然后将胱氨酸经化学或电解还原制各得到l 一半胱氨酸，国外有酶法合成和化学 合成两种方法。现将各种生产方法分述如下。 1 4 1 毛发水解后还原法 毛发( 头发、猪毛、羽毛梗) 的主要成分是角蛋白，它是由各种n 氨基酸 组成，其中l 一半胱氨酸含量为1 2 1 4 ，因此工业上常利用毛发水解来制取胱 氨酸，然后经电解还原得到l - 半胱氨酸【”删。角蛋白的水解一般采用碱水解和 酸水解两种方法，由于碱水解法对角蛋白水解后氨基酸破坏比较严重，收率较低， 另外碱水解还会产生氨基酸的外消旋反应【2 1 ，因此目前一般采用酸水解法进行生 产 2 2 , 2 3 。传统的生产一般采用人发和猪毛为原料，由于该原料成本离，资源有限， 近年来国内一批较大的羽绒制品厂提绒后剩下的鸭毛和鹅毛毛梗，已应用于代替 人发和猪毛作为生产胱氨酸的原料，拓宽了胱氨酸水解生产的原料范围2 4 1 。 酸水解制取l 一胱氨酸存在3 方面的闯题：( 1 ) 沉淀不完全会造成l 胱氨酸的 收率低；( 2 ) 提取胱氨酸后的母液是1 7 种氨基酸组成的混合氨基酸溶液，由于采 用碱中和，母液中同时含大量盐分( 氯化铵或氯化钠) ，有效利用比较困难f 2 扪。 7 南开史学硕士学位论文 前言 ( 3 ) 酸水解法制取l 胱氨酸和l - 半胱氨酸产生的废气( n h 3 和h 2 s ) 和废酸，会 对环境造成污染。 酸水解得到的l 一胱氨酸需进一步用电解还原【2 越9 】或者锡粉 3 0 , 3 1 】还原才能得 到l - 半胱氨酸。 1 4 2 化学合成法 1 9 9 7 年四川大学化学系提出根据“不对称合成原理”化学合成l - 半胱氨酸 的途径。合成原理是利用氯代烷类化合物经过氧化反应加成反应还原反 应取代反应，最后得到l 一半胱氨酸，l 半胱氨酸的提取率是7 5 。化学合 成l - 半胱氨酸需多步反应，产生d l 型外消旋体，只有经过化学拆分才能得到 所需要的。半胱氨酸，此法适用于l 半胱氨酸中间体的合成3 2 】。 1 4 3 发酵法 发酵法又称微生物转化法，目前多数的氨基酸均采用发酵法进行生产，发酵 法以葡萄糖或淀粉水解液为微生物的碳源和能源，添加有机或无机的氮源，通过 代谢调控，使代谢过程向有利于目的产物积累的方向进行，或选育缺陷型突变株， 切断莱一代谢过程和抑制目的产物的分解来获得目的产物积累。l 半胱氨酸的发 酵法生产现在正处于尝试探索阶段，大规模的生产还受到许多条件的限翻，其主 要原因是因为微生物体内的l - 半胱氨酸合成过程复杂，而且合成中的关键问题 是- s h 的来源。对大多数的植物和微生物来说，s h 基团来源于s 0 4 2 ，而s 0 4 2 可还原为某种硫化物e 1 1 不能提供s h ，这正是发酵法制取l 半胱氨酸难以解决的 问题。 1 4 4 酶法合成法 用酶法合成有用物质，多为比较昂贵的精细化工产品，合成产物的最大特点 是具有光学活性，尤为突出的是能合成有一定光学活性的氨基酸，而且工艺简单， 是化学合成法所不可比拟的。近年来，以微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的 技术有了快速的发展【3 2 】。 以酶法合成氨基酸与利用微生物作用的发酵生产方法相比较，虽然实用化程 度还不够，但酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特 别是近年来， 以酶法合成替代用发酵法生产比较困难的氨基酸，有了显著的进 步。 南开土学硕士学位论文前言 目前在氨基酸工业中，l 半胱氨酸是非发酵生产的氨基酸，基于酶法生产氨 基酸的优越性，一些科学家相继寻找微生物酶法生产l 半胱氨酸的方法。目前， 有3 种微生物酶法转化合成l 半胱氨酸的工艺路线：( 1 ) 以3 氯l - 丙氨酸为前体物 的l 广半胱氨酸酶法合成l 半胱氨酸；( z ) 以o 乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成l 广 半胱氨酸；( 3 ) 以d l 2 氨基2 噻唑啉4 羧酸为前体物的酶法合成。半胱氨酸。 现分述如下。 1 4 4 1 以3 - 童卜l 丙氨酸为前体的l 半胱氨酸酶法合成 该方法最先由y a m a d a 【3 卅等于1 9 7 7 年发现，他从阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e r c l o a c e a e ) 中分离到l - 半胱氨酸脱硫酶( l - c y s t e i n ed e s u l p h y d r y l a s e ，或称为脱巯基 酶，e c 4 4 1 1 ) ，该酶不仅能够通过q 、b 消除反应使。半胱氨酸分解为丙酮 酸、氨和硫化氢，而且还能够通过1 3 取代反应催化3 氯l 丙氨酸生成l 广半胱氨 酸晔3 5 。反应如图1 - 3 所示： 斗h 2l 半胱氨酸脱巯基酶￥h 2 h o o c - - c h - - c h 2 一c i + n a r i s + h o o c c h c 1 2 - s h + n a c l 图1 - 3l 半胱氨酸脱巯基酶催化3 氯山丙氨酸和n a s h 之间的b 取代反应 f i g 1 - 3e r e p l a c e m e n tr e a c t i o nb e t w e e n3 - c h l o r o - l - a l a n i n ea n dn a s hb yl * c y s t e i n e d e s u l p h y d r y l a s e 此酶广泛存在于细菌( 尤其是肠杆菌) 、酵母和植物中，并已从鼠伤寒沙门 氏菌和产气肠杆菌中纯化。其分子量约为2 2 9 k d a ( 鼠伤寒沙门氏菌) 和2 5 2 k d a ( 产气肠杆菌) ，它含有6 个分子量相同的亚基和6 分子磷酸吡哆醛，培养基内加 入l - 半胱氨酸可诱导此酶的产生【3 8 1 。 以3 一氯- l 丙氨酸和n a r i s 为原料在酶促反应液中得到5 0 9 l 的l - 半胱氨酸，摩 尔转化率为8 0 t 3 3 1 。 随后，d 1 l i l l o n p 9 肄又从土壤中分离到一株球形芽孢杆菌( b a c i l l u ss p h a e r f c 甜) l - 1 1 8 ，从中分离出o 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶( 0 a c e t y l s e r i n es u l p h y d r y l a s e ，e c 4 2 9 9 8 ) ，以3 - 氯一l 丙氨酸和n a r i s 为底物合成l 半胱氨酸，l 半胱氨酸的产物 收率可达至0 7 0 9 l ，3 - 氯- l - 丙氨酸的转化率可达8 0 8 5 ，但由于3 氯一l 丙氨酸 价格昂贵，尚不能进行工业化生产。 1 4 4 2 以o 乙酰- l - 丝氨酸为前体物的l 一半胱氨酸酶法合成 据相关研究报道4 0 。3 1 ，o 乙酰l 广丝氨酸硫化氢解酶( o a c e t y l s e r i n e 9 南开土学硬士学位论文 前言 s u l f l a y d r a s e ，o a s s ) 可催化由o 一乙酰一l 丝氨酸和n a h s 合成l 一半胱氨酸，反应在 室温、微碱性环境条件进行。反应过程如图1 4 所示。 1 9 8 7 年，h s i a o “1 报道了9 0 一乙酰一l 。丝氨酸( o a s ) 为前体经鼠伤寒沙门氏菌 o 乙酰一l 丝氨酸硫化氢解酶酶法转化合成l 半胱氨酸的生产工艺 4 5 】，采用一个 c h 3 n h ，c = o h o o c c h c h 2 0+ n a r i s o ，乙酰l 丝氨酸 0 一乙酰l 丝氨酸 硫化氢解酶 n h ， i 。 h o o c c h c 王2 一s h + c h 3 c o o n a l - 半胱氨酸 图1 - 4o - 乙酰- l 丝氨酸酶法合成l 半胱氨酸反应式 f i g 1 - 4t h ee q u a t i o n o f o a c e t y l - l - s e r i n ee n z y m a t i cc o n v e r s i o n t ol - c y s t e i n e 自动反馈控制系统来调节o 乙酰l 丝氨酸和n a r i s 在反应器中的浓度。在最适的 底物流加条件下，每克鼠伤寒沙门氏菌干细胞每小时可以转化o 乙酰l 广丝氨酸 生成3 6 9 l - 半胱氨酸，反应结束后，【广半胱氨酸产物的终浓度可以达至u 8 3 9 l ， o 乙酰l - 丝氨酸的摩尔转化率达到9 4 。这是首次用微生物酶法合成l 半胱氨酸 进行工业生产成功的范例。 1 4 a 3 以d l 2 - 氨基。2 - 噻唑啉4 羧酸为前体酶法生产l 半胱氨酸 d l 一2 氨基2 噻唑啉4 羧酸( d l - 2 a 蚵n o a2 - t h i a z o l i n e 4 - e a r b o x y l i ca c i d ， d l - a t c ) 是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品 4 6 , 4 7 1 。日本学者s a n 0 1 4 8 1 于1 9 7 7 年以添加甘油和d l - a t c 的极限培养基进行筛选，从3 8 8 个土样中筛选到一株嗜 硫氮杂环戊烯假单胞菌( p s e u d o m o n a st h i a z o l i n o p h i l u ma j 3 8 5 4 ) ，该菌株可以以 d l o a t c 为底物合成l 半胱氨酸。以培养1 8 d , 时的a j 3 8 5 4 细胞为酶源，添加 1 d l - a t c 3 h 2 0 、i k h 2 p 0 4 和0 1 4 盐酸羟氨的缓冲液为底物溶液，二者按 一定比例混合后在3 0 。c 反应2 4 小时后，在反应液中可产生6 1 9 l 的l 半胱氨酸( 反 应过程中有部分l 半胱氨酸氧化为l 胱氨酸，以l 半胱氨酸计) 。s a n o 又以本实 验室中3 7 个属的4 6 3 株菌株为试验对象，研究了这些菌株以d l a t c 为底物的l 半胱氨酸合成能力，研究发现，除了假单胞菌之外，其余2 2 株菌( 分属1 3 个属) 也可以以d l - a t c 为底物合成l 半胱氨酸，这些属的代表菌株及其转化能力如表 1 1 所列。 在实验中发现，有5 0 上的d l a t c 被转化成为l 半胱氨酸，由此说明在 a j 3 8 5 4 细胞内存在着a t c 消旋酶，可将d - a t c 转化成l - a t c 。s a n o 对该菌株的最 南开太学硕士学位论文 前言 表1 - 1 各种细菌的代表菌株将d l - a t c 转化为l 一半胱氨酸的产率 t a b l e1 - 1l - c y s t e i n ef o r m a t i o nf r o md l - a t cb yr e p r e s e n t a t i v eb a c t e r i a 佳生长条件和产酶条件进行了研究，结果表明甘油和葡萄糖是其产酶和生长的最 佳碳源，培养基中添加o 2 - - 0 5 的d l - a t c 对酶的产生具有诱导作用，在培养基 中不添加d l - a t c ，则在细胞内检测不到酶活，因此认为完成该转化过程的酶为 典型的诱导酶，而且酶的产生和细胞的生长呈正相关，细胞生长越旺盛其酶活也 就越高。由于细胞内同时存在着l 广半胱氨酸脱巯基酶，使得生成的产物被分解， 通过向酶促反应液中添加羟胺或氨基脲可以部分抑制脱巯基酶的活性而避免产 物的分解。通过诱变s a n o 得到一株脱巯基酶缺失菌株，对该菌株酶促反应的研究 表明，以1 6 小时培养的细胞为酶源，在4 2 、p h 8 2 条件下细胞对d l - a t c 的转 化率达到最高，反应液中的l 广半胱氨酸含量( 氧化后的l 胱氨酸以l 半胱氨酸计) 可达3 1 4 9 r l ，摩尔转化率达至( 1 9 5 。 继日本学者之后，1 9 9 0 年韩国学者r 州4 9 ，5 0 】等也从土壤中筛选到一株假单胞 菌p s e u d o m o n a ss p c u 6 ，研究了完成转化的最佳培养条件和酶促反应条件。该菌 株可利用d l a t c 合成l 半胱氨酸，并且在转化过程中以s 氨甲酰l ，半胱氨酸为 中间产物。但是该菌株细胞内同时也含有l _ 半胱氨酸脱巯基酶，影响转化率，虽 然添加羟胺可以有效地抑制它的活性，防止生成的l 半胱氨酸被水解，但是羟 南开大学硕士学位论文 前言 胺同时也对其它d l 。a t c 转化酶产生抑制，因此p 采取紫外线诱变的手段从大约 5 00 0 0 个菌落中筛选出一株脱巯基酶缺陷型m 3 8 菌株 5 l 】，在相同条件下加入 3 0 m m o l l 的l 一半胱氨酸进行酶促反应，原菌株在保温16 小时后l 半胱氨酸几乎完 全被分解，两突变株反应体系内的l 半胱氨酸却没有被分解，以d l - a t c 为底物 时也有相同的结果。 1 5 ) ) d ) l - a t c 合成l 半胱氨酸的酶法转化机制 l 。5 1 转亿途径分析 对d l a t c 酶法合成l - 半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1 9 7 9 年，日本学 者s a n o 口2 】提出了完成该转化过程的两种假设：一种是以s 。氨甲酰l 半胱氨酸 ( s - c a r b a m y l l - c y s t e i n e ，l - s c c ) 为中闻产物的转化途径；另一种是以n 氨甲 酰一l 一半胱氨酸( n - c a r b a m y l l - c y s t e i n e ，l - n c c ) 为中间产物的转化途径。 s a n o 以可能形成的两个中间产物s 一氨甲酰l - 半胱氨酸和n 氨甲酰l 半胱氮 酸为底物进行酶促反应，缩果表明以前者为底物时在反应液中有l - 半胱氨酸的生 成，而以后者为底物时没有l - 半胱氨酸生成，因此认为s 氨甲酰l 半胱氨酸为转 化过程的中间产物。又以不能利用d - a t c 但可利用l - a t c 合成l 半胱氨酸的菌株 p s e u d o m o n a sd e s m o l y t i c aa j 3 8 7 2 为对照菌株，二者细胞悬液中均加入d l - a t c 为 底物进行酶促反应，结果发现a j 3 8 7 2 细胞对d l a t c 利用率不超过5 0 ，而 a j 3 8 5 4 细胞对d l - a t c 的转化率却达到9 0 以上，由此证明了p s e u d o m o n a s t h i a z o l i n o p h i l u ms p a j 3 8 5 4 细胞中有a t c 消旋酶的存在，可催化从d 。a t c 至i j l - a t c 的消旋化反应【5 3 】。 r y u 4 9 , 5 叼等也研究了这一转化机制，他在进行细胞培养时在培养基中加k s 氨甲酰一l - 半胱氨酸发现可以提高从d l - a t c 至o 半胱氨酸的转化率，说明该化舍 物对参与转化的酶具有诱导作用，而加入n 氨甲酰l 半胱氨酸没有这种作用， 同时通过在酶促反应液中加入中间产物的方法证明q 生p s e u d o m o n a ss p c u 6 细胞 中同样进行以s - 氨甲酰l - 半胱氨酸为中间产物的转化途径。 而以n 一氨甲酰l - 半胱氨酸为中间产物的转化途径直至u 1 9 9 8 才由t a m u r a 5 4 1 报 道。该学者对l 一半胱氨酸合成菌株p s e u d o m o n a ss p o n 4 a 和p s e u d o m o n a s 口“t i d a a j 3 8 6 5 进行研究，诱导实验发现，如果分别以d l a t c 、n 。氨甲酰l 半胱氨酸和 s 一氨甲酰- l - 半胱氨酸为诱导物进行细胞培养，诱导后的细胞加入不同的底物进 南开土学硕士学a t 论j , 前言 行酶活测定，仅d l - a t c 诱导后的细胞具有l - a t c 水解酶活性；而且各种细胞均 有n 氨甲酰l 半胱氨酸水解酶活性而无s 一氨甲酰- l 半胱氨酸水解酶活性，而且 各种细胞均不能够利用n 氨甲酰d 半胱氨酸、s 一氨甲酰一l 一半胱氨酸和s 一氨甲酰 d 半胱氨酸为底物进行酶促反应生成l 半胱氨酸。t a m u r a 还对中间产物进行了 纯化，纯化后的产物经过红外光谱扫描、质谱分析、核磁共振分析和元素分析， 结果与标准的n 氨甲酰一l 一半胱氨酸完全相同，因此证明了这两株菌进行以n 一氨 甲酰l 半胱氨酸为中间产物的l - 半胱氨酸合成代谢途径。 综上所述，目前所报道的微生物酶法转化d l a t c 合成l 一半胱氨酸的途径有 两条：( 1 ) 以s 氨甲酰l - 半胱氨酸为中间产物的s 代途径；( 2 ) 以n - 氨甲酰一l 一半胱 氨酸为中间产物的n 代途径。 1 5 2d l a t c 合成【广半胱氨酸的酶系分析 目前，有关酶法合成l 半胱氨酸相关酶系的报道不多，2 0 0 1 年t a m u r a f ”】的 研究认为，不同的细菌从d l a t c 合成l 半胱氨酸采取两条途径涉及两套不同的 酶系进行催化合成反应，反应过程和酶系如图1 5 所示： c o o l t 厂弋 n ；意 n 砘 嘲 n i n m n 呻- r b 铀可，q 嘲t 耻 0 c o 图i - 5 酶法转化d l - a t c 合成工广半胱氨酸的途径 f i g 1 - 5t h ep a t h w a y o f b i o c o n v e r s i o nf r o md l - a t ct ol - c y s t e i n e 由图可知，在途径a 中有3 种酶进行协同催化作用：a t c 消旋酶( a t c r a c e m a s e ) 、l a t c 水解酶( l a t ch y d r o l y s e ) 和s 氨甲酰- l 一半胱氨酸酰胺水解酶 ( s c a r b o m y l l c y s t e 洫a m i d o h y d r o l a s e ) 。a t c 消旋酶催化拆分d l a t c 生成l a t c ； l a t c 水解酶水解a t c 噻唑环中的c = n 双键，生成s 氨甲酰l 半胱氨酸( l s c c ) 中间产物；再经s - 氨甲酰l 一半胱氨酸酰胺水解酶( l s c c 酰胺水解酶) 催化生成 。 南开土学硕士学位论文 前言 终产物l 半胱氨酸。在途径b 中也涉及3 个酶的催化作用：a t c 消旋酶催化拆分 d l a t c 合成