（植物学专业论文）八角莲的离体快繁技术和化学成分分析研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 第一部分植物组织培养文献综述 l 植物组织培养的发展简史及作用 1 9 0 2 年h a b e r l a n d t 提出细胞全能性( t o t i p o t e n c y ) 假说，直至2 0 世纪4 0 年代末至5 0 年代初，s k 0 0 9 和崔潋等利用腺嘌呤类进行烟草髓组织培养诱导根、 芽器官形成获得成功和1 9 5 8 年s t e w a r d 与r e i n e r t 分别由培养的胡萝h 细胞诱 导形成体细胞胚，该假说才得以试验证实( b h o j w a n i ，1 9 8 3 ) 。大量研究表明，植 物细胞在离体培养中，通常不易产生及保持其原有的分化状态，在不同条件下形 态发生变化并表现出极大的可塑性，可以分化出不同类型的细胞、组织、器官或 体细胞胚，直至形成再生植株( 许智宏，1 9 9 4 ) 。植物细胞全能性( t o t i p o t e n c y ) 是组织培养的理论基础，一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核， 它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传潜能，在一个适当的条件下可以通过 分裂、分化再形成一个完整的植株，这就是所谓的细胞全能性。但是在自然状态 下，由于细胞在植物体内所处位置以及生理条件的不同，它的分化受到各方面的 调控，致使其所具有的遗传信息不能全部表达出来，所以只能形成某种特化细胞， 构成植物体的一种组织或一个器官的一部分。由此可以说明条件是十分重要的， 或者说是关键的，只要条件合适，细胞潜在的遗传能力就会表现出来。植物组织 和细胞培养技术就是以细胞全能性作为理论依据，用人为的方法创造出一个适合 于生长的理想条件，使细胞的全能性得以发挥。 六十年代以后，植物组织培养工作已经遍及世界大多数国家，并获得了突飞 猛进的发展，组织和器官的培养技术日趋成熟和完善，越来越多的植物物种通过 离体培养获得了再生植株。( b h o j w a n i ，1 9 8 3 ；奚元龄，1 9 9 2 ) 。用于离体培养 的外植体遍及根、茎、叶、花、果实、子房、幼胚及成熟胚、茎尖分生组织、花 药、花粉等植物体的各个部分。在观赏植物方面己做过组织培养的有：甜叶菊、 大岩桐、非洲紫罗兰、大丽花、百合、杜鹃、中国水仙、郁金香、大花茉莉等( 曹 孜义，1 9 9 6 ；陈家银，1 9 9 0 ；沈秀丽，1 9 9 5 ；韦三立，1 9 9 6 ；范玉清，1 9 9 6 ) ， 在经济作物方面，由于它们与人们的衣食住行密切相关，在包括蔬菜、果树、油 料、作物、林木和许多使用的作物都进行了组织培养，有的己应用于生产实践之 中。在蔬菜方面，对大蒜、芦笋、茄子、黄瓜、番茄、白菜、菜豆等多种作了广 2 堑型堕些堕墼望堡丝塑! 堡壹星丝墼堑壅一 量长一些。在其它条件相同的情况下，变更酸洗时间，测定腐蚀速度。 2 2 9 酸洗液中f ，的存在对m z l l 缓蚀性能的影响 酸洗过程中不可避免的会产生f e 升，f e 对基体金属会产生新的腐蚀，f c ”和f e 按 下式反应： r j + + 愚一f e “ ( 2 _ 4 ) f e 3 + 的存在会使金属的腐蚀速度显著增加。因此酸洗过程中对金属本体的腐蚀来自 两个方面：盐酸的腐蚀和f e 3 十的腐蚀。为了考察m z l 1 抑制f e ”的能力，在酸洗介质 中添加不同浓度的三价铁离子，测定其腐蚀速度的变化。 址1 0 魂态赛验研究m 豇，l 的缀饿性能 在大多数情况下，对溶液进行搅拌会引起缓蚀效率的降低。由于流速的增大，甚至 还可能加速腐蚀。在某些情况下，由于介质的流动，使缓蚀帮分布均匀，使膜易于生成 而得到动态比静态效果好的结论。 为了尽可能考虑流速的影响，进行旋转动态挂片实验。旋转挂片测试是在实验室的 给定条件下，来筛选和评价缓蚀剂配方缓蚀效果的测试方法。试验水温为50l，温度波动范围不得超过l 。试样旋转速度为1 0 9 转，分，线速度为0 4 m s 。转速过低，会 影响成膜效果；转速过高会有旋涡、气泡等出现。旋转挂片的最大优点是在简易设备中 考虑了流速这一重要的因素【9 j 。实验装置如图2 2 所示： t 烧杯( 5 0 0 删) ：2 介质：3 ，j j i i 型电动搅拌器连接杆：4 试样： 转速：1 0 9 转分 图2 2 动态旋转挂片示意图 f 唔2 2d e v i c em a po f w e i g h t - l o s sm e 鹳u r e m e 眦f b fd y n a m i c 2 0 x 浙江大学硕士学位论文 等，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加。还有一些药 用植物，如地黄、太子参等，则因病毒危害导致退化，严重影响其产量和品质( 薛 淮，2 0 0 2 ) 。所以利用植物组织培养技术解决药用植物的植株再生与繁殖问题迫 在眉睫。近年来，国内外在这方面已做了大量的工作，已离体培养获得试管植株 的药用植物至少有2 0 0 种，从常见的到珍稀濒危植物，民族植物等，如：云南黑 节草、延龄草、高山红景天、莪术、水母雪莲、星花绣线菊、溪黄草、玉叶金花、 辽东槐木等，从生产常用有效成分的药用植物到生产具有抗癌、抗病等有效成分 的珍稀植物，如红豆杉、艾、黄杨、大戟属植物、长春花、米仔兰、狗牙花和香 榧等( 柳俊，1 9 9 8 ；许建峰，1 9 9 8 ；邢建民，2 0 0 0 ；杨礼香，2 0 0 1 ：黄勇，2 0 0 0 ) 。 通过组织培养可以培养多种药用植物，以满足人工栽培的需要，进而解决野生药 用植物资源缺乏这一日益严重的问题。 2 2 通过植物组织培养技术与细胞培养生产植物次生代谢产物 植物组织培养技术的发展，各种类型的有效培养基的制成，使科研工作者能 比较容易地获得愈伤组织与培养细胞。加之培养方法以从固体、液体、悬浮培养 发展到成批培养( 大罐发酵培养) 、半连续培养、连续培养等，使植物培养细胞 能像微生物那样进行工业发酵生产准备了较好的基础。自a r r e g n i n 和b o n n e r 用银胶菊愈伤组织生产天然橡胶以来( 罗士伟，1 9 6 4 ) ，许多科研工作者围绕着 愈伤组织能产生哪些有用物质，如何提高有效成分的得率等问题进行了不少工 作，并取得了一些成果。据不完全统计，有6 0 多种植物获得成功( 方德秋，1 9 9 4 ) 。 例如三七、云南萝美木( 方德秋，1 9 9 4 ) 、盾叶薯芋( 吴颂如，1 9 8 9 ) 、人参( 郑 光植，1 9 8 7 ) 、延胡索( ( 罗士伟，1 9 6 4 ) 、水仙、粗榧、水飞蓟等。目前从各种 培养物中产生的药用成分约有2 0 0 余种，其中药用成分含量超过或等于原植物的 有3 0 余种( 薛淮，2 0 0 2 ) 。孙瑁等( 2 0 0 0 ) 从红豆杉愈伤组织中获得的紫杉醇和 三尖杉脂碱的含量均高于外植体中含量。较有希望用于工业化生产的有：以人参 叶柄培养细胞生产人参皂甙；从薯蓣、山萆藓培养细胞生产薯蓣皂甙元；从喜树 茎培养细胞生产喜树碱；从十蕊商陆培养细胞生产病毒抑制剂：骆驼蓬培养细胞 生产蛋白酶抑制剂；莨菪培养细胞生产天仙子胺、l 一莨菪碱、红赤豆碱；烟草 b y 细胞株生产辅酶：苦瓜培养细胞生产类胰岛素以及利用筛选的洋地黄培养细 胞进行强心甙的转化；从长春花的细胞培养中生产长春新碱；从日本黄连细胞培 浙江大学碗士擘位论文 相对于陆地栽培，植物组织培养有很多优点：四季均可生产，不受地区、 季节及有害生物的影响：占地面积少，便于工厂化生产，可对自动控制细胞生长， 合理调节代谢过程：便于筛选高产细胞株；利于生物转化，寻找新的有效药物成 分。植物细胞内存在羟基化酶、氧化酶、甲基化酶、酯化酶、糖基转移酶、糖苷 酶等多种酶，植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物 所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物：个体差异小，生产周期短，设 备简单，能节省人力、物力等；利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变， 或进行脱毒，培育新品种，进而提高药用植物品质还可保存神质资源( 徐忠东， 2 0 0 1 ) 。 以繁殖性状均一的无性系为目的的微繁殖技术在中药材离体培养方面已取 得了广泛的应用，许多药用植物的组织培养已经完成实验室阶段的研究，正向工 厂化过渡，并且有一部分已实现商品化。利用微繁殖技术解决了药用植物营养繁 殖问题，如药用植物的分株、扦插等增殖率低的问题，获得性状均一的杂交种子 困难等阀题，这对于保存和繁殖稀有珍稀药材具有重要意义。 3 八角莲研究概况 3 1 ，k 角莲植物的分类地位 八角莲( 咖n 册蝴v e 船枣旭盯括( i a n c e ) m c h e n g ) 八角莲隶属小檗科鬼臼亚科 八角莲属，现已更名为鬼臼属( 应俊生，2 0 0 1 ) 。鬼臼亚科包含山荷叶属 ( d 砂f 踣协) 、八角莲属( 助d 册口) 、足时草属( p d 咖讲喇m m ) 、桃儿七属 ( s 加印d 幽p 砂舰m ) 4 属1 5 种。其中山荷叶属3 种( y m g e ta l ，1 9 8 4 ) ，八角莲属7 1 0 种( 包士英，1 9 8 7 ；应俊生，1 9 7 9 ；湖北植物研究所，1 9 7 6 ) ，足叶草属1 种( 应俊 生，1 9 7 9 ) ，桃几七属1 种( 马绍宾，1 9 9 7 ) 。我国是这类植物的分布中心与多样 性中心，在4 属1 5 种植物中，我国分布有3 属1 2 种。在全部成员中，除日本山 荷叶( d g n 掣f ) ，北美山荷叶( d q 删d ) 及足叶革( 只p e m 妇m ) 3 种外，其余的 种在我国均有分布，并且除桃儿七外，剩余的种都为我国所特有。 3 2 形态学特性 八角莲属植物为多年生草本，是我国特有履。其根状茎粗壮，横生，多须根； 茎直立，性成熟前具1 枚茎生叶，性成熟具2 叶，互生，盾状，近图形，4 9 掌状 6 浙江大学碗士擘位论文 相对于陆地栽培，植物组织培养有很多优点：四季均可生产，不受地区、 季节及有害生物的影响：占地面积少，便于工厂化生产，可对自动控制细胞生长， 合理调节代谢过程：便于筛选高产细胞株；利于生物转化，寻找新的有效药物成 分。植物细胞内存在羟基化酶、氧化酶、甲基化酶、酯化酶、糖基转移酶、糖苷 酶等多种酶，植物培养物作为一种生物反应器转化外源化合物，能够产生原植物 所没有的，甚至是至今自然界尚未发现的化合物：个体差异小，生产周期短，设 备简单，能节省人力、物力等；利用组织培养过程中出现的芽变或人工诱变， 或进行脱毒，培育新品种，进而提高药用植物品质还可保存神质资源( 徐忠东， 2 0 0 1 ) 。 以繁殖性状均一的无性系为目的的微繁殖技术在中药材离体培养方面已取 得了广泛的应用，许多药用植物的组织培养已经完成实验室阶段的研究，正向工 厂化过渡，并且有一部分已实现商品化。利用微繁殖技术解决了药用植物营养繁 殖问题，如药用植物的分株、扦插等增殖率低的问题，获得性状均一的杂交种子 困难等阀题，这对于保存和繁殖稀有珍稀药材具有重要意义。 3 八角莲研究概况 3 1 ，k 角莲植物的分类地位 八角莲( 咖n 册蝴v e 船枣旭盯括( i a n c e ) m c h e n g ) 八角莲隶属小檗科鬼臼亚科 八角莲属，现已更名为鬼臼属( 应俊生，2 0 0 1 ) 。鬼臼亚科包含山荷叶属 ( d 砂f 踣协) 、八角莲属( 助d 册口) 、足时草属( p d 咖讲喇m m ) 、桃儿七属 ( s 加印d 幽p 砂舰m ) 4 属1 5 种。其中山荷叶属3 种( y m g e ta l ，1 9 8 4 ) ，八角莲属7 1 0 种( 包士英，1 9 8 7 ；应俊生，1 9 7 9 ；湖北植物研究所，1 9 7 6 ) ，足叶草属1 种( 应俊 生，1 9 7 9 ) ，桃几七属1 种( 马绍宾，1 9 9 7 ) 。我国是这类植物的分布中心与多样 性中心，在4 属1 5 种植物中，我国分布有3 属1 2 种。在全部成员中，除日本山 荷叶( d g n 掣f ) ，北美山荷叶( d q 删d ) 及足叶革( 只p e m 妇m ) 3 种外，其余的 种在我国均有分布，并且除桃儿七外，剩余的种都为我国所特有。 3 2 形态学特性 八角莲属植物为多年生草本，是我国特有履。其根状茎粗壮，横生，多须根； 茎直立，性成熟前具1 枚茎生叶，性成熟具2 叶，互生，盾状，近图形，4 9 掌状 6 浙江大学硕士学位论文 浅裂；花深红色，5 8 朵簇生于离叶基部不远处，下垂；萼片6 ，伞形花序，蔟生 状，着生于茎端；花瓣6 ，雄蕊6 ，花丝短于花药，药隔先端急尖：子房椭圆形， 花柱短，柱头盾状；花不具蜜腺；三沟花粉，较大，为球形、扁球形或长球形； 浆果，椭圆形，种子多数。( 中国植物志，2 0 0 l ；马绍宾，1 9 9 7 ；苏应娟等1 9 9 4 ) 苏应娟( 1 9 9 4 ) 研究表明八角莲的茎内维管束均为外韧型，数目多、大小不 规则，呈近散生排列。 八角莲与六角莲仅从营养器官上很难区分，主要区别为伞形花序着生位置不 同：八角莲着生于离叶基部不远处，而六角莲着生在二茎生叶叶柄交叉处。( 中 二劳管函j ；t i j 翻萋囊薹季五黎髦ji l l i l 萋? i 静矍 ! ：! 兰2 1 ：堑 ；： 主i 3 冀； 姿o o o d d 浓度( g 1 ) x 浙江大学硕士学位论文 黄衡宇( 2 0 0 1 ) 对八角莲小孢子发生和雄配子的形成进行了研究，结果表明 八角莲小孢子母细胞的分裂基本是同步的，但也有不同步的，不仅不同花药或同 一花药不同的花粉囊中的分裂不同步，就是同一花粉囊中的分裂也不同步，这与 其近缘属植物桃儿七在同一花粉囊内观察到基本同步的现象不一致，而与其另一 近缘属植物山荷叶基本相类似。并发现大量小孢子母细胞染色体发生胶合，不能 进行正常的减数分裂以及单核和二核花粉时期出现空瘪花粉。 3 4 地理分布和生态特点 八角莲分布于我国藏东南一川西一秦岭一淮河以南海拔3 0 0 1 5 0 0 米山区。 己知湖北、湖南、河南、四川、江西、安徽、浙江、广东、广西、云南、贵州， 山西诸省均有分布( 中国植物志，2 0 0 1 ) 。 八角莲野外分布地区虽广，但数量较少，并严格要求亚热带山地森林生境( 应 俊生，1 9 7 9 ) ，常常局限生长在有机质丰富、酸性至中性( p h4 2 7 8 ) 透水性 好的土壤中。其耐荫性的特性十分突出，对湿度的要求较高。( 马绍宾，1 9 9 7 ) 3 5 八角莲种质资源现状 由于八角莲药用价值较高，而人们所用八角莲药材主要依赖于野生资源，多 年来，滥挖乱采现象极其严重，加上自身生殖机制的限制和荫暗潮湿的森林生境 遭到人类强烈破坏，八角莲的栖息地面积逐渐缩小。造成分布片段化，野外分布地 区和数量锐减，资源濒于灭绝，丞待保护。 保护生物多样性，包括保护珍稀濒危药用植物资源是我国和世界的一项紧迫 任务。针对八角莲分布面积日益缩减的现状，研究人工保护措施和繁殖技术，尤 其是寻找可供工业与商品生产的非资源依赖性的新的技术途径，以挽救其种质资 源，这是具有重要意义的工作，因为物种一旦灭绝，就不可复得；而且常会导致 另外l o 3 0 种生物的生存危机( 肖培根，1 9 9 4 ) 。而采用新技术的工业化生产则可 能兼顾应用价值与资源保护的平衡。 因此，应用植物组织培养和细胞培养的手段，对资源量少的重要野生药用植 物和珍稀濒危药用植物种质资源给以合理充分地利用和保护，就有十分重要的意 义。这不仅可以在较短的时期内较快地繁殖和增加数量，也可以直接获得有效成 分或药用活性成分。具有十分重要的生态学意义和现实的经济价值。 浙江大学硕士学位论文 3 6 八角莲药用价值和活性成分的生物学研究 3 6 1 八角莲的药用价值 八角莲据记载具清热解毒，抗毒蛇咬伤之功效( 尚明英，1 9 9 4 ) 。临床主治 跌打损伤、蛇伤及风湿关节痛：用于多种癌症、乙型肝炎、病毒性脑炎、流行性 腮腺炎、病毒症、带状疱疹、流行性出血热，备种疣类等症状，疗效颇好( 王丽 平等，1 9 9 8 ) ：八角莲已有注射液生产， 制剂，可以进行静脉滴注，有消气化痰， 为八角莲根和根茎租粉制备的无色透明 解毒消肿，抗癌、抗病毒、保肝、免疫 调节等多种疗效，八角莲所含的槲皮素和山奈酚成分有镇咳祛痰等作用( 云南药 物所，1 9 7 7 ) 。4 0 年代，k i n g 和s l l l i i v 缸首次报道鬼臼毒素具有类秋水仙碱作用， 可把细胞分裂周期阻滞在分裂前期，对组培的动物的各种肿瘤以及移植动物肿瘤 均有抑制作用。引起人们广泛注意，并进一步证实了鬼臼毒素具有抗癌活性，但 由于其毒副作用大，限制了在临床上的直接应用( k i n g1 9 4 6 ) 。5 0 年代初始， 开展了对鬼臼类木脂素的结构改造和新药开发工作，获得了一批高活、低毒的鬼 臼类抗癌药物( c r e a v e n ，1 9 7 5 ) 。6 0 年代中期v p 1 6 2 1 3 ( 鼬咖s i d e ) 和v i 2 6 ( t e n i p o s i d e ) 相继问世，临床测试具有光谱抗癌活性，对睾丸癌、白细胞癌、 淋巴肉癌、神经胶质瘤、霍杰金氏症等多种癌症有特殊疗效。 3 6 2 八角莲的药用活性成分 八角莲根状茎主要含木脂素类、黄酮类、皂甙类、鞣质、多糖、槲皮素 ( q u e r c e t i n ) 和山奈酚( k a e m p f e r 0 1 ) 等多种有效化学成分。其主要成分木脂 素类的基本结构为4 一苯基四氢萘骈丁内月旨和4 一苯基四氢萘骈丁内脂的衍生物。 主要化合物有：鬼臼毒素，去甲鬼臼脂素，锡金鬼臼脂素，去甲去氧鬼臼脂素， 去氧鬼臼脂素，o 一和b 一足叶草脂素，山荷叶素，去氢鬼臼脂素和酮基木脂素成 分等( 陈毓亨，1 9 7 9 ) 。 3 6 3 鬼臼类木脂素的生物合成 鬼臼类木脂素沿苯丙烷代谢途径，由二个苯丙素单元通过侧链的b 一碳原子 相偶合而成。氧化聚合发生在醇水平，推测松柏醇是极可能的中间体 ( b r o o m h e a d 1 9 9 0 ) 。 鬼臼类木脂素从代谢途径上分为两类：4 一去甲鬼臼毒素类和三甲氧基鬼臼 9 浙江大学硕士学位论文 毒素类。二者在两个苯丙素单元偶合后，发生环化之前发生分支( j a c k s o n ， 1 9 8 4 ) ，乌台树脂是这两类木脂素的分支点。它进步被取代后，经甲酰基化并 经环化和修饰形成各类芳基类四氢萘骈丁内脂木月旨素。 去氢鬼臼毒素在c 4 位羟基化进一步转化为鬼臼毒素( j a c k s o n ，1 9 8 4 ) 。4 7 一去甲氧鬼臼毒素和去氧鬼臼毒素通过c 5 位羟基化而成为n 或b 一足叶草脂素。 3 ，6 4 抗癌机理及构效关系 鬼臼毒素的抗肿瘤机制是在细胞分裂过程中通过抑制微管的聚合而抑制细 胞分裂。作为鬼臼毒素的受体的小管是微管的主要蛋白质成分。微管构成了减数 分裂与有丝分裂纺锤体的纤维、中心粒和基体的管状结构、纤毛和鞭毛中排列成 9 十2 的轴线纤丝。其功能是保持细胞形状、细胞运动和细胞内物质的运输。它是 一个由两个次级单位诵d 小管组成的6 s 的二聚体。在一定的条件下o l ，p 可聚合 成为二聚体而形成微管。而鬼臼毒素在动物细胞中的细胞毒作用是它与微管二聚 体结合成为微管鬼臼毒素复合物而阻止了微管的聚合，从而抑制细胞的有丝分 裂。当鬼臼毒素的浓度在5 h m 时就能完全抑制微管聚合。这些特性使鬼臼类木 脂素表现出强烈的细胞毒性从而抑制癌细胞增殖。以鬼臼毒素为原料半合成的新 药v p 1 6 和一2 6 是4 一去甲表鬼臼毒素一b d - 葡萄糖甙衍生物。由于这2 种 化合物c 4 位甲氧基被羟基取代，c 4 位表异构化以及c 4 位上存在葡萄糖甙基， 因而改变了其抗癌特性，使其成为高效低毒的抗癌新药。该类药物在细胞内强烈 抑制d n a 拓扑异构酶活性，破坏d n a 链状结构，造成d n a 双链或单链的断裂，它 作用于细胞分裂的s 后期和g 2 期，使细胞在分裂间期受阻( i s s e l l ，1 9 8 2 ) 。 目前，作为半合成原料的鬼臼类木脂素仍主要依赖从天然生药资源中提取、 分离，尽管木质素( l i g n i n ) 在植物中广泛分布，但天然鬼臼类木脂素却只存在 于小檗科的鬼臼属、八角莲属和山荷叶属以及大麻科和柏科的少数科属植物中 ( 刘长军，1 9 9 7 ) 。 3 7 组织、细胞培养生产鬼臼类木脂素的研究现状 组织、细胞培养生产鬼臼类木艏素的研究始于8 0 年代初期，至今约有6 种 植物获得了细胞株，并建立了细胞悬浮培养系，有些种类已进行了发酵培养实验， 组织培养快速繁殖技术也证明为可行( k a d k a d e1 9 8 2 ，u d e n1 9 8 9 ，c h a n g1 9 8 7 ) 。 o 浙江大学硕士学位论文 分化根亦能够积累o 7 一1 3 的5 一 l p t 。 分化根器官的培养虽然有利于目的产物的积累，但由于其生长缓慢，很难适 应工业化生产的要求。利用发根农杆菌感染获得的发状根培养系统生产次生代谢 物质，可提高次生产物的含量且生长迅速，产量稳定( h a m i l l ，1 9 8 7 ；陈士云， 1 9 9 3 ) 。利用发根农杆菌感染l 日a y 蚴叶片，已建立起发状根培养系统( a ”e s ， 1 9 9 0 ) 。该系统能够产生1 5 一3 5 干重的5 一m ”，其产率是悬浮细胞培养的4 倍多。目前高产根系的进一步筛选工作正在进行中。 细胞工程和基因工程领域的一些新技术也己应用到生物技术生产鬼臼类木 脂素的研究当中。印足叶草细胞固定化培养( u d e n 。1 9 9 0 ) ，黑曲霉诱导子诱发 处理l 订a p 唧的悬浮细胞等方法已分别进行了尝试( u d e n ，1 9 9 0 ) ，利用反义 r n a 技术可以抑制特定代谢途径中关键酶的活性，构建生产目的产物的基因工程 细胞株，m 0 1 等( 陈士云，1 9 9 3 ) 通过反义r n a 拮抗l 口a p 埘发状根中的肉桂醇 脱氢酶表达活性，抑制分支途径木质素的合成而促进了5 一m p t 含量的提高。 3 。7 ，3 发酵培养 a r e n s ，( 1 9 8 6 ) 曾以八角莲的悬浮细胞系为种子进行了规模3 2 l 的发酵培养， 但培养物中只检测到3 种黄酮类物质。 利用酶联免疫原理设计的一种快速、敏感检测鬼臼毒素及其4 一去甲衍生物 的方法可检测到o 1 6n l o l 的鬼臼毒素，并可检测小于o 2 m g 样品材料( 刘长军， 1 9 9 7 ) 。较之h p l c ，此法具有低廉、快速且可同时检测大量样品等优点，这将为 鬼臼毒素高产细胞株的筛选带来很大便利。 由于鬼臼类木脂素以其显著的细胞毒性而作为抗癌药物v p 一6 ，v m 一2 6 等的半 合成原料，但其天然生药资源日渐匮乏，难以满足日益增长的医药市场的需要。 通过对该类化合物的生源途径、化学合成和结构改造的研究，有助于合理利用现 有资源，开发高效低毒新药；植物组织细胞培养工作为人们研究鬼臼类植物的种 质保护和解决天然资源短缺提供了一条新的途径。 4 存在问题、研究内容和目的 4 1 存在问题 综上所述，由于人们多年滥挖乱采及生殖机制的某种限制( 王诗云，i 9 9 5 ： 2 浙江大学硕士学位论文 f r a n c i s c o ，2 0 0 1 ；，g i l b e r t ，1 9 9 9 ) ，八角莲野外分布地区和数量锐减，资源濒 于灭绝，亟待保护。栽培条件下，生产周期太长，难以满足医药等领域的需要( 张 忠齐，1 9 8 9 ；w o o d s o n ，1 9 8 8 ) 。虽然近年来对其研究有所深入，但大多局限于 表面的形态结构、表皮、花粉、药理药效等方面，总体上是不足的。 刘蕾等( 1 9 9 7 ) 对八角莲的组培品及野生品进行了比较，认为组培品与野生 品所含化学成分类型基本相同，但有效成分鬼臼毒素的含量低于野生品。但并未 比较不同组培条件下，不同生长阶段的八角莲的有效成分含量变化。 以往所做的研究中也未涉及到如何促进组培八角莲鬼臼毒素的含量增加。如 何把八角莲的生产利用和资源保护有机的结合起来通过对八角莲与其它植物化 学成分的比较研究，寻找八角莲的代用品，以获得更为有效的i 临床医疗效果，缩 短组培八角莲的生产周期，寻找适当的培养方法和添加物( 前体物质或激素种类 与水平) 提高其有效化学成分的产量，都有待深入研究。 4 2 研究内容与目的 ( 1 ) 利用组织培养的方法，研究八角莲的快繁的最适条件和最短周期：建立 快繁技术体系，为八角莲的工厂化生产，开发利用提供基础。 ( 2 ) 研究组织培养过程中，不同激素及其不同浓度梯度对其有效成分( 次生 代谢产物鬼臼毒素) 含量的影响，探讨利用生物技术快繁生产药物的可行性。 5 研究方案和技术路线 5 1 研究方案 5 1 1 组织培养 利用微繁的方法，通过建立无菌培养和植株的移栽，研究八角莲的快繁的最 适条件和最短周期。 ( 1 ) 组织培养：分别用八角莲的根，芽，叶各组织作为外植体，在l s 培养 基中添加2 ，4 一d ，i a a ，b a 等激素或前体物质，观察八角莲在这些培养基上的生 长( 愈伤、分化和成苗) 情况。从而摸索获得最适八角莲组织培养的条件。 ( 2 ) 炼苗：将八角莲组培所获得的无菌苗移到大棚中炼苗。 ( 3 ) 扩大八角莲的繁殖。 浙江大学硕士学位论文 5 1 2 有效成分分析 ( 1 ) 有效成分的分离：本实验采用h p l c 法进行化合物的分离。 ( 2 ) 对所分离的化合物进行物理常数的测定； 5 1 3 数据分析 愈伤组织分化率，用s a s 软件统计分析在组培过程中八角莲所产生的外植 体的发生率，愈伤组织的诱导率，愈伤组织分化率，各个浓度梯度的激素刺激 下八角莲的生长情况。对各种处理下组培八角莲所含鬼臼成分得率进行计算。 5 2 技术路线 外植体的建立 诱导八角莲外植体形成愈伤组织 统计八角莲的叶片，根茎形成的愈伤 组织和芽形成的无菌苗的生成率 愈伤组织在不同的激素及其不同 浓度梯度下形成分化 扩大培养 测定各愈伤组织中鬼臼毒素的含量 分化组织在不同的激素极其不同处 理下形成的鬼臼毒素 数据的分析，对得到的八角莲组培和化学分析数据，结合已有资料，提出最 o o io ，0 0 5i oi ，1 2 1 5 ，o0 0 0 5o 0 11 o1 1 4 浙江大学硕士学位论文 第二部分实验研究 第一节组织培养、快速繁殖部分 1 材料与方法 1 1 实验启动材料 试验材料八角莲哪o s m 口v e 船橱8 f 胁( h a n c e ) m c h e n g 于2 0 0 0 年采自峨眉 山，种植于浙江大学植物园八角莲试验地；其组织培养原材料取自上述移植个体。 参考c h u g ( 1 9 8 7 ) 的工作和预实验结果，设置2 4 种试验组合，分别为n a a 浓度梯度实验；2 ，4 _ d 浓度梯度实验；b a 浓度梯度实验( 见表1 3 ) 。各组均添 加4 8 叽琼脂，灭菌前p h 值调至5 8 ，1 2 k g c m 2 压力下灭菌2 0 m i n 。 1 2 试验方法 1 2 1 外植体选择和处理 取八角莲生长健康植株的幼嫩叶片、叶柄和根，用自来水洗净，再流水冲洗 半个小时后进行表面消毒，消毒方法为：7 0 酒精浸泡3 0 s 后，用无菌水冲沈两 次，再用o 1 升汞1 0 0 m l ( 加入2 3 滴吐温t - 2 0 ) 消毒8 m i n ，最后用无菌水冲 洗干净。 外植体消毒后用无菌滤纸吸干。叶片切成5 m m 5 m m 左右的方块，叶面朝 上接种：叶柄和根切成l c m 左右的切段，接入培养基。 1 2 2 接种方式对愈伤组织诱导的诱导 取上述处理好的带叶柄的幼嫩叶片，叶片切成5 衄5 i n m 左右的方块，分 别以叶近轴面朝上和近轴面朝下两种方式接种。培养基为m s + b ao 2m l 。2 ，4 do 5m 玑，其它成分及灭菌方法不变。 1 2 3 不同激素及其激素浓度对愈伤的诱导 实验中添加的激素种类及浓度配比设计见表l ，各处理参考前人研究c h u a l l g 和c h a n g ( 1 9 8 7 ) 的试验结果，结合本材料的具体特点而设计a 接种后1 5 天观察统计各处理对愈伤组织诱导及生长的影响，统计各外植体 愈伤组织诱导率。 浙江大学硕士学位论文 1 2 4 试验培养基配方 n a a 浓度梯度实验按表1 方法进行；2 ，4 一d 浓度梯度实验按表2 进行：b a 浓度梯度实验按表3 进行。以上培养基均加入p v p o 8 龃，蔗糖3 0 l ，琼脂4 8 l ， 煮好后p h 值调至5 8 ，装入广口瓶1 2 0 灭菌2 0 m i n 。 表1n a a 浓度梯度对愈伤组织诱导试验培养基配方 1 h b l elt h em e d i ao f d i f 耗仲n tn a ac o n c e n t r a t i o na n dk t ( b a ) o nj n d u c e m e n to f c a l l u s n o ，m s + n a a + k tn o m s + n a a + b a ( 1 ) m s 。卜n a a l ，o m g l + k t o 2 m g ，l ( 5 )m s + n a a lo r n g ，l + b a o | 2 m l ( 2 ) m s + n a a l 5 m g ，l + k t 0 2 m l ( 6 )m s 斗n aa 1 5 m l + b a 0 2 m l ( 3 ) m s + n a a 2 o m g 几十k t 0 2 m g l ( 7 ) m s + n a a 2 o m g l + b a 0 2 m g l ( 4 ) m s + n a a 2 5 m 班+ k t o 2 m g l ( 8 ) m s + n a a 2 5 m g l + b a 0 2 m g l 表22 4 - d 浓度梯度对愈伤组织诱导试验培养基配方 t h b l e2t h em e d i ao fm f f e n t2 ，4 - dc o n c e n t 豫t 吣a n dk t ( b a ) o ui n d u c 哪蛐to f i l s n o m s + 2 ，4 d + k t n o m s + 2 ，4 - d + b a ( 9 ) m s + 2 ，4 d o 5 m l + k t o 2 m g l ( 1 3 ) m s + 2 ，4 d o 5 m g l + b a 02 m g l ( 1 0 ) m s + 2 ，4 - d 1 o m g l + k t o 2 m l ( 1 4 ) m s + 2 ，4 d 1 o m g ，l + b a o 2 m g ，l ( 1 1 ) m s + 2 ，4 一d 1 5 m g ，l 汀0 2 m g l ( 15 ) m s + 2 ，4 - d 1 5 m g l + b a o 2 m 舡 ! ! ! !坚! 生2 ：垫吐塑! ：! 翌咝! ! ! !坚! 生里! ：! 垩型坚曼垒! ：；墨吐 操作方法 无菌条件下( 在超净台上操作) ，将已经消毒的八角莲外植体切成小块( 5 m m 5 m m 左右) 后接入上述1 6 种培养基中，黑暗条件下培养l 2 天，再转入4 0 w 双管目光灯下培养，光强为2 0 0 0l x ，温度保持在2 5 2 。 1 ，2 5 不同激素及其浓度对愈伤组织分化的影响 取由八角莲的叶片外植体诱导获得的愈伤组织，接入以下四种分化培养基中 培养。3 0 天后观察并记录结果。 ( 1 ) m s + b a o 5 _ n a a o 2 ( 2 ) m s + b a o 5 + n a a 0 2 + g a 0 2 6 浙江大学硕士学位论文 ( 3 ) m s + b a o 5 + g a l o ( 4 ) m s + b a l 0 + g a l o 表3b a 浓度梯度对愈伤组织诱导试验培养基配方 1 h b k3t h em e d 妇o fd i f 托悖n tc o c e n t r a t i o b aa n d n a a ( 2 ，4 一d ) o i n d u c e m e to f h u s n o m s + b a + n a an o m s + b a + 2 4 一d ( 1 7 ) m s + b a l 0 m g l + n a a 0 ，5 m g l ( 2 1 ) m s + b a l o m g l 十2 ，4 一d o 5 m l ( 18 ) m s + b a l 5 m 班+ n a a o ，5 m g l ( 2 2 ) m s + b a l 5 m g l + 2 ，4 d o 5 m 叽 ( 1 9 ) m s + b a 2 o m g 几+ n a a o 5 m 叽 ( 2 3 ) m s + b a 2 o m 班+ 2 ，4 d o 5 m l ( 2 0 ) m & + b a 2 5 m 啦+ n a a o 5 m g l ( 2 4 ) m s + b a 2 5 m l + 2 ，4 一d o 5 m g l 1 2 6 不同激素浓度对诱导再生芽的影响 取以外植体芽诱导产生的无菌苗植株的芽，在不添加任何激素的m s 培养基 中培养一个月后，转入以下四种生长培养基中观察培养。每7 天观察一次并汜录 结果。 生长培养基； ( 1 ) m s + b a l o ( 2 ) m s + b a l 0 + g a 0 5 ( 3 ) m s + b a l o + z t o 5 ( 4 ) m s + b a l o + g a 0 5 + z t o 5 1 2 7 不同激素浓度对生根的影响 取高2 3 c m 无菌苗接入以下三种生根培养基中培养，定期观察并记录结果。 ( 1 ) l 2 m s + i b a o 5 ( 2 ) l ，2 m s + b a 0 0 5 + i b a o 5 ( 3 ) l ，2 m s 十n a a 0 5 。 12 8 炼苗与移栽 以八角莲离体再生的无菌苗为试材。在自然光照下炼菌7 天后开瓶，从愈伤 团上钳取壮苗，移栽到以泥炭土：珍珠岩( 1 ：1 ) 为基质的1 2 c m 塑料盆，每盆 1 株，每1 5 盆为一个单位，一批移栽后用塑料膜覆盖7 天后：一批移栽后不用 塑料膜覆盖，每天对叶面喷1 次水，两种处理平均每7 天进行一次叶面追肥。以 后每半个月浇一次l 2 m s 营养液。1 个月后统计成活率。 浙江大学硕士学位论文 移栽试验于2 0 0 3 年1 1 月2 0 0 4 年5 月在浙江大学植物园温室大棚中进行， 最高昼温 1 8 ，相对湿度5 0 8 0 ，遮光7 5 。 1 2 ，9 数据分析 试验数据均采用s a s 软件进行方差分析。在同一个表中表示a 和b 所在组差 异显著，如果同一个表的各个处理之间差异不显著，均标为a ，如果这些处理与 另一处理出现差异显著，另一处理标为b 。如果标b 处理又与下一处理差异显 著，下一处理标为c ，依次类推。 2 结果与分析 2 1 不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响 取八角莲的叶片，叶柄和根作为外植体，接在培养基m s + 2 ，4 一d o 5 m g 几+ k t o 2 m l 上培养4 5 天。统计愈伤组织的诱导率，并用s a s 软件进行分析。统 计数据见表4 。 表4 八角莲外植体不同部位对愈伤组织诱导的影响 ：! 塾空! ! ! 兰! 璧! 坚! j ! ! ! ! ! ! ! 苎! ! ! 垫! ! ! ! ! ! ! ! ! 垒竖2 2 1 1 丝 。外植体类型接种外植体数诱导的愈伤数愈伤诱导率 t y d eo f t h en u m b e r s0 ft h en u m b e r s o ft h er a t e o ft h o e x p l a n t se x p l a n t s c a l l u si n d u c e df r o mc a l l u s i n d u c e df r o m e x p l a n t 3e x p a i n t s 注：同一栏内具有不同字母表示差异达到0 ，0 5 显著( 小写字母) 水平。 从表4 可知，八角莲根诱导的愈伤组织发生率要高于叶片和叶柄，差异显著。 叶片与叶柄的愈伤组织诱导率较接近。而由根诱导的愈伤组织较多。三者诱导所 得的愈伤率为：叶片 叶柄 根，诱导所用时间为根 叶柄 叶片。但发现，根 的愈伤组织在继代后生长缓慢，一段时间后就不再生长，愈伤组织逐渐老化，或 者直接在培养基上分化出根状分化物。叶片和叶柄诱导的愈伤组织继代后只分化 出根状物而不易分化出芽。( 图1 a d ) 浙江大学硕士学位论文 图1 外植体脱分化形成愈伤组织 a 叶片外植体脱分化形成愈伤b 叶柄外植体脱分化形成愈伤 c 根外植体脱分化形成愈伤d 叶片愈伤组织继代后分化出根 f i 昏lc a l l u si n i t i a t i o n 丹o ml e a f e x p l a r i 协 ac a l l u si n i t i a t i o nf r o ml e a fe x p l a n t s ，bc a l l u sj n t i a t i o nf r o mp e t i o l ee x 棚a n t s ，cc a i l u s i n i t i a t i o nn d mr o o te x p l a n t s ，dr 0 0 td i 毹r e n t i a t i o nnf r o mc a l l u s 2 2 接种方式对愈伤组织诱导的影响 接种方式对愈伤组织的诱导至关重要。表5 显示，近轴面朝上接种的叶片的 愈伤组织诱导率高达7 5 6 ，而近轴面朝下接种只有很少愈伤组织产生，而且后 者产生的愈伤组织生长势明显不及前者。 在试验中发现，近轴面朝下接种的叶片经过一段时间的培养后，切块会向卜 卷起，边缘暴露于空气中；而近轴面朝上接种的叶片则会中部隆起，切块边缘与 培养基紧密接触，说明外植体尤其是其切割边缘与培养基的充分接触是愈伤组织 成功诱导的重要条件。 1 9 浙江大学硕士学位论文 裂素如zt对组培中不弼赣驵蛩释嚣泌酶褡芝拥卧非i不及其他卵箕遐拦嚣鸯 鞠毛!楚矗鲻强殖酗雅塑抄强；渗型瑶臻g催滠喃涛谤舞啸，晦遵童哺j憾淮帑 讯砸g笛鑫甚涵潞谨搐蓊建壤蠕塔律埋。潆涔蕊喋留穗h：jl謦；罐受豇妒鞋 莸篓到掣侧翟别刚时l殳。壮妊醵蔽释誓忿鼍嗡懂御慑埠萌聋澎噬澄凄型篓影高 帛旺( 1 ：髫酗秘锄潮霸；鏊娑翳誊铺蕊一番琴g l ) 的b a ，超过o 1 m g l 则 抑制发 诱 导组培中外植体不定根的形成。由此可见，在八角莲的生根培养中，ba的存在 对八角莲生根有一定的抑制作用。采 用大量元素减半的瞒培养基(i2幅)作为诱导培养阶段的基本培养基，其 诱导效果优于未改良的ms培养基。通过实验获得了离体生根的最佳处理组合，即 切取八角莲芽外植体，在l2淞含活性炭的培养基(添加适宜的激素配比)中 培养生长，该处理组合生根早，转入生长培养阶段后5一10天即有根发生，前期 和后期的生根率均显著高于其他处理组合，最终生根率可达到70以上。八 角莲的研究实验证明，通过添加植物激素、改良培养基成分以及改进培养方法等途径提高八角莲试管苗的生根率是可行的。 在移栽过程中，栽培基质是影响组培苗成活和生长的重要因素。泥炭土持水 力强，但透气性、透水性较差：砻糠灰孑l 隙度高，保水力强，但吸湿性很强，容 易发生通气不良丽产生湿害( 刑禹贤，1 9 9 0 ) ：珍珠岩质轻，透气性、透水性好， 试管苗成活率高、幼苗健壮，且基质原料便宜，较适合作为试管苗的育苗基质， 但珍珠岩保水性较差，所以珍珠岩与泥炭土混合使用更适宜八角莲试管苗的移 栽。实验证明，八角莲植株在珍珠岩与泥炭土混合( 1 ：1 ) 的基质上生长良好。 在驯化阶段，组培苗一般有2 0 一3 0 枯死，这除了因为组培苗本身对环境 适应能力差外，如叶片光合能力低。小苗生长慢：叶表皮薄，从植物体内散发的 水分过多；气孔开闭机能弱，使植物体内水分调节较差；根的生理、生态机能弱， 因而由根系吸收水分、养分的能力差；不利于组培苗的生长( 赵军良，1 9 9 3 ) 。 在组培过程中，培养器内相对湿度近于1 0 0 ，以致造成小植株的表皮角质层不 够发达，而驯化期间的水势低，从而会导致驯化阶段苗成活率降低( 史跃林， 浙江大学硕士学位论文 有利于愈伤组织诱导和增殖。从2 ，4 d 和b a 浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长 的影响、b a 和n a a 浓度组合对西黄松子叶愈伤组织生长的影响可证实( 向邓 云2 0 0 1 ) 。对多数植物材料来说，o 2 2 吼g l 的2 ，4 d 是诱导愈伤组织和细 胞悬浮培养的最有效物质，同时加入o 5 2 o m g l 的k t 会对级织和细胞的生长 有帮助。八角莲的愈伤组织诱导实验也证明了这一点。 2 4 不同激素浓度对愈伤组织分化的影晌 将由叶片诱导获得的愈伤组织，接入下列培养基中上进行分化培养，1 5 天 继代一次，一个月后统计愈伤组织的分化率，结果见表1 2 。 从表1 2 可见在培养基( 2 ) 中愈伤组织的分化率最高，达到5 9 1 2 5 。培养 基( 2 ) 与( 1 ) 的差异不显著，但于培养基( 3 ) 、( 4 ) 的差异显著。培养基( 3 ) 与( 4 ) 之间的差异不显著。综合来看，愈伤组